CN112941015B - 一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的添加剂及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的添加剂及方法，包括组分一和组分二，所述组分一包括SU6656、Retinoic acid、CHIR99021、hEGF和NKH477，所述组分二包括BMP4和抗坏血酸，所述组分一用于诱导多能干细胞分化初级角质细胞阶段，所述组分二用于初级角质细胞分化成熟角质细胞阶段。本发明的添加剂使用后可以在较短时间内获得由诱导多功能干细胞来源的成熟内皮细胞，此方法获得的初级角质细胞和成熟角质细胞纯度好、活率高、功能完善，具有潜在的临床应用价值。

Description

一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的添加剂及方法
技术领域
本发明属于细胞工程技术领域，具体来说是一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的添加剂及方法。
背景技术
目前皮肤作为一个最大的人体器官，也是人体第一道屏障，具有阻止病原菌的入侵、防止机体脱水、调节体温和提供感知等多种作用。角质细胞位于复层上皮最深的基底层，有时被称为基底细胞或基底角质形成细胞。已知表皮中95％的细胞为角质细胞，鳞状角质形成细胞也存在于口腔和食道的粘膜，以及角膜、结膜和生殖器上皮细胞等也属于角质细胞。角质细胞维持表皮分化的各个阶段，并负责与皮肤的神经形成紧密连接(Tightjunctions)。它们还能支持真皮、表皮和淋巴细胞的朗格汉斯细胞(Langerhans cells)。
角质形成细胞除了其结构作用外，还在免疫系统功能中发挥作用。皮肤作为第一道防线，角质形成细胞是生物体与其环境之间的屏障。除防止毒素和病原体进入生物体体内外，它们还防止体内水分、热量和其他重要成分的流失。同时，负责在没有损伤的情况下分泌抑制性细胞因子，刺激炎症应激，并激活朗格汉斯细胞(Langerhans cells)对损伤的反应。当皮肤感染时，朗格汉斯细胞作为抗原提呈细胞，是第一批处理微生物抗原从皮肤破裂位点进入身体的细胞。
在生物体中，角质形成细胞依靠表皮基底层中的干细胞进行替代和补充。角质细胞产生的化合物和其他蛋白质对于皮肤最外层角质层的完整性十分关键，可是角质形成细胞是死亡的鳞状细胞，不具有繁殖能力。一旦角质细胞到达角质层，就会被角质化，形成坚韧的皮肤即角质层，被认为具有防御微生物入侵的主要作用，同时也作为免疫反应的激活剂。
表皮中具有抗原提呈作用的细胞类群，能够在适当的条件下激活T淋巴细胞，以适应细胞和体液免疫反应。其中发挥主要作用的是朗格汉斯细胞，但角质形成细胞在特殊条件下也会发挥作用。
当前，角质形成细胞已可被单独或与其他成分一起作为皮肤植入物。因此，鉴于角质细胞形成物理屏障的作用和产生抗菌肽的能力而被广泛用于细胞治疗。大面积的烧伤和如糖尿病、血管病、肥胖、慢性伤口损伤等疾病因为缺乏有效的治疗手段、治疗效果差以及花费巨大等原因已成为全球性难题。细胞移植治疗对上述问题来讲是当前最为及时和有效的一种治疗方式，通常采用患者自身角质干细胞进行体外增殖，以获得足够量的细胞。然而，此方式最大的弊端在于，获得足够多的干细胞通常需要较长的周期，而这么长的周期可能会导致患者机体脱水和感染。此外，还存在免疫排斥反应的问题，移植的表皮细胞可能会被快速排斥掉。
为了克服这样的难题，初期有研究者尝试提出使用惰性或生物合成的基质，但是这些都会因为快速的移植排斥反应和因为含有异种胶原和成体异源皮肤细胞导致的疾病而被放弃。多能干细胞，包括胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和诱导多能干细胞(induced Plurpotent Stem Cells，iPSCs)为该种治疗模式带来了希望。因为多能干细胞可以无限增殖，而且具有可以分化为任意细胞类型的多能性，所以被广泛用于开发临床可用的细胞治疗产品。尽管已有报道表明胚胎干细胞可以分化成角质细胞，但是其增殖潜能较低，不能大规模复制。后来，一些细胞因子短期诱导的方法也被用于将hESCs向角质细胞分化。然而产生有功能的基底角质细胞仍然有一定难度。并且，鉴于hiPSCs对比hESCs的伦理上的优势，从iPSCs来源的角质细胞的临床应用和转化更具有意义。
发明内容
1.发明要解决的技术问题
本发明的目的在于解决现有的由多能干细胞诱导分化角质细胞的方法中存在制备周期长、获得产率和纯度低、以及获得细胞功能不全等技术问题。
2.技术方案
为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
本发明的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的添加剂，包括组分一和组分二，所述组分一包括SU6656、Retinoic acid、CHIR99021、hEGF和NKH477，所述组分二包括BMP4和抗坏血酸，所述组分一用于诱导多能干细胞分化初级角质细胞阶段，所述组分二用于初级角质细胞分化成熟角质细胞阶段。
优选的，所述SU6656的浓度为3-10μM、视黄酸Retinoic acid(RA)浓度为0.5-2μM、CHIR99021浓度为5-20mM、hEGF浓度为8-16ng/mL，NKH477浓度为0.05-0.2mM。
优选的，所述第二阶段培养液中BMP4浓度为0.05-0.8nM、抗坏血酸浓度为0.05-2μM。
优选的，所述SU6656的浓度为6μM、视黄酸Retinoic acid(RA)浓度为1μM、CHIR99021浓度为10mM、hEGF浓度为12ng/mL，NKH477浓度为0.1mM.。
优选的，所述BMP4浓度为0.6nM、抗坏血酸浓度为1μM。
一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的添加剂的使用方法，将组分一和组分二分别添加到DMEM/F12基础培养液中，并加入KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇，配置得到第一阶段培养液和第二阶段培养液，接种诱导多能干细胞，将诱导多能干细胞接种于培养板上；将诱导多能干细胞放置于第一阶段培养液中进行分化得到初级角质细胞；将初级角质细胞放置于第二阶段培养液进行分化得到成熟角质细胞。
优选的，所述接种诱导多能干细胞具体为将贴壁培养的诱导多功能干细胞消化为单细胞，单细胞计数后，按照3～6万细胞/cm2密度接种于提前一小时经基质胶Matrigel包被的培养板上。
优选的，所述诱导多功能干细胞由健康人外周血单核细胞重编程获得，所述诱导多功能干细胞为8～25代细胞，所述培养板使用基质胶Matrigel的浓度为8-12mg/mL。
优选的，所述培养板使用基质胶Matrigel包被具体为使用DMEM培养基稀释Matrigel，按照1～3mg/cm2的浓度于37℃条件包被1小时，使用前弃掉孵育板子的配液。
优选的，具体为将接种有诱导多功能干细胞的培养板放置于第一阶段培养液中，并置于温度为35～39℃、CO2含量3～7％的条件下进行培养6或7天，每隔1天更换一次培养液，并在培养的前24小时内加入ROCK抑制剂；当初级角质细胞培养至聚合度为50％时，将培养液换成第二阶段培养液，并置于温度为35～39℃、CO2含量3～7％的条件下进行培养6天，每天更换一次培养液。
3.有益效果
采用本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的添加剂及方法，包括组分一和组分二，所述组分一包括SU6656、Retinoic acid、CHIR99021、hEGF和NKH477，所述组分二包括BMP4和抗坏血酸，所述组分一用于诱导多能干细胞分化初级角质细胞阶段，所述组分二用于初级角质细胞分化成熟角质细胞阶段。将组分一和组分二分别添加到DMEM/F12基础培养液中，并加入KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇，配置得到第一阶段培养液和第二阶段培养液，接种诱导多能干细胞，将诱导多能干细胞接种于培养板上；将诱导多能干细胞放置于第一阶段培养液中进行分化得到初级角质细胞；将初级角质细胞放置于第二阶段培养液进行分化得到成熟角质细胞。本发明的添加剂使用后可以在较短时间内获得由诱导多功能干细胞来源的成熟内皮细胞，此初级角质细胞和成熟角质细胞纯度好、活率高、功能完善，具有潜在的临床应用价值。
附图说明
图1为本发明的角质细胞制备流程图；
图2为本实施例2的流式细胞术检测表面标志物(K18)结果示意图；
图3为本实施例3的流式细胞术检测表面标志物(K14)结果示意图；
图4为本发明的人诱导多能干细胞形态图代表例；
图5为本发明的初级角质细胞形态图代表例；
图6为本发明的成熟角质细胞形态图代表例；
图7为实施例4-7的初级角质细胞流式细胞术检测表面标志物(K18，p63)结果示意图；
图8为实施例8-11的成熟角质细胞流式细胞术检测表面标志物(K14)结果示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述，附图中给出了本发明的若干实施例，但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例，相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明；本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的添加剂，包括组分一和组分二，所述组分一包括SU6656、Retinoic acid、CHIR99021、hEGF和NKH477，所述组分二包括BMP4和抗坏血酸，所述组分一用于诱导多能干细胞分化初级角质细胞阶段，所述组分二用于初级角质细胞分化成熟角质细胞阶段。
所述SU6656的浓度为3-10μM、视黄酸Retinoic acid(RA)浓度为0.5-2μM、CHIR99021浓度为5-20mM、hEGF浓度为8-16ng/mL、NKH477浓度为0.05-0.2mM。
所述第二阶段培养液中BMP4浓度为0.05-0.8nM、抗坏血酸浓度为0.05-2μM。
所述SU6656的浓度为6μM、视黄酸Retinoic acid(RA)浓度为1μM、CHIR99021浓度为10mM、hEGF浓度为12ng/mL、NKH477浓度为0.1mM.。
所述BMP4浓度为0.6nM、抗坏血酸浓度为1μM。
本实施例的添加剂的使用方法如下，将组分一和组分二分别添加到DMEM/F12基础培养液中，并加入KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇，配置得到第一阶段培养液和第二阶段培养液，接种诱导多能干细胞，将诱导多能干细胞接种于培养板上；将诱导多能干细胞放置于第一阶段培养液中进行分化得到初级角质细胞；将初级角质细胞放置于第二阶段培养液进行分化得到成熟角质细胞。
其中第一阶段培养液具体成分如下表：
Figure BDA0002984439820000061
Figure BDA0002984439820000071
其中第二阶段培养液具体成分如下表：
试剂 优选浓度 供应商
DMEM/F12 1：1 Life Technologies，USA
KOSR 20％ Life Technologies，USA
非必须氨基酸NEAA 1× Life Technologies，USA
L-Glutamine 1mM Life Technologies，USA
β-巯基乙醇 0.1mM Sigma，USA
BMP4 0.6nM R&D system，UK
Ascorbic acid 1μM Sigma，USA
本实施例的培养液的使用方法如下：
在体外培养诱导多能干细胞(iPSCs)至10代后，培养在细胞培养板中的汇聚度达到70％的细胞，用Accutase(STEMCELL Technologies)消化成单细胞，按照(30000个细胞/cm2)的密度将细胞种植在预先包被过Martrigel(BD)的12孔板中，并添加ROCK inhibitor(10μM)(Day0)。
24小时后(Day1)，换成1mL/Well第一阶段培养液进行初级角质细胞分化，每2天换液，待细胞生长至70％时(约第6天，Day6)，换成1mL/Well KGM培养基进行培养，逐天换液，直到细胞生长至80％-90％的汇聚度(约第12天，Day12)，细胞表现出角质细胞的形态，收取部分细胞进行流式检测，得到的表达Cytokeratin18(K18)标志的初级角质细胞。
初级角质细胞进行消化后传代，按照1:3的比例，重新铺在新的Matrigel包被的培养板上，每天更换角质细胞增殖培养基(KEM)，初级角质细胞可以在这种情况下增殖10代以上，并且持续表达K18(效率>99％)。
继续分化至成熟角质细胞表达K18标志物的初级角质细胞经过继续分化，得到成熟的表达K14的成熟角质细胞。
方法：
(1)将上述获得的初级角质细胞培养至聚合度为50％时，将培养基换成第二阶段培养液，每天更换1.5mL/Well培养基，培养6天。
(2)第7天时将培养基换成2mL/Well的KGM培养基。(K14是许多表皮组织以及真皮组织基底层细胞的标志物)。此外，转录因子p63调控着表皮组织再生能力，在表皮分化的整个过程中都有表达。收集部分细胞进行流式检测，得到强表达K14的成熟角质细胞。
使用本发明方法的优势在于：操作简单，效率高，可以在较短时间(12天左右)获得大量初级角质细胞，且角质细胞形态均一，表现出典型的角质细胞所具有的鹅卵石形。
对培养得到的初级角质细胞和成熟角质细胞经过流式细胞术(使用角质细胞特征性标志物)进行细胞类型鉴定确认后，即可超低温(液氮)储存或用于基础研究甚至临床使用。
本发明的积极进步效果在于：
首先，培养液成分简单，配置方便，且不涉及动物源性成分，既能控制并减少成本，又对所分化角质细胞的安全性有保证。
其次，培养方法高效可靠，通过改进的培养液，能够获得高产量、高纯度的角质细胞。
而且，本发明的培养方法与其它方法相比具有明显的优势，具体表现在：培养时间短(21天左右)，具有临床使用及时性；培养过程简单，只需更换两种分化培养基即可完成；培养效率高，具有95％以上的细胞纯度；诱导过程清晰透明，诱导产物高纯度。
实施例2
本实施例为测试第一阶段培养液中不同浓度的SU6656、Retinoic acid、CHIR99021、hEGF和NKH477对初级角质细胞的诱导有何影响，基本成分与实施例1的第一阶段培养液相同，其不同之处在于本实施例采用不同浓度的SU6656、Retinoic acid、CHIR99021、hEGF和NKH477分别进行测试不同浓度下对初级角质细胞的诱导会产生什么影响，具体含量和过程如下：
不同浓度的SU6656对照试验组分含量表
Figure BDA0002984439820000091
Figure BDA0002984439820000101
不同浓度的Retinoic acid对照试验组分含量表
Figure BDA0002984439820000102
不同浓度的CHIR99021对照试验组分含量表
Figure BDA0002984439820000103
不同浓度的hEGF对照试验组分含量表
Figure BDA0002984439820000104
Figure BDA0002984439820000111
不同浓度的NKH477对照试验组分含量表
Figure BDA0002984439820000112
将上述5组共计25种溶液均按照如下方法进行使用：
1)iPSCs的接种
取PBMC来源的第20代人诱导多能干细胞(iPSCs)消化成单细胞，离心后，用添加有ROCK inhibitor(10μM)的mTeSR-1培养基悬浮，按照30000个细胞/cm2的密度接种到预先包被过Matrigel的12孔板中(12孔)。放入37℃5％CO2的培养箱中培养24小时。
2)不同浓度诱导剂对初级角质细胞的诱导
将步骤(1)中培养24小时后的12孔板取出，吸弃培养基，换上新鲜的1mL/Well基础培养基(DMEM/F12基础培养液、KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇等基础组分)，并加入上述共计25种溶液。每两天换液，待细胞生长至汇聚度约70％时(约第6天)，换成1mL/Well KGM培养基，逐天换液，直至细胞生长至80％-90％的汇聚度(约第12天)，细胞出现角质细胞的形态，收取部分细胞进行流式检测，检测结果如图2所示。
由图2可知，SU6656浓度为6μM时对初级角质细胞的诱导效果最佳，Retinoic acid浓度为1μM时对初级角质细胞的诱导效果最佳，CHIR99021浓度为10mM时对初级角质细胞的诱导效果最佳，hEGF浓度为12ng/mL时对初级角质细胞的诱导效果最佳，NKH477浓度为0.1mM时对初级角质细胞的诱导效果最佳。
将实施例2所得的初级角质细胞进行特征性蛋白(K18)表达及纯度的鉴定，方法如下：
1)固定细胞
将培养于12孔板的初级角质细胞使用1×DPBS(0.5mL/孔)润洗一次后加0.5～1mLAccutase消化液，置于37℃消化3～5分钟至细胞分离；然后加2～4倍量DPBS稀释消化液，200～300g离心并弃掉消化液和DPBS。细胞沉淀使用1mL90％的冷甲醇固定。
2)一抗孵育
将细胞样本室温下300rcf离心2分钟，弃上清液。向细胞样本中加入5mL1×PBS，振荡混匀。300rcf离心3分钟，弃上清，加入FACS buffer，吹打混匀，使细胞浓度为2*107个/mL。向流式细胞仪专用管中分别加入50μL相应样本细胞。向样本细胞中加入50μL对应的一抗，吹打5次混匀，室温避光孵育30分钟(每10分钟震荡混匀一次)。向抗体孵育后的细胞中各加入2mL FACS buffer，使用漩涡混合器振荡混匀。一抗的种类及体积见下表。
抗体的种类及体积
Figure BDA0002984439820000121
3)二抗孵育
室温下300rcf离心2分钟。弃上清，向样本细胞中加入50μL对应的二抗，吹打5次混匀，室温避光孵育15分钟(根据一抗来源选择对应的二抗)。各加入300μL FACS buffer，使用漩涡混合器振荡混匀。选择对应的流式细胞仪通道检测每个标志物的阳性率。
图2为实施例2所得初级细胞的K18的流式细胞鉴定结果图，可知当加入一定浓度的SU6656、视黄酸Retinoic acid(RA)、CHIR99021、hEGF和NKH477时，能获得初级角质细胞，其特征性蛋白K18表达量开始表达，而对照组不表达K18。当SU6656的浓度为3-10μM，优选为6μM；视黄酸Retinoic acid(RA)浓度为0.5-2μM，优选为1μM；CHIR99021浓度为5-20mM，优选为10mM；hEGF浓度为8-16ng/mL，优选为12ng/mL和NKH477浓度为0.05-0.2mM，优选为0.1mM)所得初级角质细胞的特征性蛋白K18表达量最佳。
实施例3
本实施例在实施例2的基础上，分别选择SU6656、Retinoic acid、CHIR99021、hEGF和NKH477的最佳浓度，并按照实施例2的方式培育得到初级角质细胞，并将初级角质细胞换上新鲜的1mL/Well基础培养基(DMEM/F12基础培养液、KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇等基础组分)，并加入不同浓度的BMP4和抗坏血酸等成熟角质细胞分化特异性组分，测试不同浓度的BMP4和抗坏血酸对成熟角质细胞分化特异性组分的影响。
本实施例采用的第一阶段培养液的成分如下：
Figure BDA0002984439820000131
Figure BDA0002984439820000141
本实施例采用的第二阶段培养液中采用不同浓度的BMP4和抗坏血酸测试BMP4和抗坏血酸对成熟角质细胞的诱导的影响，具体含量和过程如下：
不同浓度的BMP4对照试验组分含量表
序号/组分 BMP4 抗坏血酸
1 0nM 0.5μM
2 0.05nM 0.5μM
3 0.2nM 0.5μM
4 0.4nM 0.5μM
5 0.6nM 0.5μM
6 0.8nM 0.5μM
不同浓度的BMP4对照试验组分含量表
Figure BDA0002984439820000142
Figure BDA0002984439820000151
将上述2组共12种培养液分别进行如下培养：
在实施例2的基础上，将最优选诱导剂浓度诱导的初级角质细胞换上新鲜的1mL/Well基础培养基(DMEM/F12基础培养液、KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇等基础组分)，并加入不同浓度的BMP4和抗坏血酸等成熟角质细胞分化特异性组分。将实施例2步骤(2)中的初级角质细胞培养至聚合度为50％时，更换培养基为不同浓度诱导剂的成熟角质细胞分化培养基，每天更换1.5mL/Well培养基，持续培养6天。第7天时将培养基换成2mL/Well的KGM培养基。
将实施例3得到的成熟角质细胞收取部分细胞进行流式检测，检测结果如图3所示，由图3可知，BMP4浓度为0.6nM时对成熟角质细胞的诱导效果最佳，抗坏血酸浓度为1μM时对成熟角质细胞的诱导效果最佳。
实施例3所得的成熟角质细胞进行特征性蛋白(K14)表达及纯度的鉴定，方法如下：
1)固定细胞
将培养于12孔板的成熟角质细胞使用1×DPBS(0.5mL/孔)润洗一次后加0.5～1mLAccutase消化液，置于37℃消化3～5分钟至细胞分离；然后加2～4倍量DPBS稀释消化液，200～300g离心并弃掉消化液和DPBS。细胞沉淀使用1mL90％的冷甲醇固定。
2)一抗孵育
将细胞样本室温下300rcf离心2分钟，弃上清液。向细胞样本中加入5mL1×PBS，振荡混匀。300rcf离心3分钟，弃上清，加入FACS buffer，吹打混匀，使细胞浓度为2*107个/mL。向流式细胞仪专用管中分别加入50μL相应样本细胞。向样本细胞中加入50μL对应的一抗，吹打5次混匀，室温避光孵育30分钟(每10分钟震荡混匀一次)。向抗体孵育后的细胞中各加入2mL FACS buffer，使用漩涡混合器振荡混匀。一抗的种类及体积见下表。
抗体的种类及体积
Figure BDA0002984439820000161
3)二抗孵育
室温下300rcf离心2分钟。弃上清，向样本细胞中加入50μL对应的二抗，吹打5次混匀，室温避光孵育15分钟(根据一抗来源选择对应的二抗)。各加入300μL FACS buffer，使用漩涡混合器振荡混匀。选择对应的流式细胞仪通道检测每个标志物的阳性率。
图3为实施例3所得初级细胞的K14的流式细胞鉴定结果图，可知实施例2在BMP4浓度为0.05-0.8nM，优选为0.6nM；和抗坏血酸浓度为0.05-2μM，优选为1μM时所得成熟角质细胞的特征性蛋白K14表达量最佳。
实施例4-7
实施例4-7具体为重复下列操作4次：
(1)iPSCs的接种
取PBMC来源的第20代人诱导多能干细胞(iPSCs)消化成单细胞，离心后，用添加有ROCK inhibitor(10μM)的mTeSR-1培养基悬浮，按照30000个细胞/cm2的密度接种到预先包被过Matrigel的12孔板中(12孔)。放入37℃5％CO2的培养箱中培养24小时。
(2)初级角质细胞的诱导
在实施例2的基础上，选择优选浓度诱导剂，将步骤(1)中培养24小时后的12孔板取出，吸弃培养基，换上新鲜的1mL/Well第一阶段培养液。每两天换液，待细胞生长至汇聚度约70％时(约第6天)，换成1mL/Well KGM培养基，逐天换液，直至细胞生长至80％-90％的汇聚度(约第12天)，细胞出现角质细胞的形态，收取部分细胞进行流式检测。
分别将实施例4-7所得的初级角质细胞进行特征性蛋白(p63，K18)表达及纯度的鉴定，方法如下：
1)固定细胞
将培养于12孔板的初级角质细胞使用1×DPBS(0.5mL/孔)润洗一次后加0.5～1mLAccutase消化液，置于37℃消化3～5分钟至细胞分离；然后加2～4倍量DPBS稀释消化液，200～300g离心并弃掉消化液和DPBS。细胞沉淀使用1mL90％的冷甲醇固定。
2)一抗孵育
将细胞样本室温下300rcf离心2分钟，弃上清液。向细胞样本中加入5mL1×PBS，振荡混匀。300rcf离心3分钟，弃上清，加入FACS buffer，吹打混匀，使细胞浓度为2*107个/mL。向流式细胞仪专用管中分别加入50μL相应样本细胞。向样本细胞中加入50μL对应的一抗，吹打5次混匀，室温避光孵育30分钟(每10分钟震荡混匀一次)。向抗体孵育后的细胞中各加入2mL FACS buffer，使用漩涡混合器振荡混匀。一抗的种类及体积见下表。
抗体的种类及体积
Figure BDA0002984439820000171
Figure BDA0002984439820000181
3)二抗孵育
室温下300rcf离心2分钟。弃上清，向样本细胞中加入50μL对应的二抗，吹打5次混匀，室温避光孵育15分钟(根据一抗来源选择对应的二抗)。各加入300μL FACS buffer，使用漩涡混合器振荡混匀。选择对应的流式细胞仪通道检测每个标志物的阳性率。
图7为实施例4-7所得初级细胞的K18和p63的流式细胞鉴定结果图，可知实施例4-7所得初级角质细胞的特征性蛋白K18和p63表达量在99％以上；可以说明使用本发明的培养液和培养方法所得的角质细胞生长均质，效率高。
实施例8-11
分别将实施例4-7得到的初级角质细胞进行下列操作得到实施例8-11
在实施例3的基础上，选择优选浓度诱导剂，并将实施例3-6的初级角质细胞转移到成熟角质细胞培养基中进行成熟角质细胞的分化培养。
将步骤实施例3-6步骤(2)中的初级角质细胞培养至聚合度为50％时，更换培养基为第二阶段培养液，每天更换1.5mL/Well培养基，持续培养6天。第7天时将培养基换成2mL/Well的KGM培养基。
将实施例8-11所得的成熟角质细胞进行特征性蛋白(K14)表达及纯度的鉴定。方法如下：
1)固定细胞
将培养于12孔板的成熟角质细胞使用1×DPBS(0.5mL/孔)润洗一次后加0.5～1mLAccutase消化液，置于37℃消化3～5分钟至细胞分离；然后加2～4倍量DPBS稀释消化液，200～300g离心并弃掉消化液和DPBS。细胞沉淀使用1mL90％的冷甲醇固定。
2)一抗孵育
将细胞样本室温下300rcf离心2分钟，弃上清液。向细胞样本中加入5mL1×PBS，振荡混匀。300rcf离心3分钟，弃上清，加入FACS buffer，吹打混匀，使细胞浓度为2*107个/mL。向流式细胞仪专用管中分别加入50μL相应样本细胞。向样本细胞中加入50μL对应的一抗，吹打5次混匀，室温避光孵育30分钟(每10分钟震荡混匀一次)。向抗体孵育后的细胞中各加入2mL FACS buffer，使用漩涡混合器振荡混匀。一抗的种类及体积见下表。
抗体的种类及体积
Figure BDA0002984439820000191
3)二抗孵育
室温下300rcf离心2分钟。弃上清，向样本细胞中加入50μL对应的二抗，吹打5次混匀，室温避光孵育15分钟(根据一抗来源选择对应的二抗)。各加入300μL FACS buffer，使用漩涡混合器振荡混匀。选择对应的流式细胞仪通道检测每个标志物的阳性率。
图8为实施例8-11所得初级细胞的K14的流式细胞鉴定结果图，可知实施例8-11所得成熟角质细胞的特征性蛋白K14表达量在95％以上；可以说明使用本发明的培养液和培养方法所得的角质细胞生长均质，效率高。
以上实施例的数据结果表明：使用本专利发明的培养液和分化方法，可以在较短时间内获得由诱导多功能干细胞来源的成熟内皮细胞，此初级角质细胞和成熟角质细胞纯度好、活率高、功能完善，具有潜在的临床应用价值。
在实施例4-11中，在初级角质细胞分化培养铺板前(D0)、和诱导分化后(D6)以及成熟角质细胞分化完成(D21)，将培养板置于显微镜下观察并拍照。
结果如图4、图5和图6所示：图4为诱导多功能干细胞，其具有典型的iPSC细胞形态，图5对应实施例4～7培养得到的初级角质细胞的细胞形态图；图6为实施例8～11培养得到的成熟角质细胞的细胞形态图。
以上所述实施例仅表达了本发明的某种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围；因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种基于诱导多能干细胞分化制备角质细胞的添加剂的使用方法，其特征在于：将组分一和组分二分别添加到DMEM/F12基础培养液中，并加入KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇，分别配置得到第一阶段培养液和第二阶段培养液，接种诱导多能干细胞，将诱导多能干细胞接种于培养板上；将诱导多能干细胞放置于第一阶段培养液中进行分化得到初级角质细胞；将初级角质细胞放置于第二阶段培养液进行分化得到成熟角质细胞。
所述组分一为SU6656、视黄酸、CHIR99021、hEGF和NKH477，所述组分二为BMP4和抗坏血酸，所述组分一用于诱导多能干细胞分化初级角质细胞阶段，所述组分二用于初级角质细胞分化成熟角质细胞阶段。
2.根据权利要求1所述的一种基于诱导多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：所述接种诱导多能干细胞具体为将贴壁培养的诱导多能干细胞消化为单细胞，单细胞计数后，按照3～6万细胞/cm2密度接种于提前一小时经基质胶包被的培养板上。
3.根据权利要求1所述的一种基于诱导多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：所述诱导多能干细胞由健康人外周血单核细胞重编程获得，所述诱导多能干细胞为8～25代细胞，所述培养板使用基质胶的浓度为8-12mg/mL。
4.根据权利要求2所述的一种基于诱导多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：所述培养板使用基质胶包被具体为使用DMEM培养基稀释基质胶，按照1～3mg/cm2的浓度于37℃条件包被1小时，使用前弃掉孵育板子的配液。
5.根据权利要求1所述的一种基于诱导多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：具体为将接种有诱导多能干细胞的培养板放置于第一阶段培养液中，并置于温度为35～39℃、CO2含量3～7％的条件下进行培养6或7天，每隔1天更换一次培养液，并在培养的前24小时内加入ROCK抑制剂；当初级角质细胞培养至聚合度为50％时，将培养液换成第二阶段培养液，并置于温度为35～39℃、CO2含量3～7％的条件下进行培养6天，每天更换一次培养液。
6.根据权利要求1所述的一种基于诱导多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：所述SU6656的浓度为3-10μM、视黄酸浓度为0.5-2μM、CHIR99021浓度为5-20mM、hEGF浓度为8-16ng/mL、NKH477浓度为0.05-0.2mM；所述组分二中BMP4浓度为0.05-0.8nM、抗坏血酸浓度为0.05-2μM。
7.根据权利要求6所述的一种基于诱导多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：所述SU6656的浓度为6μM、视黄酸浓度为1μM、CHIR99021浓度为10mM、hEGF浓度为12ng/mL、NKH477浓度为0.1mM。
8.根据权利要求6所述的一种基于诱导多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：所述BMP4浓度为0.6nM、抗坏血酸浓度为1μM。
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