CN107028980A

CN107028980A - 用于治疗心脏疾病的药物组合物

Info

Publication number: CN107028980A
Application number: CN201610828324.3A
Authority: CN
Inventors: V·高森; R·戈登-贝瑞斯福特; C·霍姆西
Original assignee: Cardio3 Biosciences SA
Current assignee: Celyad Oncology SA
Priority date: 2009-05-20
Filing date: 2010-05-20
Publication date: 2017-08-11
Also published as: US10086016B2; MX2011012183A; TW201108935A; RU2011145370A; CA2762584A1; WO2010133686A1; BRPI1012116A2; KR101689415B1; JP2012527432A; AU2010251151B2; HK1163500A1; US20120128638A1; RU2595801C2; CN102438636A; IL216399A0; NZ623454A; AU2010251151A1; JP6029468B2; TWI492707B; WO2010133686A8

Abstract

本发明涉及根据国际认可的药品生产标准制备的、包含定向产生心脏组织的细胞和至少一种药学上可接受赋形剂的药物组合物，用于制备这种药物组合物的方法，以及用于施用所述药物组合物的、包括含有所述药物组合物的容器的试剂盒。

Description

用于治疗心脏疾病的药物组合物

本申请是申请号为201080021110.6、发明名称为“用于治疗心脏疾病的药物组合物”的分案申请。

技术领域

本发明涉及通过将药物组合物递送至有需要的个体而治疗心脏疾病或疾患倾向。具体地，公开了包含定向产生心脏组织的细胞和至少一种药学上可接受赋形剂的药物组合物，所述药物组合物以允许细胞存活和运输至世界各地、方便人员操作以递送给接受者的方式包含在容器中，其中所述细胞根据国际认可的药品生产标准制备。

背景技术

再生细胞疗法对于其中器官以需要组织重构以例如恢复形态以及患病器官功能的方式受损的疾病或者当生理修复机制受损时特别相关。心脏是末端分化器官，并且在例如心脏疾病发作中心肌细胞的大量损伤导致不可逆的损伤，因此需要修复。此外，心脏疾病是世界范围死亡率的首要原因。心脏修复的细胞疗法是极其重要的挑战。

细胞疗法的临床经验基于以未改变状态递送的成体干细胞。第一代生物制剂是天然的人干细胞，人干细胞被鉴定为容易获得的细胞型。已经显示，一些个体在递送了天然人干细胞时得到改善。人类心脏的天然细胞移植领域的技术水平特别描述于Abdel-Latif A.等.‘Adult bone marrow-derived cells for cardiac repair:a systematic reviewand meta-analysis.’Arch Intern Med.(2007)167:989-997的综述及其中参考文献。在希望改善临床结果的过程中，开发了第二代干细胞疗法的概念，包括在递送给患者之前提高天然干细胞的生心潜能。

为了探索提高细胞生心潜能的方式，基础研究首先使用小鼠胚胎干细胞(下文称为mESC)来阐释心脏分化期间涉及的复杂的信号传导通路。该研究导致生心物质的鉴定，所述生心物质与细胞接触时改善所述细胞分化成心脏修复细胞的能力。心脏修复细胞是中间细胞表型，其中细胞定向产生心脏组织但还没有完全分化。心脏再生领域基础研究的关键里程碑公开于：

Behfar等.‘Derivation of a cardiopoietic population from humanmesenchymal stem yields progeny’,Nature Clin.Pract.,Cardiovasc.Med.(2006)3:S78–S82,

Behfar等.,‘Cardiopoietic programming of embryonic cells for tumor-free repairs’,J.Exp.Med.(2007)204:405-420,以及

WO 2006/015127,US 2008/0019944和WO 2009/151907，全部授予MayoFoundation for Medical Education and Research,Terzic A.和Behfar A。

上述作者、申请人和发明人显示，mESC分化成定向产生心脏组织的细胞可以在mESC与所谓生心物质的‘混合物’接触培养时启动，所述生心物质的‘混合物’即在溶液中含有生心因子的组合物。如WO2006/015127中公开的，当mESC衍生的心脏修复细胞被递送入慢性梗死鼠心脏时，可以实现心脏修复。因此，已知mESC衍生的心脏修复细胞可以显示再生心脏组织的益处。然而，与ESC相关的肿瘤发生风险提出了将这些基础发现用于治疗用途的安全性问题。而且，在实验室环境下在小鼠中进行实验，使用从悬浮于实验管培养基的培养物收集并随后在相同设备中迅速使用的mESC衍生的心脏修复细胞。

据信，成体干细胞疗法没有肿瘤发生风险。没有记载肿瘤发生风险并合适衍生为心脏修复细胞的干细胞源的鉴定描述于Behfar等.‘Derivation of a cardiopoieticpopulation from human mesenchymal stem yields progeny’,Nature ClinicalPractice,Cardiovascular Medicine(2006)3:S78–S82。US 2008/0019944描述了从心脏修复细胞获得的心脏修复细胞。

作者、申请人和发明人还公开了可以使用生心因子的混合物实现人成体间充质干细胞分化成心脏修复细胞(WO 2009/151907)。

人类心脏细胞移植领域的技术水平特别描述于Abdel-Latif A.等.‘Adult bonemarrow-derived cells for cardiac repair:a systematic review and meta-analysis.’Arch Intern Med.(2007)167:989-997的综述及其中参考文献。在Behfar等.‘Guided stem cell cardiopoietic:Discovery and translation’J.Mol.andCell.Cardiology(2008)45:523–529的另一综述中，也公开了使用心脏修复细胞进行心脏再生的概念。

从实验室到医院的转移通常是制药工业的挑战。在这种情况下，该挑战特别难克服，这是因为定向产生心脏组织的细胞的生物学特征以及当个体不在生产场所附近场所时绝对需要维持这些特征直到递送给个体。

本发明通过以下公开解决了该问题：根据国际认可的药品生产标准工业生产包含定向产生心脏组织的细胞和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物的方法，允许不同用途同时维持定向产生心脏组织的细胞的特征、其存活、运输至世界各地、方便人员操作以递送给接受者的细胞保持和包装方法。

定义

在本发明范围内并且除非指明相反，以下引号内指定的术语具有以下定义。

‘BMMSC’指骨髓间充质干细胞。‘hBMMSC’指人来源的此类BMMSC。

‘心脏修复细胞’是中间细胞表型，即，定向产生心脏组织但未完全分化。心脏修复细胞特征在于Nkx2.5和MEF2C的核转移，以及肌节蛋白的缺乏(Behfar等.‘Derivation ofa cardiopoietic population from human mesenchymal stem yields progeny’,NatureClin.Pract.,Cardiovasc.Med.(2006)3:S78–S82)。心脏修复细胞保留增殖能力。心脏修复细胞可以衍生自干细胞，包括例如人成体间充质干细胞、胚胎样干细胞、可诱导的多能干细胞或任何其他获得性来源。此外，在下文中，所述的干细胞均不是人胚胎干细胞。

‘生心混合物(cardiogenic cocktail)’或‘混合物(cocktail)’指含有至少两种生心物质的组合物。

‘生心物质(cardiogenic substance)’是与细胞接触时提高所述细胞分化成心脏修复细胞的能力的物质。

‘汇合’指其中细胞在一定空间量内生长至最大容量的状态。此时，与其他细胞的接触导致它们抑制生长。

‘有效量’表示足以提供预期治疗或生理效应或结果的量。这种效应或结果包括心脏组织的修复、维持、再生、增大、或心脏功能的改善。不期望的效应有时与期望的治疗效应一起显现；因此，专业人员在确定合适的‘有效量’时权衡潜在的益处和潜在的风险。该量可以在受试者之间变化，取决于例如受试者年龄、健康状况、天生和后天差异等以及施用方式。因此，不可能指定确切的‘有效量’。然而，在任何个体情况下合适的‘有效量’可以由本领域普通技术人员在药物组合物施用程序之前或期间确定，例如通过在药物组合物的递送期间递送无不期望效应的最高可能量。

‘赋形剂’是用作药物活性成分载体的无活性物质。在许多情况下，"活性"物质可能不容易施用和被人体吸收；在这种情况下，关注的物质可以溶解入赋形剂或与赋形剂混合。除了其以单剂量使用外，赋形剂可用于生产过程以帮助操作关注的活性物质。根据施用途径和药物形式，可以使用不同的赋形剂。为了稳定活性成分，添加赋形剂，保证活性成分保持"活性"，并且重要的是，稳定足够长的时间，使得产品贮存期限与其他产品相当。

‘增殖能力’指在本文件范围内细胞数目的增加。

‘存活力’在本文件范围内表示不吸收台盼蓝染料、从而说明细胞膜完整性的细胞特征。

术语‘受试者’、‘接受者’和‘患者’在本文可互换使用并且除非明确说明，否则指需要用本文公开的药物组合物治疗心脏疾病或疾患的任何人或哺乳动物。受试者还包括有风险患者这种心脏疾病或疾患的那些。

除非上下文另外明确指明，本说明书使用的单数形式‘一个’、‘一种’和‘该’包括复数方面。因此，例如，提及‘一个干细胞’包括单个细胞，也包括两个或多个细胞；提及‘一种物质’或‘一种试剂’包括单一物质或试剂，也包括两种或多种物质或试剂；提及‘该本发明’或‘一个发明’包括一个方面的单个方面或多个方面；依此类推。

除非另外定义，本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本发明，但下文描述了合适的方法和材料。

发明概述

在以下详细描述中，提供了许多细节以提供对要求保护的本主题的全面理解。然而，本领域技术人员会理解，要求保护的主题的实施可以无这些具体细节。在其他情况下，公知的方法、程序、组分等未详细描述以清晰要求保护的主题。

本发明涉及包含定向产生心脏组织的细胞和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。定向产生心脏组织的细胞优选根据国际认可的药品生产标准来产生。更优选地，所述药学上可接受的赋形剂是保存液。优选地，所述保存液选自包括以下的组：允许在-196℃至0℃的温度下深低温保藏的保存液和允许在0℃至+40℃的温度下保存的保存液。优选地，所述保存液是可以含有离子、pH缓冲剂、抗渗透剂(impermeant)、胶体和代谢物、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、蔗糖、血清白蛋白、海藻糖或其任意组合的保存液。优选地，离子选自由以下组成的组：Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-和所述离子的组合。优选地，pH缓冲剂选自由以下组成的组：H₂PO₄ ^-、HCO₃ ^-、(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(HEPES)及其混合物。优选地，抗渗透剂选自由以下组成的组：乳糖醛酸盐、蔗糖、甘露醇、葡萄糖及其组合。优选地，胶体是葡聚糖-40。优选地，代谢物选自由以下组成的组：腺苷、谷胱甘肽及其组合。优选地，所述至少一种药学上可接受的赋形剂还包括选自由以下组成的组的至少一种成分：生长因子、细胞因子、参与器官发生信号传导的蛋白、药物、血小板溶胞产物、血清、同位素、体内示踪细胞的工具、稀释剂、润滑剂、基质或支架材料及其组合。

优选地，定向产生心脏组织的细胞可以是干细胞，或者定向产生心脏组织的细胞衍生自干细胞。优选地，干细胞选自由以下组成的组：成体干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞(IPS)、骨髓分离的成体多谱系可诱导细胞(MIAMI)、心脏自身干细胞、植物干细胞（vegetal stem cell）或其任意组合。优选地，干细胞是从选自由以下组成的组的合适组织源收获的间充质干细胞：骨髓、脂肪组织、脐带血、羊水、月经液、血液。优选地，定向产生心脏组织的细胞是哺乳动物细胞。优选地，哺乳动物细胞选自由以下组成的组：人、猫、狗、猪、马、小鼠、大鼠、仓鼠和其他哺乳动物。优选地，所述细胞是自体细胞、同种异体细胞、异种细胞或其任意组合。

优选地，定向产生心脏组织的细胞是心脏修复细胞。优选地，心脏修复细胞可以衍生自人成体间充质干细胞、胚胎样干细胞、可诱导的多能干细胞、心脏自身干细胞或任何其他获得性来源或其组合。

优选地，所述组合物不含可检测的非心脏修复细胞，所述非心脏修复细胞包括但不限于心肌细胞、造血细胞、内皮祖细胞、成脂肪细胞、脂肪细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成骨细胞骨细胞、成神经细胞和神经细胞。优选地，总的非心脏修复细胞含量是总细胞数的0%至50%，优选是总细胞数的0%至15%。优选地，每个类别的非心脏修复细胞的含量是总细胞数的0%至50%，优选是总细胞数的0%至15%。

本发明还涉及用于治疗缺血性心肌病、急性心肌梗死、慢性心肌梗死、非局部缺血起源的心衰竭、局部缺血起源的心衰竭、先天性心肌病或其组合的药物组合物。

本发明还涉及用于生产药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

获得可以衍生定向产生心脏组织的细胞的细胞；

在允许获得定向产生心脏组织的细胞的条件下培养所述细胞；

收获所述定向细胞；

向所述定向细胞添加至少一种药学上可接受的赋形剂。

优选地，本发明方法根据国际认可的药品生产标准来进行，所述方法包括在所述方法的任何步骤取样，以进行质量控制操作。最优选地，本发明方法根据国际认可的药品生产标准来进行，所述方法包括在细胞培养的最后一步取样，以进行活性物质的质量控制。

优选地，活性物质的质量控制标准包括选自由以下组成的组的至少一种检验：鉴定检验、均一性检验、纯度检验及其组合。优选地，当定向产生心脏组织的细胞是心脏修复细胞时，所述心脏修复细胞的鉴定对应于由以下组成的组中至少一种基因表达水平的观察到的增加：Nkx2.5、Tbx5、MEF2C、GATA4、GATA6、Mesp1、FOG1、FOG2、Flk1及其同系物。优选地，基因表达的增加通过qPCR方法测定与参照相比是至少2倍。优选地，当定向产生心脏组织的细胞是心脏修复细胞时，所述心脏修复细胞的鉴定被认为满足与参照相比由以下组成的组中至少一种多肽物类的观察到的存在：Nkx2.5、Tbx5、MEF2C、GATA4、GATA6、Mesp1、FOG1、FOG2、Flk1及其同系物，并且Nkx2.5或MEF2C或两者进一步转移至心脏修复细胞的细胞核。优选地，所述观察到的存在通过用由以下组成的组的至少一种抗体免疫标记来显示：抗Nkx2.5、抗Tbx5、抗MEF2C、抗GATA4、抗GATA6、抗Mesp1、抗FOG1、抗FOG2、抗Flk1及其同系物。优选地，当给定样品中至少50%是心脏修复细胞时，满足均一性。优选地，当给定样品中至少50%、优选至少80%是心脏修复细胞时，满足均一性。优选地，收获细胞中间充质干细胞的存在通过以下显示：用针对选自由CD105、CD90、CD133、CD105、CD166、CD29和CD44组成的组的表面标记的抗体阳性免疫标记，和用针对选自由CD14、CD34和CD45组成的组的表面标记的抗体无可检测的免疫标记。优选地，与参照相比CD34、FABP4、骨钙蛋白、巢蛋白、Sox9和MYH7基因及其同系物表达水平增加两倍或更多时纯度不符合要求。优选地，与参照相比基因表达的所述增加通过qPCR方法测定。优选地，通过免疫标记显示增加的非心脏修复细胞数目时纯度不符合要求，所述非心脏修复细胞包括但不限于心肌细胞、造血细胞、内皮祖细胞、成脂肪细胞、脂肪细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成骨细胞骨细胞、成神经细胞和神经细胞。优选地，所述参照由非心脏修复细胞组成。优选地，所述参照由在缺乏任何生心物质时培养的细胞组成。优选地，培养条件包括使用生物反应器，包括固定或包封所述细胞至颗粒或基质上并使细胞培养基穿过颗粒或基质床。

本发明还涉及用于治疗心脏疾病或疾患倾向的方法，其中药物以有效量递送给个体。优选地，所述个体显示心血管系统的不足。优选地，所述个体罹患缺血性心肌病、心肌梗死、局部缺血起源的心衰竭或非局部缺血起源的心衰竭、先天性心肌病或其组合。

优选地，所述药物组合物使用选自由以下组成的组的施用途径递送：心肌内、心脏内、冠状血管内、肌肉内、皮下、腹腔内、子宫内、胃肠外或全身。优选地，所述药物组合物使用导管、注射器或其组合心肌内递送。

可以衍生定向产生心脏组织的细胞的细胞可以至少一种生心物质接触，所述生心物质可以选自由以下组成的组：TGF-β1、TGF-β2、TNF-α、BMP-1、BMP-2、BMP-4、BMP-6、FGF-2、FGF-4、FGF-5、FGF-12、FGF-13、FGF-15、FGF-20、白血病抑制因子(LIF)、VEGF-A、VEGF-C、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、白介素6(IL-6)、活化素A、α凝血酶、视黄酸、心肌营养蛋白1、cardiogenol C及其组合。

可以使用许多生心混合物。以下列表不是限制性的。可以使用例如生心物质的混合物，所述生心物质的混合物包括TGFβ-1、BMP-4、α-凝血酶、选自由心肌营养蛋白和IL-6组成的组的化合物、和选自由Cardiogenol C和视黄酸组成的组的化合物。另一种混合物可以包括TGFβ-1、BMP-4、α-凝血酶、心肌营养蛋白和Cardiogenol C。另一种混合物可以包括选自由以下组成的组的至少一种化合物：FGF-2、IGF-1、活化素-A、TNF-α、FGF-4、LIF、VEGF-A及其组合。它们还可以包括FGF-2、IGF-1和活化素-A。其他优选的混合物包括活化素-A、FGF-2、IL-6、IGF-1和视黄酸。其他混合物可以缺乏选自由TNF-α、FGF-4、LIF和VEGF-A组成的组的至少一种化合物。

当以下化合物存在于混合物中时，其可以1至5ng所述TGFβ-1/ml、1至10ng所述BMP4/ml、0.5至5ng所述心肌营养蛋白/ml、0.5至5单位所述α-凝血酶/ml、50至500nM所述Cardiogenol C/ml、1至10ng所述FGF-2/ml、10至100ng所述IGF-1/ml、1至50ng所述活化素-A/ml、1至50ng所述TNF-α/ml、1至20ng所述FGF-4/ml、10至100ng所述IL-6/ml、1至10单位所述LIF/ml、1至50ng所述VEGF-A/ml、0.1至1.0μM所述视黄酸/ml的量存在。

特定的混合物类型包括以组合方式使用的重组TGFβ-1(2.5ng/ml)、BMP4(5ng/ml)、心肌营养蛋白(1ng/ml)、Cardiogenol C(100nM)。特别优选的混合物包括此类化合物，并且还包括α-凝血酶、(1U/ml)、FGF-2(10ng/ml)、IGF-1(50ng/ml)和活化素-A(5ng/ml)。

其他优选的混合物包括以组合方式使用的重组TGFβ-1(2.5ng/ml)、BMP4(5ng/ml)、活化素-A(5ng/ml)、FGF-2(10ng/ml)、IL-6(100ng/ml)、因子-IIa(hα-凝血酶、1U/ml)、IGF-1(50ng/ml)和视黄酸(1μM)。

混合物可以在介质中稀释，所述介质包含选自由胎牛血清、人血清、血小板溶胞产物、血小板衍生的生长因子及其混合物组成的组的化合物和选择的化合物。

本发明还涉及用于施用药物组合物的试剂盒，所述试剂盒包括含有所述药物组合物的容器。优选地，所述容器是允许细胞存活和世界范围内运输、方便护理人员操作以递送给接受者的生物相容性容器。优选地，所述容器是密闭的。优选地，所述容器与赋形剂和保存条件相容。优选地，所述容器是密闭的玻璃容器。优选地，所述容器具有可刺穿的隔膜帽。优选地，所述可刺穿的隔膜帽允许包括luer激活阀的管形瓶接头从所述容器抽取液体。优选地，所述可刺穿的隔膜帽可以用针头进入。优选地，所述药物组合物贮存在合适深低温保藏的密闭容器中。优选地，所述容器中药物组合物的贮存期限是至少48小时。优选72小时。优选地，所述试剂盒还包括至少一个导管。优选地，所述试剂盒还包括至少一个注射器。

附图简述

图1显示左心室(LV)舒张末期容量(LVEDV,图A)、左心室收缩末期容量(LVESV,图B)和左心室射血分数(LVEF,图C)，其在基线和之后6个月在受试者中测量，受试者被随机分成对照组(n=8)和治疗组(n=9)。结果根据基线标准化。

发明详述

实施例

生产起始：已经从患者髂嵴收获并满足最低质量标准的人骨髓样品在37℃/5%CO₂培养箱中175-cm²烧瓶中培养以纯化BMMSC。最低质量标准包括供体的阴性血清学检测(至少HIV 1/2、梅毒、HBV、HCV)、收集地点和生产地点之间的骨髓运输温度控制、总体积、记录血块的存在和体积、和细菌污染的缺乏。24小时之后，从烧瓶小心去除骨髓和细胞碎片。附着的BMMSC用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，添加培养基，重新开始培养，直至初始传代P0，每4至6天更换培养基。

P0–从集落初始扩增为细胞层：进行初始传代(P0)以离解集落并使它们扩增并形成单层。细胞以1:1的比例接种于175-cm²烧瓶并允许扩增并形成单层，持续6天。汇合决定下一次传代的时间。如果BMMSC自发形成单层而无可检测的集落，则该步骤可以被跳过。该过程以类似传代继续，编号‘P0’，随后连续字母，直至获得最少50x10⁶个细胞。确定诸如接种细胞密度和汇合触发的传代等参数。决定应该用于接种以优化产量并避免接触抑制的容器大小的是传代获得的细胞数目。P0期的过程中控制测试包括细胞数目和百分比存活。

P1-生心混合物处理的开始：细胞在培养基和生心混合物中培养5天。例如，可以使用诸如描述于以下的生心混合物：WO2006/015127、WO2009/151907和Behfar等.‘Derivation of a cardiopoietic population from human mesenchymal stem yieldsprogeny’,Nature Clinical Practice,Cardiovascular Medicine,March2006vol.3supplement 1,第S78–S82页)。

P2-生心混合物处理的结束：除去含有生心混合物的培养基。现在，培养物中含有心脏修复细胞。培养物被传代并接种于含有培养基的新容器以允许需要的额外扩增期。

P3–扩增和收获：接下来的传代编号为‘P3’，随后是连续字母。细胞在达到最佳汇合时传代，并重复直至获得细胞数目为600x10⁶至1200x10⁶个细胞。当符合该标准时，收获细胞。该步骤涉及最终的胰蛋白酶消化，随后洗涤和离心浓缩步骤。最后洗涤在细胞保存液中进行。合适地，采用的保存液可以类似于标准器官和生物组织保存的冷贮存水溶液，例如BioLifeSolutions(Bothell,Wash)的

然后将细胞浓缩物转移至生物相容性容器(本实施例中是I型玻璃瓶,Ph.Eur.)，添加保存液，达到10ml的总体积和60x10⁶至120x10⁶细胞/ml范围的细胞浓度。这时结束药物组合物的生产。

药物组合物释放标准通常包括细胞密度、均一度和纯度，它们与确认不存在外来污染的生产参数(无菌、低水平内毒素、和过程中未增加支原体)相结合。

值得注意的是，不对本发明有任何偏见，可以考虑生产心脏修复细胞的其他方法来替代生心物质的使用。

本实施例中，保存介质是来自BioLifeSolutions(Bothell,Wash)的HypoThermosol-FRS含有离子(100mM Na⁺、42.5mM K⁺、0.05mMCa²⁺、5mM Mg²⁺、17.1mM Cl^-)；pH缓冲剂(10mM H₂PO^4-、5mM HCO^3-、25mM HEPES)；抵抗细胞溶胀的抗渗透剂(100mM乳糖醛酸盐、20mM蔗糖、20mM甘露醇)；胶体(6%葡聚糖-40)；和代谢物(5mM葡萄糖、2mM腺苷、3mM谷胱甘肽)。

药物组合物的保存可以根据本发明通过在二甲基亚砜(DMSO)中深低温保藏来实现。这提供了允许甚至更长贮存期限(一周或更长)的优点，条件是在干冰上运输、适当控制运输温度。

根据其中赋形剂是HypoThermosol-FRS的本发明药物组合物的实施方案，容器中药品的贮存期限是至少72小时。特别值得注意的是发现，总数1200x10⁶的细胞具有约8毫升的体积，而心肌内注射的期望最大体积是约10毫升。这意味着HypoThermosol-FRS的量相对于细胞体积而言是小的，并且将在仅几毫升的范围内。

已经令人惊讶地发现，即使小量的HypoThermosol-FRS也足以维持药物组合物这种重要的72小时贮存期限。这提供了足以确认所有要满足的释放标准、将药物组合物运输至世界任何地方和将它递送给接受者的时间。

药物组合物释放标准–鉴定：心脏修复细胞特征在于几种早期心脏分化标志物的阳性表达和适用的核转移，所述标志物包括Nkx2.5、MEF2C和GATA-4。通过实时定量RT-PCR(qPCR)测量的MEF2C和/或Tbx5表达水平与参照标准相比至少2倍增加及其在贮存期限期间的维持代表药物组合物中含有的心脏修复细胞的阳性鉴定。

在该优选实施方案中，以下表1、表2和表3显示早期心脏分化标志物的表达被维持直至药物组合物贮存于其最终容器后14天，并且这种细胞的存活和增殖维持至少5天。这说明了本文描述的生产方法的独特能力，以获得并维持暴露于生心物质的处于适合其预期用途状态的细胞的鉴定。

表1：100百万总存活细胞/ml的鉴定(qPCR)。

表2：细胞浓度为100百万总存活细胞/ml的药物组合物的存活。

天	第1批	第2批
			0	96	96
1	88	95
			2	92	96
3	87	93
			4	91	96
5	87	91

表3：细胞浓度为100百万总存活细胞/ml的药物组合物的增殖能力。

天	第1批	第2批
			1	444	456
2	297	481
			3	417	333
4	306	417
			5	303	722

而且，表4和表5显示，药物组合物不限于单一确定的细胞浓度产量。实际上，不同细胞浓度下细胞存活和增殖能力的维持是本文所述药物组合物的区别特征。

表4：细胞浓度对百分比存活的影响

表5：细胞浓度对增殖能力的影响

用(*)标示的、第1批在第2天对80百万细胞/ml获得的值被认为是实验误差。

药物组合物释放标准–均一性：为了测定该优选实施方案中描述的药物组合物中心脏修复细胞的百分比，用抗MEF2C和CD105抗体对一小份细胞进行双免疫标记，随后使用DAPI进行细胞核染色。目的是测定心脏修复细胞(针对MEF2C的细胞核染色)和间充质干细胞(CD105-阳性)的百分比，计数细胞的总数由DAPI染色的细胞核数目给出。通过qPCR的鉴定测试(MEF2C：2.8±0.6倍增，Tbx5：2.2±0.6倍增)的患者衍生的心脏修复细胞分析显示，96±2%的细胞是生心细胞。此外，100%的计数细胞是CD105阳性。与缺少造血细胞和内皮祖细胞的标志物CD34的表达水平增加(参见‘纯度’段落)一起考虑，这表明100%的细胞是间充质干细胞或衍生自间充质干细胞。

药物组合物释放标准–纯度：根据本发明优选实施方案进行的纯度测试旨在确定药物组合物中没有不同于心脏修复细胞和BMMSC的细胞类型。解决纯度标准的一种选择方法是qPCR。用来发展纯度测试的qPCR方法的途径包括鉴定合适的标志物、设计专属引物和探针组、分析扩增曲线和熔融峰和鉴定商业途径可获得的阳性对照RNA。都正常存在于骨髓的造血表型和内皮祖细胞表型的缺乏通过药物组合物中可检测水平的CD34表达细胞的缺乏所确定。药物组合物中成脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞或成神经细胞的缺乏分别通过可检测水平的FABP4表达细胞、Sox9表达细胞、骨钙蛋白表达细胞和巢蛋白表达细胞的缺乏所确定。成熟心肌细胞的排除通过药物组合物中可检测水平的MYH7表达细胞的缺乏所评价。

本文描述的本发明药物组合物的优选实施方案是使用专用导管将有效量的1200x10⁶个细胞心内注射入局部缺血起源的心衰竭患者的非存活心肌的边缘带。获得了令人满意的结果。

根据本发明含有心脏修复细胞的药物组合物的可行性、安全性和效力在预期的、随机的、开放的、连续平行的两组别多中心临床试验中评价。

在缺血性心肌病后继发慢性心衰竭的受试者被随机分成对照组或治疗组。对照组接受最佳的护理标准。治疗组除了最佳的护理标准还接受含有心脏修复细胞的药物组合物。

含有心脏修复细胞的药物组合物使用注射导管(Biologics DeliverySystems,California,USA)心室内注射入梗死区的边缘带。在单次注射程序中，达1,2x10⁹个细胞被注射入梗死区周围达20%的注射部位。

左心室(LV)功能的二维超声心电图评价在该实验招募的17位受试者(9个治疗，8个对照)中在基线和之后6个月时进行。通过测量左心室舒张末期容量(LVEDV)、左心室收缩末期容量(LVESV)和左心室射血分数(LVEF)从基线到细胞注射后6个月的变化来评估心脏功能。在治疗组中观察到这三个重要参数支持药物组合物对心脏功能的积极作用的趋势(图1)。本领域医师将知道这些结果具有的重要预后和治疗意义。

其他实施方案

要理解，虽然已经结合其详细描述而描述了本发明，但之前描述预期示例说明而非限制本发明范围，本发明范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求书的范围内。

具体地，本文描述的药物组合物，包括其贮存条件和贮存期限，只是描述衍生自骨髓间充质干细胞(BMMSC)的自体心脏修复细胞（即，由BMMSC制备的将用于从中收集BMMSC的相同个体的药物组合物）用途的优选实施方案。本发明范围不限于自体BMMSC并且包括使用不论来源的任何干细胞，条件是所述干细胞不是人胚胎干细胞。允许获得定向产生心脏组织的细胞的细胞(本文该段落之后称为‘原始细胞’)可以是同种异体的和异种的。原始细胞还可以通过不同于获取新鲜骨髓的其他方式获得。原始细胞可以是胚胎干细胞（条件是所述干细胞不是人胚胎干细胞），条件是它们的获取不涉及人胚胎的破坏。原始细胞可以是通过任何方式获得的胚胎样干细胞，例如诱导的多能干细胞(IPS)，所述方式包括转染、细胞重编程或使IPS不含外源基因的其他方法。原始细胞还可以是骨髓分离的成体多谱系可诱导细胞(MIAMI)、心脏自身干细胞、植物干细胞或其任意组合。本发明不限于具体的制剂成分、生产方法、生物材料或试剂、剂量方案等，因为这些可以改变。

在其他实施方案中，本文描述的药物组合物可以包括其他成分，例如生心物质、生长因子例如成纤维细胞生长因子、胎盘生长因子或血管内皮生长因子、细胞因子、或参与器官生成信号传导的蛋白、分子构建体、离体改变的非心脏修复细胞、药物、血小板溶胞产物、支架材料例如胶原蛋白、层粘连蛋白或任何其他细胞外基质蛋白。

在其他实施方案中，本文描述的试剂盒可以包括根据PCT/EP2010/055869、TW099113613、US 61/312371、BE2009/0271、PCT/EP2010/055856、TW099113627或BE2009/0272的导管。

在其他实施方案中，本文描述的试剂盒可以包括其他成分例如适合冷藏、冷冻、深低温冷藏、冻干、玻璃化、解冻、再水化、洗涤、分选、浓缩、过滤、冻干、离心、重悬、取样或分装药物组合物的袋或介质

在其他实施方案中，本文描述的试剂盒可以包括热监测、防伪装置或射频鉴定装置。

还要理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案而不是限制性的。

Claims

1.一种药物组合物，包含定向产生心脏组织的中间表型细胞，其中所述细胞显示：

(1)与非心脏修复细胞的参照相比，MEF2C和至少另外一种基因的表达水平均有观察到的增加，所述另外一种基因选自由以下组成的组：Nkx2.5、Tbx5、GATA4、GATA6、Mesp1、FOG1、FOG2、Flk1及其同系物；和

(2)不存在可检出的MYH7表达水平；以及

至少一种药学上可接受的赋形剂，其中所述至少一种药学上可接受的赋形剂是包含二甲基亚砜(DMSO)、离子、pH缓冲剂、抗渗透剂、胶体和代谢物的保存液；

其中所述非心脏修复细胞的总含量是总细胞数的0％至50％。

2.权利要求1的药物组合物，其中所述保存液选自包括以下的组：允许在-196℃至0℃的温度下冷冻保藏的保存液和允许在0℃至+40℃的温度下保存的保存液。

3.权利要求1的药物组合物，其中所述保存液是进一步含有一种或多种组分的保存液，所述一种或多种组分选自由以下组成的组：甘油、蔗糖、血清白蛋白、海藻糖或其任意组合的保存液。

4.权利要求1的药物组合物，其中所述离子选自由以下组成的组：Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-和所述离子的组合。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述pH缓冲剂选自由以下组成的组：H₂PO₄ ^-、HCO₃ ^-、(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(HEPES)及其混合物。

6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗渗透剂选自由以下组成的组：乳糖醛酸盐、蔗糖、甘露醇、葡萄糖及其组合。

7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述胶体是葡聚糖-40。

8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述代谢物选自由以下组成的组：腺苷、谷胱甘肽及其组合。

9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述至少一种药学上可接受的赋形剂包括选自由以下组成的组的至少一种成分：生长因子、细胞因子、参与器官发生信号传导的蛋白、药物、血小板溶胞产物、血清、同位素、体内示踪细胞的工具、稀释剂、润滑剂、基质或支架材料及其组合。

10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述定向产生心脏组织的细胞是干细胞。

11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述定向产生心脏组织的细胞来源于干细胞。

12.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述干细胞选自由以下组成的组：成体干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞(IPS)、骨髓分离的成体多谱系可诱导细胞(MIAMI)、心脏自身干细胞、植物干细胞及其组合。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述干细胞是从选自由以下组成的组的合适组织源收获的间充质干细胞：骨髓、脂肪组织、脐带血、羊水、月经液和血液。

14.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述定向产生心脏组织的细胞是哺乳动物细胞。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述哺乳动物细胞选自由以下组成的组：人、猫、狗、猪、马、小鼠、大鼠和仓鼠。

16.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述细胞是自体细胞、同种异体细胞、异种细胞或其任意组合。

17.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述定向产生心脏组织的细胞是心脏修复细胞，所述心脏修复细胞能够衍生自人成体间充质干细胞、人胚胎干细胞(条件是其产生不引起人胚胎破坏)、胚胎样干细胞、可诱导的多能干细胞、心脏自身干细胞或任何其他获得性来源或者其组合。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述组合物不含可检测的非心脏修复细胞，所述非心脏修复细胞包括但不限于心肌细胞、造血细胞、内皮祖细胞、成脂肪细胞、脂肪细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成骨细胞骨细胞、成神经细胞和神经细胞。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中每个类别的非心脏修复细胞的含量是总细胞数的0％至50％。

20.根据权利要求1所述的药物组合物，其用于治疗缺血性心肌病、急性心肌梗死、慢性心肌梗死、非局部缺血起源的心衰竭、局部缺血起源的心衰竭、先天性心肌病或其组合。

21.一种用于治疗心脏疾病或疾患倾向的方法，其中将有效量的根据权利要求1所述的药物组合物递送入个体。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述个体罹患一种或多种病症，所述病症选自由以下组成的组：缺血性心肌病、心肌梗死、局部缺血起源的心衰竭、非局部缺血起源的心衰竭、先天性心肌病及其组合。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述药物组合物使用选自由以下组成的组的施用途径递送：心肌内、心脏内、冠状血管内、肌内、皮下、腹腔内、子宫内、胃肠外或全身。

24.根据权利要求21所述的方法，其中所述药物组合物使用导管心肌内递送。

25.一种用于施用根据权利要求1所述的药物组合物的试剂盒，所述试剂盒包括含有所述药物组合物的容器。

26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述容器是允许细胞存活和世界范围内运输、方便护理人员操作以递送给接受者的生物相容性容器。

27.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述容器是密闭的。

28.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述容器与赋形剂和保存条件相容。

29.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述容器是密闭的玻璃容器。

30.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述容器具有可刺穿的隔膜帽。

31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述可刺穿的隔膜帽允许包括luer激活阀的管形瓶接头从所述容器抽取液体。

32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述可刺穿的隔膜帽可以用针头进入。

33.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述药物组合物贮存在适合冷冻保藏的密闭容器中。

34.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述容器中药物组合物的贮存期限是至少48小时。

35.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述容器中药物组合物的贮存期限是至少72小时。

36.根据权利要求25所述的试剂盒，所述试剂盒还包括至少一个导管。

37.根据权利要求25所述的试剂盒，所述试剂盒还包括至少一个注射器。

38.根据权利要求1所述的药物组合物，其中表达水平的观察到的增加通过qPCR方法测定与参照相比是至少2倍。

39.根据权利要求21所述的方法，其中所述药物组合物使用注射器心肌内递送。

40.根据权利要求18所述的药物组合物，其中非心脏修复细胞的总含量是总细胞数的0％至15％。

41.根据权利要求18所述的药物组合物，其中每个类别的非心脏修复细胞的含量是总细胞数的0％至15％。

42.一种药物组合物，包含定向产生心脏组织的中间表型细胞，其中所述细胞显示以下观察到的存在：

(1)与非心脏修复细胞的参照相比，至少一种多肽类型，所述多肽类型选自由以下组成的组：Nkx2.5、Tbx5、GATA4、GATA6、Mesp1、FOG1、FOG2、Flk1及其同系物；和

(2)Nkx2.5和MEF2C中的一种或多种核转移至细胞核；和

不存在可检出的MYH7表达水平；以及

其中所述非心脏修复细胞的总含量是总细胞数的0％至50％。