CN114107188A - 一种干细胞成膜培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种干细胞成膜培养基及其应用，干细胞成膜培养基包括细胞基础培养基、胎牛血清、生长因子、附着骨架材料和维生素，涉及干细胞成膜培养基的配制、干细胞的分离、干细胞的培养和干细胞成膜。本发明的有益效果是：本发明成膜方法利用胶原蛋白本身的溶解性质，将其进行低温离心成膜，操作成本、技术要求低，利于大规模生产；本发明最终获得的干细胞生物补片免疫相容性高，不良反应少，膜厚度薄且厚度根据温度和离心时间可控，并且由于本发明将干细胞嵌入了生物补片膜内，移植后随着基质被机体吸收而缓慢释放干细胞，因而起效时间更长，较普通培养吸附制备的干细胞生物补片修复卵巢的效果更好优。

Description

一种干细胞成膜培养基及其应用

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种干细胞成膜培养基及其应用。

背景技术

卵巢早衰(POF)是指卵巢功能衰竭所导致的40岁之前即闭经的现象，特点是原发或继发闭经伴随血促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，并伴有不同程度的一系列低雌激素症状如：潮热多汗、面部潮红、性欲低下、不孕不育等，严重影响育龄妇女健康。已有研究证实，间充质干细胞(MSCs)具有调节蜕膜免疫细胞的作用，通过尾静脉注射能够修复小鼠衰老的卵巢结构，改善卵巢内分泌功能，表明采用间充质干细胞(MSCs)治疗卵巢早衰(POF)具有潜在的临床应用价值。然而，卵巢损伤部位的微环境会由于炎症反应和细胞外基质的沉积，而失去正常顺应性，产生的非诱导性微环境影响干细胞迁移，使其易向其他器官扩散，而向靶器官归巢能力下降、再生能力被严重限制。

生物补片是指取自同种、异种的组织，经脱细胞处理去除组织中含有的各种细胞而完整保留细胞外基质的三维框架结构并能用于修复人体软组织的材料，目前国内外已有数十种商品化的生物补片。生物补片不含细胞富含细胞外基质蛋白，可为干细胞提供附着和迁移的自然环境，具有较好的细胞相容性，抗原性低，有利于干细胞的生长和存活，从而对损伤器官组织功能具有一定的改善作用，以生物补片作为间充质干细胞(MSCs)归巢的载体，是解决间充质干细胞(MSCs)归巢率低的一种方法，但生物补片需要另行制备再作为载体使用，总厚度大，特别是吸水后厚度会增加，造成移植后被机体吸收代谢速度慢的问题，不利于快速恢复。

人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)具有的低污染、来源充足、增殖旺盛等优点，并且，脐带间充质干细胞不受任何伦理及法理限制，因此，可作为卵巢移植的优选细胞，人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)可采用体外培养的方式进行增值，但人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)相对于其他细胞更脆弱，对环境敏感性腔，生长环境微弱的变化就会引起其生长，因此培养基的选择对其生长传代尤为重要。如何培养出移植后高归巢率的人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)，使其发挥更好的移植治疗效果是目前急需解决的问题。

中国发明专利申请号201510540753.6，公开了白芨多糖水凝胶、培养基质及其应用与诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法，将白芨多糖经硫酸化后与携带多官能团的ε-聚赖氨酸交联制得多糖水凝胶。该白芨多糖水凝胶呈半透明膜状，其中具有良好的孔隙，适宜细胞的生长与分化。实验表明，以本发明提供的白芨多糖水凝胶为支架，将hUC-MSCs与羊膜上皮细胞共培养7天后，hUC-MSCs的分化率可达31.96％。该分化率显著(p<0.01)未采用凝胶支架的对比例。并且，本发明提供的凝胶还能够使细胞生长旺盛缩短诱导时间。其采用教练的方法制备白芨多糖水凝胶，产生的半透明状膜厚度较大，并且由于为植物性多糖，免疫相容性较动物来源多糖差，不利于移植操作，且由于不是与干细胞进行共沉淀，而是先制膜后附着的方式，造成干细胞只停留于膜表面，含量低，不利于移植后干细胞长效释放，功效时间较短。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)治疗卵巢早衰(POF)时，移植前处理复杂，移植后归巢率低的问题，而提出的一种干细胞成膜培养基。

本发明的另一目的是提供该培养基的一种应用。

为了实现第一个发明目的，本发明公开的技术方案是：一种干细胞成膜培养基，包括细胞基础培养基、胎牛血清、生长因子、附着骨架材料和维生素；

进一步地，所述细胞基础培养基可以是DMEM、α-MEM、F12、DMEM/F12和IMEM等中的任意一种或其任意组合；

进一步地，所述胎牛血清的终浓度为1-100μl/ml；

进一步地，所述生长因子为表皮生长因子和所述碱性成纤维细胞生长因子，所述表皮生长因子的终浓度为1-100ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为1-100ng/ml；

进一步地，所述附着骨架材料为Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白中的一种或其任意组合，所述附着骨架材料的终浓度为10-500μg/ml；

进一步地，所述维生素为维生素A、维生素B1、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素E种的一种或其任意组合，维生素A的终浓度为0-50ng/ml，维生素B1的终浓度为0-20ng/ml，维生素B6的终浓度为0-20ng/ml，维生素B12的终浓度为0-20ng/ml，维生素C的终浓度为0-100ng/ml，维生素E的终浓度为0-60ng/ml。

为了实现第二个发明目的，本发明公开的技术方案是：

a、干细胞成膜培养基的配制

在超净工作台内配制细胞基础培养基，调节pH，加入胎牛血清、青霉素/链霉素、生长因子维生素，混匀后膜过滤除菌，再加入附着骨架材料；

b、干细胞的分离

在本发明中，所述干细胞为脐带来源的间充质干细胞，而且是具有能够分化为脂肪组织、软骨组织或骨组织的未分化细胞；用磷酸盐缓冲液漂洗脐带去除残留血液，将组织剪碎；加入6倍于剪碎组织体积的磷酸盐缓冲液，加入1/2-1/3该总体积的II型胶原酶在37℃下搅拌消化75-80min，过滤；将磷酸盐缓冲液和胰酶加入未消化完全的组织块中继续消化，37℃搅拌消化35-40min，血清终止胰酶的作用，过滤使细胞悬液和未消化完全的组织块分开；在所有收集的细胞悬液中加入等量磷酸盐缓冲液混匀，缓慢加到Ficoll分离液上，900g离心10-20min，取界面云雾状细胞层加入细胞基础培养基，洗涤3-5次，加入本发明培养基将细胞吹打成单细胞悬液接种于100ml培养瓶中；

c、干细胞的培养

将上述的细胞在37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养2-3天后弃去非贴壁细胞，以后每3-4天换液一次，当细胞达到70％-80％融合时，按照12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1，重复上述操作进行传代培养过程，将传至P3及以上的细胞用于后续实验；

d、干细胞成膜

将步骤c中的P3细胞培养瓶放入专用的冷冻离心机中，1-15℃，800-1500g离心10-90min，低温状态下缓慢将液体倒出，保留底部离心沉淀物，剖开细胞培养瓶，在无菌条件下采用无菌PE膜覆盖至沉淀物上方表面，迅速将培养瓶颠倒，使PE膜位于最底部，缓慢移动PE膜使其连同沉淀物从培养瓶壁上脱离，立即对脱离表面覆盖无菌PE膜，即为成膜产品。

本发明的有益效果是：第一，本发明培养基各组成成分都可直接采购市售产品，易于实现；第二，本发明成膜方法利用胶原蛋白本身的溶解性质，将其进行低温离心成膜，操作成本、技术要求低，利于大规模生产；第三，本发明最终获得的干细胞生物补片免疫相容性高，不良反应少，膜厚度薄且厚度根据温度和离心时间可控，并且由于本发明将干细胞嵌入了生物补片膜内，移植后随着基质被机体吸收而缓慢释放干细胞，因而起效时间更长，较普通培养吸附制备的干细胞生物补片修复卵巢的效果更好优。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。

实施例1

培养基配制：根据DMEM/F12说明书，将一袋培养基倒入容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器，加注射用水(温度20-30℃)到950ml，轻微搅拌溶解，加入碳酸氢钠、青霉素，轻微搅拌溶解后加注射水至1L，用1mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH至7.5，加入胎牛血清使终浓度为60μl/ml，加入表皮生长因子使终浓度为45ng/ml，加入碱性成纤维细胞生长因子使终浓度为35ng/ml，加入维生素A使终浓度为0.5ng/ml、维生素B1使终浓度为1.2ng/ml、维生素C使终浓度为16ng/ml、维生素E使终浓度为3ng/ml，轻微搅拌溶解后，过0.22μm膜除菌，加入无菌脱毒Ⅲ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白，使Ⅲ型胶原蛋白终浓度为55μg/ml，使Ⅳ型胶原蛋白终浓度为245μg/ml，二者综合终浓度为300ug/ml。

干细胞分离和培养：用磷酸盐缓冲液漂洗脐带去除残留血液，将组织剪碎；加入6倍于剪碎组织体积的磷酸盐缓冲液，加入1/2该总体积的II型胶原酶在37℃下搅拌消化75min，过滤；将磷酸盐缓冲液和胰酶加入未消化完全的组织块中继续消化，37℃搅拌消化35min，血清终止胰酶的作用，过滤使细胞悬液和未消化完全的组织块分开；在所有收集的细胞悬液中加入等量磷酸盐缓冲液混匀，缓慢加到Ficoll分离液上，900g离心15min，取界面云雾状细胞层加入细胞基础培养基，洗涤4次，加入本发明培养基将细胞吹打成单细胞悬液接种于100ml培养瓶中。将上述细胞在37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养2天后弃去非贴壁细胞，以后每3天换液一次，当细胞达到70％融合时，按照12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1，重复上述操作进行传代培养过程，将传至P3及以上的细胞用于后续实验。

成膜：将步骤c中的P3细胞培养瓶放入专用的冷冻离心机中，4℃，1200g离心35min，低温状态下缓慢将液体倒出，保留底部离心沉淀物，剖开细胞培养瓶，在无菌条件下采用无菌PE膜覆盖至沉淀物上方表面，迅速将培养瓶颠倒，使PE膜位于最底部，缓慢移动PE膜使其连同沉淀物从培养瓶壁上脱离，立即对脱离表面覆盖无菌PE膜，即为成膜产品，不采用干燥处理，厚度为0.12mm。

实施例2

培养基配制：根据MEM说明书，向容器内加超纯水950ml，将一袋培养基倒入容器中，用超纯水将袋内残留培养基洗下，并入容器，搅拌溶解，加入碳酸氢钠、HEPES、青霉素，轻微搅拌溶解后加纯化水至1L，用1mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH至7.2，加入胎牛血清使终浓度为60μl/ml，加入表皮生长因子使终浓度为35ng/ml，加入碱性成纤维细胞生长因子使终浓度为20ng/ml，加入维生素B1使终浓度为2ng/ml、维生素C使终浓度为25ng/ml、维生素E使终浓度为5ng/ml，轻微搅拌溶解后，过0.22μm膜除菌，加入无菌脱毒Ⅲ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白，使Ⅲ型胶原蛋白终浓度为105μg/ml，使Ⅳ型胶原蛋白终浓度为105μg/ml，二者综合终浓度为210μg/ml。

干细胞分离和培养：用磷酸盐缓冲液漂洗脐带去除残留血液，将组织剪碎；加入6倍于剪碎组织体积的磷酸盐缓冲液，加入1/3该总体积的II型胶原酶在37℃下搅拌消化80min，过滤；将磷酸盐缓冲液和胰酶加入未消化完全的组织块中继续消化，37℃搅拌消化40min，血清终止胰酶的作用，过滤使细胞悬液和未消化完全的组织块分开；在所有收集的细胞悬液中加入等量磷酸盐缓冲液混匀，缓慢加到Ficoll分离液上，900g离心20min，取界面云雾状细胞层加入细胞基础培养基，洗涤3次，加入本发明培养基将细胞吹打成单细胞悬液接种于100ml培养瓶中。将上述细胞在37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养3天后弃去非贴壁细胞，以后每3天换液一次，当细胞达到75％融合时，按照12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1，重复上述操作进行传代培养过程，将传至P3及以上的细胞用于后续实验。

成膜：将步骤c中的P3细胞培养瓶放入专用的冷冻离心机中，2℃，1300g离心25min，低温状态下缓慢将液体倒出，保留底部离心沉淀物，剖开细胞培养瓶，在无菌条件下采用无菌PE膜覆盖至沉淀物上方表面，迅速将培养瓶颠倒，使PE膜位于最底部，缓慢移动PE膜使其连同沉淀物从培养瓶壁上脱离，立即对脱离表面覆盖无菌PE膜，即为成膜产品，不采用干燥处理，厚度为0.17mm。

对比例1

培养基配制：根据DMEM/F12说明书，将一袋培养基倒入容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器，加注射用水(温度20-30℃)到950ml，轻微搅拌溶解，加入碳酸氢钠、青霉素，轻微搅拌溶解后加注射水至1L，用1mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH至7.5，加入胎牛血清使终浓度为60μl/ml，加入表皮生长因子使终浓度为45ng/ml，加入碱性成纤维细胞生长因子使终浓度为35ng/ml。

干细胞分离和培养：用磷酸盐缓冲液漂洗脐带去除残留血液，将组织剪碎；加入6倍于剪碎组织体积的磷酸盐缓冲液，加入1/2该总体积的II型胶原酶在37℃下搅拌消化75min，过滤；将磷酸盐缓冲液和胰酶加入未消化完全的组织块中继续消化，37℃搅拌消化35min，血清终止胰酶的作用，过滤使细胞悬液和未消化完全的组织块分开；在所有收集的细胞悬液中加入等量磷酸盐缓冲液混匀，缓慢加到Ficoll分离液上，900g离心15min，取界面云雾状细胞层加入细胞基础培养基，洗涤4次，加入本发明培养基将细胞吹打成单细胞悬液接种于100ml培养瓶中。将上述细胞在37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养2天后弃去非贴壁细胞，以后每3天换液一次，当细胞达到70％融合时，按照12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1，重复上述操作进行传代培养过程，将传至P3及以上的细胞用于后续实验。

采用北京佰仁医疗科技有限公司生产神经外科生物补片(国械注准20173464401)，神经外科生物补片由取自于牛心包组织，经化学改性处理制成，呈浅黄色，厚度为0.2--0.6mm，加入P3干细胞培养液37℃孵育12h。

对比例2

培养基配制：根据MEM说明书，向容器内加超纯水950ml，将一袋培养基倒入容器中，用超纯水将袋内残留培养基洗下，并入容器，搅拌溶解，加入碳酸氢钠、HEPES、青霉素，轻微搅拌溶解后加纯化水至1L，用1mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH至7.2，加入胎牛血清使终浓度为60μl/ml，加入表皮生长因子使终浓度为35ng/ml，加入碱性成纤维细胞生长因子使终浓度为20ng/ml。

干细胞分离和培养：用磷酸盐缓冲液漂洗脐带去除残留血液，将组织剪碎；加入6倍于剪碎组织体积的磷酸盐缓冲液，加入1/2该总体积的II型胶原酶在37℃下搅拌消化75min，过滤；将磷酸盐缓冲液和胰酶加入未消化完全的组织块中继续消化，37℃搅拌消化35min，血清终止胰酶的作用，过滤使细胞悬液和未消化完全的组织块分开；在所有收集的细胞悬液中加入等量磷酸盐缓冲液混匀，缓慢加到Ficoll分离液上，900g离心15min，取界面云雾状细胞层加入细胞基础培养基，洗涤4次，加入本发明培养基将细胞吹打成单细胞悬液接种于100ml培养瓶中。将上述细胞在37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养2天后弃去非贴壁细胞，以后每3天换液一次，当细胞达到70％融合时，按照12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1，重复上述操作进行传代培养过程，将传至P3及以上的细胞用于后续实验。

采用北京大清生物技术有限公司生产的瑞拜善生物疝修补片(国械注准20163461387)，补片由猪小肠粘膜下层组成，加入P3干细胞培养液37℃孵育12h。

将实施例1、对比例1和对比例2获得的最终产品，对注射环磷酰胺造成卵巢早衰的大鼠模型，进行补片移植，将以上三款最终产品剪裁为0.5x0.5cm方片，移植与大鼠模型卵巢被膜下，分别于7d、14d、28d采取性激素水平检测和卵巢指数检测。性激素水平采取血液标本离心取上清液，用化学发光法进行激素测定；卵巢指数检测为取出卵巢后，采用电子天平精确称重并计算，卵巢指数＝卵巢湿重(mg)/体重(g)x100％，对照组为正常大鼠，未进行环磷酰胺注射。

实验结果：

每组实验例数30例，性激素水平实验结果如表一所示：

表一 性激素水平比较

每组实验例数30例，体重、卵巢指数实验结果如表二所示：

表二 各组体重、卵巢指数比较

由以上实验结果，分析发现，实施例1组在恢复大鼠激素水平以及体重方面，要优于对比例1和对比例2，并且修复持久性要优于对比例1和对比例2。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种干细胞成膜培养基，其特征在于：包括细胞基础培养基、胎牛血清、生长因子、附着骨架材料和维生素。

2.根据权利要求1所述的一种干细胞成膜培养基，其特征在于：所述细胞基础培养基可以是DMEM、α-MEM、F12、DMEM/F12和IMEM等中的任意一种或其任意组合。

3.根据权利要求1所述的一种干细胞成膜培养基，其特征在于：所述胎牛血清的终浓度为1-100μl/ml。

4.根据权利要求1所述的一种干细胞成膜培养基，其特征在于：所述生长因子为表皮生长因子和所述碱性成纤维细胞生长因子，所述表皮生长因子的终浓度为1-100ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为1-100ng/ml。

5.根据权利要求1所述的一种干细胞成膜培养基，其特征在于：所述附着骨架材料为Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白中的一种或其任意组合，所述附着骨架材料的终浓度为10-500μg/ml。

6.根据权利要求1所述的一种干细胞成膜培养基，其特征在于：所述维生素为维生素A、维生素B1、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素E种的一种或其任意组合，维生素A的终浓度为0-50ng/ml，维生素B1的终浓度为0-20ng/ml，维生素B6的终浓度为0-20ng/ml，维生素B12的终浓度为0-20ng/ml，维生素C的终浓度为0-100ng/ml，维生素E的终浓度为0-60ng/ml。

7.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的一种干细胞成膜培养基在干细胞成膜培养中的应用。

8.根据权利要求3所述的一种干细胞成膜培养基在干细胞成膜培养中的应用，其特征在于包含以下步骤：

a、干细胞成膜培养基的配制

在超净工作台内配制细胞基础培养基，调节pH，加入胎牛血清、青霉素/链霉素、生长因子维生素，混匀后膜过滤除菌，再加入附着骨架材料；

b、干细胞的分离

在本发明中，所述干细胞为脐带来源的间充质干细胞，而且是具有能够分化为脂肪组织、软骨组织或骨组织的未分化细胞；用磷酸盐缓冲液漂洗脐带去除残留血液，将组织剪碎；加入6倍于剪碎组织体积的磷酸盐缓冲液，加入1/2-1/3该总体积的II型胶原酶在37℃下搅拌消化75-80min，过滤；将磷酸盐缓冲液和胰酶加入未消化完全的组织块中继续消化，37℃搅拌消化35-40min，血清终止胰酶的作用，过滤使细胞悬液和未消化完全的组织块分开；在所有收集的细胞悬液中加入等量磷酸盐缓冲液混匀，缓慢加到Ficoll分离液上，900g离心10-20min，取界面云雾状细胞层加入细胞基础培养基，洗涤3-5次，加入本发明培养基将细胞吹打成单细胞悬液接种于100ml培养瓶中；

c、干细胞的培养

将上述的细胞在37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养2-3天后弃去非贴壁细胞，以后每3-4天换液一次，当细胞达到70％-80％融合时，按照12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1，重复上述操作进行传代培养过程，将传至P3及以上的细胞用于后续实验；

d、干细胞成膜

将步骤c中的P3细胞培养瓶放入专用的冷冻离心机中，1-15℃，800-1500g离心10-90min，低温状态下缓慢将液体倒出，保留底部离心沉淀物，剖开细胞培养瓶，在无菌条件下采用无菌PE膜覆盖至沉淀物上方表面，迅速将培养瓶颠倒，使PE膜位于最底部，缓慢移动PE膜使其连同沉淀物从培养瓶壁上脱离，立即对脱离表面覆盖无菌PE膜，即为成膜产品。