CN115584345B - 确定肿瘤电场治疗参数的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤医疗技术领域，具体而言，涉及一种确定肿瘤电场治疗参数的方法。该方法包括：a)将从受试者体内所获取的包含肿瘤细胞的组织进行3D细胞培养得到细胞群；b)对所述细胞群中的细胞进行电场干预，测量所述细胞球体中的参数，以判断所述电场干预对肿瘤细胞治疗的有效性；以及c)根据所述所测量的参数选择电场治疗参数。

Description

确定肿瘤电场治疗参数的方法
技术领域
本发明涉及肿瘤医疗技术领域，具体而言，涉及一种确定肿瘤电场治疗参数的方法。
背景技术
肿瘤电场治疗(TTFields)是一种新型的肿瘤治疗方法，它通过体外贴敷式电极片，向体内病灶传递中频(100-300kHz)、低场强(1-3V/cm)的交变电场，破坏处于快速分裂状态的肿瘤细胞，是一种便携、有效、低副反应的新型治疗方式。TTFields是一种物理而非化学的模式，这种治疗方式耐受性良好，几乎没有任何毒性。唯一的副作用是电极下的接触性皮炎，这种反应也可能是多种因素综合作用的结果。
目前，大多数恶性肿瘤疗效欠佳，其中一个很重要的原因是肿瘤的异质性。所谓的肿瘤异质性就是，同一肿瘤类型的不同病人间或者同一病人肿瘤内部不同细胞之间存在着多种生物学差异。这种差异决定了同一种肿瘤不同患者之间对同一治疗方案存在着显著的疗效差异，对于个体而言这种标准治疗方案就缺乏相应针对性，具有一定的盲目性。例如，根据文献报道，并不是所有的脑胶质瘤患者都对200kHz电场频率敏感，有研究提到每例原代细胞均存在多个敏感频率，且在相应的敏感频率中均存在一特定的最适频率，结果显示它们各自的最适频率不尽相同，这也就能够理解在临床中某些患者对TTFields出现耐受现象。目前治疗中仪器设置频率固定在200kHz，但根据上述文献提到的可能会存在比200kHz治疗效果更好的频率，也就是说并不是所有的人都对200kHz敏感。因而如何实现更精细、更为个性化的电场治疗是TTFields的一个重要改进方向。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种确定肿瘤电场治疗参数的方法，包括：
a)将从受试者体内所获取的包含肿瘤细胞的组织进行3D细胞培养得到细胞群；
b)对所述细胞群中的细胞进行电场干预，测量所述细胞球体中的参数，以判断所述电场干预对肿瘤细胞治疗的有效性；以及
c)根据所述所测量的参数选择电场治疗参数。
本发明的第二目的在于提供一种肿瘤治疗系统，所述系统包括：
受试者信息处理模块以及输出模块；
所述受试者信息处理模块用于接收采用如上所述方法选择得到的电场治疗参数；
所述输出模块用于接收所述受试者信息处理模块输出的信息，并指导对所述受试者的肿瘤电场治疗的施用参数调整。
本发明通过向3D培养得到的肿瘤球施加不同的电场干预参数，可以明显发现不同电场干预参数的效果上的差异，由此我们发现不同患者来源的3D肿瘤球的电场干预参数存在着差异，因而可采用该方法进行个性化治疗以获得更佳的治疗效果；相比于现有技术，本发明提供的上述确定肿瘤电场治疗参数的方法，由于过程中肿瘤细胞所处的环境更加接近其在人体内的环境，所以本发明提供的上述方法得到的肿瘤细胞的最佳电场干预参数与处于体内肿瘤细胞的最佳电场治疗参数更加接近。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例所提供的不同电场频率对3D胶质瘤肿瘤球GPDC的影响；
图2为本发明一个实施例所提供的不同电场频率对3D胶质瘤肿瘤球G009的影响；
图3为本发明一个实施例所提供的电场频率对GPDC肿瘤体积大小的影响；
图4为本发明一个实施例所提供的为本发明一个实施例所提供的电场频率对G009肿瘤体积大小的影响；
图5为本发明一个实施例所提供的不同电场频率对2D细胞GPDC增殖的影响；
图6为本发明一个实施例所提供的不同电场频率对2D细胞G009增殖的影响。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2％，可以允许±0.1％范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1％、±2％、±5％等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10％的波动。
本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。
本发明中，“第一”和“第二”仅用于区分不同处理阶段的细胞悬液，而不产生额外限定作用。
本发明中，“电场干预”是指对3D细胞培养得到细胞群进行模拟电场治疗的过程，其最佳干预参数通常与在人体所采用的电场治疗所采用的最佳参数一致，也可以根据实际治疗效果再进行调整。但可以合理预期电场干预参数与电场治疗参数具有强相关性，因而对电场治疗参数的选择进行指导。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明的第一方面涉及一种确定肿瘤电场治疗参数的方法，包括：
a)将从受试者体内所获取的包含肿瘤细胞的组织进行3D细胞培养得到细胞群；
b)对所述细胞群中的细胞进行电场干预，测量所述细胞球体中的参数，以判断所述电场干预对肿瘤细胞治疗的有效性；以及
c)根据所述所测量的参数选择电场治疗参数。
在本发明中，3D细胞培养用于区分2D培养，其是指将细胞(优选与具有三维结构不同材料在体外共同)培养，使细胞能够构成三维的细胞复合物。具有三维培养特征的任何培养方法均可以被采用，例如采用基于水凝胶、商品化定制的支架、纤维支架、多孔支架、微球以及天然组织支架的培养方法，或者使用常称为球状体的游离漂浮细胞聚集体的无支架方法。
在一些实施方式中，所述细胞群中至少5％、10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或90％以上的细胞为肿瘤细胞。
在一些实施方式中，所述电场为交变电场。
在一些实施方式中，所述电场干预参数包括电场频率。
在一些实施方式中，步骤b)中，所述电场干预所施加的电场频率为100kHz～300kHz，例如110kHz、120kHz、130kHz、140kHz、150kHz、160kHz、170kHz、180kHz、190kHz、200kHz、210kHz、220kHz、230kHz、240kHz、250kHz、260kHz、270kHz、280kHz、290kHz，较为优选的频率是150kHz～250kHz，或150kHz～220kHz，或150kHz～210kHz，或170kHz～210kHz。
适用于本发明方法的肿瘤是实体瘤，尤其优选具有成熟的3D细胞培养技术的肿瘤。
在一些具体的实施方式中，所述肿瘤是胶质瘤。
在一些实施方式中，步骤a)包括，将所述组织处理为单细胞状态的第一细胞悬液并培养得到直径400μm～500μm的细胞球，例如420μm、450μm、480μm。
在一些实施方式中，所述第一细胞悬液于含无血清培养基的超低吸附平面培养耗材中进行培养。
无血清培养基可以是肿瘤细胞培养所常用的任何培养基，典型的例如DMEM培养基或DMEM/F12培养基。
超低吸附平面培养耗材是指能减少培养过程中的细胞附着、细胞活化、蛋白质吸收和酶活化的耗材，其可以是市售的超低吸附培养皿、超低吸附细胞培养板或超低吸附细胞培养瓶等。
在一些实施方式中，将所述组织处理为单细胞后，用含FBS的培养基进行洗涤。例如无额含5％～15％ FBS，优选含8％～12％ FBS的DMEM培养基进行洗涤。
在一些实施方式中，步骤b)中，所述对所述细胞群中的细胞进行电场干预的步骤，具体包括：
将所述细胞球消化为单细胞状态的第二细胞悬液，将所述第二细胞悬液与细胞基底膜提取物混匀，形成胶质体，培养所述胶质体8h～24h后，进行电场干预。
细胞基底膜提取物可以含有例如层粘连蛋白、胶原、巢蛋白等常规组分，还可以含有一些生长因子，例如TGF-β、表皮生长因子、类胰岛素生长因子等，还可以含有组织纤溶酶原和基底膜聚糖等成分。在一些较为优选的实施方式中，细胞基底膜提取物为Matrigelmatrix。
在一些实施方式中，制备所述第二细胞悬液所用培养基为DMEM+B27+bFGF；优选70％～90％(v/v)DMEM+15％～25％(v/v)B27+15ng/ml～25ng/ml bFGF。
在一些实施方式中，所述第二细胞悬液的细胞密度为(1-2)×106cells/ml。
在本发明中，“患者”或“受试者”是哺乳动物，哺乳动物包括但不限于人、猴子、猪和其他农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、大熊猫、啮齿动物(包括小鼠、大鼠、豚鼠)等。在一些具体的实施方式中，所述受试者为人。
在一些实施方式中，在对所述细胞群中的细胞进行电场干预之前、同时或之后，用肿瘤治疗剂与所述细胞群中的细胞进行接触。
肿瘤治疗剂包括CAR-T疗法、病毒癌症疫苗(例如，编码癌症特异性抗原的腺病毒载体)、细菌癌症疫苗(例如，表达一种或多种癌症特异性抗原的非热原性大肠杆菌)、核酸或核酸类似物、酵母癌症疫苗、N-803(也被称为ALT-803，ALTOR生物科学公司)、化疗药物、抗体(例如，与肿瘤相关抗原或患者特异性肿瘤新抗原结合)、干细胞移植物(例如，异体或自体)和肿瘤靶向细胞因子(例如，NHS-IL12，IL-12与肿瘤靶向抗体或其片段偶联)。
在一些具体的实施方式中，肿瘤治疗剂包括胶质瘤治疗剂，胶质瘤治疗剂优选包括以下药物的一种或多种：
新陈代谢类药物，如：甲氨蝶呤、巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤等；
烷化剂类，如：亚硝基脲类、铂类、丙卡巴肼、替莫唑胺等；
拓扑酶抑制剂，如：依托泊苷、伊利康唑、替尼泊苷等；
植物类药物，如：长春新碱、长春花碱、白花丹提取物、黄连素等。
抗体靶向治疗药物，如VFGF抗体(例如贝伐单抗)。
对所述细胞群中的细胞进行电场干预和/或肿瘤治疗剂与所述细胞群中的细胞进行接触的环境可以在任何合适的固相上进行，在一些优选的实施方式中，此类固相为微流体平台、载玻片、细胞培养板或多孔培养板。
在一些实施方式中，所测量的所述细胞球体中的参数包括肿瘤细胞和/或其他细胞的如下变化：
感兴趣的表型，感兴趣基因的表达水平，感兴趣蛋白的表达水平或其组合。
感兴趣蛋白可以选自肿瘤的标志物或相关蛋白，例如O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶、异柠檬酸脱氢酶、表皮生长因子受体、肿瘤抑制蛋白53。
“感兴趣的”是指在众多的表型、基因或蛋白等指标中，本领域技术人员根据需要所选择的预期能够发生显著性变化/不发生变化的指标，该指标的变化预期与肿瘤治疗效果(如对肿瘤的杀伤作用、对正常细胞的副作用、预后评估等)相关，本领域技术人员可自行选择。
当3D细胞培养得到细胞群中还包含免疫细胞、血管、正常组织细胞中的一种或多种时，感兴趣蛋白还可以选自白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化性细胞因子和生长因子等细胞因子。在较为优选的实施方式中，感兴趣蛋白与细胞因子风暴(cytokine storm)的形成相关，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等中的一种或多种。在另外一些实施方式中，感兴趣蛋白与致热与炎症病理损害有关，如IL-1、IL-6、TNF-α等中的一种或多种。在另外一些实施方式中，感兴趣蛋白与过敏反应有关，如IgE抗体、FcεRII、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ、IFN-α、PAF等中的一种或多种。
感兴趣基因的表达水平可以是上述感兴趣蛋白的表达水平。感兴趣基因还可以为肿瘤的核酸标志物，如MicroRNA相关基因的表达水平。
在一些实施方式中，所述感兴趣的表型包括肿瘤细胞的增殖速率变化和/或肿瘤细胞死亡数。
本发明的第二方面涉及一种肿瘤治疗系统，所述系统包括：
受试者信息处理模块以及输出模块；
所述受试者信息处理模块用于接收采用如上所述方法选择得到的电场治疗参数；
所述输出模块用于接收所述受试者信息处理模块输出的信息，并对所述受试者的肿瘤电场治疗的施用参数调整。
本发明中，第一方面和第二方面中的受试者为同一受试者。
其中肿瘤电场治疗的施用参数调整的内容可以包括电场频率、场强、干预时间、电场刺激次数、相邻两次电场刺激的间隔时间、电场刺激施用与患者身体上的位置等。调整的结果可以通过系统报告主界面的方式呈现，操作者再通过指导信息进行操作；但更优选的是直接对电场发生装置进行控制。
所述输出模块还可以用于指导给药方式调整，调整的内容可以包括给药种类、给药量、给药次数、给药间隔、用药禁忌(如药物交叉作用提示)、副作用提示等。所调整的药物优选为如上所述的肿瘤治疗剂。
根据本发明的第三方面，本发明还涉及一种肿瘤电场治疗方法，包括：
i)将从受试者体内所获取的包含肿瘤细胞的组织进行3D细胞培养得到细胞群；
ii)对所述细胞群中的细胞进行电场干预，测量所述细胞球体中的参数，以判断所述电场治疗对肿瘤细胞治疗的有效性；以及
iii)根据所述所测量的参数选择电场治疗参数；
iv)依据iii)所得参数对所述受试者进行电场治疗。
对本发明第一方面和第二方面的描述也适用于第三方面。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例
一、体外3D肿瘤球获得电场治疗参数
1.实验方法
采用从医院提供的胶质瘤手术样本两例(GPDC；G009)分离培养得到我们所需要的3D胶质瘤肿瘤球。
1.1样本处理过程需在无菌操作条件下进行。
1.2组织消化：用含有双抗的PBS清洗组织表面，去除凝血块、灼烧变性组织及瘢痕、液化的组织。将样本尽量剪碎，再次用含有双抗的PBS清洗，如清洗液为红色，应重复清洗步骤，至清洗液为无色。转移到50mL离心管中，加入木瓜蛋白酶消化至将组织块全部浸没，37℃消化，震荡，20分钟，中间观察消化状态。孵育期间每10分钟观察消化状态并用移液器吹打消化液，直至组织中大多数细胞脱落，至少80％细胞呈单细胞状态(根据不同组织，孵育时间不同，具体应以标本大小，质地等实际情况来确定何时结束消化)。
1.3消化结束后，加入5-10倍体积含10％FBS的DMEM终止消化，轻轻吹打形成细胞悬液。用70um细胞筛网过滤去除未消化组织块。将过滤后的细胞悬液300g离心10min。剩余组织块较多可以再次加入木瓜蛋白酶消化。
1.4弃上清，加入5-10ml含有10％FBS的DMEM洗涤细胞一次(300g，10min)；
1.5细胞培养：分离得到的细胞采用DMEM/F12无血清培养基按106/mL的密度接种于超低吸附平面培养耗材上，培养5-10天，每天观察细胞状态直到形成大量直径400-500μm的细胞球。细胞球形成后即可用于后续实验。
1.6电场对3D胶质瘤肿瘤球增殖的影响：将上述形成的细胞球加入胰蛋白酶消化成单个细胞，300g离心10min，弃上清，加入培养基(80％DMEM+20％ B27，bFGF浓度20ng/ml)，调节细胞浓度(1～2)×106/ml。每个电场专用四边形培养皿中加入100ul细胞悬液与适量Matrigel基质胶混匀，形成胶质体。胶质体均匀分布于四边形培养皿中。置于37℃饱和湿度培养箱中培养过夜。将细胞分为两组，一组施加电场，一组不加电场。加电场组根据实验条件，将仪器的电场参数调至所需频率，且根据不同频率、场强参数设置相对应的细胞培养箱温度，以确保整个通电过程中四边形培养皿内温度始终保持37℃。不同电场频率分别设置为100kHz、150kHz、180kHz、200kHz、220kHz、250kHz，电场作用时间7天后，通过基质胶溶解，离心去除上清液里的基质胶，收集我们需要的细胞球悬液进行观察并拍照成像。
2.实验结果
2.1不同电场频率对3D胶质瘤肿瘤球GPDC的影响
电场频率与干预效果的关系如下图1所示，100kHz、150kHz、180kHz、200kHz、220kHz、250kHz电场分别干预3D胶质瘤肿瘤球GPDC后，与不加电场组(CTL)相比，表现为在200kHz电场处抑制效果最佳；其次为220kHz、250kHz。
2.2不同电场频率对3D胶质瘤肿瘤球G009的影响
电场频率与干预效果的关系如下图2所示，100kHz、150kHz、180kHz、200kHz、220kHz、250kHz电场分别干预3D胶质瘤肿瘤球G009后，与不加电场组(CTL)相比，表现为在220kHz电场处抑制效果最佳；其次为180kHz、250kHz；而在200kHz电场处抑制效果不显著。
二、动物实验对电场治疗参数的一致性验证
1.实验方法
为了评估体外3D肿瘤球敏感频率结果的准确性，我们采用不同频率电场作用胶质瘤动物模型。12-14g雄性裸鼠，购自湖南省动物实验中心，所有裸鼠均饲养于环境恒温、恒湿、并且无特定病原微生物的动物房。所使用的鼠笼、垫料、饲料均经过高压蒸汽灭菌消毒处理，并有专人按时给予更换。
裸鼠经异氟烷吸入麻醉后，立体定向仪固定，使用电热毯保持动物体温正常(36.5-37.5℃)。手术区域消毒后，切开头皮，在前囟冠状缝与矢状缝交点处使用牙科钻钻一直径1.0mm的小孔。26号针头注射器抽取10μL的上述准备好的细胞悬液(GPDC，G009分别含细胞5×105个)，沿钻孔缓慢将细胞悬液注入尾状核内，推注速度为1μL/min，注射完毕后留针5min，后以2mm/min速度退针。无菌骨蜡封闭骨孔，缝合皮肤，常规饲养。
将裸鼠分为两组，一组施加电场，一组不加电场。加电场组分别设置不同电场频率：100kHz组、150kHz组、180kHz组、200kHz组、220kHz组、250kHz组。电场干预每天24h，每2天更换一次电极片，持续10天。用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积。
实验数据采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行数据分析。两组具有正态分布的连续变量的比较采用学生t检验；非正态分布的连续变量采用Mann-Whitney U秩和检验。多组间的比较采用One-Way或Two-way ANOVA，方差齐则采用Bonferroni检验进行事后比较，方差不齐则采用Dunn's检验进行事后比较。*P＜0.05，**P＜0.01，与不加电场组比较，均表示差异具有统计学意义。
2.实验结果
2.1不同电场频率对GPDC裸鼠模型的影响
电场频率与肿瘤体积大小的关系如图3所示，100kHz、150kHz、180kHz、200kHz、220kHz、250kHz电场分别干预GPDC裸鼠模型组后，与不加电场组相比，表现为在200kHz电场治疗组肿瘤体积明显减小(**P＜0.01,与不加电场组比较)；其次为220kHz组(*P＜0.05,与不加电场组比较)。
2.2不同电场频率对G009裸鼠模型的影响
电场频率与肿瘤体积大小关系如图4所示，100kHz、150kHz、180kHz、200kHz、220kHz、250kHz电场分别干预G009裸鼠模型组后，与不加电场组相比，表现为在220kHz电场治疗组肿瘤体积明显减小(**P＜0.01,与不加电场组比较)；其次为180、250kHz组(*P＜0.05,与不加电场组比较)。
上述动物实验结果均表现出与体外3D肿瘤球所得到的结果相一致。
三、2D细胞实验比较例
1.实验方法
细胞增殖CCK8检测：制备上述细胞悬液(GPDC，G009)，调节到所需细胞浓度。将直径为φ20mm玻片置于陶瓷培养皿中，并使用体外细胞实验肿瘤电场干预设备。每片玻片加100-150ul细胞悬液，使细胞悬液均匀分布于玻片表面。置于37℃饱和湿度培养箱中4-6h待细胞完全贴壁后，补充培养基4ml，置于37℃饱和湿度培养箱中培养过夜。将细胞分为两组，一组施加电场，一组不加电场。加电场组根据实验条件，将仪器的电场参数调至所需频率，加电场组分别设置不同电场频率：100kHz组、150kHz组、180kHz组、200kHz组、220kHz组、250kHz组。根据不同频率参数设置相对应的细胞培养箱温度，以确保整个通电过程中四边形培养皿内温度始终保持37℃。电场作用时间72h。电场处理完后取出所有玻片，进行细胞增值检测。实验重复3次。
实验数据用Graphpad Prism软件进行统计分析，组间比较采用t检验，所有数据以均数±标准差表示，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。*代表各实验组与对照组统计学比较。
2.实验结果
2.1不同电场频率对2D细胞GPDC增值的影响
电场频率与干预效果的关系如图5所示，100kHz、150kHz、180kHz、200kHz、220kHz、250kHz电场分别干预GPDC后，与不加电场组(CTL)相比，表现为在250kHz电场处抑制效果最佳；其次为200kHz、150kHz。
2.2不同电场频率对2D细胞G009增值的影响
电场频率与干预效果的关系如图6所示，100kHz、150kHz、180kHz、200kHz、220kHz、250kHz电场分别干预G009后，与不加电场组(CTL)相比，表现为在220kHz电场处抑制效果最佳；其次为150kHz。
综上，根据体外2D细胞增值检测结果表明，与体内动物实验结果相比，体外3D肿瘤球所得到的结果更为接近体内动物实验，一致性更好。
四.讨论
Manuela等人采用两例胶质瘤病人来源的肿瘤原代细胞进行电场200kHz处理，但发现得到的实验结果与对照组比较无统计学意义(Manuela S.et al.Biologicalactivity of tumor-treating fields in preclinical glioma models.Cell DeathDis.doi:10.1038/cddis.2017.171(2017).)。不过其采用的是2D细胞培养。本发明发现，3D胶质瘤肿瘤球由于与真实的肿瘤组织具有高度的相似性，因而对于电场频率的差异有更强的敏感性，能够用于作为电场治疗个体化差异性治疗的疾病模型，从而能为胶质瘤肿治疗提供更多的个性化指导。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (5)

1.确定肿瘤电场治疗参数的方法，所述参数为电场频率，所述方法包括：
a)将包含肿瘤细胞的组织处理为单细胞状态的第一细胞悬液，并将第一细胞悬液于含无血清培养基的超低吸附平面培养耗材中进行3D细胞培养得到直径400μm～500μm的细胞球；
b)将所述细胞球消化为单细胞状态的第二细胞悬液，所述第二细胞悬液的细胞密度为(1-2)×106cells/ml，将所述第二细胞悬液与细胞基底膜提取物Matrigel matrix混匀，形成胶质体，培养所述胶质体8h～24h后，进行电场干预，通过基质胶溶解，离心去除上清液里的基质胶，收集细胞球悬液，测量所述细胞球体中的参数，所述参数为肿瘤细胞的增殖速率变化和/或肿瘤细胞死亡数，以判断所述电场干预对肿瘤细胞治疗的有效性；以及
c)根据所测量的参数选择电场治疗参数。
2.根据权利要求1所述的确定肿瘤电场治疗参数的方法，所述电场为交变电场。
3.根据权利要求2所述的确定肿瘤电场治疗参数的方法，步骤b)中，所述电场干预所施加的电场频率为100kHz～300kHz。
4.根据权利要求3所述的确定肿瘤电场治疗参数的方法，步骤b)中，所述电场干预所施加的电场频率为150kHz～250kHz。
5.根据权利要求1所述的确定肿瘤电场治疗参数的方法，所述肿瘤为胶质瘤。
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