CN114736870A - 一种唾液腺腺样囊性癌类器官及其培养方法、培养基和应用 - Google Patents

一种唾液腺腺样囊性癌类器官及其培养方法、培养基和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种唾液腺腺样囊性癌类器官及其培养方法、培养基和应用。本发明针对唾液腺腺样囊性癌细胞的生长特点，通过含多种组分培养基所发挥的协同作用，能有效地短期内在体外形成类器官。本发明所述培养基及方法适用于唾液腺腺样囊性癌类器官的培养，培养获得的类器官对于研究该肿瘤发生、独特侵袭性生长机制、预后、治疗靶点及药物筛选等具有重要意义，具有广泛应用前景。

Description

一种唾液腺腺样囊性癌类器官及其培养方法、培养基和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，涉及一种唾液腺腺样囊性癌类器官及其培养方法、培养基和应用。
背景技术
唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cysticcar cinoma，SACC)是一种常见唾液腺上皮源性恶性肿瘤，分别约占所有唾液腺肿瘤和唾液腺恶性肿瘤的10％和28％，是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一，好发于腮腺及腭，其次为下颌下腺。嗜神经生长是唾液腺腺样囊性癌独特生物学特征，患者早期即可出现面瘫、麻木等神经症状，易发生肺转移；但肿瘤生长缓慢，患者总病程较长，5年生存率尚可，但长期生存状况不佳，10年生存率明显降低。手术切除和术后辅助放化疗是目前临床治疗唾液腺腺样囊性癌的首选方法，尚无有效化疗药物。
以往唾液腺腺样囊性癌的体外研究多采用平面培养体系，细胞或组织多不能反应肿瘤真实组织形态、细胞功能，丧失肿瘤异质性，是导致药物开发及肿瘤发生、发展机制研究进展缓慢的主要因素之一。类器官是近年来兴起、模拟体内培养条件的体外研究模型，培育出的组织不仅保留原肿瘤的遗传学特征、细胞组织形态，且类器官细胞具异质性，是研究肿瘤异质性、发生发展机制的优秀体外模型，在药物研发、个体化精准治疗中具广阔应用前景，目前对唾液腺腺样囊性癌类器官建立方法较少。本发明关于唾液腺腺样囊性癌类器官模型建立方法将有利于推动腺样囊性癌组织发生、浸润生长机制、药物研发、个体化治疗等研究迈上新高度。
发明内容
鉴于以上所述唾液腺腺样囊性癌培养技术现状，本发明目的在于提供一种唾液腺腺样囊性癌类器官及其培养方法和应用，用于解决现有技术中唾液腺腺样囊性癌类器官培养基及培养方法等问题，实现培养获得组织细胞形态、蛋白表达等与真实唾液腺腺样囊性癌高度一致的3D类器官目的。
为实现上述目的及其它相关目的，本发明提供一种唾液腺腺样囊性癌类器官及其培养方法和应用。
本发明提供了一种培养唾液腺腺样囊性癌类器官的培养基，所述培养基包括：
Advanced DMEM/F12，以及以Advanced DMEM/F12为基准的以下成分：0.5～2v％青霉素-链霉素双抗、0.5～2v％GlutaMAX、0.5～2v％HEPES缓冲液，50～300ng/ml成纤维生长因子(FGF-10)、10～200ng/ml EGF、0.01～1μmol/l TGF-βI型受体抑制剂、300～800ng/mlWnt3a重组蛋白、0.05～0.3μg/ml Noggin重组蛋白、0.05～0.3μg/ml R-spondin-1重组蛋白、0.2～2.5mmol/L N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)，5～30mmol/L烟酰胺(Nicotinamide)，0.5～5v％B27补充剂，0.2～5μmol/L地塞米松，5～30μmol/l Y-27632(Rock抑制剂)，0.5～3v％N-2补充剂。
其中，v％是指某物质占Advanced DMEM/F12的体积百分比。例如0.5～2v％青霉素-链霉素双抗是指在100mL Advanced DMEM/F12中，青霉素-链霉素双抗的体积为0.5～2mL。
其中，青霉素-链霉素双抗占Advanced DMEM/F12的体积百分数为0.5～2％，可以是0.5～1.0％、0.5～1.0％、1.0～1.5％、1.5～2％，具体可以是0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0％。优选地，为0.6～1.6％；进一步优选地，为0.8～1.2％；更进一步优选地，为1％。
其中，GlutaMAX占Advanced DMEM/F12的体积百分数为0.5～2％，可以是0.5～1.0％、1.0～1.5％、1.5～2％，具体可以是0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0％。优选地，为0.6～1.6％；进一步优选地，为0.8～1.2％；更进一步优选地，为1％。
其中，HEPES缓冲液占Advanced DMEM/F12的体积百分数为0.5～2％，可以是0.5～1.0％、0.5～1.0％、1.0～1.5％、1.5～2％，具体可以是0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0％。优选地，为0.6～1.6％；进一步优选地，为0.8～1.2％；更进一步优选地，为1％。
其中，成纤维生长因子(FGF-10)在Advanced DMEM/F12中的浓度为50～300ng/ml，可以是50～100ng/ml、100～150ng/ml、150～200ng/ml、200～250ng/ml、250～300ng/ml，具体可以是50、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300ng/ml。优选地，为60～240ng/ml；进一步优选地，为80～160ng/ml；进一步优选地，为80～120ng/ml；更进一步优选地，为100ng/ml。
其中，EGF在Advanced DMEM/F12中的浓度为10～200ng/ml，可以是10～20ng/ml、20～30ng/ml、30～40ng/ml、40～50ng/ml、50～60ng/ml、60～80ng/ml、80～100ng/ml、100～120ng/ml、120～140ng/ml、160～180ng/ml、180～200ng/ml，具体可以是10、20、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180、200ng/ml。优选地，为20～150ng/ml；进一步优选地，为30～80ng/ml；进一步优选地，为40～60ng/ml；更进一步优选地，为50ng/ml。
其中，TGF-βI型受体抑制剂(优选A83-01)在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.01～1μmol/l，可以是0.01～0.05μmol/l、0.05～0.1μmol/l、0.1～0.2μmol/l、0.2～0.3μmol/l、0.3～0.4μmol/l，0.4～0.6μmol/l，0.6～0.8μmol/l，0.8～1μmol/l，具体可以是0.01μmol/l、0.02μmol/l、0.03μmol/l、0.04μmol/l、0.05μmol/l、0.06μmol/l、0.08μmol/l、0.1μmol/l、0.2μmol/l、0.3μmol/l、0.4μmol/l、0.5μmol/l、0.6μmol/l、0.7μmol/l、0.8μmol/l、0.9μmol/l、1.0μmol/l。优选地，为0.02～0.5μmol/l；进一步优选地，为0.06～0.2μmol/l；更进一步优选地，为0.1μmol/l。
其中，Wnt3a重组蛋白在Advanced DMEM/F12中的浓度为300～800ng/ml，300～350ng/ml、350～400ng/ml、450～500ng/ml、500～550ng/ml、550～600ng/ml、600～650ng/ml、650～700ng/ml、750～800ng/ml。优选地，为400～600ng/ml；进一步优选地，为450～550ng/ml；更进一步优选地，为500ng/ml。
其中，Noggin重组蛋白在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.05～0.3μg/ml，可以是0.05～0.1μg/ml、0.1～0.15μg/ml、0.15～0.2μg/ml、0.2～0.25μg/ml、0.25～0.3μg/ml，具体可以是0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18、0.2、0.22、0.25、0.28、0.3μg/ml。优选地，为0.07～0.2μg/ml；进一步优选地，为0.08～0.15μg/m；更进一步优选地，为0.1μg/ml。
其中，R-spondin-1重组蛋白在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.05～0.3μg/ml，可以是0.05～0.1μg/ml、0.1～0.15μg/ml、0.15～0.2μg/ml、0.2～0.25μg/ml、0.25～0.3μg/ml，具体可以是0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18、0.2、0.22、0.25、0.28、0.3μg/ml。优选地，为0.07～0.2μg/ml；进一步优选地，为0.08～0.15μg/m；更进一步优选地，为0.1μg/ml。
其中，N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.2～2.5mmol/L，可以是0.2～0.75mmol/L、0.75～1mmol/L、1～1.25mmol/L、1.25～1.5mmol/L、1.5～1.75mmol/L、1.75～2mmol/L、2～2.25mmol/L、2.25～2.5mmol/L，具体可以是0.75、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.5mmol/L。优选地，为0.5～1.8mmol/L；进一步优选地，为0.8～1.5mmol/L；更进一步优选地，为1mmol/L。
其中，烟酰胺(Nicotinamide)在Advanced DMEM/F12中的浓度为5～30mmol/L，可以是5～10mmol/L、10～15mmol/L、15～20mmol/L、20～25mmol/L、25～30mmol/L，具体可以是5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30mmol/L。优选地，为6～20mmol/L；进一步优选地，为8～16mmol/L；更进一步优选地，为10mmol/L。
其中，B27补充剂在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.5～5％，可以是0.5～1％、1～1.5％、1.5～2％、2.5～3％、3.5～4％、4.5～5％，具体可以是0.5、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5％。优选地，为1～3.5％；进一步优选地，为1.5～2.5％；更进一步优选地，为2％。
其中，地塞米松在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.2～5μmol/L，可以是0.2～0.5μmol/L、0.5～1μmol/L、1～1.5μmol/L、1.5～2μmol/L、2.5～3μmol/L、3.5～4μmol/L、4.5～5μmol/L，具体可以是0.2、0.5、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5μmol/L。优选地，为0.5～3.5μmol/L；进一步优选地，为0.8～2.5μmol/L；更进一步优选地，为1μmol/L。
其中，Y-27632(Rock抑制剂)在Advanced DMEM/F12中的浓度为5～30μmol/l，可以是5～10μmol/l、10～15μmol/l、15～20μmol/l、20～25μmol/l、25～30μmol/l，具体可以是5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30μmol/l。优选地，为6～20μmol/l；进一步优选地，为8～16μmol/l；更进一步优选地，为10μmol/l。
在一些优选实施方式中，所述培养基还包括N-2补充剂。所述N-2补充剂占Advanced DMEM/F12的体积百分数为0.5～3％，可以是0.5～1.0％、1.0～1.5％、1.5～2％、2～2.5％、2.5～3％，具体可以是0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.5、2.8、3.0％。优选地，为0.6～1.6％；进一步优选地，为0.8～1.2％；更进一步优选地，为1％。
在一些更优选实施方式中，所述培养基包含：500ml Advanced DMEM/F12(Gibco)，1v％的青霉素-链霉素双抗(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco)、1v％的GlutaMAX(Gibco)、1v％的HEPES缓冲液(Gibco)，成纤维生长因子(FGF-10)100ng/ml(MCE)、EGF 50ng/ml(MCE)、A83-01 0.1μmol/l(MCE)、Wnt3a重组蛋白500ng/ml(MCE)、Noggin重组蛋白0.1μg/ml(MCE)、R-spondin-1重组蛋白0.1μg/ml(MCE)、N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)1mmol/L(MCE)，烟酰胺(Nicotinamide)10mmol/L(MCE)，2v％B27补充剂(MCE)、地塞米松(Dexamethasone)(MCE)1μmol/L、1v％N-2补充剂(MCE)、Y-27632(Rock抑制剂)10μmol/l；其中，所述培养基中，Advanced DMEM/F12外，其他组分的用量如百分含量或浓度均以Advanced DMEM/F12为基准进行说明；B27补充剂为50XB27补充剂；N-2补充剂为100XN-2补充剂。
本发明还提供了如上所述的培养基在培养腺样囊性癌类器官中的应用。本发明的培养基针对于唾液腺腺样囊性癌细胞的培养生长特点，选用了多种细胞因子成份按照特定的比例进行复配，获得的培养基中，含有适宜含量的细胞因子、信号通路调控因子，唾液腺腺样囊性癌细胞能够在较短的时间内形成与真实肿瘤组织形态和特性接近的3D类器官。本发明的培养基成本低、可操作性强、重复性好，经过多次传代培养的类器官，依然能够保持类器官的细胞形态，蛋白表达接近于真实肿瘤组织。
本发明还提供了一种唾液腺腺样囊性癌类器官的培养方法，所述方法包括，将破碎后的唾液腺腺样囊性癌细胞采用如上所述的培养基进行培养，获得所述的唾液腺腺样囊性癌类器官。
本发明的方法，所采用的培养基中，各种细胞因子及调控因子相互协调配合，结合独特的消化酶和消化方法以及接种培养方法，使得唾液腺腺样囊性癌细胞在培养过程中能够更好的表现出其固有的活性特征，实现高度近似于真实唾液腺腺样囊性癌肿瘤的综合特性。采用本发明的培养基培养获得的唾液腺腺样囊性癌类器官，组织细胞形态和蛋白表达与真实唾液腺腺样囊性癌高度一致。
具体地，所述方法包括：
(a)组织破碎
将唾液腺腺样囊性癌肿瘤组织进行破碎，获得组织碎块；
(b)组织消化
采用消化酶消化所述的组织碎块，获得消化后的悬液；
所述消化酶包含Ⅱ型胶原酶和DNase I；优选地，所述消化酶包含0.8～4mg/mlⅡ型胶原酶和0.05～0.3mg/ml DNase I；
(c)过滤
对消化后的悬液进行过滤，弃上清，重悬沉淀获得细胞悬液，接种并培养。
步骤(b)所述消化酶中，Ⅱ型胶原酶的浓度为0.8～4mg/ml；可以是0.8～1mg/ml、1～1.5mg/ml、1.5～2mg/ml、2～2.5mg/ml、2.5～3mg/ml、3～3.5mg/ml、3.5～4mg/ml，具体可以是0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4mg/ml。优选地，为0.8～3mg/ml；进一步优选地，为1.5～2.5mg/ml；更进一步优选地，为2mg/ml。
步骤(b)所述消化酶中，DNase I的浓度为0.05～0.3mg/ml；可以是0.05～0.1mg/ml、0.1～0.15mg/ml、0.15～0.2mg/ml、0.2～0.25mg/ml、0.25～0.3mg/ml，具体可以是0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18、0.2、0.22、0.25、0.28、0.3mg/ml。优选地，为0.07～0.2mg/ml；进一步优选地，为0.08～0.15mg/ml；更进一步优选地，为0.1mg/ml。
步骤(b)中，所述消化在摇床中进行，摇床转速为200～600rpm；可以是200～250rpm、300～500rpm、350～400rpm、450～500rpm、500～550rpm、550～600rpm；优选地，为220～460rpm；优选地，为260～380rpm；更优选地，为350rpm。
步骤(b)中，所述消化的时间，摇床转速为0.5～6h；可以是0.5～1h、1～1.5h、1.5～2h、2～2.5h、2.5～3h、3～3.5h、3.5～4h、4～4.5h、4.5～5h、5～6h；优选地，为1～3.5h；优选地，为1.5～3h；更优选地，为2h。
步骤(b)中，在消化后，加入含有血清的DMEM培养基终止消化时，可以上下吹打，对于上下吹打的次数不宜太多，例如，不超过15次，优选为10～15次，以免对组织细胞产生损伤。
步骤(c)中，所述过滤的步骤包括，将所述消化后的悬液依次通过90～120μm、60～80μm的过滤膜进行过滤；优选地，依次通过100μm、70μm的过滤膜进行过滤。
步骤(c)中，获得所述细胞悬液后，将所述细胞悬液与基质胶混合，接种到如上所述的培养基进行培养。其中，所述混合的操作在0～10℃进行；可以是0℃、2℃、4℃、6℃、8℃、10℃。
步骤(c)中，所述培养的温度为28～40℃；可以是28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃。优选地，为32～38℃；进一步优选地，为37℃。
步骤(c)中，所述培养的温度为5～10d；可以是5、6、7、8、9、10d。优选地，为6～8d；进一步优选地，为6d。
步骤(c)中，先将接种后的培养板倒置培养至基质胶形成圆顶状结构后，再正置在培养箱中进行培养。
本发明通过上述方法能够培养获得所述唾液腺腺样囊性癌类器官，即原代唾液腺腺样囊性癌类器官，将所述原代唾液腺腺样囊性癌类器官继续进行传代培养，获得传代唾液腺腺样囊性癌类器官；所述传代的次数不做限制，如可以进行一次、二次、三次及以上传代，只要能实现培养具有目标性质的唾液腺腺样囊性癌类器官即可，优选地，可进行一次、二次、三次传代。
所述传代的步骤包括：
将基质胶融化，离心弃上清，去除基质胶，加胰酶消化，获得含细胞或合适大小细胞团块的细胞悬液，然后进行传代培养，培养步骤和方法同原代唾液腺腺样囊性癌类器官。
在一些优选实施方式中，所述传代的步骤包括：弃原培养基，用预冷的PBS-1将基质胶融化，轻轻吹打下基质胶和类器官的混合物并转移至离心管中，离心弃上清后，加PBS-1第一次重悬并离心弃上清，以将基质胶去尽，加2～3ml胰酶(苏州新赛美生物科技有限公司)重悬沉淀消化球体3min，终止消化。离心弃上清，之后再用PBS-1第二次重悬沉淀。显微镜下计数板计数，根据计数结果加适量培养基重悬细胞沉淀；之后进行接种、培养，步骤同原代唾液腺腺样囊性癌类器官。在一些更优选实施方式中，前述PBS-1第一次重悬后，如有部分小球在悬液中，还有部分大球下沉，可以将含小球的上清先转移到另一个离心管，将含有大球的PBS-1悬液、离心弃上清，之后用胰酶消化后转移至含小球的离心管中进行离心；这样可以一定程度上保留部分原来的小球和单细胞，并且能把大球消化成小球或者单细胞，小球的存在可以一定程度上利于更快更易长出类器官。
本发明中，PBS-1是指添加5v％青链霉素双抗的PBS。
本发明中，所述唾液腺腺样囊性癌肿瘤组织选自人。
本发明中，v％是指某物质的体积百分比。例如，以Advanced DMEM/F12为基准的0.5～2v％青霉素-链霉素双抗，是指在100mL Advanced DMEM/F12中，青霉素-链霉素双抗的体积为0.5～2mL。
相对于现有技术，本发明的有益效果包括：
本发明提供一种唾液腺腺样囊性癌类器官，尤其是一种来源于人腮腺的腺样囊性癌类器官疾病模型。
本发明的唾液腺腺样囊性癌类器官的细胞组织形态学和蛋白分子标志物的表达与临床样本相似，可用于模拟真实唾液腺腺样囊性癌细胞的生存微环境，可以有效地维持细胞组织特异性，细胞组织形态和蛋白表达高度一致；可用于筛选唾液腺腺样囊性癌的治疗药物、研究唾液腺腺样囊性癌发生发展机制、筛选唾液腺腺样囊性癌相关生物标志物等，不仅满足科学研究需要，而且在临床用药指导方面提供有益选择。
本发明针对于唾液腺腺样囊性癌来源细胞的生长特点，采用的培养基中多种细胞因子成份按照特定比例进行复配，各组分协同配合，使唾液腺腺样囊性癌细胞能够在较短的时间内如4～5天即可形成与真实肿瘤组织形态和性质接近的3D类器官。
通过本发明的培养基及培养方法，可以使得唾液腺腺样囊性癌组织进行多次传代培养，且传代后能保持原代唾液腺腺样囊性癌3D类器官的形态和性质，从而满足大规模复制唾液腺腺样囊性癌类器官的需求。
附图说明
图1为实施例1唾液腺腺样囊性癌原代培养类器官培养(P1)第8天的镜下观察图(10×)，四幅小图分别为不同视野下形态大小不一的唾液腺腺样囊性癌类器官。
图2为实施例1唾液腺腺样囊性癌第2代类器官培养第22天不同视野下的镜下观察图(分别为4×、10×、20×、40×)。
图3A为实施例1唾液腺腺样囊性癌第2代类器官培养第13天时HE染色结果(HE，20×)。
图3B为实施例1患者肿瘤组织样本石蜡切片HE染色结果(HE，20×)。
图4A为实施例1唾液腺腺样囊性癌第2代类器官培养第13天时CK7、CK14、MYB、S100、CK-PAN、P63蛋白表达和细胞增殖指标Ki67免疫组织化学染色结果(免疫组化，40×)。
图4B为实施例1患者肿瘤组织样本石蜡切片CK7、CK14、MYB、S100、CK-PAN、P63蛋白表达和细胞增殖指标Ki67的免疫组织化学染色结果(免疫组化，20×)。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的优点与功效。本发明还可通过其它不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明人经过大量实验深入研究，提供了一种唾液腺腺样囊性癌类器官的体外构建方法及应用，提取人腮腺唾液腺腺样囊性癌细胞，并诱导构建类器官，镜下观察其形态，通过HE染色、免疫组化观察及验证唾液腺腺样囊性癌类器官组织细胞形态、蛋白表达状况，获得与患者肿瘤样本组织细胞形态、蛋白表达等高度一致的类器官。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
本实施例中，PBS是指磷酸盐缓冲液(品牌Gibco)。
PBS-1是指添加5v％青链霉素双抗的PBS。
实施例1唾液腺腺样囊性癌类器官培养
标本来源为上海交通大学附属第九人民医院口腔颌面头颈肿瘤科，一例52岁的女性唾液腺腺样囊性癌患者，原发灶位于腮腺。冷冻活检术前，征得患者本人及监护人同意，签署知情同意书，术后病理诊断为：唾液腺腺样囊性癌。
(1)具体培养方法
(1.1)组织保存
将活检样本迅速装入含有组织保存液的离心管中，保存液的主要成分为DMEM(上海源培生物科技股份有限公司)，并向其中加入两性霉素B(在保存液中的浓度为500ng/ml)(苏州新赛美生物科技有限公司)和占保存液5v％的青霉素-链霉素双抗(Gibco)。离心管装入冰盒中送至实验室。
(1.2)组织破碎
在生物安全柜内操作，将唾液腺腺样囊性癌组织转移至培养皿中，用含有5v％青霉素-链霉素双抗的PBS-1溶液浸泡组织约10分钟。转移至新的组织洗涤液即PBS-1溶液的培养皿中，去除包膜组织。将组织剪成约1mm^3大小的组织碎块。
(1.3)组织消化
将组织碎块转移到含有消化酶(2mg/mlⅡ型胶原酶(Gibco)和0.1mg/ml DNase I(Applichem))的50ml离心管中，在37℃摇床350rpm消化2h，获得较多细胞沉淀，并且无细胞粘连的情况。之后加有血清DMEM培养基终止消化，上下吹打10～15次，以进一步促进组织破碎。
(1.4)过滤
将消化后的悬液依次用100μm、70μm滤网进行过滤，得到细胞悬液；200g离心3min弃上清，将细胞沉淀用PBS-1重悬沉淀之后，显微镜下计数板计数，根据计数结果加适量预设培养基重悬细胞沉淀。
其中，所述预设培养基各成分配比：500ml Advanced DMEM/F12(Gibco)，1v％的青霉素-链霉素双抗(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco)、1v％的GlutaMAX(Gibco)、1v％的HEPES缓冲液(Gibco)，成纤维生长因子(FGF-10)100ng/ml(MCE)、EGF 50ng/ml(MCE)、A83-01 0.1μmol/l(MCE)、Wnt3a重组蛋白500ng/ml(MCE)、Noggin重组蛋白0.1μg/ml(MCE)、R-spondin-1重组蛋白0.1μg/ml(MCE)、N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)1mmol/L(MCE)，烟酰胺(Nicotinamide)10mmol/L(MCE)，2v％B27补充剂(MCE)、地塞米松(Dexamethasone)(MCE)1μmol/L、1v％N-2补充剂(MCE)、Y-27632(Rock抑制剂)10μmol/l；其中，所述培养基中，除Advanced DMEM/F12外，其他组分的用量如百分含量或浓度均以Advanced DMEM/F12为基准进行说明；B27补充剂为50XB27补充剂；N-2补充剂为100XN-2补充剂。
(1.5)接种
取适量细胞悬液与基质胶(低生长因子型Matrigel，Corning公司)混合，其中，每40μl基质胶混合物中约含10^4个细胞，接种于24孔细胞培养板(NEST)中，每孔加入40μl基质胶混合物。
本发明中，由于基质胶在0～10℃时处于液态，温度变高时凝固，故需要在冰上进行基质胶的相关操作，同时最好用预冷的枪头在最短时间内完成基质胶跟细胞悬液的混合以防止基质胶凝固。
(1.6)原代唾液腺腺样囊性癌类器官培养
将接种后的24孔板倒置放置于37℃培养箱(Thermo Fisher)中约40min，待胶体凝固，将24孔板正置，每孔加450ul如上步骤(1.4)中所述的培养基。放回37℃培养箱培养。之后每2～3天更换一次培养基。
上述倒置操作更有利于基质胶形成圆顶状结构，并且贴壁牢固。期间倒置显微镜镜下观察类器官，一般在2周内，如果类器官不会再变大则进行传代。传代比例是24孔板中1：6(即一个孔中的原代唾液腺腺样囊性癌类器官传代至新的24孔板中的6个孔中)。
(1.7)唾液腺腺样囊性癌类器官传代
弃原培养基，用预冷的PBS-1将基质胶融化，轻轻吹打下基质胶和类器官的混合物并转移至离心管中，离心弃上清后，加PBS-1重悬并离心弃上清，以将基质胶去尽，加2～3ml胰酶(苏州新赛美生物科技有限公司)重悬沉淀消化球体3min(每隔1min，可以用枪头轻轻吹打几下，以进一步促进消化)，终止消化。离心弃上清，之后再用PBS-1重悬沉淀。镜下计数板计数，根据计数结果加适量培养基重悬细胞沉淀；之后进行接种、培养，步骤同原代唾液腺腺样囊性癌类器官。
(2)唾液腺腺样囊性癌类器官形态观察
在倒置显微镜镜下观察不同生长代数唾液腺腺样囊性癌类器官的形态并摄图。原代(P1)唾液腺腺样囊性癌类器官培养至第8天的形态如图1所示：类器官形状呈圆球状，边缘连续。传代后获得第2代(P2)唾液腺腺样囊性癌类器官，P2代培养至第22天时镜下表现见图2，相对于图1，图2中传代后的P2代类器官的组织细胞形态基本保持不变。
(3)唾液腺腺样囊性癌类器官细胞形态及蛋白表达鉴定
将P2代腺样囊性癌类器官培养第2代第13天，然后收获培养的腺样囊性癌类器官，进行HE染色(图3A)，其染色结果与图3B所示的临床患者肿瘤组织HE染色结果(资料调自上海市第九人民医院组织样本库)进行组织形态学对比。由图3A和3B对比可知，采用本发明的方法培养的类器官的形态与临床样本相似。
将P2代腺样囊性癌类器官培养第2代第13天，然后收获培养的腺样囊性癌类器官，进行相关分子标志的免疫组织化学染色(图4A)，组织形态学显示分子标志物(如CK7、CK14、Ki67、MYB、S100、CK-PAN、P63)染色结果与图4B所示的临床患者肿瘤组织(资料调自上海市第九人民医院组织样本库)进行组织形态学对比。由图4A和4B对比可知，采用本发明的方法培养的类器官与临床样本相似。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种培养唾液腺腺样囊性癌类器官的培养基，其特征在于，所述培养基包括：Advanced DMEM/F12，以及以Advanced DMEM/F12为基准的以下成分：0.5～2v％青霉素-链霉素双抗、0.5～2v％GlutaMAX、0.5～2v％HEPES缓冲液，50～300ng/ml成纤维生长因子、10～200ng/ml EGF、0.01～1μmol/l TGF-βI型受体抑制剂、300～800ng/ml Wnt3a重组蛋白、0.05～0.3μg/ml Noggin重组蛋白、0.05～0.3μg/ml R-spondin-1重组蛋白、0.2～2.5mmol/L N-乙酰半胱氨酸，5～30mmol/L烟酰胺(Nicotinamide)，0.5～5v％B27补充剂，0.2～5μmol/L地塞米松，5～30μmol/l Y-27632。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，还包括N-2补充剂。
3.如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述N-2补充剂的含量占Advanced DMEM/F12的体积百分数为0.5～3％。
4.如权利要求1～3任一项所述的培养基在培养唾液腺腺样囊性癌类器官中的应用。
5.一种唾液腺腺样囊性癌类器官的培养方法，其特征在于，所述方法包括，将破碎后的唾液腺腺样囊性癌肿瘤细胞采用如权利要求1～3任一项所述的培养基进行培养，获得所述的唾液腺腺样囊性癌类器官。
6.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)组织破碎
将唾液腺腺样囊性癌肿瘤组织进行破碎，获得组织碎块；
(b)组织消化
采用消化酶消化所述的组织碎块，获得悬液；
所述消化酶包含Ⅱ型胶原酶和DNase I；优选地，所述消化酶包含0.8～4mg/mlⅡ型胶原酶和0.05～0.3mg/ml DNase I；
(c)过滤
对消化后的悬液进行过滤，弃上清，重悬沉淀获得细胞悬液，接种并培养。
7.如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，包括以下1)～6)之至少一项：
1)步骤(b)中，所述消化在摇床中进行，摇床转速为150～500rpm；
2)步骤(c)中，所述过滤的步骤包括：将所述消化后的悬液依次通过90～120μm、60～80μm的过滤膜进行过滤；优选地，依次通过100μm、70μm的过滤膜进行过滤；
3)步骤(c)中，获得所述细胞悬液后，将所述细胞悬液与基质胶混合，接种到如权利要求1～3任一项所述的培养基进行培养；优选地，所述混合的操作在0～10℃进行；
4)步骤(c)中，所述培养的温度为28～40℃；
5)步骤(c)中，所述培养的时间为5～10d；
6)步骤(c)中，先将接种后的培养板倒置培养至基质胶形成圆顶状结构后，再正置在培养箱中进行培养。
8.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，培养获得的所述唾液腺腺样囊性癌类器官为原代唾液腺腺样囊性癌类器官，将所述原代唾液腺腺样囊性癌类器官传代，获得传代唾液腺腺样囊性癌类器官；
所述传代的步骤包括：将基质胶融化，离心弃上清，去除基质胶，加胰酶消化，进行传代培养，培养步骤和方法同所述原代唾液腺腺样囊性癌类器官。
9.采用如权利要求5～8任一项所述的方法制备得到的唾液腺腺样囊性癌类器官。
10.如权利要求9所述的唾液腺腺样囊性癌类器官的如下至少一项应用：
1)制备或筛选治疗唾液腺腺样囊性癌的药物；
2)研究唾液腺腺样囊性癌的发生发展机制；
3)筛选唾液腺腺样囊性癌的相关生物标志物。
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