CN114107388A - 一种腺病毒转染类器官的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种腺病毒转染类器官的方法，包括以下步骤：消化：对类器官进行消化处理；转染：消化处理后的类器官中加入腺病毒的病毒液，孵育；培养：孵育后的类器官离心分离后，进行培养，得到腺病毒转染的类器官。与现有技术相比，本发明方法不需要细胞因子的加入，降低了转染成本；本发明方法可以使用腺病毒转染，可转染的片段长度更长；本发明方法无需购置额外的设备，可运用普通的冰冻离心机和培养箱完成转染。
Description
技术领域
本发明属于细胞处理技术领域，尤其是涉及一种腺病毒转染类器官的方法。
背景技术
类器官作为一种具有自我更新能力和分化潜能的多细胞，是一种良好的研究工具，但限于难以向类器官中转染病毒的问题，很多基础实验难以展开。传统转染类器官的方法需要许多昂贵的细胞因子加入，并且需要控制类器官的数量以及状态，步骤繁琐耗时，但转染效率低。
目前的类器官转染方法存在诸多问题：1.多使用腺相关病毒，转染的片段大小受限，且腺相关病毒价格高昂；2.需要许多额外的细胞因子的支持，从病毒的处理到类器官的预处理，都需要例如烟酰胺、Choir99021等细胞因子，成本高昂；3.处理要求较高，需要培养板离心机等机器，对设备的要求高。
因此，现有技术中需要一种简单高效的传染方法帮助处理类器官。
中国专利CN110484506A公开了一种胶质母细胞瘤类器官模型的构建方法和应用。所述构建胶质母细胞瘤类器官模型的方法为胶质母细胞瘤细胞系经预处理获得胶质母细胞瘤单细胞，将胶质母细胞瘤单细胞移植入培养至30天的大脑皮质类器官中。该方法可以模拟临床上胶质母细胞瘤的生长特点和肿瘤的微环境，实现肿瘤细胞在正常脑组织生长过程的模拟。该专利并没有给出如何高效实现病毒转染肿瘤细胞的方法。
发明内容
基于现有技术中，转染类器官的方法繁琐耗时且转染效率低的技术问题，本发明提供一种腺病毒转染类器官的方法。
本发明的方法可转染各种状态、各种数量的类器官，且操作方便，有利于大量操作。
本发明提供的腺病毒转染类器官的方法为一种技术突破，可以解决如今难以利用类器官进行机制研究的现状，进行更加深入的科学研究。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种腺病毒转染类器官的方法，包括以下步骤：
消化：对类器官进行消化处理；
转染：消化处理后的类器官中加入腺病毒的病毒液，孵育；
培养：孵育后的类器官离心分离后，进行培养，得到腺病毒转染的类器官。
在本发明的一个实施方式中，对类器官进行消化处理的方法为：弃原类器官培养基，加入PBS，重悬类器官和基质胶，离心处理，弃上清。
在本发明的一个实施方式中，对类器官进行消化处理的过程中，加入PBS，重悬类器官和基质胶，离心处理，弃上清后，再次加入PBS，重悬类器官和基质胶，离心处理，弃上清。
在本发明的一个实施方式中，对类器官进行消化处理的过程中，加入的PBS为冰PBS。
在本发明的一个实施方式中，对类器官进行消化处理的过程中，离心处理的条件为500g离心5min。
在本发明的一个实施方式中，消化处理后的类器官中加入腺病毒的病毒液后孵育的条件为：37℃培养箱中孵育24h。
在本发明的一个实施方式中，孵育后的类器官离心分离的条件为：吸取培养基和类器官混合物，加入冰PBS，500g离心5min。
在本发明的一个实施方式中，所述类器官选择人肠腺瘤类器官。
在本发明的一个实施方式中，腺病毒转染类器官的方法，具体包括以下步骤：
(1)消化：弃原类器官培养基，加入500ul冰PBS，重悬类器官和基质胶，500g离心5min，弃上清，加入PBS，500g离心5min弃上清；
(2)转染：加入适量培养基重悬类器官，加入24孔板中，加入适量病毒液，37度培养箱中孵育24h；
(3)培养：吸取培养基和类器官混合物，加入冰PBS，500g离心5min，弃上清，将类器官种入24孔板，培养。
在本发明的一个实施方式中，所述病毒滴度为1.0E+09TU/ML，病毒种类并不固定，本方法适用于各种腺病毒转染。
本发明提供的方法可以减少细胞因子的应用，用实验室已有的设备进行转染即可，具有时间少和成本低的优势。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1.不需要细胞因子的加入，降低了转染成本；
2.可以使用腺病毒转染，可转染的片段长度更长；
3.无需购置额外的设备，可运用普通的冰冻离心机和培养箱完成转染。
附图说明
图1：实施例1得到的肠腺瘤类器官图片(其为光学显微镜通过4倍目镜和10倍物镜观察得到的照片)；
图2：实施例2得到的腺病毒转染肠腺瘤类器官的照片(其为光学显微镜通过4倍目镜和10倍物镜观察得到的图片)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
人肠腺瘤类器官的分离与培养：
(1)取肠腺瘤头段0.3cm*0.5cm*0.5cm组织，使用冰保存液(所述保存液购于上海诺典生物公司，货号为ND-2001-PS 100mL)保存。
(2)至实验室后，弃保存液，使用冰双抗-PBS溶液(双抗-PBS溶液为每500mlPBS溶液中加入5ml双抗得到的混合溶液，所述双抗购于武汉赛维尔生物科技有限公司，货号G4003-100ML，成分为青霉素-链霉素混合液，PBS购于武汉赛维尔生物科技有限公司，货号G4202-500ML，为磷酸盐缓冲液)摇床清洗4次，每次8min；
(3)取组织，切成1mm*1mm大小碎块，转入预热的12ml消化液(购于上海诺典生物技术有限公司，货号为ND-3001-DS 100ML)中，37℃震荡消化20min；
(4)组织块消化成云雾状，加入10ml冰PBS，移液枪吹打至大部分碎片消失；
(5)50um滤器过滤至50ml离心管1中，500g离心5min；
(6)弃上清，若可见红色则加入2ml红细胞裂解液(购于天津灏洋华科生物科技有限公司，货号NH4CL2009)，重悬组织，待红色消失后，在消化管中添加冰PBS至20ml，500g离心5min，弃上清；
(7)冰PBS(购于武汉赛维尔生物科技有限公司，货号G4202-500ML，为磷酸盐缓冲液)重悬，500g离心5min，弃上清，此步骤重复2次；
(8)冰上溶解的基质胶重悬细胞团，基质胶的加入量与初始人肠腺瘤组织大小的比例关系为：每0.3cm*0.5cm*0.5cm大小的初始人肠腺瘤组织加入1100μl的基质胶，所述基质胶货号为Corning 356231，100-150/75μl每孔接种入24孔板，放入培养箱5-10min待基质胶凝固后每孔加500ul培养液(购于上海诺典生物技术有限公司，货号为ND-1007-CM100ML)和10μmol浓度为10uM的Y27632(型号为Tocris 1254/10)。
本实施例得到的肠腺瘤类器官图片如图1所示。
实施例2:腺病毒转染类器官的方法：
(1)弃实施例1所得原类器官培养基，加入500ul冰PBS，溶解基质胶，重悬类器官。
(2)将PBS、基质胶和类器官吸入离心管中，反复吹打至基质胶完全溶解。
(3)500g离心5min，弃上清。加入PBS重悬，500g离心5min。
(2)弃上清，加入250ul培养基重悬类器官，加入24孔板中。
(3)加入10ul病毒液，所述病毒滴度为1.0E+09TU/ML，病毒种类并不固定，本方法适用于各种腺病毒转染，吹打混匀，37度培养箱中孵育24h。
(4)吸取培养基和类器官混合物，加入4.5ml冰PBS，500g离心5min
(5)弃上清，冰上溶解的基质胶重悬细胞团，100-150/75μl每孔接种入24孔板，放入培养箱8min待基质胶凝固后每孔加500ul培养液。
本实施例中，腺病毒转染肠腺瘤类器官的照片如图2所示。
根据以上记载，可以将类器官作为实验工具，通过病毒转染，研究肿瘤或癌症的病理生理变化。同时，避免了感染动物后再培养类器官的复杂过程和可能存在的干扰因素，本发明提供的方法是一种非常经济高效的转染方法。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种腺病毒转染类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：
消化：对类器官进行消化处理；
转染：消化处理后的类器官中加入腺病毒的病毒液，孵育；
培养：孵育后的类器官离心分离后，进行培养，得到腺病毒转染的类器官。
2.根据权利要求1所述的一种腺病毒转染类器官的方法，其特征在于，对类器官进行消化处理的方法为：弃原类器官培养基，加入PBS，重悬类器官和基质胶，离心处理，弃上清。
3.根据权利要求2所述的一种腺病毒转染类器官的方法，其特征在于，对类器官进行消化处理的过程中，加入PBS，重悬类器官和基质胶，离心处理，弃上清后，再次加入PBS，重悬类器官和基质胶，离心处理，弃上清。
4.根据权利要求2所述的一种腺病毒转染类器官的方法，其特征在于，对类器官进行消化处理的过程中，加入的PBS为冰PBS。
5.根据权利要求2所述的一种腺病毒转染类器官的方法，其特征在于，对类器官进行消化处理的过程中，离心处理的条件为500g离心5min。
6.根据权利要求1所述的一种腺病毒转染类器官的方法，其特征在于，消化处理后的类器官中加入腺病毒的病毒液后孵育的条件为：37℃培养箱中孵育24h。
7.根据权利要求1所述的一种腺病毒转染类器官的方法，其特征在于，孵育后的类器官离心分离的条件为：吸取培养基和类器官混合物，加入冰PBS，500g离心5min。
8.根据权利要求1所述的一种腺病毒转染类器官的方法，其特征在于，所述类器官选择人肠腺瘤类器官。
9.根据权利要求1所述的一种腺病毒转染类器官的方法，其特征在于，腺病毒转染类器官的方法，具体包括以下步骤：
(1)消化：弃原类器官培养基，加入500ul冰PBS，重悬类器官和基质胶，500g离心5min，弃上清，加入PBS，500g离心5min弃上清；
(2)转染：加入适量培养基重悬类器官，加入24孔板中，加入适量病毒液，37度培养箱中孵育24h；
(3)培养：吸取培养基和类器官混合物，加入冰PBS，500g离心5min，弃上清，将类器官种入24孔板，培养。
10.根据权利要求9所述的一种腺病毒转染类器官的方法，其特征在于，所述病毒滴度为1.0E+09TU/ML。
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