CN112266898A - 结直肠癌类器官的培养方法和培养液 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种结直肠癌类器官的培养方法和培养液。本发明的培养基用自产Wnt‑3a、R‑Spondin1和Noggin的细胞系替代三种昂贵细胞因子的加入，对比文献中类器官培养基配方最大限度地节约了类器官培养的成本，且成功率达到90％以上。本发明的培养液，能够培养来源于患者结直肠来源的肿瘤组织。所述培养方法操作简便，五天即可传代，五天之内可不用频繁换液，也减少了操作的繁琐和节约了成本。

Description

结直肠癌类器官的培养方法和培养液

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，具体地涉及一种结直肠癌类器官的培养方法和培养液。

背景技术

癌症治疗的主要挑战是确定一种局部疾病是否会发展成恶性表型，以及如何根据疾病的类型和阶段进行最佳的“匹配”治疗。现在人们普遍认为，对于许多癌症来说，它们不再是一种单一类型的疾病，而是一组癌症类型，根据组织学病理分类，对药物的反应不同。多年来，基础癌症研究和抗癌药物开发利用原代癌细胞和体外培养的细胞系在组织培养皿中培养。虽然这种方法产生了许多目前使用的抗癌药物，但最近的研究发现，这种方法在体内模拟肿瘤生长效果不佳。在大多数情况下，二维(2D)培养,就像在培养皿中进行的培养，无法复制肿瘤的微环境：一个由基质细胞、细胞外基质(ECM)成分，和一个混合信号因子组成的复杂的空间，药物扩散动力学差异很大，2D有效的药物剂量对患者来说通常是无效的，细胞-细胞/细胞-基质的相互作用是不准确的。培养皿的细胞与分离肿瘤的组织有三个主要区别：表面形貌、表面硬度和2D而非3D的结构。因此，2D培养对细胞施加了选择性压力，这可能极大地改变细胞的分子和表型特性。实验室细胞培养和天然组织之间的这些差异导致许多药物在实验室最初有效，但在病人身上测试时却出乎意料地无效和/或有毒。

因此，为了在生理上提供一种比2D细胞培养更相关的选择，三维(3D)细胞培养被开发出来。通过考虑至关重要的细胞-细胞和细胞-ECM相互作用，3D培养允许细胞复制组织中存在的几个关键特征，包括形态、分化、极性，增殖率，基因表达谱和基因组谱，和肿瘤细胞异质性和营养和氧梯度。重要的是，3D细胞培养跨越了2D细胞培养和动物模型之间的鸿沟：3D细胞培养模型包含了生理上相关的相互作用，同时仍然能够方便地进行遗传操作、生化分析和成像。通过提供一个可复制的、可控的微环境来模拟体内条件，3D细胞培养已经成为一种有效的替代动物模型的方法。此外，由于能够创建三维设计微环境，3D细胞培养可以研究有机生命体中难以解决的问题。

自20世纪70年代首次以漂浮胶原凝胶的形式被使用以来，3D细胞培养系统已经有了很大的发展，目前仍在发展和改进中，其最终目标是在培养中再造整个器官。许多科学界的科学家已经贡献了工具和技术，如生物工程材料、纳米技术、微流体和3D生物打印，以在多个层次和尺度上精确地操纵和控制细胞微环境(其化学、几何和力学)。这些进展导致了无数的三维细胞培养系统的创造，这些系统主要是根据科学家的特殊需要而研发设计的。

结直肠癌是目前世界上癌症引发死亡的主要因素之一。据已有的报道发现，结直肠癌是全球第三大最常见的恶性肿瘤，预计到2030年，结直肠癌新增病例将超过220万，癌症死亡人数将达到110万。大约有20％的结肠癌病人在诊断时已为晚期，失去手术机会，导致结直肠癌患者死亡的主要原因是远端转移。目前阻碍临床转化的问题是许多癌症模型不能很好地重现患者肿瘤的异质性，导致各种化疗药、小分子抑制剂或者靶向药最终在临床实验中以失败告终。导致失败的主要原因是目前普遍使用的肿瘤细胞系模型和异种移植动物模型所存在的不足，例如，单层细胞培养缺乏多样化的细胞类型、空间组织性和体内整体微环境，无法模拟个体间的肿瘤异质性，而动物模型虽然能在一定程度上模拟体内的情形，且能反映各系统间的相互作用，但移植成功率低、培养周期长和成本高等缺点使其难以应用于临床。由此，兼具两者优势的类器官研究近年来成为一个新的研究热点。

类器官是由多种器官特异性细胞类型组成的三维培养体，可以重现其结构和基因表达谱，以及相应器官的一些关键特征和功能。类器官技术被评为2017年生命科学领域的年度技术。目前这项技术由于成本高，操作复杂和技术难度大和而并没有普及使用。因此，有需要开发一种低成本，简便并且成功率可低温冷藏的体外类器官培养方法。

发明内容

基于此，本发明的目的之一是提供一种类器官培养液,该培养液特别适合结直肠癌类器官的培养。

实现上述目的的技术方案如下。

类器官培养液，包括为含有45-55％的产Wnt-3a、R-Spondin1和Noggin的WRN细胞系条件培养基、50±5ng/mL EGF、500±5nM A8301、10±5μM SB202190、10±1μM Y-27632、1±0.25mM N-acetylcysteine、10±1nM Gastrin、1XB27、10±1mM Nicotinamide、2±0.1mMGlutamax、1±0.1mM HEPES的Advanced DMEM/F12培养液。

在其中一些实施例中，还包括有100±5U/mL的青霉素和链霉素。

在其中一些实施例中，所述产Wnt-3a、R-Spondin1和Noggin的WRN细胞系条件培养基的制备方法包括：解冻低代数的L-WRN细胞，在DMEM培养基中培养一天，然后换成加入G418(500μg/mL)和hygromycin(500μg/mL)的常规培养基至交汇；

在37℃TE消化3-5分钟，用常规培养基重悬，传代比率为1：4-6。

培养3-4天后至交汇后，将培养基换成原代培养基；培养24h后，离心收集上清；用同等体积的原代培养基继续培养，每隔22-26h，收集上清，培养三至五次，收集全部上清，然后加入等体积的原代培养基。

本发明的另一目的是还提供了一种结直肠癌类器官的培养方法。

实现上述目的的技术方案如下。

一种结直肠癌类器官的培养方法，包括以下步骤：

样本的取样和预处理：在结直肠癌患者手术样本的边缘突起实质部分剪切(优选为0.4g-1g)的组织，低温培养基保存送至实验室，清洗干净(优选为用大量的冷的含抗生素的PBS清洗至上清液澄清为止)；

结直肠癌单细胞的分离：清洗干净后的组织剪切至无可见颗粒为止，按10mL/1g加入酶消化液进行消化，至消化液里大量颗粒沉淀变为絮状物为止；(优选地，酶消化液为含1±0.1mg/mL的胶原酶Ⅳ、100±5μg/mL的DNA酶、100±5μg/mL的透明质酸酶和10±1μM的Y-27632)，过滤获得细胞；加入上述细胞培养液，得到细胞混悬液；

结直肠癌组织消化后细胞体外培养：将细胞混悬液和基质胶按照体积比为1：1.5-3混合，得混合物，每40ul混合物中含有结直肠癌单细胞2～3万个，然后混合物接种于六孔板中，培养4-6天后进行传代。

在其中一个实施例中，所述培养于37℃培养箱中，固化后加入新鲜配制的结直肠癌类器官培养液，继续培养。

在其中一个实施例中，按照1：4-1：6的传代比率进行传代，传代后可稳定生长，且在传代前不需要再次更换新鲜的培养基。

在其中一些实施例中，剪切组织为0.4g-1g，所述酶消化液的用量为每1g组织加入8-12ml。

在其中一些优选的实施例中，剪切组织为0.45g-0.55g；和/或细胞混悬液和基质胶按照体积比为1：1.8-2.2混合。

本发明另一个上面还提供了上述培养方法得到的结直肠癌类器官。

实现上述目的技术方案如下。

本发明的有益效果如下：

本发明的培养基用自产Wnt-3a、R-Spondin1和Noggin的细胞系替代三种昂贵细胞因子的加入，对比文献中类器官培养基配方最大限度地节约了类器官培养的成本，且成功率达到90％以上。

本发明的培养基对比文献中类器官培养基配方含有肠癌类器官培养所需最少的组分，能够培养来源于患者结直肠来源的肿瘤组织。

本发明类器官的培养方法操作简便，五天即可传代，五天之内可不用频繁换液，也减少了操作的繁琐和节约了成本。

本发明的培养方法能够有效降低肠癌培养微生物污染风险，大大减少了珍贵组织的浪费和基质胶和培养基的成本浪费情况。

本发明的培养方法可以稳定构建个体病人来源的类器官系，置于液氮中冷藏保存，可随取随用。

本发明的的结直肠癌类器官培养基经过鉴定维持了原发组织的组织病理学特征和分子遗传特征。

附图说明

图1：类器官生长形态图，a是低倍镜下的类器官生长图，b是a图放大后类器管的生长图；

图2：类器官活死细胞染色情况示意图；

图3：H&E染色结果示意图，其中，a图是原代组织，b图是其衍生的类器官；

图4：结直肠癌特异性markers的表达模式：其中，a图是原代组织结直肠癌特异性markers的免疫荧光染色结果，从左至右四张图片分别是EPCAM、pan-CK、beta-catenin和ki-67标记物的阳性信号，b图是其衍生的类器官相对应的四种标记物的阳性信号结果；

图5：全mRNA分子水平比较表达情况：转录组测序；

图6：全外显子测序的结果示意图；

图7：类器官冻存复苏后生长效果图；

图8：a图是实施例2类器官的生长效果图，b图是对比例的类器官生长效果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

3D类器官培养最重要的就是提供最为恰当的所述的细胞外基质(ECM)成分和含有各种生长因子和小分子抑制剂的特殊培养基。尽管这些添加物都大同小异，但是由于这些添加物都有其不同的生理作用，对于不同的细胞而言各有千秋。本发明发明人经过长期的实验和经验，优化到培养基能刺激肠道干细胞自我更新分化形成一个更加真实接近人体器官的三维培养物。

肠上皮是成年哺乳动物更新最快的组织。肠上皮的更新受肠干细胞(ISC)维持和自我更新的严格控制。小肠上皮在组织学上分为两个单元:隐窝和绒毛。隐窝主要由未分化的祖细胞组成，如转运扩增细胞和ISCs，而绒毛则由成熟的上皮细胞组成，这些细胞负责消化和吸收管腔营养等肠道主要功能。ISCs在生物体的整个生命周期中不断自我更新，并在组织中产生各种类型的分化谱系。虽然Lgr5(G蛋白偶联受体5)+SCs能在天然组织环境中大量繁殖，但它们不能在传统单层二维培养体系环境中存活。通过对ISCs在体细胞外生态位微环境的概括，而开发了一种三维培养方法，称为类器官培养，其中Lgr5+ISCs有效地扩展并形成类似于肠隐窝的立体结构。这些条件包括模拟基底膜的细胞外基质(基质凝胶)和添加三个生态位因子:表皮生长因子(EGF)、Noggin(骨形成蛋白抑制剂)和R-spondin1(Wnt激动剂)。随后，通过加入Wnt-3a，一种激活蛋白激酶4/5/7抑制剂(A83-01)，一种p38丝裂原激活蛋白激酶抑制剂(SB202190)和胃泌素，优化了人ISCs的类器官培养条件。当培养单个ISC时，它们的繁殖会受到分离诱导的细胞死亡(anoikis)的阻碍。补充一种抑制剂(Y-27632)可以抑制anoikis，并能从单一的ISCs中得到稳定的恢复。肠类器官分化为肠上皮的所有细胞类型，包括吸收性肠上皮细胞和分泌细胞，如Paneth、goblet、和肠内分泌细胞等。这些类器官培养具有表型和遗传稳定性，允许用患者病变组织建立的类器官进行疾病建模。手术标本或小的活检标本足以产生大量的人体类器官。一旦建立，类器官当需要时可以冻存和解冻。三维肠道类器官培养的建立为干细胞行为、基因功能和疾病建模的生理生化/分子研究提供了新的模型。在本方案中，我们提供了关于结直肠手术样本的获取，原代细胞的分离、类器官的培养、类器官的鉴定、类器官的低温保存详细信息。

关于以下实施例中涉及的名称和材料:

1.在实施例中未注明具体实验温度的条件为室温操作(20-25℃)。实施例中使用的原料及原料配置如下：

2.Advanced DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)/F12培养液：购自Gibco，4℃保存。

3.胎牛血清(FBS)：购自BI公司，-20℃保存。

4.胶原酶Ⅳ:购自sigma公司，-20℃保存，使用前用Advanced DMEM/F12培养液配制成1mg/mL。

5.透明质酸酶、DNA酶:购自Biofroxx公司，使用前用Advanced DMEM/F12培养液配制成1mg/mL，-20℃保存。

6.B27：购自Life Technologies公司，-20℃保存，在使用前加至培养液到终浓度1X。

7.N2：购自Life Technologies公司，-20℃保存，在使用前加至培养液到终浓度1X。

8.HEPES：N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸，购自Life Technologies公司，4℃保存，在使用前加至培养液到终浓度1mM。

9.GlutaMAX：购自Invitrogen公司，4℃保存，在使用前加至培养液到终浓度1X。

10.N-acetyl-l-cysteine：N-乙酰半胱氨酸，购自sigma公司，加水配制1M的储存液，分装储存于负二十摄氏度冰箱，在使用前加至培养液到终浓度1mM。

11.Nicotinamide：烟酰胺，购自sigma公司，加水配制1M的储存液，分装储存于四度冰箱，在使用前加至培养液到终浓度10mM。

12.Gastrin：胃泌素，购自tocris公司，用0.1％(wt/vol)BSA/PBS配制为100μM的储存液。分装储存于负二十摄氏度冰箱，在使用前加至培养液到终浓度10nM。

13.R-Spondin1：购自Peprotech公司，用0.1％(wt/vol)BSA/PBS配制为500μg/ml的储存液。分装储存于负二十摄氏度冰箱，在使用前加至培养液到终浓度500ng/mL。

14.Noggin：购自Peprotech公司，用0.1％(wt/vol)BSA/PBS配制为1mg/ml的储存液。分装储存于负二十摄氏度冰箱，在使用前加至培养液到终浓度100ng/mL。

15.Wnt3A：购自R&D公司，用0.1％(wt/vol)BSA/PBS配制为1mg/ml的储存液。分装储存于负二十摄氏度冰箱，在使用前加至培养液到终浓度100ng/mL。

16.EGF：购自Peprotech公司，用0.1％(wt/vol)BSA/PBS配制为50ng/ml的储存液。分装储存于负二十摄氏度冰箱，在使用前加至培养液到终浓度500ng/mL。

17.Prostaglandin E2：前列腺素E2，购自MCE公司，用0.1％(wt/vol)BSA/PBS配制为10μM的储存液。分装储存于负二十摄氏度冰箱，在使用前加至培养液到终浓度1μM。

18.A83-01：购自MCE公司，用DMSO配制为10μM的储存液。分装储存于负二十摄氏度冰箱，在使用前加至培养液到终浓度500nM。

19.SB202190：购自MCE公司，用DMSO配制为10μM的储存液。分装储存于负二十摄氏度冰箱，在使用前加至培养液到终浓度10μM。

20.FGF-10：购自Peprotech公司，用水配制为10μg/ml的储存液。分装储存于负二十摄氏度冰箱，在使用前加至培养液到终浓度10ng/mL。

21.FGF-basic：购自Peprotech公司，用水配制为10μg/ml的储存液。分装储存于负二十摄氏度冰箱，在使用前加至培养液到终浓度10ng/mL。

22.Y-27632：购自MCE公司，用水配制为10mM的储存液。分装储存于负二十摄氏度冰箱，在使用前加至培养液到终浓度10μM。

23.TrypLE：购自Gibco公司，4℃保存。

24.Cell recovery solution：(细胞回收液)，购自康宁公司，4℃保存。

25.L-WRN

CRL-3276^TM(细胞)：购自ATCC。

26.青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)：购于Invitrogen。1000X浓度原液用时加至培养液到1X。

27.基质胶：购自康宁公司，使用前分装负二十摄氏度保存，在使用时提前放置于四摄氏度冰箱解冻。

实施例1

本实施例提供的是L-WRN

CRL-3276^TM细胞自产Wnt-3a、R-Spondin1和Noggin三种细胞因子的条件培养基的制备，包括：

1)解冻低代数的L-WRN细胞，在常规含10％的FBS的DMEM培养基中培养一天，然后换成加入G418(500μg/mL)和hygromycin(500μg/mL)的常规培养基至交汇。

2)在37℃TE消化3-5分钟，用常规培养基重悬，传代比率为1/5。

3)培养3-4天后至交汇后，将培养基换成原代培养基(Advanced DMEM/F12+20％FBS+2mM GlutaMAX+1％双抗)。

4)培养24h后，收集第一次的上清，2000g离心5分钟，每收集完上清后，用同等体积的原代培养基继续培养，每隔24h，收集上清，将第一、第二、第三和第四次的上清合并至一起。加入等体积的原代培养基，分装储存于负二十摄氏度待用。

所述直肠癌类器官培养液的制备方法，包括(以在50mL的培养液的终浓度为例)：体积占50％的WRN条件培养基、50ng/mL EGF、500nM A8301、10μM SB202190、10μM Y-27632、1mM N-acetylcysteine、10nM Gastrin、1XB27、10mM Nicotinamide、2mM Glutamax、1mMHEPES、100U/mL青霉素/链霉素，加入Advanced DMEM/F12补足50ml。

实施例2

1、结直肠癌活检组织的体外处理

1)切取结直肠癌肿瘤顶部突起实质部分的肿瘤组织(0.5g左右)，多点切取。低温培养基保存递送实验室。发明人在多次的培养中发现，当取0.5g左右的肿瘤组织/块时，可以获得足够量的单细胞，也不会浪费大量的消化液。

2)用含抗生素的冰冷的1xPBS(1％双抗(青霉素-链霉素)+100ug/ml的primocin+50ug/ml的getamicin)上下震荡清洗十次左右至上清澄清。

3)将组织置于冰上，剪切至无明显可见颗粒。

消化液配成1mg/mL的胶原酶Ⅳ、100ug/mLDNA酶、100ug/ml透明质酸酶消化工作液。0.22um的无菌滤膜过滤，使用前预热至37℃。按1g的组织加入10mL的消化液，37℃，220rpm摇床消化30-50分钟。

4)孵育结束后，过滤收集100μM滤膜过滤后的细胞，即结直肠癌单细胞和细胞团的混合物。

5)离心收集结直肠癌单细胞(300g，5分钟)，将上清小心移除后，将细胞重悬到1mladvanced DMEM/F12培养基中，计数收集到的结直肠癌细胞数量。

2、结直肠癌细胞的体外类器官培养

1)将待用的基质胶置于冰上解冻，六孔板放于培养箱预热。整个实验过程为防止基质胶凝固，需保持在冰上进行。

2)将所得到的结直肠癌细胞离心收集后，加入上述细胞培养液(结直肠癌类器官培养液)，得到细胞悬混液，将细胞悬混液与基质胶按照体积为1：2的量进行混合，得到混合液，每40μl混合液中含有20000-30000个细胞。

3)取含有结直肠癌细胞的混合液种入六孔板内，每孔40μl混合液，接种时注意防止沾壁，使其成3D的胶滴状态，每个孔六个胶滴。放置于37℃培养箱20分钟固化后加入2mL新鲜配制的结直肠癌类器官培养液，放入37℃培养箱继续培养。结直肠癌类器官培养液为含有50％WRN条件培养基、50ng/mL EGF、500nM A8301、5μM SB202190、10μM Y-27632、1.25mM N-acetylcysteine、10nM Gastrin、1XB27、10mM Nicotinamide、2mM Glutamax、1mMHEPES、100U/mL青霉素/链霉素，50％的Advanced DMEM/F12。

4)培养5天后进行传代，按照1：5的传代比率进行传代，传代后可稳定生长，且在传代前不需要再次更换新鲜的培养基，得到结直肠癌类器官。

5)结直肠癌细胞在经过3天的初次培养后可以在(10X10)显微镜下看到类器官生成。通过该方法，培养的成功率可以达到95％以上。所得到的结直肠癌类器官具有三维结构(图1)，极大保留了病人肿瘤组织特有的形态学特征，表明类器官具有与原生肿瘤高度一致的形态结构。

实施例3

结直肠癌类器官的低温保存

1)在某一代数内收集生长五天后生长的类器官，加入cell recovery solution置于冰上30分钟融解基质胶。

2)离心，弃上清，沉淀用500μL的Tryple重悬，置于37℃消化3分钟，加入培养基中止消化。

3)再次离心，弃上清。按一个六孔板中一个孔的类器官量加入1mL的冻存液冻存，大概50万个类器官碎片/1mL的冻存液，冻存液组分为含10％DMSO的FBS。冻存使用程序冻存梯度降温方式。

结果见图7，从图7中可以看出类器官经过低温冻存再复苏仍然可以稳定生长，且不影响细胞活性。

实施例4

3、结直肠癌类器官的鉴定

全外显子测序可以看出类器官无论是从形态结构、蛋白水平、RNA水平还是基因水平类器官都与其原生肿瘤保持高度的一致性。

按照常规方法，对实施例2所得的结直肠癌类器官模型进行活死细胞染色，结果见图2，从图2中可以看出活细胞被染为绿色，死细胞为红色，说明类器官正在发生增值，死细胞较少，主要由无数个活细胞构成。

按照常规方法，对实施例2所得的结直肠癌类器官模型和其原代组织进行H&E染色，结果见图3，从图3中可以看出体外培养的类器官具有与原代组织一样的空腔结构。

按照常规方法，对实施例2所得的结直肠癌类器官和其原代组织进行免疫荧光，结果见图4，从图4中可以看出几个特定的markers在原代组织和其衍生的类器官中具有一致的表达情况。

全mRNA分子水平比较表达情况：转录组测序送广州艾基生物科技有限公司进行转录组测序，结果见图5，从图5中可以看出从总mRNA水平热图统计原代组织和类器官表达的一致性为0.84，且基因表达总体分布也非常相似。

全DNA水平比较基因突变情况：全外显子测序。

送广州华大基因科技有限公司进行全外显子测序，结果见图6，从图6中可以看出在venn图中统计了结直肠癌关键驱动基因的突变在类器官和原代组织上的共性发现47个基因为两个样本的共有突变；在选定的一些结直肠癌常见的突变基因在两个样本的对比上也发现具有完全的一致性，在总的突变统计上两个样本的突变一致性高于90％。

对比例

使用来自一篇science文献(Patient-derived organoids modeltreatmentresponse of metastatic gastrointestinal cancers)的结直肠癌类器官液按照实施例2相同的培养方法进行培养，该文献培养液组成为含有50ng/mL EGF、100ng/mL Wnt-3a、500ng/mL R-Spondin1、500nM A8301、10μM Y-27632、100ng/mL Noggin、5μM SB202190、1XN2、1XB27、10mM HEPES、10nM Gastrin、10ng/mL FGF-10、10ng/mL FGF-basic、1μMProstaglandin E2、4mM Nicotinamide、2mM Glutamax、0.01％的BSA、100U/mL青霉素/链霉素、100mg/ml的Primocin的advanced DMEM/F12培养液。

表1对比例和实施例2中类器官样本成功数

培养液	样本培养总数	成功数
			实施例2组	10	9
文献(对比组)	10	5

而且，在培养中发现，此配方类器官的生长速度慢，成功率不如实施例2所述方法的高，更重要的此配方所需的生长因子昂贵，成本巨大，不利于类器官模型的普及使用。

实施例2所得结直肠癌类器官模型和对比例中类器官，生长五天后的形态学对比，结果见图8，从图8中a图可以看出使用实施例2中的培养液能够使从肿瘤组织分离的单细胞生长为类器官，具有肠癌类器官的形态结构，而从图8中b图可以看出使用对比例中的培养液培养类器官形成效率较低，从类器官样本成功数量统计结果也可以看出对比例成功率相较于实施例低很多。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

Claims (10)

1.一种类器官培养液，其特征在于，包括为含有占总体积的45-55％的产Wnt-3a、R-Spondin1和Noggin的WRN细胞系条件培养基、以及50±5ng/mL EGF、500±5nM A8301、10±5μM SB202190、10±1μM Y-27632、1±0.25mM N-acetylcysteine、10±1nM Gastrin、1XB27、10±1mM Nicotinamide、2±0.1mM Glutamax、1±0.1mM HEPES的Advanced DMEM/F12培养液。

2.根据权利要求1所述的类器官培养液，其特征在于，还包括100±5U/mL的青霉素和链霉素。

3.根据权利要求1所述的类器官培养液，其特征在于，所述产Wnt-3a、R-Spondin1和Noggin的WRN细胞系条件培养基的制备方法包括：

解冻低代数的L-WRN细胞，在DMEM培养基中培养22-26h，然后换成加入G418和hygromycin的常规培养基至交汇；

在37℃TE消化3-5分钟，用常规培养基重悬，传代比率为1：4-1：6；

培养3-4天后至交汇后，将常规培养基换成原代培养基；培养22-26h后，离心收集上清；用同等体积的原代培养基继续培养，每隔22-26h，收集上清，培养三至五次，汇总全部上清，然后加入等体积的原代培养基，即得。

4.一种结直肠癌类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

样本的取样和预处理：在结直肠癌患者手术样本的边缘突起实质部分剪切组织，低温培养基保存送至实验室，清洗干净；

结直肠癌单细胞的分离：清洗干净后的组织剪切至无可见颗粒为止，按10mL/1g加入酶消化液进行消化，至消化液里大量颗粒沉淀变为絮状物为止；过滤获得细胞，加入权利要求1-3任一项所述细胞培养液，得到细胞混悬液；

结直肠癌组织消化后细胞体外培养：将细胞混悬液和基质胶按照体积比为1：1.5-3混合，得混合物，每40ul混合物中含有结直肠癌单细胞2～3万个；然后所述混合物接种于六孔板中，培养4-6天后进行传代。

5.根据权利要求4所述的结直肠癌类器官的培养方法，其特征在于，所述培养于37℃培养箱中，固化后加入新鲜配制的结直肠癌类器官培养液，继续培养。

6.根据权利要求4所述的结直肠癌类器官的培养方法，其特征在于，按照1：4-1：6的传代比率进行传代，传代后可稳定生长，且在传代前不需要再次更换新鲜的培养基。

7.根据权利要求4所述的结直肠癌类器官的培养方法，其特征在于，所述酶消化液为含1±0.1mg/mL的胶原酶Ⅳ、100±5μg/mL的DNA酶、100±5μg/mL的透明质酸酶和10±1μM的Y-27632。

8.根据权利要求4所述的结直肠癌类器官的培养方法，其特征在于，剪切组织为0.4g-1g；和/或所述酶消化液的用量为每1g组织加入8-12ml。

9.根据权利要求4所述的结直肠癌类器官的培养方法，其特征在于，剪切组织为0.45g-0.55g；和/或细胞混悬液和基质胶按照体积比为1：1.8-2.2混合。

10.根据权利要求4-9任一项所述培养方法得到的结直肠癌类器官。

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