CN117660348A - 一种唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型的构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体为一种唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型的构建方法及其应用，该方法包括以下步骤：配制培养基：配制唾液腺恶性肿瘤类器官的培养基；组织解离与消化：获取肿瘤标本组织，利用解离酶1和解离酶2对组织进行解离与消化，获得单细胞；所述解离酶1和解离酶2成分不同、且均具有解离与消化的作用；类器官培养：所述单细胞进行种板，传代，在所述培养基上实现类器官多代培养；构建唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型：125I放射性粒子干预类器官，预估唾液腺恶性肿瘤类器官对放射性粒子干预后的敏感程度，以期预测临床治疗方案的效果，实现精准预测放射治疗对肿瘤的杀伤情况的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型的构建方法和应用。
背景技术
唾液腺恶性肿瘤(Salivary GlandMalignant Tumors)是口腔颌面部常见恶性肿瘤之一，组织病理类型复杂，不同类型的肿瘤在临床和影像表现、诊断、治疗以及预后方面均有不同。根据肿瘤的生物学行为，可将其分为三大类：
①高度恶性肿瘤：颈淋巴结及远处转移率较高，术后易复发，预后差，包括低分化黏液表皮样癌(MEC)、腺样囊性癌(ACC)。②低度恶性肿瘤：颈淋巴结转移率较低，术后可出现复发，预后相对较佳，包括腺泡细胞癌(AciCC)、高分化黏液表皮样癌(MEC)。③中度恶性肿瘤：介于上述两者之间。
发生在口腔颌面部的唾液腺恶性肿瘤治疗难度较大，目前临床上的一线治疗方案还是以手术为主，结合化学药物治疗与放射治疗的综合治疗方案。但根治性手术常并发解剖结构缺陷、颌面部功能障碍等，药物治疗也常常出现耐药现象，常规远距离放疗也有可能损害正常组织，精准性有待进一步优化。而且对于一些局部晚期、低分化及有大量淋巴结转移，或手术治疗意义不大的患者，确定除手术以外的更为精准的个性化的综合治疗方案，对降低患者术后肿瘤复发及转移，提高患者预后及生存质量具有十分重要的临床及社会意义。肿瘤治疗失败的主要原因之一是肿瘤的异质性，与肿瘤的复发转移以及耐药密切相关。目前研究唾液腺恶性肿瘤的体外模型建立中的主力军是肿瘤细胞系，但它并不能良好反映肿瘤的特征，而患者源性的肿瘤类器官(patient-derived tumor organoid，PDTO)因保留了肿瘤的异质性，能最大程度还原与体内高度一致的肿瘤微环境，已在其他肿瘤的研究模型中被证实具有基础与临床转化的能力，在唾液腺恶性肿瘤的个体化治疗中提供了优秀的临床前体外模型。
125I放射性粒子植入治疗作为一种高度适形的近距离放疗技术，是将放射源125I放射性粒子植入肿瘤内或者受累组织内，利用放射源持续发出的低能射线，进行肿瘤杀伤。其作为近距离放疗技术，拥有常规远距离放疗不具备的优点。有效距离较短，在生物体内仅为1-2cm(体内约为1.7cm)，最大程度降低了对临近正常组织的放射性。近来已在治疗口腔颌面部唾液腺恶性肿瘤方面有了一定的进展。但相关放射学体外实验较少且研究集中在细胞系层面，个体最佳剂量预估、术前疗效评价研究都受到了较大限制。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型构建方法和应用。
一种唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型的构建方法，包括以下步骤：
配制培养基：配制唾液腺恶性肿瘤类器官的培养基；
组织解离与消化：肿瘤标本组织利用解离酶1和解离酶2对组织进行解离与消化，获得单细胞；所述解离酶1和解离酶2成分不同、且均具有解离与消化的作用；
类器官培养：所述单细胞进行种板，传代，在所述培养基上实现类器官多代培养；
构建唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型：125I放射性粒子干预类器官。
优选的，所述培养基包括：基础培养基Advance DMEM/F12和相关功能组分；
所述相关功能组分为：HEPES缓冲液，0.5-2X；GlutaMAXTM，0.5-2X；N2补充剂，0.5-2X；青霉素-链霉素-两性霉素溶液，0.5-2X；B27补充剂，0.5-2X；N-乙酰半胱氨酸，0.5-2.5mmol/L；烟酰胺，5-30mmol/L；Rock抑制剂5-20μmol/L；重组Human R-Spodin-1蛋白，0.05-0.25μg/ml；重组Human Noggin蛋白，0.05-0.2μg/ml；重组Human Wnt-3A蛋白，0.05-0.2μg/ml；
Prostaglandin E2，0.05-0.2μg/ml；A83-01，0.2-1μmol/L；HumanFGF-10，5-20ng/ml；Human EGF，30-100ng/ml；Butylatedhydroxyanisole，2-8ng/ml；Gastrin I，0.01μmol/L。
优选的，相关功能组分在所述培养基中的优选浓度为：HEPES缓冲液，1X；GlutaMAXTM，1X；N2补充剂，1X；青霉素-链霉素-两性霉素溶液，1X；B27补充剂，1X；N-乙酰半胱氨酸，1.25mmol/L；烟酰胺，10mmol/L；Rock抑制剂，10μmol/L；重组Human R-Spodin-1蛋白，150ng/mL；重组Human Noggin蛋白，100ng/mL；重组Human Wnt-3A蛋白，100ng/mL；Prostaglandin E2，1μmol/L；A83-01，0.5μmol/L；Human FGF-10，10ng/mL；Human EGF，50ng/mL；Butylated hydroxyanisole，5ng/mL；Gastrin I，0.01μmol/L。
优选的，所述解离酶1为无血清的DMEM、5mg/mL的Ⅱ型胶原酶和10μg/mL的DNaseⅠ的混合物。
优选的，所述解离酶2为0.25％胰蛋白酶-EDTA(1X)和10μg/mL的DNaseⅠ的混合物。
优选的，解离与消化时，组织经所述解离酶1消化三次后，再使用所述解离酶2消化类器官培养时，所述单细胞与所述培养基的用量比为细胞总数(1.6-2.0)*105个：5000-6000μL。
优选的，125I放射性粒子干预类器官3-5天。
所述的构建方法构建得到的唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型。
所述的唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型在预测放射治疗对肿瘤的杀伤情况中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明实现了培养出能够高度保留患者来源唾液腺恶性肿瘤异质性的立体类器官、并在类器官平台上个体化建立粒子放射学模型，精准预测放射治疗对肿瘤的杀伤情况的目的。
附图说明
图1为患者来源的唾液腺恶性肿瘤类器官培养形态(以腺样囊性癌为例)，其中，1A为口腔腺样囊性癌类器官原代培养至第7天镜下影像；1B为传代后第4代口腔腺样囊性癌类器官原代培养至第7天镜下影像；
图2为10X镜下图，其中，2A为MEC-1原代第5天镜下图，图2B为MEC-1原代复苏后第12天镜下图10X；
图3为切片HE染色图像(以腺样囊性癌为例)，其中，3A为原代口腔腺样囊性癌类器官切片HE染色图像，3B为P4代口腔腺样囊性癌类器官切片HE染色图像，3C为患者肿瘤样本切片HE染色图像；
图4为口腔原代腺样囊性癌类器官切片免疫组化图像；
图5为P4代口腔腺样囊性癌类器官切片免疫组化图像；
图6为患者口腔腺样囊性癌肿瘤样本切片免疫组化图像；
图7为其中7A为125I对ACC PDTO组织形态影响图；
图8为125I对AciCC-1PDTO组织形态影响图；
图9为125I对MEC-1PDTO组织形态影响图；
图10为不同放射天数的125I对PDTO活性的影响，其中A为125I对ACC PDTO的活性抑制曲线，B为125I对AciCC-1PDTO的活性抑制曲线，C为125I对AciCC-2PDTO的活性抑制曲线，D为125I对MEC-1PDTO的活性抑制曲线，7H为125I对MEC-2PDTO的活性抑制曲线。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明提供一种体外3D培养唾液腺恶性肿瘤类器官近距离放射学模型的构建方法及应用，通过解离消化临床切取的唾液腺恶性肿瘤组织(包括口腔腺样囊性癌(ACC)、口腔腺泡细胞癌(AciCC)、口腔黏液表皮样癌(MEC))获得原代单细胞悬液，诱导成球构建类器官，并于镜下观察组织形态，通过HE染色、免疫组化等技术观察并验证唾液腺恶性肿瘤类器官组织细胞形态、蛋白表达状况，获得高度保留患者肿瘤异质性的类器官，并以构建成功的类器官模型为基础，针对唾液腺不同恶性肿瘤类型构建125I粒子放射学模型，评价125I粒子放射性粒子干预后对不同类器官活性的影响。
本发明中所公开的实验方法、制备方法、检测方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术、多功能酶标仪检测技术及相关领域的常规技术。
本发明所取肿瘤标本来源于临床患者的活检术中，相关课题已经过本医院医学伦理道德委员会批准并同意立项。
本发明所采用的试剂：Advance DMEM/F12基础培养基，HEPES缓冲液，GlutaMAXTM，N2补充剂，B27补充剂购自ThermoFisher公司。
本发明所采用的试剂：N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)，重组Human R-Spodin-1蛋白，重组HumanNoggin蛋白，重组HumanWnt-3A蛋白，A83-01，Human FGF-10，Gastrin I均购自MCE公司。
本发明所采用的试剂：烟酰胺(Nicotinamide)，Prostaglandin E2，Butylatedhydroxyanisole均购自Sigma公司
本发明所采用的试剂：Rock抑制剂(Y-27632)购自Selleck公司。
本发明所采用的试剂：Human EGF购自Peprotech公司
本发明所采用的试剂：青霉素-链霉素-两性霉素溶液购自Beyotime公司。
本发明所采用的试剂：125I放射性粒子购自长欣医疗公司。
本发明所采用的试剂：CellTiter-Glo试剂盒购自Promega公司。
由于本发明所采用的唾液腺恶性肿瘤组织是人源性的，因此本发明提供的培养基针对唾液腺恶性肿瘤的培养生长特点所选用的细胞因子均为人源，且均为商品化产品，减少了传统肿瘤类器官培养时使用自行培育的条件培养基提供细胞因子带来的成分误差。
本发明的培养基是按照特定比例对所选的细胞因子进行复配获得的终培养基，成本较低、操作较简便，可重复，已证明经过多次传代培养的类器官，依然能够保留肿瘤异质性，维持类器官的细胞形态，蛋白表达等功能特性接近于原始肿瘤组织。
本发明提供的唾液腺恶性肿瘤类器官培养基作为基础，构建近距离放射学模型进行放射学体外实验，评估肿瘤的恶性程度，术前预估PDTO对放射性粒子干预后的敏感程度，一定程度上预测临床治疗方案的效果，预估个体最佳剂量率，为实现个体化精准治疗提供有力的数据支持。
本发明中“X”指浓缩倍数。将购买的试剂配制成优选浓度时，需要利用特定的试剂将原浓度稀释成优选浓度的倍数。不同的试剂盒内配备不同的特定试剂，通常是PBS或者去离子水，按照购买试剂时试剂盒内给定的特定试剂进行稀释即可。
本发明使用24孔板时，由于设置间隔最终使用了10个孔，因此向24孔板中添加物质时以10个孔计。
实施例1
一种培养唾液腺恶性肿瘤类器官培养基包括：基础培养基Advance DMEM/F12和相关功能组分，其中相关功能组分在培养基中的优选浓度组成为：HEPES缓冲液，1X；GlutaMAXTM，1X；N2补充剂，1X；青霉素-链霉素-两性霉素溶液，1X；B27补充剂，1X；N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)，1.25mmol/L；烟酰胺(Nicotinamide)，10mmol/L；Rock抑制剂(Y-27632)，10μmol/L；重组Human R-Spodin-1蛋白，150ng/mL；重组Human Noggin蛋白，100ng/mL；重组Human Wnt-3A蛋白，100ng/mL；Prostaglandin E2，1μmol/L；A83-01，0.5μmol/L；Human FGF-10，10ng/mL；Human EGF，50ng/mL；Butylated hydroxyanisole，5ng/mL；Gastrin I，0.01μmol/L。
实施例2
唾液腺恶性肿瘤类器官的培养及其放射学模型的建立和应用
以一例腮腺腺样囊性癌为例
标本取自徐州市中心医院口腔科，一例女性腺样囊性癌患者，术前结合临床表现、影像学检查及细针穿刺活检等初步诊断为腺样囊性癌，术前经患者本人及家属充分知情同意后，签订知情同意书。
具体培养方法：
(1)组织材料
患者肿瘤标本组织用肿置于无菌离心管内，在2000rpm下进行4℃低温离心5min，弃上清，取组织沉淀进行解离。
(2)组织解离与消化
解离酶配制：
解离酶1：无血清的DMEM(南京凯基生物科技)+5mg/mL的Ⅱ型胶原酶+10μg/mL的DNaseⅠ；
解离酶2：0.25％胰蛋白酶-EDTA(1X)(ThermoFisher)+10μg/mL的DNaseⅠ。
取(1)中所获得的组织碎片沉淀，加入5mL解离酶1，吹打混匀，置于37℃恒温水浴摇床中15min，摇床转速为300-400rpm，每5分钟吹打混匀一次，在2000rpm下进行4℃低温离心5min，弃上清，此为一次消化，取第一次消化完得到的组织沉淀加入5mL解离酶1继续消化，共消化三次。
经解离酶1消化三次后，在离心沉淀内加入5mL解离酶2，吹打混匀，置于37℃恒温水浴摇床中消化10min，摇床转速为300-400rpm，每5分钟吹打混匀一次，加5mL含10％血清的DMEM培养基混匀，终止消化，收集悬液依次用100μm、70μm的细胞过滤器(BD)进行过滤。在2000rpm下进行4℃低温离心5min，弃上清。
所获沉淀可见较多红色，加入3mL红细胞裂解液(Beyotime)吹打混匀，置于37℃恒温水浴摇床中5min，摇床转速为300-400rpm，获得悬液，在所获悬液中加入10mL PBS溶液稀释终止裂解，在2000rpm下进行4℃低温离心5min，弃上清，在沉淀内加2mL实施例1的唾液腺恶性肿瘤类器官培养基，吹打混匀。
需要说明的是，若沉淀中无红色则不用加3mL红细胞裂解液。
(3)类器官培养
取(2)中吹打混匀的细胞悬液(细胞沉淀和2ml培养基的混合液)，于显微镜下细胞计数，取约1.9*105个细胞的悬液，对该悬液在2000rpm下进行4℃低温离心5min，弃上清，进行种板。
种板：在冰上用预冷、去尖枪头取300μL解冻基质胶Matrigel与重悬沉淀轻轻混匀，避免产生气泡；在提前经37℃培养箱预热好的24孔板(NEST，非TC)中，每孔加入50μL细胞沉淀与基质胶的悬液，先倒置培养5min，
(3-5min)待基质胶形成圆顶结构后，再正置于培养箱中培养30min。待基质每2-3天更换类器官培养基，即换液，并于镜下检测类器官污染情况及拍照记录类器官生长状态。镜下测量大多数球体直径达100μm左右标志着类器官成熟，此时进行P0代的传代。
传代：用移液枪小心弃掉原培养基，每孔加入1000μL预冷D-PBS溶液，去尖枪头反复吹打破坏基质胶，并移至15mL离心管中，在2000rpm下进行4℃低温离心5min，弃上清，加入3mL解离酶2重悬沉淀并混匀，置于37℃恒温水浴摇床中10min，摇床转速为300-400rpm，每5分钟吹打混匀一次，加入5mL含10％血清的DMEM培养基混匀终止消化，收集悬液依次经100μm、70μm的细胞过滤器进行过滤得到单细胞。
所获单细胞与基质胶重悬再次进行种板得到P1代，P1代传代、种板得到P2代，以此类推，多次进行传代、种板，直至唾液腺恶性肿瘤PDTO稳定传代，在本实施例中得到P3代。
需要说明的是，换液时用移液枪小心弃掉原培养基，每孔加入1000μL预冷D-PBS溶液轻柔荡洗后，移除并加入500μL新培养基。全程注意勿破坏基质胶。
每日于镜下检测类器官污染情况及拍照记录类器官生长状态，待类器官培养成熟时，可进行传代、冻存、固定及鉴定。镜下测量大多数球体直径达100μm左右标志着类器官成熟，正常培养时长为10-14天，如镜下未形成球形且直径未达100μm可再延长1-2w培养周期。
传代比例正常为24孔板一个孔中的原代唾液腺恶性肿瘤类器官传代至新的24孔板中的4-6个孔中，即1：4-6，具体传代比例以实际细胞计数为主。
传代后需冻存时：先计算剩余细胞悬液中细胞数量，配置细胞冻存液：90％FBS胎牛血清+10％DMSO，在2000rpm下进行4℃低温离心5min，弃上清，加入冻存液重悬混匀细胞沉淀后移至冻存管内，1*105个细胞/mL/管，梯度冻存。梯度冻存：4℃冰箱5min→-20℃冰箱存30min→-80℃冰箱存过夜→液氮桶长期冻存。
(3)125I粒子构建唾液腺恶性肿瘤PDTO放射学模型
本实施例举例的是将P2代腺样囊性癌类器官培养成熟后传代接种于10个96孔板中的D6、F6、E5、E7四个孔中，共计40个孔，待96孔板中的P3代腺样囊性癌类器官培养至生长汇合度达50％时换液。
对10个96孔板进行随机分组，5板作为空白对照组，不放置125I放射性粒子进行干预；另外5板作为实验组，在96孔板中的E6孔各放置10颗125I放射性粒子进行干预，建立125I粒子离体唾液腺恶性肿瘤PDTO放射模型。
对作为实验组的5个96孔板给予125I放射性粒子干预，分别在干预1d、2d、3d、4d、5d后，根据美国医学物理学会经验公式计算即累积剂量分别为1448.45cGy、2880.15cGy、4295.30cGy、5694.09cGy、7076.71cGy时停止125I粒子干预，并收取样本。
需要说明的是，构建时将稳定传代至二代及以上代数的唾液腺恶性肿瘤PDTO培养成熟后传代接种于96孔板中的D6、F6、E5、E7孔中进行种板，种板步骤同上。种板比例为24孔板内8个孔中的二代或三代唾液腺恶性肿瘤类器官传代至10板96孔板中，本申请使用的是三代唾液腺恶性肿瘤类器官，每板接种4个孔，共40个孔，即1：5(8：40)，具体传代比例以实际细胞计数为主。
结果
镜下观察腺样囊性癌形态并拍照记录
每日在倒置显微镜镜下观察不同代数腺样囊性癌类器官的污染情况及生长形态，并拍照记录，结果见图1。
图1(A)为口腔腺样囊性癌类器官原代培养至第7天镜下影像，可见多数腺样囊性癌肿瘤干细胞呈球形生长。图1(B)为传代后第4代(P4代)口腔腺样囊性癌类器官原代培养至第7天镜下影像；通过图1(A)、(B)比对，传代后腺样囊性癌类器官的生长速度和形态与原代类器官相似，无显著差异。
图2为黏液表皮样癌-1液氮复苏前后镜下比对图，其中，图2(A)为MEC-1原代第5天镜下图，图2(B)为MEC-1原代复苏后第12天镜下图，比对2(A)和2(B)可知，经液氮冻存后的原代细胞通过复苏后培养，延长培养周期后可以观察到和冻存前一致的球体结构。
口腔腺样囊性癌类器官的组织学鉴定
将原代、P4代口腔腺样囊性癌类器官培养至第10天进行固定、包埋、切片，并取患者肿瘤组织切片，患者肿瘤样本切片来自徐州市中心医院病理科档案库，对所获得切片进行HE染色比对细胞形态，结果见图3，将所获得切片进行蛋白表达(P63、C-Kit、CK7、CD43、VIM)和细胞增殖指数Ki67表达的免疫组织化学染色，结果见图4。
如图3所示，图3(A)为原代腺样囊性癌类器官切片HE染色图像；图3(B)为P4代腺样囊性癌类器官切片HE染色图像；图3(C)为患者肿瘤样本切片HE染色图像。比对显示原代腺样囊性癌类器官细胞组织形态与来源肿瘤样本相似，且传代后仍可保留。
如图4所示，图4为原代腺样囊性癌类器官切片免疫组化图像；图5为P4代腺样囊性癌类器官切片免疫组化图像；图6为患者肿瘤样本切片免疫组化图像。比对显示原代类器官蛋白表达和增殖指数表达水平与来源肿瘤样本相近，且多次传代后仍能稳定表达。
125I放射性粒子干预腺样囊性癌PDTO的活性评价
采用CellTiter-Glo试剂盒(Promega公司)的3D微组织检测法，将CellTiter-Glo试剂分别与实验组和对照组的96孔板中的样本混合后，于摇床震荡5min混匀，室温孵育25min。在多功能酶标仪技术条件下进行细胞活力检测，采用GraphPad Prism9.0软件绘制增殖抑制曲线及计算IC50值，并分别拍照记录不同剂量干预后类器官的形态特征变化，结果见图7-10和表1。
图7-10为镜下记录的125I放射性粒子剂量依赖性抑制类器官生长图，表达了不同放射天数(累积剂量)的125I对唾液腺恶性肿瘤PDTO活性的影响，由图7-10可见，125I放射性粒子可剂量依赖性地抑制唾液腺恶性肿瘤类器官(腺样囊性癌、黏液表皮样癌、腺泡细胞癌)类器官的生长，且不同肿瘤类型的类器官对125I放射性粒子的敏感性不同，同种肿瘤类型的不同患者个体的类器官的敏感性也不同；表1为125I放射性粒子对唾液腺恶性肿瘤PDTO增殖抑制作用的IC50均值(cGy)，其中腺泡细胞癌对125I放射性粒子的敏感性明显高于其他肿瘤类器官，且腺泡细胞癌-2这个患者个体对125I放射性粒子的敏感度更高。图7-10及表1内含数据包括本发明中展示的腺样囊性癌以及额外的两例口腔黏液表皮样癌、两例口腔腺泡细胞癌，共五例。
表1125I放射性粒子对唾液腺恶性肿瘤PDTO增殖抑制作用的IC50均值(cGy)
| 组别 | IC50 |
| ACC | 8508 |
| AciCC-1 | 6053 |
| AciCC-2 | 5203 |
| MEC-1 | 10379 |
| MEC-2 | 7743 |
本发明提供的唾液腺恶性肿瘤类器官培养基中各种细胞因子和调控因子直接互相影响，并相互配合，结合按比例配置的消化酶和独特的消化方法以及接种培养方法，能解决唾液腺恶性肿瘤(包括腺样囊性癌、黏液表皮样癌、腺泡细胞癌)原代细胞培养困难的问题，并通过倒置显微镜下观察类器官组织形态、HE染色、免疫组化等技术，鉴定了所培养的唾液腺恶性肿瘤类器官可以在细胞形态和蛋白表达上高度保留并还原了患者来源的唾液腺恶性肿瘤的功能表达和异质性。
本发明在种板后正置培养板之前的倒置操作可以极大避免肿瘤细胞在基质胶固化前沉底贴壁。种板选用的非TC培养板可减少底层细胞贴壁，较TC培养板更利于3D培养细胞成球。
本发明已通过多次实践证实，置于液氮中长期冻存的原代唾液腺恶性肿瘤类器官细胞经复苏后稍微延长1-2w培养周期仍可保持细胞活性并扩增成类器官。
本发明在传代接种于96孔板的D6、F6、E5、E7孔中时，应将基质胶接种于孔中间的位置，确保125I粒子等量等距均匀放射每个板内的4个实验孔；本发明在设置对照组与实验组的数量时参照干预的天数决定，实际情况可根据具体的细胞计数、预期干预的时间和希望达到的累积剂量更改设计。
本发明在利用125I放射性粒子进行干预时应注意个人防护，按照放射实验保护条例规定穿戴铅衣、铅帽、铅围脖等防护用具，注意个人防护。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
配制培养基：配制唾液腺恶性肿瘤类器官的培养基；
组织解离与消化：肿瘤标本组织利用解离酶1和解离酶2进行解离与消化，获得单细胞；所述解离酶1和解离酶2成分不同、且均具有解离与消化的作用；
类器官培养：所述单细胞进行种板，传代，在所述培养基上实现类器官多代培养；
构建唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型：125I放射性粒子干预类器官。
2.根据权利要求1所述的一种唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型的构建方法，其特征在于，所述培养基包括：基础培养基Advance DMEM/F12和相关功能组分；
所述相关功能组分为：HEPES缓冲液，0.5-2X；GlutaMAXTM，0.5-2X；N2补充剂，0.5-2X；青霉素-链霉素-两性霉素溶液，0.5-2X；B27补充剂，0.5-2X；N-乙酰半胱氨酸，0.5-2.5mmol/L；烟酰胺，5-30mmol/L；Rock抑制剂5-20μmol/L；重组Human R-Spodin-1蛋白，0.05-0.25μg/ml；重组Human Noggin蛋白，0.05-0.2μg/ml；重组Human Wnt-3A蛋白，0.05-0.2μg/ml；
Prostaglandin E2，0.05-0.2μg/ml；A83-01，0.2-1μmol/L；HumanFGF-10，5-20ng/ml；Human EGF，30-100ng/ml；Butylatedhydroxyanisole，2-8ng/ml；Gastrin I，0.01μmol/L。
3.根据权利要求2所述的一种唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型的构建方法，其特征在于，相关功能组分在所述培养基中的优选浓度为：HEPES缓冲液，1X；GlutaMAXTM，1X；N2补充剂，1X；青霉素-链霉素-两性霉素溶液，1X；B27补充剂，1X；N-乙酰半胱氨酸，1.25mmol/L；烟酰胺，10mmol/L；Rock抑制剂，10μmol/L；重组Human R-Spodin-1蛋白，
150ng/mL；重组Human Noggin蛋白，100ng/mL；重组Human Wnt-3A蛋白，100ng/mL；Prostaglandin E2，1μmol/L；A83-01，0.5μmol/L；Human FGF-10，10ng/mL；Human EGF，50ng/mL；Butylatedhydroxyanisole，5ng/mL；
Gastrin I，0.01μmol/L。
4.根据权利要求1所述一种唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型的构建方法，其特征在于，所述解离酶1为无血清的DMEM、5mg/mL的Ⅱ型胶原酶和10μg/mL的DNaseⅠ的混合物。
5.根据权利要求1所述一种唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型的构建方法，其特征在于，所述解离酶2为0.25％胰蛋白酶-EDTA(1X)和10μg/mL的DNaseⅠ的混合物。
6.根据权利要求1所述一种唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型的构建方法，其特征在于，解离与消化时，组织经所述解离酶1消化三次后，再使用所述解离酶2消化。
7.根据权利要求1所述一种唾液腺恶性肿瘤类器官的构建方法，其特征在于，类器官培养时，所述单细胞与所述培养基的用量比为细胞总数(1.6-2.0)*105个：5000-6000μL。
8.根据权利要求1所述一种唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型的构建方法，其特征在于，125I放射性粒子干预类器官3-5天。
9.一种根据权利要求1所述的构建方法构建得到的唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型。
10.权利要求9所述的唾液腺恶性肿瘤类器官放射学模型在预测放射治疗对肿瘤的杀伤情况中的应用。
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