KR20230087559A - 정상 핵형을 갖는 신규한 nr1 es-유래 신경 줄기세포 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
NR1 ES-유래 신경 줄기 세포와 관련된 조성물 및 방법이 제공된다. 세포는 제한 없이 뇌졸중을 포함하는 불리한 신경학적 병태에 대한 치료 방법에 유용하다.
Description
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2020년 10월 12일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/090,671호의 이점 및 우선권을 주장하며, 이 기초출원의 전체 개시내용은 본 명세서에 원용된다.
지금까지 뇌졸중으로 인한 잔여 구조적 및 기능적 결손을 개선하기 위한 효과적인 치료법은 없었다. 연간 발생률이 가장 높은 알츠하이머병, 외상성 뇌 손상, 간질 및 파킨슨병을 포함한 임의의 신경학적 장애와 함께 뇌졸중은 성인 장애(disability)의 주요 원인이다. 매년 미국에서 795,000명의 사람들이 뇌졸중을 경험할 것이며, 대략 700만 명의 미국인들이 현재 뇌졸중으로 인한 장애를 가지고 살고 있다. 뇌졸중-관련 비용은 연간 340억 달러를 초과하며, 이러한 수치는 일반 인구의 연령이 증가함에 따라 증가할 것으로 예상된다. 개선된 급성기 의료 관리(acute medical management)로 인해 뇌졸중 사망률이 감소하고 있으며, 따라서 뇌졸중은 급성 살인자에서 만성 장애 질환으로 바뀌고 있다. 그러나, 이 뇌졸중의 만성 단계를 표적으로 하는 치료 옵션은 거의 없다. 회복을 위한 이러한 치료는 물리치료 의학 - 작업 요법, 물리 치료 및 언어/인지 요법에 초점을 맞추고 있다. 그러나, 이들은 시간이 많이 소요되며, 비용이 많이 들고, 기능 회복에 매우 미미한 이점이 있으며, 뇌졸중 후 6개월 이상 신경학적 기능을 추가로 개선하는 데 효과적이지 않다. 이러한 사실은 기존의 의료 요법이 없는 일반적이고 파괴적인 만성 질환을 정의하며, 뇌졸중 회복을 충족되지 않은 의료 수요의 주요 영역으로 확립한다.
NR1 ES-유래 신경 줄기 세포에 관한 조성물 및 방법이 제공되며, 이 세포는 대상체에서 신경학적 기능의 회복에 활성인 영양 인자(trophic factor)를 발현하고, 여기서 영양 인자는 내인성 신경 복구 과정을 증대시킨다. 세포는 유전적으로 조작되거나 또는 변경되지 않는다. 세포는 정상 핵형(karyotype)을 갖는다. 세포의 다른 이점은 해동 후 및 이식 전 개선된 생존력(12시간의 생존력); 저용량에서의 효능 및 견고하고 확장 가능한 cGMP 제조 공정을 포함한다.
개시된 NR-1 세포는 제한 없이 뇌졸중 또는 외상성 뇌 손상을 포함하는 불리한 신경학적 병태에 대한 치료 방법에 유용하다. 일부 방법에서, NR1 세포는 이의 치료를 필요로 하는 환자에게 뇌내로 전달된다. NR-1 세포는 유효 용량의 세포를 환자의 대뇌 피질 내로 또는 그 근처에 이식함으로써 투여될 수 있되, 대상체의 대뇌 피질은 전전두 피질, 운동 연합 피질, 1차 운동 피질 또는 1차 체감각 피질 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 이러한 투여는, 예를 들어, 피질 또는 피질하일 수 있으며, 뇌의 피질하 영역은 해마, 편도체, 확장된 편도체, 대상핵, 기저핵 또는 기저 전뇌 중 어느 하나일 수 있다.
일부 실시형태에서, 유효 용량의 NR1 세포는 뇌졸중의 치료를 위해 환자에게 전달된다. 다른 실시형태에서, 유효 용량의 NR1 세포는 허혈성 뇌졸중, 만성 출혈성 뇌졸중, 아급성 허혈성 및 출혈성 뇌졸중 환자, 외상성 뇌 손상 환자, 척수 손상, 파킨슨병, ALS(루게릭병) 및 알츠하이머병으로부터 선택되는 신경학적 병태의 치료를 위해 환자에게 전달된다.
NR1 세포는 면역계, 혈관신생의 조절을 포함하는 다수의 고유한(내인성) 분자 및 세포 메커니즘을 강화하고 신경 네트워크의 흥분/저해 균형을 개선함으로써 신경학적 기능을 개선하는 인자를 분비하는 것으로 나타났다. NR1 세포는 뉴런, 성상세포, 희소돌기아교세포 또는 뇌의 다른 세포의 통합 및 세포 교체를 통해 작동하지 않는다.
NR1 ES-유래 신경 줄기 세포는 ColA1, LGALS1, TGF-B3, TIMP1, COL6A1, COL3A1, MMP2, SPARC, NRG3, SDF1(a), 갈렉틴 1, FGF18, CSF3, CCL2(MCP-1이라고도 함), FGF7, FGF17, PAI1/세르핀 1, VEGF-A, MCP1(CCL2) 및/또는 SDF1α 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다. 발현된 영양 인자는 피질 및/또는 피질하 뇌 영역 내의 혈류 및 혈관 신호를 증가시키고 구조적 가소성을 증가시킴으로써 신경 혈관신생에서 복구 과정을 증대시킬 수 있다. 증가된 구조적 가소성은, 예를 들어, 시냅스생성, 수지상 발아, 축색돌기 발아 등을 수반할 수 있다. 예를 들어, 영양 인자는 성장 인자, 사이토카인 및/또는 세포외 기질 단백질의 조합을 포함할 수 있다. 세포외 기질 단백질은 임의의 ColA1, LGALS1, TGF-B3, TIMP1, COL6A1, COL3A1, MMP2, SPARC, NRG3, SDF1(a), 갈렉틴 1, FGF18, CSF3, CCL2(MCP-1이라고도 함), FGF7, FGF17, PAI1/세르핀 1, VEGF-A, MCP1(CCL2) 및/또는 SDF1α 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포의 유효 용량은 개별 용량당 약 1×106개, 최대 약 108개의 세포이며, 약 2.5×106개 내지 약 2×107개, 예를 들어, 약 2.5×106개, 약 5.0×106개, 약 10×106개, 약 20×106개/용량일 수 있다. 전달을 위한 세포의 농도는 약 106개 내지 약 108개 세포/㎖ 부형제, 예를 들어, 약 8.3×106개, 약 16.6×106개, 약 33.3×106개, 약 66.6×106개/㎖ 부형제일 수 있다.
일부 실시형태에서, 성장 인자, 사이토카인 및/또는 세포외 기질 단백질의 조합을 포함하는 영양 인자를 분비하는 정상 핵형을 갖는 포유동물 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포의 단리된 집단이 제공된다. 일부 실시형태에서, NR1 세포는 비정상 핵형을 갖는 비유전적으로 변형된 NR1 ES 신경 줄기 세포로부터 유래되고, 정상 핵형을 나타내도록 적어도 15회, 16회, 17회, 18회, 19회, 20회 이상의 계대 후에 배양된다.
일부 실시형태에서, 정의된 세포 배양 조건하에 정상 핵형을 갖는 인간 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포를 생산하는 방법이 제공되되, 방법은 (a) 피더 세포의 부재하에 글루타맥스, N2 보충제, RA, EGF, FGF, LIF 및 PHS가 없는 B27이 포함된 배양 배지에서 고체 지지체 상에 인간 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 이에 의해 정의된 세포 배양 조건하에 시험관내에서 인간 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포를 생산하는 단계를 포함한다.
NR1 ES-유래 신경 줄기 세포의 투여는 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포를 대상체의 대뇌 피질 내로 또는 그 근처에 이식하는 것을 포함할 수 있되, 대상체의 대뇌 피질은 전전두 피질, 운동 연합 피질, 1차 운동 피질 또는 1차 체감각 피질 중 어느 하나를 포함한다. 뇌의 피질하 영역은 해마, 편도체, 확장된 편도체, 대상핵, 기저핵 또는 기저 전뇌 중 하나일 수 있다. 뇌의 피질 영역은 전전두 피질, 운동 연합 피질, 1차 운동 피질 또는 1차 체감각 피질일 수 있다. 투여는 뇌졸중 또는 외상성 뇌 손상 후 적어도 1주일 후일 수 있으며, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월 및 최대 약 60개월 전에 발생한 안정적인 허혈성 뇌졸중으로 인한 편측 부전마비가 있는 개체에게 투여될 수 있다.
증가된 구조적 가소성은 시냅스생성, 수지상 분지 및 축색돌기 발아 중 어느 하나를 수반할 수 있다. 회복된 신경학적 기능은, 예를 들어, 대상체의 팔을 들거나 또는 들어올리는 상지 기능을 부분적으로 또는 완전히 회복시킬 수 있다. 신경학적 기능의 회복은 걷거나 또는 균형을 잡는 능력의 회복 또는 보행 장애, 보행 불능 또는 균형 상실을 역전시키는 것을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 보행 장애는 임의의 보행 속도의 감소, 비대칭 보행 패턴, 걸음 거리의 감소, 보폭의 증가, 영향을 받는 사지의 유각기(swing phase) 연장, 물리적 장애물을 극복하는 능력의 감소, 지형의 변화에 대한 보행 조정 능력의 감소, 리드미컬한 움직임의 상실, 가로대를 가로질러 이동하는 능력의 감소 및 이들의 조합을 포함한다. 대상체의 손상된 이동성을 역전시키는 것은 임의의 더 큰 보행 속도, 대칭 보행 패턴의 증가, 더 큰 걸음 거리, 보폭 감소, 영향을 받는 사지의 유각기 기간의 감소, 물리적 장애물을 극복하는 더 큰 능력, 지형의 변화에 대한 보행을 조정하는 더 큰 능력, 리드미컬한 움직임의 증가, 가로대 또는 사다리를 가로질러 이동하는 더 큰 능력 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
NR1은 신경-유도성 조건에서의 배양에 의한 원래 H9 인간 배아 줄기 세포주(human Embryonic Stem Cell: hESC)로부터 유래된 전구세포주로부터의 제품이다. 이는 유전자 변형되지 않은 안정적인 세포주이다. NR1은 NR1 cGMP 마스터 세포 은행(Master Cell Bank)으로부터 제조될 수 있으며, 완제 의약품 사용 후(post-drug product) p30의 광범위한 계대에 걸쳐 일관된 성장 및 품질 속성을 나타낸다. 이러한 평가는 MCB로부터 3회 계대만 확장될 수 있는 임상 완제 의약품 로트에 대한 확신을 준다. 일관된 성장 특성과 함께, 임상 검체 생산의 3회 계대에 걸쳐 유지되는 속성은 정상 핵형분석(normal karyology) 및 0.01% 미만의 잔여 hESC의 수준을 포함한다.
일부 실시형태에서, 개체는 피질하 경색 영역에 인접한 회백질 또는 백질 부위에 입체 정위적으로 이식된 1회 이상의 용량의 NR1으로 치료된다. 1회의 천공 개두술 기법이 사용될 수 있으며, 세포는 손상된 영역 주변의 다양한 깊이에서 각 트랙에 침착물이 있는 니들 트랙을 사용하여 이식된다.
일부 실시형태에서, 뇌 병변은 대상체의 피질 또는 피질하 뇌 영역 외부에 위치할 수 있으며, 예를 들어, 뇌 병변은 대상체의 피질 또는 피질하 뇌 영역에 또는 그 주위에 위치한다.
뇌졸중 후 대상체에서 내인성 신경 복구 과정을 증대시키기 위해 대뇌 피질의 외인성 영양 인자를 증가시킴으로써 대상체에서 운동 결함을 저해, 감소 또는 역전시키는 방법은 대상체의 운동 결함을 저해, 감소 또는 역전시키기 위해 대상체의 신경학적 기능을 회복시키기 위해 치료학적 유효량의 영양 인자를 발현하는 신경 줄기 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 뇌졸중 후 대상체의 신경학적 기능을 회복시켜 대상체의 운동 결함을 치료하기 위해 치료학적 유효량의 영양 인자를 발현하는 신경 줄기 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 내인성 신경 복구 과정을 증대시키기 위해 대뇌 피질의 외인성 영양 인자를 증가시킴으로써 대상체의 운동 결함을 치료하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 뇌졸중의 결과인 운동 결함을 저해, 감소 또는 역전시킴으로써 대상체의 운동 결함을 감소 또는 역전시킴으로써 뇌졸중의 결과로서 운동 결함을 앓고 있는 대상체를 재활시키는 방법이 제공된다.
도 1. H9 및 NR-1 세포 함량의 함수로서의 기형종 형성.
도 2. 원료 의약품(drug substance) 생산에 대한 흐름도.
도 3. NR-1 세포의 배양 및 풀링에 대한 흐름도.
도 4. 운동 비대칭성에 대한 신체 거상 스윙 테스트(elevated body swing test).
도 5. 감각운동 기능에 대한 평균 신경학적 점수 테스트.
도 6. 운동 협응에 대한 로타로드 테스트.
도 7. NR-1 용량을 비교하는 시간 경과에 따른 VP 점수.
도 8. NR-1 용량을 비교하는 수염-발 테스트(Vibrissae-Paw test).
도 9. NR-1 용량을 비교하는 자세-반사 테스트.
도 10. NR-1 용량을 비교하는 수정된 신경학적 점수 테스트.
도 11. NR-1 용량의 효과를 비교하는 조직학 슬라이드.
도 12. NR-1 용량의 효과를 비교하는 조직학 슬라이드.
도 13. L2 강도 및 반응 곡선의 비교.
도 14. NR1 시냅스생성 값.
도 15. GO 생물학적 처리 과정도.
도 16. 이식 후 단핵구 및 과립구의 플롯.
도 17. M1 및 M2 대식세포에 의한 사이토카인의 발현.
도 18. M1 및 M2 대식세포에 의한 사이토카인의 발현.
도 19. 자극되지 않은 대식세포의 단백질 발현.
도 20. 시간 경과에 따른 NR-1 생존.
도 21. 유전자 발현의 평가.
도 22. 유전자 발현의 평가.
도 23. PLX의 존재 또는 부재하의 미세아교세포 세포.
도 24. 미세아교세포 조직학.
도 25. 뇌 조직학.
도 26. Iba1 및 GFAP에 대한 염색.
도 27. T2 MRI 분석.
도 2. 원료 의약품(drug substance) 생산에 대한 흐름도.
도 3. NR-1 세포의 배양 및 풀링에 대한 흐름도.
도 4. 운동 비대칭성에 대한 신체 거상 스윙 테스트(elevated body swing test).
도 5. 감각운동 기능에 대한 평균 신경학적 점수 테스트.
도 6. 운동 협응에 대한 로타로드 테스트.
도 7. NR-1 용량을 비교하는 시간 경과에 따른 VP 점수.
도 8. NR-1 용량을 비교하는 수염-발 테스트(Vibrissae-Paw test).
도 9. NR-1 용량을 비교하는 자세-반사 테스트.
도 10. NR-1 용량을 비교하는 수정된 신경학적 점수 테스트.
도 11. NR-1 용량의 효과를 비교하는 조직학 슬라이드.
도 12. NR-1 용량의 효과를 비교하는 조직학 슬라이드.
도 13. L2 강도 및 반응 곡선의 비교.
도 14. NR1 시냅스생성 값.
도 15. GO 생물학적 처리 과정도.
도 16. 이식 후 단핵구 및 과립구의 플롯.
도 17. M1 및 M2 대식세포에 의한 사이토카인의 발현.
도 18. M1 및 M2 대식세포에 의한 사이토카인의 발현.
도 19. 자극되지 않은 대식세포의 단백질 발현.
도 20. 시간 경과에 따른 NR-1 생존.
도 21. 유전자 발현의 평가.
도 22. 유전자 발현의 평가.
도 23. PLX의 존재 또는 부재하의 미세아교세포 세포.
도 24. 미세아교세포 조직학.
도 25. 뇌 조직학.
도 26. Iba1 및 GFAP에 대한 염색.
도 27. T2 MRI 분석.
정의
본 개시내용의 실시형태를 더 설명하기 전에, 본 개시내용은 기재된 특정 실시형태에 제한되지 않으며 물론 그 자체가 다양할 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 본 개시내용의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이며 이를 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분양의 당업자에 의해 일반적으로, 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 또한 본 개시내용의 실시형태를 실시하거나 또는 테스트하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, "단수형"은 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "화합물"에 대한 언급은 단일 화합물뿐만 아니라 2개 이상의 화합물의 조합도 포함하고, "치환기"에 대한 언급은 단일 치환기뿐만 아니라 2개 이상의 치환기 등을 포함한다.
본 발명을 설명하고 청구함에 있어서, 소정의 용어가 아래 제시된 정의에 따라 사용될 것이다. 본 명세서에 제공되는 정의는 상호 배타적인 것으로 의도되지 않음을 이해할 것이다. 따라서, 일부 화학적 모이어티는 하나 초과의 용어의 정의에 포함될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 어구 "예를 들어(for example)", "예를 들어(for instance)", "예컨대" 또는 "포함하는"은 보다 일반적인 특허 대상을 더욱 명확하게 하는 예를 소개하기 위한 것이다. 이들 예는 개시내용을 이해하는 데 도움을 주기 위한 것일 뿐이며 어떤 식으로든 제한하려는 의도가 아니다.
용어 "활성제", "길항제", "저해제", "약물" 및 "약리학적으로 활성인 작용제"는 본 명세서에서 유기체(인간 또는 동물)에게 투여될 때 국부 및/또는 전신 작용에 의해 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 화학 물질 또는 화합물을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "치료", "치료하는" 등은 바이러스 역가의 감소와 같은 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 측면에서 예방일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기인하는 유해 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 측면에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질환의 임의의 치료를 포괄하며, (a) 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환(예를 들어, 원발성 질환과 관련이 있거나 또는 이에 의해 유발될 수 있는 질환 포함)이 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환 또는 질환의 증상이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 저해하는 것, 즉, 질환의 발생을 저지하는 것; 및 (c) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환의 퇴행(예를 들어, 바이러스 역가의 감소)을 유발하는 것을 포함한다.
용어 "개체", "숙주", "대상체" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 유인원 및 인간을 포함하는 인간 및 비인간 영장류; 래트 및 마우스를 포함하는 설치류; 소; 말; 양; 고양이; 개; 조류 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 동물을 지칭한다. "포유동물"은 임의의 포유동물 종의 구성원 또는 구성원들을 의미하며, 예로서, 개; 고양이; 말; 소; 양; 설치류 등 및 영장류, 예를 들어, 비인간 영장류 및 인간을 포함한다. 비인간 동물 모델, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 비인간 영장류, 뮤린, 토끼목 등이 실험적 조사를 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "결정하는", "측정하는", "평가하는" 및 "검정하는"은 상호교환적으로 사용되며, 정량적 및 정성적 결정을 모두 포함한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 코딩된 아미노산 및 코딩되지 않은 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 또는 유도체화된 아미노산 및 변형된 펩타이드 백본을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭한다. 용어는 이종 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질, N-말단 메티오닌 잔기가 있거나 없는 이종 및 천연 리더 서열과의 융합체; 면역학적으로 태깅된 단백질; 검출 가능한 융합 파트너를 갖는 융합 단백질, 예를 들어, 융합 파트너로서 형광 단백질, β-갈락토시데이스, 루시퍼레이스 등을 포함하는 융합 단백질; 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 융합 단백질을 포함한다.
용어 "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용되며, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이들의 유사체 중 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 공지되거나 또는 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 제어 영역, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함한다. 핵산 분자는 선형 또는 원형일 수 있다.
"치료학적 유효량" 또는 "유효한 양"은 질환, 병태 또는 장애를 치료하기 위해 포유동물 또는 다른 대상체에게 투여될 때 질환, 병태 또는 장애에 대한 이러한 치료를 수행하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. "치료학적 유효량"은 화합물, 질환과 이의 중증도 및 치료되는 대상체의 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "단위 투여 형태"는 인간 및 동물 대상체를 위한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각 단위는 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 비히클과 함께 목적하는 효과를 내기에 충분한 양으로 계산된 미리 결정된 양의 화합물을 포함한다. 단위 투여 형태에 대한 사양은 사용된 특정 화합물과 달성될 효과 및 숙주에서의 각 화합물과 관련된 약동학에 따라 다르다.
"약제학적으로 허용 가능한 부형제", "약제학적으로 허용 가능한 희석제", "약제학적으로 허용 가능한 담체" 및 "약제학적으로 허용 가능한 보조제"는 일반적으로, 안전하고, 무독성이며 및 생물학적으로나 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 약제학적 조성물을 제조하는 데 유용한 부형제, 희석제, 담체 및 보조제를 의미하며, 수의학적 용도뿐만 아니라 인간의 약제학적 용도에 대해 허용 가능한 부형제, 희석제, 담체 및 보조제를 포함한다. 명세서 및 청구범위에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제, 담체 및 보조제"는 이러한 부형제, 희석제, 담체 및 보조제 중 하나 및 하나 초과를 모두 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적 조성물"은 포유동물, 특히 인간과 같은 대상체에게 투여하기에 적합한 조성물을 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로, "약제학적 조성물"은 멸균이며, 바람직하게는 대상체 내에서 바람직하지 않은 반응을 유발할 수 있는 오염물질이 없다(예를 들어, 약제학적 조성물 내의 화합물(들)이 약제학적 등급임). 약제학적 조성물은 경구, 협측, 직장, 비경구, 복강내, 피내, 기관내, 근육내, 피하 등을 포함하는 다수의 상이한 투여 경로를 통해 이를 필요로 하는 대상체 또는 환자에게 투여하도록 설계될 수 있다.
NR1 세포
신경 재생성 1로부터의 NR1 세포주는 직접적인 뇌내 주사에 의한 뇌졸중 및 외상성 뇌 손상의 운동 후유증을 치료하기 위해 개발된 독특한 연구용 세포 치료제이다. 이러한 운동 결함은 극도로 장애를 초래할 수 있으며, 팔 및/또는 다리 운동 제어의 임의의 개선은 대상체의 건강 및 삶의 질을 크게 개선한다. 동물 뇌졸중 모델에서, NR1은 운동 기능 제어를 개선하는 효능을 보였으며, NR1은 우수한 안전성 프로파일을 보여준다.
NR1은 신경-유도성 조건에서의 배양에 의한 원래 H9 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통으로부터 유래된 전구세포주로부터의 완제 의약품이다. 이는 유전자 변형되지 않은 안정적인 세포주이다. NR1(완제 의약품)은 NR1 cGMP 마스터 세포 은행(NR1 MCB)으로부터 제조되며, 완제 의약품 사용 후 p30의 광범위한 계대에 걸쳐 일관된 성장 및 품질 속성을 나타낸다. 일관된 성장 특성과 함께, 임상 검체 생산의 3회 계대에 걸쳐 유지되는 속성은 정상 핵형분석 및 Oct 및 Re×1에 대한 qPCR에 의해 평가되는 바와 같은 잔여 hESC의 수준을 포함한다.
약물 NR1은 운동 결함을 동반한 만성 허혈성 피질하 뇌졸중의 치료를 위해 개발되고 있는 독특한 배아 줄기 세포-유래 제품이다. 뇌졸중의 중심부는 혈류 없이는 생존 불가능한 조직으로 이루어져 있으므로, 이식된 세포는 이 영역에서 일시적으로도 생존하지 못할 것이다. 따라서, NR1의 투여 대상은 기능적 인간 뇌 이미징 및 비임상 연구에서 조직 복구 및 재구성에 활성인 것으로 나타난 영역인 피질하 뇌졸중에 인접한 뇌 조직의 피질하 부분이다. 이러한 투여는 이들 각각의 모델에서의 병변의 평균 크기 및 위치의 사전 결정에 기초하여 피질하 및 피질 허혈성 뇌졸중의 설치류 모델에서 뇌졸중 병변에 인접한 조직으로 NR1을 직접 전달하기 위해 주입 좌표가 확인된 비임상 약리학 연구와 일치한다. 이 모델에서, 동물 모델에서의 감각운동 및 다른 신경학적 결과는 긍정적이었으며, 이는 뇌 피질하 뇌졸중 조직이 피질하 및 피질 영역에서 적어도 부분적으로 신경학적 기능을 회복하도록 자극될 수 있음을 나타낸다. 신경 회로의 복원 및 임상적 개선을 동반한 이러한 동일한 활성이 뇌졸중 후 인간 뇌에서 유사하게 발생할 수 있기 때문에, 이 연구는 아래 기재된 바와 같이 설계된 비임상 연구를 제안하며 이를 뒷받침한다.
NR1 이식은 이식 후 경색 주변 피질에서 운동 회로 활동을 상당히 증가시키는 반면, 저해성 연결은 크기가 감소하고 발병이 지연된다. NR1 세포는 저해성 제어로부터 경색 주변 영역에서 개별 뉴런을 방출함으로써 운동 회로 활동을 증가시킨다. NR1 세포는, 예를 들어, 망막 신경절 신경 세포(ganglion neuronal cell: RGC)의 시냅스생성을 향상시키는 분비 인자에 의해 신경 세포의 가소성에 영향을 미칠 수 있다. NR1 이식은 가소성과 관련된 유전자의 발현과 관련이 있다. NR1 세포는 성체 신경 전구세포 증식, 신경 분화, 뉴런의 전기생리학적 특성에 직접 관여하는 개폐형 채널, 축색돌기 유도, 축색돌기 형성(axonogenosis) 및 시냅스생성을 자극하는 것과 관련된 유전자의 특이적이고 차별적인 발현을 야기한다.
NR1은 세포외 기질(extracellular matrix: ECM) 리모델링(대부분의 뇌 복구 메커니즘에 관여함) 및 염증 및 축색돌기 유도와 관련된 과정을 포함하는 뇌 복구와 관련된 단백질을 분비한다. 특히, NRG3 및 TGFβ3는 생체내 뇌졸중 환경에서 상향 조절된다.
NR1에 의한 이식 후 면역 반응은 대식세포를 M1/전염증성 상태에서 M2/항-염증성 상태로 변화시키는 것으로 나타났다. T2-FLAIR MRI는 뇌졸중 대상체에서 NR1-유도성 기능 회복의 임상적 예측인자로서 사용될 수 있다. T2-MRI FLAIR 신호는 염증과 관련이 있다. 이는 두 번째 비침습적 이미징 양식인 TSPO-PET라고 하는 전위 단백질 18kDa(translocator protein: TSPO)의 PET 이미징과 함께 사용될 수 있다. TSPO는 뇌 상주 면역 세포, 미세아교세포와 성상세포 및 단핵구/대식세포, 호중구 및 수지상 세포와 같은 침윤성 골수 세포를 포함하는 활성화된 면역 세포를 포함한다. TSPO 수준은 건강한 뇌에서는 낮지만 염증성 병태하에서는 상향 조절된다. 따라서, TSPO-PET 방사성 리간드는 신경 염증의 유용한 지표 역할을 한다. 이러한 검정은 뇌졸중 회복을 촉진하는 NR1의 효과로서 면역조절을 보여줄 수 있다.
NR1 세포는 성체 신경 전구세포 증식, 신경 분화, 뉴런의 전기생리학적 특성에 직접 관여하는 개폐형 채널, 축색돌기 유도, 축색돌기 형성 및 시냅스생성을 자극하는 것과 관련된 유전자의 특이적이고 차별적인 발현을 야기할 수 있다. 세포는 저해성 제어로부터 경색 주변 피질에서 개별 뉴런을 방출할 뿐만 아니라 시냅스생성을 자극하는 분비 인자에 의해 가소성을 조절함으로써 뇌졸중 후 경색 주변 영역의 가소성에 기여한다.
생체내에서 NR1에 의해 대부분 고도로 발현되는 분비된 유전자 중 일부는 다음을 포함한다: ECM 조직화에 관여하며 백혈구 이동 및 염증에 영향을 미칠 수 있는 Col1A1(collagen type 1 alpha 1 chain: 콜라겐 유형 1 알파 1 사슬)4; 뇌졸중 후 생체내에서 대식세포 분극화를 M2-유사(보다 항-염증성) 상태로 이동시키는 것으로 나타난 LGALS1(갈렉틴 1); ECM 형성을 조절하며 전염증성 및 항-염증성 효과 모두를 갖는 TGFβ3; ECM 분해에 관여하는 MMP의 저해제인 TIMP1. 또한, 이는 마이엘린 복구 역할을 하는 성장 인자로 작용하는 MMP-독립적인 작용을 한다. 가소성과 관련된 유전자는 COL6A1, COL3A1, MMP2, SPARC, NRG3 및 SDF1을 포함한다.
NR1은 표현형의 변화 또는 핵형 안정성의 손실 없이 안정적이고 무한한 시험관내 확장 가능하며 균질한 장기 배양물로부터 형성된다. NR1의 제조 공정은 hESC의 반복 사용 및 신경 전구세포로의 분화를 필요로 하지 않으며, 오히려 15회 계대(p15)에서 동결보존된 NR1 마스터 세포 은행(MCB)의 바이알이 해동되고, 피더가 없는 부착 배양으로 정의된 배양 배지에서 p18로 확장되어 NR1 원료 의약품(Drug Substance: DS)을 생산한다. DS의 제조는 충전, 마무리 및 NR1 DP로의 동결보존을 포함하는 연속 공정의 일부이기 때문에, NR1 DS의 바이알은 그 자체로 생산되지 않는다.
NR1 생산
NR1 원료 의약품 및 완제 의약품은 cGMP 요건을 준수하여 제조되며, cGMP NR1 MCB의 생성으로 개시된다. NR1 제조 공정의 예시적인 "높은 수준"의 공정 흐름도가 도 2에 제공되어 있다. 세포 확장 동안, 단층이 트립신에 노출된 후 배양 계대 수는 1씩 증가한다(예를 들어, 16회 계대 세포가 시딩된 다음 거의 컨플루언트한 단층으로 확장되고 트립신 처리되면, 생성된 현탁액은 17회 계대 등으로 간주됨). 벌크 원료 의약품은 공정 흐름도에서 "단위 작업" 열의 #5에서 수확 및 첫 번째 재현탁 단계로 식별되며, NR1을 만들기 위해 같은 날 연속적으로 처리된다. NR1 완제 의약품은 바이알당 7.5% DMSO, 42.5% ProFreeze 및 50% 완전 성장 배지로 이루어진 1㎖의 최종 동결보존 제형에 동결보존된 6×106개의 특정 계대 NR1 세포로 이루어진다.
NR1 로트는 1) 무균성(USP), 2) 정균 작용 및 정진균 작용, 3) 마이코플라스마(USP), 4) 정마이코플라스마 작용(mycoplasmastasis), 5) 내독소, 6) 시험관내 외생성 바이러스, 7) 세포 생존력, 8) 세포 수(강도), 9) 핵형, 10) 정체(유세포 분석법에 의한 CD73 발현), 11) 순도(유세포 분석법에 의한 β-튜불린-III 발현) 및 12) 불순물(유세포 분석법에 의한 Tra-1-60 발현 및 RT-qPCR에 의한 OCT4 및 REX1) 중 하나 이상에 대해 테스트될 수 있으며, 이는 이러한 매개변수에 대한 표준이 충족되는 경우에만 사용된다.
내인성 신경 복구 경로 및 잠재적 메커니즘
NR1의 투여는 아급성 또는 만성 기간에 투여될 때 피질 및 피질하 뇌졸중 모두의 장기간 신경학적 회복을 제공한다. 신경-염증의 감소 및 경색 주변 혈관신생의 증가는 초기의 알려진 작용 메커니즘이다. 지금까지 NR1을 사용하여 수행된 모든 생체내 연구에서, 관찰, 데이터 및 결과는 독성의 명백한 임상 징후가 없고, 종양 또는 기형종 형성의 거시적 또는 현미경적 증거가 없으며, 테스트 물품-관련 유해 소견이 없음을 나타낸다.
일부 실시형태에서, NR1의 투여 대상은 기능적 인간 뇌 이미징에서 관찰되는 바와 같이 뇌졸중 후 조직 복구 및 재구성에 있어서 활성이 있는 것으로 나타난 영역인 피질하 뇌졸중에 인접한 뇌 조직의 피질하 부분이다. 이 동일한 영역은 동일한 투여 부위를 사용하는 연구에서도 조직 복구 및 재구성에 활성이 있는 것으로 나타났다. 이러한 각각의 모델에서 병변의 평균 크기 및 위치의 사전 결정에 기초하여 뇌졸중 병변에 인접한 조직으로 NR1을 직접 전달하기 위한 주입 좌표가 확인되었다.
일부 실시형태에서, 효능은 임상 및 방사선학적 반응뿐만 아니라 효능 측정 도구의 유용성에 의해 평가된다. 대상체는 자신의 안정적인 이식 전 기준선과 비교될 수 있다. 효능의 확립된 척도 및 1차 평가는 이식 후 6개월에 푸글 마이어(Fugl Meyer: FM) 운동 점수에 대한 신경학적 기능 결과일 수 있다. 탐색적 종점 결과 측정은 치료 후 6개월에 NIHSS, 안정 보행속도(Comfortable Gait Speed: CGS) 테스트, mRS 및 신경 삶의 질(Neuro Quality of Life: QOL) 및 총 FM 점수를 포함할 것이다.
만성 뇌졸중의 치료
지금까지 뇌졸중으로 인한 잔여 구조적 및 기능적 결손을 개선하기 위한 효과적인 치료법은 없었다. 뇌졸중은 성인 장애의 주요 원인이며, 임의의 신경학적 장애의 연간 발생률이 가장 높다. 개선된 급성기 의료 관리로 인해 뇌졸중 사망률은 감소하고 있으며, 따라서 뇌졸중은 급성 살인자에서 만성 장애 질환으로 바뀌고 있다. 그러나, 이 뇌졸중의 만성 단계를 표적으로 하는 치료 옵션은 거의 없다. 회복을 위한 이러한 치료는 물리치료 의학 - 작업 요법, 물리 치료 및 언어/인지 요법에 초점을 맞추고 있다. 그러나, 이들은 시간이 많이 소요되며, 비용이 많이 들고, 기능 회복에 매우 미미한 이점이 있으며, 뇌졸중 후 6개월 이상 신경학적 기능을 추가로 개선하는 데 효과적이지 않다. 이러한 사실은 기존의 의료 요법이 없는 일반적이고 파괴적인 만성 질환을 정의하며, 뇌졸중 회복을 충족되지 않은 의료 수요의 주요 영역으로 확립한다.
제대혈, 골수 또는 뇌 조직(태아 및 성인)으로부터 유래된 세포의 이식은 뇌졸중의 실험적 모델에서 감각운동 기능을 향상시키는 인자를 분비한다. 그러나, 이러한 연구에 사용되는 정상적인 인간-유래 체성 줄기 세포는 대규모 세포 생산에 적합하지 않다. 허혈성 피질하 뇌졸중(ISS) 모델의 연구에서, 동물은 NR1(신경 줄기 세포 완제 의약품)을 사용한 뇌내 이식이 현저한 독성 없이 운동 기능의 내인성 회복을 향상시키는 인자를 분비함을 보여주었다. 그러나, 이전에 사용된 이러한 줄기 세포와 달리, NR1은 대규모 생산에 적합하다.
뇌내 이식
환자는 피질하 경색 영역에 인접한 회백질 또는 백질 부위에 입체 정위적으로 이식되는 단일 또는 다중 용량으로 제공될 수 있는 유효 용량의 NR1 세포를 투여받는다. 유효 용량은 약 2.5×106개 세포, 5.0×106개 세포, 10×106개 세포, 20×106개 세포, 50×106개 세포, 100×106개 세포 범위의 고정된 용량일 수 있다.
일부 실시형태에서, 1회의 천공 개두술 기법이 사용될 수 있으며, 세포는 손상된 영역 주변의 다양한 깊이에서 각 트랙에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 등의 침착물이 있는 다중 니들 트랙을 사용하여 이식된다. 일부 실시형태에서, 세포는 탐침(stylet) 및 주사 니들이 있는 안정화 캐뉼러를 포함하는 전달 시스템을 사용하여 수동으로 투여된다.
NR1의 동종이계 특성 및 이에 수반되는 제제로 인해, 수용자는 타크롤리무스, 표준-용량 사이클로스포린 A(CsA), 저용량 CsA 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역억제성 양생법으로 치료될 수 있다.
실험적
실시예 1
실시예 1
스탠포드 대학 신경 이식 프로그램(스탠포드 University Neural Transplant Program: SUNTP)은 이들의 NR1(신경 재생성 1) 세포주로부터 새로운 세포 완제 의약품인 NR1을 개발하였다. NR1은 직접적인 뇌내 주사에 의해 뇌졸중의 운동 후유증을 치료하기 위해 개발된 독특한 연구용 세포 치료제이다. 이러한 운동 결함은 극도로 장애를 초래할 수 있으며, 팔 및/또는 다리 운동 제어의 임의의 개선은 대상체의 건강 및 삶의 질을 크게 개선할 것이다. 동물 뇌졸중 모델에서, NR1은 운동 기능 제어를 개선하는 효능을 보였으며, NR1은 우수한 안전성 프로파일을 보여준다.
NR1은 신경-유도성 조건에서의 배양에 의한 원래 H9 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통으로부터 유래된 전구세포주로부터의 완제 의약품이다. 이는 유전자 변형되지 않은 안정적인 세포주이다. NR1(완제 의약품)은 NR1 cGMP 마스터 세포 은행(NR1 MCB)으로부터 제조되며, 완제 의약품 사용 후 p30의 광범위한 계대에 걸쳐 일관된 성장 및 품질 속성을 나타낸다. 이러한 평가는 MCB로부터 3회 계대만 확장될 수 있는 임상 완제 의약품 로트에 대한 확신을 준다. 일관된 성장 특성과 함께, 임상 검체 생산의 3회 계대에 걸쳐 유지되는 속성은 정상 핵형분석 및 Oct4(0.01%의 검정 검출 한계 미만) 및 Re×1(검출 불가)에 대한 qPCR에 의해 평가된 바와 같은 잔여 hESC의 수준을 포함한다.
위에 언급한 바와 같이, NR1 세포는 WiCell Research Institute WA09(H9) 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통으로부터 유래된 인간 신경 줄기 세포주이며, 완제 의약품(DP) NR1의 활성 성분이다. NR1은 표현형의 변화 또는 핵형 안정성의 손실 없이 안정적이고 무한한 시험관내 확장 가능하며 균질한 장기 배양물로부터 형성된다. NR1의 제조 공정은 hESC의 반복 사용 및 신경 전구세포로의 분화를 필요로 하지 않으며, 오히려 15회 계대(p15)에서 동결보존된 NR1 마스터 세포 은행(MCB)의 바이알이 해동되고, 피더가 없는 부착 배양으로 정의된 배양 배지에서 p18로 확장되어 NR1 원료 의약품(DS)을 생산한다. DS의 제조는 충전, 마무리 및 NR1 DP로의 동결보존을 포함하는 연속 공정의 일부이기 때문에, NR1 DS의 바이알은 그 자체로 생산되지 않는다.
NR1의 임상적 평가
만성 허혈성 피질하 뇌졸중(cISS)이 있는 피험자에서 안전성, 내약성을 평가하고 NR1의 뇌내 이식(intra-cerebral transplantation: ICT)의 효능의 지표를 얻기 위해 조합된 임상 1상/2상 연구를 설계하였다. 이는 안정적인 허혈성 뇌졸중으로 인한 편측 부전마비가 있는 18세 내지 75세 사이의 피험자에서 NR1 세포의 입체 정위적, 두개내 주사를 사용한 오픈-라벨 안전성 및 내약성 연구이다. 안정성은 스크리닝 및 수술 전 기준 기간(적어도 1주 간격) 동안 안정적으로 유지된 피험자를 확인함으로써 평가하였다. 주로 안전성 연구가 진행되는 동안, 효능 매개변수도 평가할 것이다.
4개의 코호트 각각에 피질하 경색 영역에 인접한 회백질 또는 백질 부위에 입체 정위적으로 이식되는 코호트 별로 증량되는 단일 용량의 NR1을 투여한다. 1회의 천공 개두술 기법을 사용하였고, 세포는 손상된 영역 주변의 다양한 깊이에서 각 트랙에 5개의 침착물이 있는 3개의 니들 트랙을 사용하여 이식하였다. 세포 이식은 부피(20 ㎕/침착물) 및 주입 속도(10 ㎕/분)에 대해 표준화하였고, 각 임플란트 사이의 간격은 대략 5㎜ 내지 6㎜였다. 각 침착은 대략 2분 내지 3분이 소요되고, 각 니들 트랙은 15분 이내에 완료될 것으로 예상되었다.
NRI은 바슈롬(Bausch & Lomb)에서 제조된 탐침 및 주사 니들이 있는 맞춤 제작 안정화 캐뉼러 및 Hamilton Gastight 1700 시리즈 100㎕ 보로실리케이트 유리 주사기로 이루어진 전달 시스템을 사용하여 수동으로 투여하였다. 현재 NR1 투여에 필요한 투여 용량 부피에 적합한 FDA 시장 승인을 받은 니들 또는 주사기는 없다. 사강(dead space)을 제거하기 위해, 니들 캐뉼러에 의한 조직에 대한 손상을 최소화하고 용량 정확도를 최대화하기 위해, NR1 주입 니들 및 탐침이 있는 안정화 캐뉼러를 맞춤 제작하였다.
사용을 위해 제안된 NR1 전달 시스템은 뇌졸중에 대한 줄기 세포 치료제의 6개의 이전(및 1개의 진행 중인) 임상 시험에서 사용된 것과 동일하다. 이는 동물 및 인간에서 줄기 세포 용량의 일관되고 정확한 전달을 보장하도록 제공하고 입증하도록 설계되었다. 이 연구에서, NRI은 안정화 임플란트 캐뉼러 및 보로실리케이트 유리 100㎕ 주사기에 부착된 주사 니들로 이루어진 전달 시스템을 사용하여 수동으로 투여할 것이다. NR1 전달 시스템 사양은 Leksell 입체 정위적 시스템 장치에 맞도록 설계하였다. 또한, 이 맞춤 설계된 주사 니들 및 안정화 캐뉼러 구성은 이전의 임상 1상 및 2상 시험에서 사용되었다.
NR1의 동종이계 특성 및 이에 수반되는 제제로 인해, 모든 피험자는 급성 숙주 거부 반응에 대한 임의의 가능성을 최소화하기 위해 경구 타크롤리무스(Prograf)의 전처치 및 동시 투여를 받을 것이다. 여러 면역억제제에 대해 발표된 연구에서, 타크롤리무스는 표준-용량 사이클로스포린 A(CsA) 및 저용량 CsA보다 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 면역요법적 양생법의 선택은 임상에서의 타크롤리무스의 원리(rationale) 및 사용을 설명하는 임상 프로토콜 부록에 포함되어 있다. 이 연구에서는 면역 억제를 위해 저용량 타크롤리무스를 선택하였으며, 용량 및 기간은 임상 타크롤리무스 사용에 대한 스탠포드 대학 임상 프로토콜을 준수할 것이다.
등록된 모든 피험자는 최상의 의료 행위 및 지원 치료를 받을 것이다. 테스트될 것으로 예상되는 4가지 용량은 비임상적으로 평가된 용량을 기준으로 고정된 부피(300㎕)의 2.5, 5.0, 10 및 20×106개 세포이며, 다음 고용량 코호트로 이동하기 전에 마지막 피험자가 치료된 후 1개월 동안 각 코호트에서 안정성을 확인하였다. 안전성 및 내약성 모두에 대한 평가에 추가하여, 안전하고 내약성이 양호한 용량이 정상 기능으로 복귀하는 방향으로 임상적 개선을 촉진할 것인지를 정의하기 위한 시도로 여러 신경학적 및 기능적 매개변수를 평가할 것이다.
NR1 생산
NR1 원료 의약품 및 완제 의약품은 시티 오브 호프(City of Hope: COH)의 응용 기술 개발 센터(Center for Applied Technology Development: CATD) GMP 제조 시설에서 cGMP 요건을 준수하여 제조하였다. 생산은 2012년 9월 1일에 바이알에 담아 동결보존한 cGMP NR1 MCB의 생성과 함께 시작하였다. 따라서, 이 "원료" 물질로부터, 지금까지 NR1 DS 및 NR1 DP를 제조하기 위해 세 번의 cGMP 실행을 수행하였다. NR1 MCB(p15)로부터의 NR1 제조 공정의 "높은 수준"의 공정 흐름도가 도 2에 도시되어 있다. 세포 확장 동안, 단층이 트립신에 노출된 후 배양 계대 수는 1씩 증가한다(예를 들어, 16회 계대 세포가 시딩된 다음 거의 컨플루언트한 단층으로 확장되고 트립신 처리되면, 생성된 현탁액은 17회 계대 등으로 간주됨). 벌크 원료 의약품은 공정 흐름도에서 "단위 작업" 열의 #5에서 수확 및 첫 번째 재현탁 단계로 식별되며, NR1을 만들기 위해 같은 날 연속적으로 처리된다. NR1 완제 의약품은 바이알당 7.5% DMSO, 42.5% ProFreeze 및 50% 완전 성장 배지로 이루어진 1㎖의 최종 동결보존 제형에 동결보존된 6×106개의 18회 계대(p18) NR1 세포로 이루어진다. 임상용으로 제조되고 중심이 되는 비임상 연구에 사용되는 NR1 완제 의약품은 시티 오브 호프(COH)의 CATD GMP 제조 시설에서 cGMP 준수 요건에 따라 제조되었다는 점을 강조하는 것이 중요하다.
최종적인 비임상 및 임상 연구에 사용하기 위한 NR1 완제 의약품의 모든 로트는 cGMP 준수 조건하에 제조하였으며 계속 그렇게 제조할 것이다. NR1 완제 의약품은 현재 초기 임상 개발 단계에 적절한 출시 기준을 적용한 후 사용을 위해 완전히 특성화하여 출시하였다. 임상 연구에 사용하도록 제안된 3개의 cGMP NR1 로트를 1) 무균성(USP), 2) 정균 작용 및 정진균 작용, 3) 마이코플라스마(USP), 4) 정마이코플라스마 작용, 5) 내독소, 6) 시험관내 외생성 바이러스, 7) 세포 생존력, 8) 세포 수(강도), 9) 핵형, 10) 정체(유세포 분석법에 의한 CD73 발현), 11) 순도(유세포 분석법에 의한 b-튜불린-III 발현) 및 12) 불순물(유세포 분석법에 의한 Tra-1-60 발현 및 RT-qPCR에 의한 OCT4 및 REX1)에 대해 테스트하였다. 마이코플라스마(USP), 정마이코플라스마 작용, 시험관내 외생성 바이러스 및 핵형에 대한 테스트는 NR1 DS를 사용하여 수행하였다. NR1 완제 의약품의 안전하고 일관된 제조를 보장하기 위한 사양을 확립하였다.
파일럿 및 GLP 비임상 실험적 연구 데이터는 비임상 연구 독성학 결과의 우세함을 기반으로 제시되며, NR1을 사용한 비임상 연구 전반에 걸쳐 일관되었다.
내인성 신경 복구 경로 및 잠재적 메커니즘
NR1의 투여는 아급성 또는 만성 기간에 투여될 때 피질 및 피질하 뇌졸중의 표준 동물 모델에서 장기간 신경학적 회복을 초래한다. 이러한 모델로부터의 데이터는 신경-염증의 감소 및 경색 주변 혈관신생의 증가가 초기에 알려진 작용 메커니즘임을 시사한다.
NR1은 우수한 안전성 프로파일을 가지며, 이는 미경험 상태, 신생아 및 성체 동물, 및 유전적으로 면역결핍성이며 약리학적으로 면역 억제된 동물의 다수의 뇌졸중 모델에서의 조사에 의해 뒷받침되었다. 많은 가능한 면역학적, 연령 및 건강을 위태롭게 하는 상황을 포함하는 이 광범위한 동물 모델에서, 세포 제품의 지속성을 최적화하기 위한 세포 제형의 사용과 조합하여, NR1은 효능의 장기 지속 기간에 비해 수정된 지속성을 보여준다. 생체내 연구에서, 지속성, 지속적인 효능 및 기계론적 데이터는 여러 사례에서 동물 대 동물 및 그룹 평균 기준으로 상관관계가 있었다. 지금까지 NR1을 사용하여 수행된 모든 생체내 연구에서(MPI, USF, 스탠포드), 관찰, 데이터 및 결과는 관찰, 데이터 및 결과는 독성의 명백한 임상 징후가 없고, 종양 또는 기형종 형성의 거시적 또는 현미경적 증거가 없으며, 테스트 물품-관련 유해 소견이 없음을 나타낸다.
기능 회복에 대한 잠재적 테스트뿐만 아니라 혈관신생, 염증 및 가소성으로 지칭되는 숙주 뉴런에 의한 증가된 축색돌기 발아와 같은 숙주 뇌 병변 크기 및 숙주 뇌 복구 경로를 포함하는 여러 조직학-기반 정량화 종점을 조사하였다. 이러한 내인성 복구 경로는 이전에 복구 및 잠재적인 인간 신경 전구세포(hNPC) 생체내 작용 메커니즘의 대리 측정으로 조사되었다. 또한, 뇌에 이식된 세포의 생존을 평가하여 NR1 지속성 및 이식 후 분화, 이동, 이소성 조직 형성 및 종양형성 가능성에 대해 특성화하였다.
NR1의 제안된 임상 평가: 요약
제안된 임상 연구의 1차 목적은 피질 뇌졸중 유무에 관계없이 만성 ISS가 있는 피험자에게 손상 후 단일 시점에서 뇌내로 투여될 때 고정된 부피에서 증가하는 세포 수를 사용하여 NR1 세포의 증량 용량의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이다. 연구는 NR1 세포의 뇌내 투여의 단일 용량 수준에서 각각의 코호트를 갖는 최대 4개의 코호트를 사용하는 용량 증량일 것이다. 추가적인 목적은 임상 및 방사선학적 반응뿐만 아니라 확립된 효능 측정 도구의 유용성을 평가하는 것이다. 피험자는 자신의 안정적인 이식 전 기준선과 비교되었다. 추가의 탐색적 종점은 자기 공명(Magnetic Resonance: MR) 확산 텐서 영상(Diffusion Tensor Imaging: DTI), 액체 감쇠 역전 회복(Fluid Attenuation Inversion Recovery: FLAIR) 및 휴지 상태 기능적 자기 공명 영상(Resting State functional Magnetic Resonance Imaging: fMRI)의 변화를 기준선과 비교하여 모니터링하는 것도 포함한다.
1차 목적은 피질 뇌졸중 유무에 관계없이 만성 허혈성 피질하 뇌졸중(ISS)이 있는 피험자에게 손상 후 단일 시점에서 뇌내로 투여된 NR1의 증량 용량(고정된 부피에서 증가하는 세포 수)의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이다. 연구는 허혈성 뇌졸중 피험자의 90% 이상이 뇌졸중 후 90일 동안 안정적이었기 때문에 6개월 내지 60개월 전에 발생한 안정적인 허혈성 뇌졸중으로 인한 편측 부전마비가 있는 성인 피험자(18세 내지 75세)에서 수행하였다.
제안된 연구는 NR1 세포의 뇌내 투여를 위한 용량 증량 설계를 사용한다. NR1의 투여 대상은 기능적 인간 뇌 이미징에서 관찰되는 바와 같이 뇌졸중 후 조직 복구 및 재구성에 있어서 활성이 있는 것으로 나타난 영역인 피질하 뇌졸중에 인접한 뇌 조직의 피질하 부분이다. 이 동일한 영역은 동일한 투여 부위를 사용하는 비임상 연구에서도 조직 복구 및 재구성에 활성이 있는 것으로 나타났다. 임상 투여는 이러한 각각의 모델에서 병변의 평균 크기 및 위치의 사전 결정에 기초하여 피질하 및 피질 허혈성 뇌졸중의 설치류 모델에서 뇌졸중 병변에 인접한 조직으로 NR1을 직접 전달하기 위해 주입 좌표가 확인된 비임상 약리학 연구와 일치한다. 뇌 크기의 차이를 허용하는 지나친 용량의 비임상 연구에서 입증된 안전성, 내약성 및 효능은 제안된 임상 연구의 기초이다.
2차 목적은 수반되는 임상 및 방사선학적 반응뿐만 아니라 효능 측정 도구의 유용성을 평가하는 것을 포함한다. 자신의 안정적인 이식 전 기준선과 피험자를 비교할 것이다. 연구 동안 1-일, 1-주 및 1-개월, 2-개월, 3-개월 및 6-개월에 수술 후 NR1의 안전성 및 내약성에 대해 피험자를 평가할 것이다. 안전성 및 내약성은 임상 증상, 부종, 염증, 기타 병리학적 변화 및 임상 실험실 소견을 모니터링함으로써 평가할 것이다. 동시에, 효능 데이터는 효능의 확립된 척도 및 1차 평가를 사용하여 수집하였으며, 이는 이식 후 6개월에 푸글 마이어(FM) 운동 점수에 대한 신경학적 기능 결과가 될 것이다. 탐색적 종점 결과 측정은 치료 후 6개월에 NIHSS, 안정 보행속도(CGS) 테스트, mRS 및 신경 삶의 질(QOL) 및 총 FM 점수를 포함할 것이다.
4개의 연속적인 코호트에 피질하 경색 영역에 인접한 회백질 또는 백질 부위에 입체 정위적으로 이식될 NR1의 증가하는 단일 용량을 투여한다. 1회의 천공 개두술을 할 것이며, 세포는 손상된 영역 주변의 다양한 깊이에서 각 트랙에 대해 5개의 침착물이 있는 3개의 니들 트랙을 사용하여 이식할 것이다. 세포 이식은 부피(20 ㎕/침착물) 및 속도(10 ㎕/분)에 대해 표준화할 것이며, 각 임플란트 사이의 간격은 대략 5㎜ 내지 6㎜이다. 각 침착은 대략 3분이 소요될 것으로 예상되며, 각 니들 트랙은 20분 이내에 완료하였다. 이러한 수술 절차는 필요한 경우 외과적으로 적절하게 수정할 수 있다. FDA 및 IRB는 모두 이러한 필요성이 결정되는 즉시 변경에 대한 필요성을 알릴 것이다.
피험자 코호트는 각 피험자가 단일 용량만을 투여받는 전통적인 3 + 3 시험 설계를 사용하여 증가하는 용량의 NR1로 치료하였다. 처음 3명의 피험자는 동물 독성학 연구로부터의 외삽법에 기초하여 동물에서 안전한 것으로 나타난 용량의 NR1을 투여받을 것이다. 후속 코호트는 고정된 부피를 사용하여 선험적으로 결정된 증가된 NR1 용량으로 치료하였다. 코호트의 피험자가 CTCAE 척도를 사용하여 정의된 용량-제한 독성(dose-limiting toxicity: DLT)을 경험하지 않은 경우, 또 다른 3명의 피험자에서 코호트 사이에 4-주 관찰 보류 후 다음으로 더 고용량 수준에서 치료를 시작하였다. 코호트의 처음 3명 중 1명의 피험자만이 DLT를 나타내는 경우, 추가적인 3명의 피험자가 대상체 이 용량 수준으로 치료될 것이고, 추가적인 DLT가 이 용량 수준에서 발생하지 않는 경우, 코호트에서 치료된 전체 피험자는 6명이다.
DLT는 CTCAE 척도, 버전 5에 대해 NR1과 관련이 있을 가능성이 있는 것으로 조사자가 결정한 등급 3 또는 등급 4의 임상 사건으로 정의된다. 용량 증량은 최대 6명의 피험자의 코호트에서 적어도 2명의 피험자가 DLT를 나타낼 때까지(즉, 해당 용량에서 피험자의 33% 이상) 계속할 것이다. 최대 허용 용량(Maximum Tolerated Dose: MTD)은 2명의 피험자가 DLT를 경험한 용량 바로 아래의 용량 수준 또는 용량 제한 독성 없이 최대 용량에 도달한 경우로 지정되며, 추가적인 6명의 피험자를 MTD를 확립하기 위해 해당 용량으로 치료할 것이다.
안전성 모니터링은 임상 증상, MRI(부종, 염증, 다른 병리학적 변화) 및 임상 실험실 소견에 의해 이루어질 것이다. 그런 다음, 피험자는 NR1 이식 후 15년 동안 추적될 것이다.
NR1 임상 연구의 세부사항
약물 NR1은 운동 결함을 동반한 만성 허혈성 피질하 뇌졸중의 치료를 위해 개발되고 있는 독특한 배아 줄기 세포-유래 제품이다. 뇌졸중의 중심부는 혈류 없이는 생존 불가능한 조직으로 이루어져 있으므로, 이식된 세포는 이 영역에서 일시적으로도 생존하지 못할 것이다. 따라서, NR1의 투여 대상은 기능적 인간 뇌 이미징 및 비임상 연구에서 조직 복구 및 재구성에 활성인 것으로 나타난 영역인 피질하 뇌졸중에 인접한 뇌 조직의 피질하 부분이다. 이러한 투여는 이들 각각의 모델에서의 병변의 평균 크기 및 위치의 사전 결정에 기초하여 피질하 및 피질 허혈성 뇌졸중의 설치류 모델에서 뇌졸중 병변에 인접한 조직으로 NR1을 직접 전달하기 위해 주입 좌표가 확인된 비임상 약리학 연구와 일치한다. 이 모델에서, 동물 모델에서의 감각운동 및 다른 신경학적 결과는 긍정적이었으며, 이는 뇌 피질하 뇌졸중 조직이 피질하 및 피질 영역에서 적어도 부분적으로 신경학적 기능을 회복하도록 자극될 수 있음을 나타낸다. 신경 회로의 복원 및 임상적 개선을 동반한 이러한 동일한 활성이 뇌졸중 후 인간 뇌에서 유사하게 발생할 수 있기 때문에, 이 연구는 아래 기재된 바와 같이 설계된 비임상 연구를 제안하며 이를 뒷받침한다.
1차 목적은 피질 뇌졸중의 유무에 관계없이 만성 ISS가 있는 피험자에게 손상 후 단일 시점에서 뇌내로 투여된 NR1의 최대 4개의 증가하는 용량 수준(고정된 300㎕ 부피에서 증가하는 세포 수)의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이다. 총 연구 기간은 2.5년으로 예상되며, 연구 등록에 2년이 허용된다.
NR1의 투여 대상은 기능적 인간 뇌 이미징 및 비임상 연구에서 조직 복구 및 재구성에 활성인 것으로 나타난 영역인 피질하 뇌졸중에 인접한 뇌 조직의 피질하 부분이다. 이 투여는 피질하 및 피질 허혈성 뇌졸중의 설치류 모델이 허혈성 뇌졸중 병변에 인접한 조직에 NR1을 직접 주사한 후 개선된 기능을 보인 비임상 약리학 연구와 일치한다.
피험자를 연구 동안 1-주 및 1-개월, 2-개월, 3-개월 및 6-개월에 수술 후 안정성에 대해 평가하였다. 연구 안전성 추적 조사 동안, 12-개월 및 24-개월에, 효능의 지표에 대해 계속 추적할 것이다. 또한, 연구 동안, 피험자 안전성 모니터링은 임상 증상, 부종 및 기타 병리학적 변화에 대한 자기 공명 영상(MRI) 및 임상 실험실 소견을 평가할 것이다. 효능의 1차 평가는 이식 후 6개월에 푸글 마이어(FM) 운동 점수에 대한 신경학적 기능 결과이며, 2차 결과 측정은 추가적인 시점에서 NIHSS, 안정 보행속도(CGS) 테스트, mRS, 신경 삶의 질(QOL) 및 FM 운동 점수를 포함할 것이다.
임상에서 고정된 부피(300㎕)의 2.5, 5.0, 10 및 20×106개의 세포로 테스트될 제안된 NR1 용량에서의 안전성, 활성을 뒷받침하고 투여 위험을 평가하기 위해 비임상 연구를 설계하고 수행하였다. 임상 연구에서 안전 평가를 위해 설계된 바와 같이, 안전성 및 내약성 매개변수를 평가할 것이며, 코호트 다음으로 더 고용량 코호트로 이동하기 전에 각 코호트에서 안전성을 확인할 것이다. 적어도 11명 내지 30명 이하의 피험자를 테스트할 것이다. 피험자는 표준 3 + 3 연구 설계에서 NR1의 단일 상승 용량을 투여받을 것이다. 코호트는 일반적으로 3명의 피험자로 이루어지며, 1명의 피험자에서 용량-제한 독성(DLT)이 발생하는 경우 추가적인 3명의 피험자가 코호트에 추가된다. 이전에 기재된 바와 같이, 임의의 한 코호트에서 처음 3명 내지 6명의 피험자 중 2명의 피험자가 용량-제한 독성을 경험하지 않는 한(33% 이상의 DLT) 용량 증량은 계속될 것이다. 최대 허용 용량(MTD)은 DLT에 도달하는 용량 바로 아래의 용량 수준 또는 용량이 DLT를 발생시키지 않는 경우 가장 고용량 코호트인 코호트 4에 도달하는 최대 용량으로 지정할 것이다. 추가적인 6명의 피험자가 MTD를 투여받을 것이다.
피험자는 일상적인 관리 관행과 일치하는 수술 전후 기간에 항혈전 요법을 중단해야 하며, 투여된 NR1의 급성 거부 가능성을 최소화하기 위해 타크롤리무스를 투여받을 것이다. 등록된 피험자는 최상의 의료 행위와 지원 치료를 받을 것이다.
동결보존된 NR1 세포로서 NR1은 기체상 액체 질소에 보관된 각각 6×106개의 세포를 포함하는 일회용 바이알로 임상 현장에 공급된다. "현장 조제(On Site Preparation)" NR1 세포를 해동하고, 세척하고, PlasmaLyte-A™ 완충액과 인간 혈청 알부민(HSA)으로 구성된 전달 용액에 재현탁시킨 다음, 그람 염색(즉시) 및 14일까지의 USP 무균성(소급하여)에 의해 검출 가능한 유기체의 생존 및 부재를 확인하고, 마지막으로 수술실로 운반하기 위해 냉동 바이알에 로딩할 것이다. NR1 세포는 투여 준비의 완료 후 6시간 이내에 투여할 것이다.
임상 평가를 위해 계획된 대로 준비된 NR1 세포는 독성을 검출하기 위해 설계된 비임상 연구에서 독성이 발생하더라도 인식 가능한 안전성 문제가 없음을 보여주었다. 이렇게 준비된 NR1은 이동하지 않고 주입 부위에 남아 있으며, NR1은 NR1로 치료한 350마리 이상의 동물에서 어떠한 종양 생성도 나타내지 않았다. 물론, 일반화된 독성, 종양형성/기형종 형성, 검출되지 않은 인간 또는 뮤린 바이러스의 전염 또는 세포 이식에 대한 면역 반응을 포함한 이론적인 위험이 존재한다. 실제 가능성을 연구하고, 0.01%의 민감도를 갖는 Oct4 및 Re×1 qPCR 검정을 사용하여 검출 가능한 잔여 H9 세포가 존재하지 않음을 입증하는 것을 포함한 NR1 세포 유해 효과를 최소화하기 위한 모든 시도를 하였다. 추가적으로, 가능한 외부 인자에 대한 광범위한 연구를 수행하였으며, 이의 수준은 검출 수준 미만인 것으로 밝혀졌다.
NR1 세포 사멸을 피하기 위한 면역억제의 사용은 2가지 비임상 연구에서 표준이었으며, 임상 연구에서 사용하도록 제안되었다. 타크롤리무스로 인한 위험은 30일까지 낮은 전혈 수준을 유지하고, 41일에서 60일까지 타크롤리무스를 감량하고, NR1 주입 후 제60일에 타크롤리무스를 중단함으로써 가능한 한 감소할 것이다. 또한, 안전성을 위한 빈번한 실험실 테스트를 통해 잠재적 타크롤리무스 독성에 대해 피험자를 주의 깊게 모니터링할 것이다
NR1 세포는 전신 마취 없이 감시 마취 관리(monitored anesthesia care: MAC)의 개시 후에 개복 수술 절차 동안 뇌내 주사를 필요로 한다. 수술은 MAC, 국부 마취제의 주입, 입체 정위적-프레임 배치, 천두공(burr-hole) 배치 및 경막 열기를 필요로 한다. 이러한 절차의 위험은 최상의 외과 시술을 사용하여 완화될 것이다. 전달 모델 및 외과적 접근법은 다른 줄기 세포 생물학적 제제에 대한 임상 시험에서 성공적으로 사용되었다.
NR1의 비임상 평가
NR1은 운동 결함을 동반한 만성 허혈성 피질하 뇌졸중의 치료를 위해 개발 중인 인간 배아 줄기 세포-유래 제품이다. NR1의 투여 대상은 기능적 인간 뇌 이미징 및 비임상 연구에서 조직 복구 및 재구성에 활성인 것으로 나타난 영역인 피질하 뇌졸중에 인접한 뇌 조직의 피질하 부분이다.
독성/종양형성/기형종 평가를 위한 최적의 동물 모델을 선택하기 위한 연구와 함께, 동물에서 활성의 메커니즘을 평가하기 위해 약리학 연구를 수행하였다. 동물 모델에서의 NR1 투여는 이들 각각의 모델에서의 병변의 평균 크기 및 위치의 사전 결정에 기초하여 피질하 및 피질 허혈성 뇌졸중의 설치류 모델에서 뇌졸중 병변에 인접한 조직으로 NR1을 직접 전달하기 위해 주입 좌표가 확인된 임상 투여 경로와 일치한다. 이렇게 치료된 동물은 개선된 기능을 나타낸다.
활성의 평가
생체내 효능, 지속성과 이동 및 기형종의 발생을 포함하는 부작용을 유발할 가능성을 평가하기 위해 NR1 완제 의약품을 사용하여 약리학, 체내분포 및 독성학 연구를 수행하였다. 인간 NR1 세포의 거부 가능성을 최소화하기 위해 모든 연구에 면역결핍성 또는 면역 억제된 동물에 대해 선택된 모델을 사용하였다.
두 가지 약리학 연구의 목적은 뇌내(IC) 주입에 의해 이식된 NR1의 효능을 측정하는 것이었다. 면역 억제된 스프래그-다우리(Sprague-Dawley: SD) 래트의 허혈성 피질하 뇌졸중(ISS) 모델에서 1차 약리학 연구를 수행하였으며; 이 모델은 뇌졸중 분야에서 일상적으로 사용되는 잘 특성화된 ISS 모델이며, 만성 ISS가 있는 피험자의 제안된 표적 적응증에 가장 가까운 일치를 제공한다. 지원 약리학 연구에는 면역결핍성 무흉선 래트의 허혈성 피질 뇌졸중(ICS) 모델을 사용하였다. 이 모델은 또한 뇌졸중 분야에서 널리 사용되며, 피질 병변에 특이적인 NR1 효능을 평가할 수 있게 한다.
활성 및 작용 메커니즘의 평가
허혈성 피질하 뇌졸중(ISS) 및 허혈성 피질 뇌졸중(ICS)의 비임상 래트 모델에서 NR1 치료의 기능적 연구 및 행동 회복의 개선을 테스트하기 위해 약리학 연구를 수행하였으며, 감각운동 기능의 손상 후 회복을 정량화하기 위해 일련의 운동 및 행동 테스트를 사용하여 부분적 기능 회복을 측정하였다. 조직학적 평가를 사용하여 두 연구 모두에서 NR1-유도성 변화와의 잠재적 상관관계에 대한 후보 작용 메커니즘을 탐색하였다. 중추적 효능 연구는 ISS의 중간 대뇌동맥 폐색 모델의 면역 억제된 SD 래트를 사용하여 ISS의 래트 모델에서 NR1의 IC 이식의 잠재적 치료 가치를 평가하였다. 이 래트 모델에서 인간 NR1 세포의 거부를 감소시키기 위해 면역억제제를 포함하였다. 해당 시스템은 뇌졸중 분야에서 일상적으로 사용되는 잘 특성화된 ISS 모델이며, 만성 ISS가 있는 피험자의 제안된 표적 적응증에 가장 가까운 일치를 제공한다.
1차 종점은 뇌졸중 후 제7일 또는 제28일에 NR1 치료가 신체 거상 스윙 테스트(EBST)에 통계적 개선을 초래할 것이라는 가설을 테스트하는 것이고, 2차 종점은 신경학적 검사 및 로타로드 테스트의 개선이다. 연구는 뇌졸중 후 NR1 완제 의약품의 이식이 만성 ISS가 있는 피험자의 제안된 NR1 표적 적응증과 가장 일치하는 만성 뇌졸중의 ISS 모델을 포함하는 동물 모델에서 운동 및 신경행동 종점 모두에 의해 측정된 바와 같이 감각운동 기능의 적어도 부분적인 회복을 가져올 가능성이 있음을 보여주었다. ICS의 모델에 대한 지지 연구는 여러 가지 상이한 종점(수염-발 및 자세 회복 테스트 및 전반적인 신경학적 평가)을 사용하여 측정된 개선된 감각운동 기능을 포함한 데이터를 제공하였다. 신경학적 회복은 NR1 완제 의약품의 이식 후 적어도 3개월(총 연구 기간) 동안 지속되었다. 치료 3개월 후 조직학적 평가는 뇌졸중 후 아급성기(7일) 동안 NR1을 투여하였을 때 증가된 경색 주변 혈관 밀도와 NR1-관련 기능 회복의 향상 사이의 연관성 및 뇌졸중 후 만성기(28일)에 고용량 NR1을 투여하였을 때 감소된 경색 주변 미세아교세포/면역 세포 활성화와 NR1-관련 기능 회복의 향상 사이의 연관성을 시사하였다.
스탠포드-5 연구에서, 이 ICS 모델의 1차 종점은 테스트 비히클 단독(Plasmalyte-A + 0.5% 인간 혈청 알부민)으로 처리된 동물과 NR1(4×105개 또는 1×105개 세포/래트)을 포함하는 테스트 비히클로 처리된 동물의 기능 회복을 비교하는 것이었다. 수염-발 테스트로 알려진 감각운동 행동 테스트는 피질 허혈성 뇌졸중 및 hNPC 처리 후 기능 회복의 증가를 재현 가능하게 보여주었기 때문에, 이를 기능 회복의 주요 척도로 선택하였다. 2차 종점에는 수염-발 테스트와 양의 상관관계가 있는 것으로 밝혀진 자세-반사 테스트를 포함시켰으며, 이는 기능 회복의 지속 가능성을 평가한다. 3차 종점에는 수정된 신경학적 점수 테스트를 사용하여 용량 효과의 경향에 대한 두 활성 치료 간의 비교를 포함시켰다. 회복은 부분적이었지만 지속적이었으며, 회복의 증거는 NR1 처리 후 2개월(총 연구 기간) 동안 지속되었다. 조직학-기반 정량화 종점은 혈관신생, 염증 및 가소성으로 지칭되는 숙주 뉴런에 의한 축색돌기 발아 증가와 같은 숙주 뇌 병변 크기 및 숙주 뇌 복구 경로를 포함하였다. 이러한 내인성 복구 경로는 이전에 복구 및 잠재적 hNPC 생체내 작용 메커니즘의 대리 측정으로 조사되었다. 또한, 뇌에 이식된 세포의 생존을 평가하여 NR1 지속성 및 이식 후 분화, 이동, 이소성 조직 형성 및 종양형성의 가능성을 특성화하였다.
USF-1 및 스탠포드-5 둘 다에서, 회복은 부분적이었지만 지속적이었으며, 회복의 증거는 NR1 치료 후 2개월 내지 3개월 동안 지속되었다. NR1 세포가 효과적인 효과를 매개하는 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았지만, 적어도 부분적으로 NR1 처리 후 관찰된 부분적 기능 회복뿐만 아니라 신경 가소성에 대한 가능한 효과와 상관관계가 있는 면역 세포 활성화의 치료-관련 감소에 반영된 바와 같은 면역조절 기능과 관련이 있는 것으로 보인다. 증거는 NR1이 부분적으로는 생체내에서 대식세포 분극화를 보다 유익한 M2-유사(보다 항-염증성임) 상태로 이동시키는 것으로 알려진 유전자의 발현 증가로 인한 염증 과정 및 세포외 기질의 조직화를 포함하여 뇌졸중 회복의 중심이라고 여겨지는 과정의 자극으로 인해 이러한 효과를 가짐을 시사한다. 또한, NR1은 뇌졸중 후 피질 내에서 흥분성/저해성 균형을 개선하는 것으로 보인다. NR1 세포 지속성 데이터는 또한 뇌에 이식된 후 6개월 동안 생존하여 잠재적으로 관찰된 회복을 향상시킬 수 있음을 시사한다.
USF-1에서와 같이, 스탠포드-5 연구에서의 회복은 부분적이었지만 지속적이었으며, 회복의 증거는 NR1 처리 후 2개월(총 연구 기간) 동안 지속되었다. NR1 세포가 효과적인 효과를 매개하는 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았지만, 적어도 부분적으로 NR1 처리 후 관찰된 부분적 기능 회복뿐만 아니라 신경 가소성에 대한 가능한 효과와 상관관계가 있는 면역 세포 활성화의 치료-관련 감소에 반영된 바와 같은 면역조절 기능과 관련이 있는 것으로 보인다. 증거는 NR1이 부분적으로는 생체내에서 대식세포 분극화를 보다 유익한 M2-유사(보다 항-염증성임) 상태로 이동시키는 것으로 알려진 유전자의 발현 증가로 인한 염증 과정 및 세포외 기질의 조직화를 포함하여 뇌졸중 회복의 중심이라고 여겨지는 과정의 자극으로 인해 이러한 효과를 가짐을 시사한다. 또한, NR1은 뇌졸중 후 피질 내에서 흥분성/저해성 균형을 개선하는 것으로 보인다. NR1 세포 지속성 데이터는 또한 뇌에 이식된 후 6개월 동안 생존하여 잠재적으로 관찰된 회복을 향상시킬 수 있음을 시사한다.
체내분포 및 독성학 테스트를 위한 동물 모델의 선택에 대한 논의
선택된 동물 모델에서 NR1 세포의 지속성은 효능, 분포 및 독성의 정확한 측정을 얻는 데 중요하다. 최상의 세포 지속성을 갖는 동물 모델을 선택하기 위해 몇 가지 상이한 접근법을 평가하였다. 성체 및 신생아 무흉선 래트 및 성체 NSG 마우스를 포함하는 상이한 면역결핍성 설치류 모델에서 NR1 생존을 비교하였다. 가장 높은 세포 생존율과 지속성을 면역결핍성 성체 무흉선 래트에서 측정하였으며, 특정 면역 세포 집단의 고갈에 의해 지속성을 개선하기 위한 접근법을 추가로 테스트하는 데 사용하였다. CNS에서 대식세포로 작용하는 미세아교세포의 고갈 또는 자연 살해 세포 수의 고갈은 성체 무흉선 래트에서 NR1의 생존을 증가시키지 않았다. NR1 세포 지속성은 세포 주입에 Matrigel을 포함시킴으로써 증가하였다. Matrigel은 구조적 단백질 및 줄기 세포의 생존을 개선하는 것으로 알려진 세포 성장 인자의 이종성 혼합물이다. 파일럿 연구에서, Matrigel을 포함시키면 장기 NR1 세포 생존이 크게 개선된다. Matrigel은 NR1 생존 및 성장을 개선하기 위해 독성학 연구에서만 주입 배지에 포함되었지만, 교란 효과의 가능성 때문에 약리학 및 분포 연구에서는 사용하지 않았다.
GLP 체내분포 연구 및 NR1 지속성에 대한 논의
만성 뇌졸중이 있는 인간 피험자의 임상 상태를 가장 잘 모델링하는 뇌졸중이 있는 동물에서 IC-주입된 NR1 세포의 지속성 및 이동에 대한 가장 완전한 평가를 제공하기 위해 면역 억제된 스프래그-다우리 래트의 ISS 모델에서 GLP 체내분포 연구를 수행하였다. 이식 후 24시간 내지 60일 범위의 시점에서, IHC에 의한 NR1 세포의 존재를 분석하기 위해 뇌 및 선택된 말초 조직으로부터 슬라이드를 준비하고, qPCR 분석을 위해 냉동된 샘플을 수집하였다. IHC는 이식 후 45일 동안 급성 및 만성 뇌졸중 그룹 모두의 동물의 뇌에서 NR1 세포의 최소 내지 중간 크기의 NR1의 발생을 보여주었으며, 발생률 및 크기 모두에서 일반적인 감소 경향을 보였다. NR1 세포의 존재는 세포가 주입된 뇌의 반구로 제한되었고, 임의의 동물에서 검사된 다른 기관에서 세포는 검출되지 않았다. qPCR 분석은 처리 후 1-주 동안 동물의 주입 부위에 NR1 세포가 존재함을 보여주었다. 일부 동물의 뇌실에 부주의로 주입된 세포와 및 부검 시 또는 조직 처리 절차를 통한 오염과 관련된 소견을 제외하면, IHC 또는 qPCR을 사용하여 주입 부위로부터 멀리 떨어진 뇌의 임의의 영역 또는 말초 조직에서 NR1 세포는 검출되지 않았다.
GLP 독성학 연구에서 Matrigel의 존재하에 세포 지속성 연구를 또한 수행하였다. IHC 및 qPCR 분석을 모두 사용하여, NR1 세포는 처리 후 180일 동안 대부분의 처리된 동물에서 최소 내지 중간 수준으로 검출되었다. 체내분포 연구에서와 같이, NR1 세포는 뇌 실질 내에서 또는 이보다 덜 빈번하게 뇌실 공간 내에서 현미경으로 공동화된 공간으로 시각화된 주입 부위에 존재하였으며, 주입 부위에서 NR1 세포가 이동하였다는 증거는 없었다. 뇌실에서의 NR1 세포의 존재는 이식 동안 뇌실로의 세포의 부주의한 주입에 기인하였다.
전반적으로, NR1 체내분포 연구는 뇌내 주사의 부위로부터 NR1 세포가 이동하지 않음을 명확하게 보여주었다.
GLP 독성학/종양형성/기형종 형성 연구에 대한 논의
위에 언급한 바와 같이, 6-개월의 GLP 독성학 연구를 위한 무흉선 래트 모델의 선택은 면역력이 저하된 설치류 모델의 광범위한 평가 및 작용 부위에서의 NR1의 지속성을 기반으로 하였다. 뇌에서 NR1 지속성을 평가하는 연구는 미경험(뇌졸중이 없는) NSG 마우스 또는 누드 래트에 대한 3가지 파일럿 독성학 연구뿐만 아니라 미경험 누드 래트에서 수행된 소규모 지속성 연구를 포함한다. 면역 억제된 SD 래트의 ISS 모델에서의 약리학 연구에서 이식 후 제10주에 뇌에서 NR1 세포는 검출되지 않았으며, 이식 후 제9주 및 3개월의 연구에서 뇌에서 NR1 세포가 검출되지 않은 경우도 이 표에 지시되어 있다.
NR1의 종양형성 및 주입 부위 지속성뿐만 아니라 광범위한 조직병리학적 평가를 포함한 일반적인 독성학 종점을 평가하기 위해 무흉선 래트를 사용한 독성학 연구를 설계하였다. 그룹당 미경험(뇌졸중이 없는) 수컷 및 암컷 누드 래트의 9개의 처리 그룹에 cGMP NR1 세포 또는 NR1 세포와 H9 세포의 조합을 IC 이식하였다. 세포를 뇌의 반구당 2개(하나는 피질, 하나는 선조체)의 주입 부위에 입체 정위적으로 주입하였다. 세포 생존의 가능성 및 기형종의 성장을 향상시키기 위해 세포 배지에 구조적 단백질과 세포 성장 인자의 이종성 혼합물인 Matrigel을 포함시켰다. NR1과 H9 세포의 조합물을 투여받은, 즉, H9 세포를 스파이킹한(spiked) 그룹의 사용은 무흉선 래트 모델이 H9 줄기 세포-유래 기형종의 발생을 지원한다는 것을 보여주기 위해 포함시켰다. 이러한 H9-스파이킹 그룹은 각각 높은 H9-스파이킹-NR1 용량(50%)으로 처리된 동물의 약 67% 내지 낮은 H9를 스파이킹한 NR1 용량(0.1%)으로 처리된 동물의 약 5%(19마리 중 1마리) 범위의 기형종의 선형 용량-관련 형성을 보여주었다. 기형종의 성장을 촉진하는 데 있어서 독성학 연구에 사용된 세포 배지에 포함된 Matrigel의 전반적인 역할은 완전히 이해되지 않았다. 그러나, Matrigel의 존재 및 부재하에 세포 지속성을 비교한 연구에서 나타난 바와 같이, Matrigel의 사용은 기형종 또는 독성을 생성하지 않고 NR1의 성장 및 지속성을 지원한다는 것이 분명하다. Matrigel은 뮤린 성장 인자를 포함하는 것으로 보고된 마우스 엥겔브레스-홀름-스웜(Engelbreth-Holm-Swarm) 육종 세포로부터 유래되는 복합 단백질 혼합물이다. Matrigel은 설치류에서 인간 세포의 생존을 촉진하는 데에만 사용되었으며, 임상 NR1 완제 의약품의 주입 배지에는 포함하지 않을 것이다.
최대 2×106개 NR1 세포 IC 용량의 NR1의 투여 또는 IM 주입된 1×107개의 세포는 임의의 예상치 못한 사망, 임상 소견, 체중 또는 음식 소비의 변화, 임상 병리학 또는 골수 종점의 변화, 또는 거시적 또는 현미경적 관찰과 관련이 없었다. NR1-관련 조기 사망 및/또는 안락사는 없었으며, 임의의 NR1-단독 그룹의 뇌 또는 말초 조직에서 기형종 형성은 관찰되지 않았다. NR1은 투여 후 180일 동안 저용량 및 고용량 각각 4×105개 및 2×106개 세포/동물에서 내약성이 양호하였다. H9 세포 단독을 뇌에 IC 투여하였을 때 또는 NR1 또는 H9 세포를 스파이킹한 NR1을 IM 주입하였을 때 세포 또는 기형종은 검출되지 않았다. H9만 처리한 그룹에서, 뇌의 투여 부위에 공동화(cavitation)가 나타났으며, 이는 세포가 생존하거나 또는 생착하지 않았음을 시사한다. 1×106의 용량으로 단독 투여하였을 때 뇌에서 H9 세포의 성장이 부족한 이유는 명확하지 않다. 이는 사용된 H9 세포 로트의 생존력 부족 때문은 아니었지만, 동일한 수의 H9 세포를 1×106개의 NR1 세포에 첨가하였을 때(그룹 4) 그룹 5 내지 그룹 8에서 사용된 H9 세포의 수가 더 적었을 때와 마찬가지로 기형종을 형성하였다. 상이한 세포 배지인 40%가 아닌 30% Matrigel이 포함된 DMEM/F12 + 0.5% HSA 중 1×106개 H9 세포/동물을 IC 주입한 래트에서 처리 후 대략 50일까지 눈에 보이는 기형종이 발생하였다. 최대 1×107의 용량으로 IM-주입된 세포 NR1 및 NR1 + H9의 지속성의 부족은 IM 주입 부위에서 덜 허용적인 성장 환경으로 인한 것으로 보인다.
NR1 세포만으로 처리된 임의의 래트의 뇌 또는 말초 조직에서 기형종은 검출되지 않았다. 총 100마리의 무흉선 래트에게 동물당 최대 2×106개의 NR1 세포를 주입하고, 이식 후 최대 6개월 동안 추적 관찰하였다. 해당 모델에서 NR1과 H9 세포의 준비된 혼합물 내 낮은 0.1% H9 세포(2×106개 NR1 세포/동물의 용량에 첨가된 2000개의 H9 세포)의 H9 수준에서 기형종을 검출할 수 있었다. NR1 완제 의약품은 0.01% 미만의 H9 세포를 포함하는 것으로 알려져 있다. NR1에서 hESC의 검출을 위한 검정 민감도는 최저 H9 hESC 스파이킹된 수준인 0.1%보다 적어도 10-배 낮으며, 여기서 19마리 중 1마리의 동물만이 기형종이 동물의 67%에서 관찰되었으며 대부분의 동물이 연구 전체 기간 동안 생존하지 못한 50% H9 hESC-스파이킹 NR1 처리된 동물의 67%와 비교하여 분류되지 않은 현미경적 조직 이상이 발생하였다.
비임상 연구 결과의 개요
NR1의 투여를 위한 대상은 기능적 인간 뇌 이미징 및 전임상 연구에서 조직 복구 및 재구성에 활성인 것으로 나타난 영역인 피질하 뇌졸중에 인접한 뇌 조직의 피질하 부분이었다.
위에서 언급한 체내분포 연구를 수행하여, NR1이 뇌내 주입 부위에 남아 있음을 입증하였다. 이식 후 뇌 내 및 말초 조직 모두에서 NR1 세포의 체내분포는 안전성의 평가에 중요하다. 추가적으로, 뇌 내 NR1 지속성의 평가는 NR1 작용 메커니즘에 대한 정보를 제공하였다. 중간 대뇌동맥 폐색 ISS 모델에서 면역 억제된 스프래그 다우리(SD) 래트의 경색 주변 영역으로의 NR1 세포의 이식 후 GLP-준수 2-개월 체내분포 연구를 수행하였다. 이 모델은 또한 연구 USF-1에서도 사용하였으며, 운동 및 행동 기능의 부분적 회복에서 NR1 이식의 효능을 보여주었다. 이 모델은 잘 특성화되어 있고, 뇌졸중 분야에서 일상적으로 사용되며, 만성 ISS가 있는 피험자의 제안된 표적 적응증과 가장 가까운 일치를 제공한다.
NR1 세포의 존재 및 수준을 인간 핵 DNA를 검출하기 위한 적격화되고 검증된 실시간 qPCR 검정 및 인간 항-핵 항체 HuNu를 사용한 조직의 면역조직화학(IHC) 염색을 사용하여 선택된 말초 조직, 전체 병변 및 조직 덩어리뿐만 아니라 뇌 및 신경 축에서 정량화하였다. GLP-준수 체내분포 및 독성학 연구에 사용된 NR1은 cGMP 요건을 준수하여 제조된 cGMP 제품이었으며, 또한 연구 USF-1에 사용된 제품이었다.
체내분포 결과는 동물당 최대 4×105개 세포의 총 용량(고용량)을 뇌의 피질 및 선조체의 실질에 주사한 후, NR1 세포가 급성 및 만성 뇌졸중 동물에서 적어도 45일 동안 뇌 내에서 지속되었음을 보여주었다. NR1 세포는 주입 트랙에서 뇌의 인접한 영역(부주의하게 뇌실에 주입된 세포는 제외) 또는 말초 비-CNS 조직으로 이동하지 않고 투여 부위에 국한된 상태로 남아 있었다. GLP 독성학 연구에서 주입 부위에서 NR1 세포의 지속성의 평가는 일관성이 있었다. 면역조직화학 염색(IHC)은 세포가 이식 후 30일에서 180일까지 일관된 낮은 수준으로 존재함을 보여주었다.
GLP 독성학 연구에서 Matrigel의 존재하에 세포 지속성 연구를 또한 수행하였다. IHC 및 qPCR 분석을 모두 사용하여, NR1 세포는 처리 후 180일 동안 대부분의 처리된 동물에서 최소 내지 중간 수준으로 검출되었다. 체내분포 연구에서와 같이, NR1 세포는 뇌 실질 내에서 또는 이보다 덜 빈번하게 뇌실 공간 내에서 현미경으로 공동화된 공간으로 시각화된 주입 부위에 존재하였으며, 주입 부위에서 NR1 세포가 이동하였다는 증거는 없었다. 뇌실에서의 NR1 세포의 간헐적인 존재는 이식 동안 뇌실로의 세포의 부주의한 주입으로 인한 것으로 보인다.
전반적으로, 다중 세포 분포 또는 지속성 연구의 결과는 뇌내로 이식된 NR1 세포가 주입 후 최대 180일 동안 뇌에서 지속됨을 보여주었다. 이러한 소견 및 여러 상이한 평가에 의해 측정된 바와 같이 NR1에 의해 유발된 일반적인 운동 행동, 신경학적 기능 및 운동 협응의 지속적인 부분적 회복을 보여준 두 가지 약리학 연구의 결과는 이식 후 3개월 동안 지속되었으며, 가장 긴 연구의 종료 시 뇌졸중 치료에 고무적인 결과를 제공하였다. NR1 체내분포 연구는 뇌내 주사의 부위로부터 NR1 세포가 이동하지 않았음을 명확하게 보여주었다. 뇌실 내 NR1 세포의 간헐적이고 일관되지 않은 개별 소견이 관찰되었을 때, 이는 설치류 뇌에 투여하기 위한 작고 섬세한 영역이 주어졌을 때 뇌실에 세포가 부주의하게 주입되거나(이는 영역이 훨씬 더 큰 NR1의 임상 사용에서는 발생하지 않음) 또는 수집 중 오염으로 인해 발생한 결과로 보인다.
이식 후 제30일 및 제180일에 뇌에서 NR1의 지속성은 선택된 동물 모델인 면역결핍성(무흉선) 미경험(뇌졸중이 없는) 누드 래트에서 수행된 GLP 독성학 연구에서 명확하게 입증되었다. 동물에게 4×105개의 NR1 세포(저용량) 또는 2×106 NR1개의 세포(고용량)를 주입하였다. IHC-염색된 슬라이드의 현미경적 검사는 NR1 세포가 저용량(20마리 중 17마리) 및 고용량(20마리 중 16마리) 동물에서 NR1 투여 후 제30일에 최소 내지 중간 수준으로 존재하였음을 보여주었다. 제180일에 부검 시(6개월 이식 후), NR1 세포는 투여 후 제180일에 저용량(30마리 중 22마리) 및 고용량(30마리 중 23마리) 동물에서 최소 내지 현저한 수준으로 존재하였다. 이식 후 제30일 및 제180일 모두에서, NR1 세포는 대부분 뇌 실질 내에서 또는 이보다 덜 빈번하게 뇌실 공간 내에서 현미경으로 공동화된 공간으로 시각화된 주입 부위에 존재하였으며, 주입 부위에서 NR1 세포가 이동하였다는 증거는 없었다.
무흉선 래트 모델에서 NR1의 세포 생존 및 종양형성/기형종 형성의 결여를 입증하기 위해 설계된 GLP 독성학 연구는 또한 연구에 사용된 무흉선 래트 모델이 NR1에 첨가된 특정 양의 H9 hESC를 또한 포함하는 처리 그룹을 포함시킴으로써 이 모델에서 줄기 세포-유래 기형종의 발생을 뒷받침할 것임을 보여주었다. 이러한 H9-스파이킹 그룹은 기형종 형성뿐만 아니라, 각각 높은 H9(50%) 및 낮은 H9(0.1%)로 스파이킹된 용량으로 처리된 동물의 약 67%(20마리 중 약 14마리)에서 거의 5%(19마리 중 약 1마리) 범위의 첨가된 H9 세포의 수준과 관련된 기형종의 감소, 용량-관련 형성을 보여주었다. 기형종의 성장을 촉진하는 Matrigel의 전반적인 역할은 완전히 이해되지는 않았지만, 기질은 또한 Matrigel의 존재 또는 부재하에 세포 지속성을 비교한 연구에서 나타난 바와 같이 기형종 또는 독성을 생성하지 않고 NR1의 성장 및 지속성을 지원한다는 것은 분명하다. 그러나, Matrigel이 없는 경우에도, NR1 세포는 동일한 결과로 이식 후 45일 동안 뇌에서 생존하였다.
NR1 세포를 뇌에 주입하였을 때 또는 H9 세포를 스파이킹한 NR1 세포를 IM 주입하였을 때 세포 또는 기형종은 검출되지 않았다. H9 세포만을 뇌에 IC 투여하였을 때 세포 또는 기형종은 검출되지 않았다. H9 단독 세포 주입 후 제180일에 H9 세포는 검출되지 않았다. 뇌의 투여 부위에서 관찰된 공동화는 세포가 생존하거나 또는 생착하지 않았음을 시사하였다. 1×106의 용량으로 단독 투여(NR1이 첨가되지 않음)하였을 때 뇌에서 H9 세포의 성장이 부족한 이유는 명확하지 않다. 이는 사용된 H9 세포 로트의 생존력 부족 때문은 아니었지만, 동일한 수의 H9 세포를 1×106개의 NR1 세포에 스파이킹하였을 때 그룹 5 내지 그룹 8에서 사용된 H9 세포의 수가 더 적었을 때와 마찬가지로 기형종을 형성하였다. 상이한 세포 배지인 40%가 아닌 30% Matrigel이 포함된 DMEM/F12 + 0.5% HSA 중 1×106개 H9 세포/동물을 IC 주입한 래트에서 처리 후 대략 50일까지 눈에 보이는 기형종이 발생하였다. 최대 1×107의 용량으로 IM-주입된 세포(NR1, NR1 + H9)의 지속성의 부족은 IM 주사 부위에서 덜 허용적인 성장 환경으로 인한 것으로 보인다.
NR1을 사용하여 수행된 GLP 장기 독성학 연구에서, NR1 처리된 동물에서 종양은 검출되지 않았다. 50마리의 수컷 및 50마리의 암컷 무흉선 래트에 동물당 최대 2×106개의 NR1 세포를 주입하고, 이식 후 최대 6개월 동안 추적 관찰하였다. 국부 및 전신 독성은 처리 후 발생하지 않았다. NR1은 생착되어 연구 기간 동안 지속되었으며, NR1은 투여 부위에 분포하거나 또는 이로부터 이동하지 않았으며, 뇌 또는 말초 조직에 종양 또는 기형종은 형성되지 않았다.
종양/기형종을 나타내는 동물 모델은 증가하는 용량 수준으로 NR1에 H9 hESC를 첨가하면 증가하는 H9 백분율로 용량-관련 종양이 생성된다는 것을 보여줌으로써 검증하였다. NR1에서 hESC를 검출하기 위한 검정 민감도는 0.1%의 최저 H9 hESC 스파이킹된 수준보다 적어도 10-배 낮으며, 여기서 1마리의 동물(약 5%)만이 기형종이 관찰되고 연구 기간 동안 동물 생존이 문제가 되는 50% H9 hESC-스파이킹 NR1-처리된 동물의 67%와 비교하여 분류되지 않은 현미경적 조직 이상을 나타내었다. 아래 그래프 참조:
모든 독성학 평가와 일치하는 NR1 주입된 동물에서 종양은 관찰되지 않았다. H9 스파이킹된 수준이 증가하고 NR1 수준이 감소함에 따라, 처리된 동물에서 종양이 발생하였다. 따라서, 동물 모델은 H9가 0.1%인 종양을 보여주는 데 유효하며, NR1 완제 의약품 자체는 종양을 생성하지 않는다. 위에 인용된 다른 연구와 더불어 이 연구는 NR1의 안전성을 뒷받침한다.
비임상 연구의 관련성; 인간에 대한 용량 외삽
NR1의 투여 대상은 기능적 인간 뇌 이미징 및 비임상 연구에서 조직 복구 및 재구성에 활성인 것으로 나타난 영역인 피질하 뇌졸중에 인접한 뇌 조직의 피질하 부분이다. 이 투여는 이들 각각의 모델에서의 병변의 평균 크기 및 위치의 사전 결정에 기초하여 피질하 및 피질 허혈성 뇌졸중의 설치류 모델에서 뇌졸중 병변에 인접한 조직으로 NR1을 직접 전달하기 위해 주입 좌표가 확인된 비임상 약리학 연구와 일치한다. 이 비임상 모델에서, NR1 처리된 동물은 개선된 기능을 나타낸다.
제안된 임상 연구 용량 증량 대상체 코호트 및 이들 각각의 용량은 아래 표에 나타나 있다:
비임상 모델에서, 최대 2×106개 세포의 용량을 독성학 연구에서 평가하였다. 1:74의 래트 대 인간 선조체 부피 비를 기준으로, 148×106개 세포의 상응하는 등가의 임상 용량을 잠재적 최대 용량으로 외삽할 수 있다. 그러나, 선조체 부피 비를 기준으로 60-배의 안전 한계(safety margin)를 조정하여 제안된 첫 번째 임상 시험 용량은 2.5×106개 세포/㎖이다. 1㎖의 고정된 부피당 5.0×106개, 10×106개 또는 20×106개의 NR1 세포(30-배, 15-배 및 7.5-배의 안전 한계)로의 후속 용량 증량을 제안한다. 이는 뇌내 전달을 사용하는 뇌졸중에 대한 다른 줄기 세포 임상 시험에서 사용된 용량 및 농도와 유사하며, 설치류에서 1×105개 및 4×105개의 세포가 효과적인 것으로 비임상 약리학 연구에서 효능이 관찰된 외삽된 용량 범위 내에 있다. 1:74의 래트 대 인간 선조체 비를 사용하여, 1×105개 및 4×105개 세포의 래트 용량은 각각 740만개 및 2960만개 세포의 임상 용량으로 확장될 것이다.
인간에서 NR1을 안전하게 투여할 수 있는 능력에 대한 이러한 결론은 위에 설명한 광범위한 테스트로부터의 데이터를 기반으로 하며, 다음과 같은 수의 성체 무흉선 래트를 테스트하여 안전 한계 결정을 계산하기에 충분한 데이터 및 결과를 제공한다.
NSG 마우스(6)를 1×106개 세포/동물로 NR1을 뇌내로 처리하였다.
고용량 동물을 최대 가능한 용량으로 처리하고, 투여 후 30일 및 180일로 희생 시점을 선택하였다. GLP 독성학 연구에 긴 추적 관찰 기간(6개월)을 포함시켜 NR1 세포의 성장 또는 오염된 줄기 세포 전구체로 인해 발생할 수 있는 천천히 형성되는 기형종 및 이소성 조직 덩어리의 존재를 검출할 수 있는 시간을 벌었다. 세포 주입 배지에는 NR1 세포 성장을 향상시키고 드문 기형종 형성의 검출을 최적화하기 위해 체성 조직에서 줄기 세포-유래 신경 전구체의 생존을 촉진하는 것으로 알려진 Matrigel®을 포함시켰다. NR1로 처리한 후 생존, 임상 병리학 종점 및 조직의 현미경적 소견에 대한 임의의 영향을 포함하여 국부 또는 전신 독성은 관찰되지 않았다. 6-개월의 연구 기간 동안 임의의 조직 또는 기관에서 NR1 처리 후 종양 또는 기형종 형성의 증거는 발견되지 않았다. IHC 염색 및 qPCR 분석은 세포가 이식 후 30일에서 180일까지 낮지만 일관된 수준을 유지하며, 주입 부위로부터 이동하지 않았음을 보여주었다. 파일럿 독성학 연구 및 두 가지 약리학 연구를 포함하여 여러 다른 연구에서 NR1 지속성과 이동의 결여가 나타났다. NR1 체내분포 연구는 또한 뇌내 주입 부위로부터 NR1 세포가 이동하지 않음을 보여주었다.
중간 대뇌동맥 폐색 ISS 모델의 면역 억제된 스프래그 다우리(SD) 래트의 경색 주변 영역에 NR1 세포를 이식한 후 체내분포 연구를 수행하였다. 이 모델은 운동 및 행동 기능의 부분적 회복을 유도하는 데 있어서 NR1의 효능을 보여준 NR1을 사용한 1차 약리학 연구인 연구 USF-1에서도 사용하였다. 해당 모델은 뇌졸중 분야에서 일상적으로 사용되는 잘 특성화된 ISS 모델이며, 만성 ISS가 있는 피험자의 제안된 표적 적응증에 가장 가까운 일치를 제공한다.
체내분포 연구에서 동물당 4×105개 세포의 용량으로 뇌의 피질 및 선조체에 주입한 후, NR1 세포는 적어도 45일 동안 경색 주변 주입 부위에서 지속되었다. NR1 세포는 주입 트랙에서 뇌의 인접한 영역 또는 말초 조직으로 이동하지 않고 투여 부위에 국한된 상태로 남아있었다. 뇌졸중이 없는 무흉선 래트에서의 GLP 독성학 연구의 소견은 주입 트랙으로부터 NR1 세포가 이동하지 않고 뇌의 주입 부위에서 세포가 장기간 지속되는 이러한 소견을 확인시켜 주었다.
임상 연구에서 NR1의 안전한 투여를 뒷받침하는 우세한 증거
파일럿 약리학 연구, 면역 억제된 SD 래트의 ISS 래트 모델에서의 60-일 GLP 체내분포 연구 및 무흉선 래트에서의 6-개월 GLP 독성학 연구를 모두 평가하여 동물당 최대 2×106개 세포의 수준의 NR1의 단일 IC 용량의 장기 안전성을 평가하였다. 임상적으로 NR1의 안전한 투여를 뒷받침하는 우세한 증거는 다음을 포함한다:
위의 결론은 6-개월의 연구 기간 동안 임의의 조직 또는 기관에서 NR1 치료 후 독성, 종양 또는 기형종 형성의 증거가 검출되지 않았기 때문에 동물 모델에서 사용된 NR1의 용량이 뇌에 안전하게 투여될 수 있다는 확신을 제공한다. NR1은 투여 부위에 분포하거나 또는 이로부터 이동하지 않았으며, 뇌 주입 부위 또는 신체의 다른 조직에서 임의의 거리만큼 떨어져 있는 인간 세포의 증거도 없다. 주입 부위에서 NR1 세포의 존재는 인간 DNA를 검출하는 매우 민감한 검정을 사용하여 그리고 현미경 슬라이드에서 인간 세포의 면역조직화학 염색에 의해 입증되었으며, 검출 가능한 세포가 이식 후 180일 동안 경색 주변 주입 부위에서 눈의 띄었다.
비임상 모델에서, 최대 2×106개 세포의 용량을 뇌졸중 모델 동물에서 평가하였다. 위에 기재된 바와 같이, 최대 2×106개 세포/㎖로 처리된 뇌졸증이 있는 동물은 뇌졸중 전 운동 기능을 회복하였다.
1:74의 래트 대 인간 선조체 부피 비를 기준으로, 148×106개 세포의 상응하는 등가의 임상 용량을 잠재적 최대 용량으로 외삽할 수 있다. 그러나, 선조체 부피 비를 기준으로 60-배의 안전 한계를 조정하여 제안된 첫 번째 임상 시험 용량은 2.5×106개 세포/㎖이다. 1㎖의 고정된 부피당 5.0×106개, 10×106개 또는 20×106개의 NR1 세포(30-배, 15-배 및 7.5-배의 안전 한계)로의 후속 용량 증량을 제안한다. 이는 뇌내 전달을 사용하는 뇌졸중에 대한 다른 줄기 세포 임상 시험에서 사용된 용량 및 농도와 유사하며, 설치류에서 1×105개 및 4×105개의 세포가 효과적인 것으로 비임상 약리학 연구에서 효능이 관찰된 외삽된 용량 범위 내에 있다. 1:74의 래트 대 인간 선조체 비를 사용하여, 1×105개 및 4×105개 세포의 래트 용량은 각각 740만개 및 2960만개 세포의 임상 용량으로 확장될 것이다.
실시예 2
비임상 개요
NR1 완제 의약품은 인간 배아 줄기 세포(hESC) H9로부터 유래되는 신경 줄기 세포 제품이다. 이는 편측 부전마비가 있는 성인 대상체에서 운동 결함이 있는 만성 허혈성 피질하 뇌졸중의 치료를 위해 개발되고 있다. NR1의 투여 대상은 기능적 인간 뇌 이미징 및 비임상 연구에서 조직 복구 및 재구성에 활성인 것으로 나타난 영역인 피질하 뇌졸중에 인접한 뇌 조직의 피질하 부분이다. NR1 치료의 효능을 테스트하기 위해 두 가지 비임상 연구를 수행하였으며, 하나는 면역 억제된 SD 래트의 허혈성 피질하 뇌졸중(ISS) 모델에서 그리고 다른 하나는 면역결핍성 무흉선 래트의 허혈성 피질 뇌졸중(ICS) 모델에서 수행하였다. 면역결핍성 또는 면역 억제된 동물을 사용하여 인간 NR1 세포의 잠재적 거부를 최소화하였다. 효능 모델 모두에서 관찰되는 NR1-관련 부분적 감각운동 회복의 작용 메커니즘을 설명하고 적절한 동물 모델이 GLP 체내분포 및 독성학 연구에 사용되었음을 입증하기 위해 조사 연구를 수행하였다.
NR1 완제 의약품의 세포 특성으로 인해, 약동학, 대사 또는 배설 연구는 적용할 수 없었다. 면역 억제된 SD 래트의 ISS 뇌졸중 모델(중추적 약리학 연구에서 사용된 모델이기도 함)에서 NR1의 뇌내(IC) 주입 후 GLP 체내분포 연구를 수행하였다. 중추적인 GLP 독성학 연구에서 미경험(뇌졸중이 없는) 무흉선 래트. GLP 독성학 연구는 NR1 이식 후 180일의 기간에 걸쳐 IC 주사의 잠재적 유해 효과를 평가하였다. 또한, 치료 후 발생할 수 있는 기형종을 검출하는 면역결핍성 래트 모델의 능력을 결정하기 위해 NR1 처리 용량의 최대 50% 수준으로 NR1 완제 의약품과 H9 hESC의 혼합물을 주입한 처리 그룹을 포함시켰다. 구조적 단백질과 세포 성장 인자의 이종성 혼합물인 Matrigel®은 독성학 연구의 세포 배지에 포함되어 오염된 H9 세포가 NR1 완제 의약품에 남아 있는 경우 기형종이 형성될 가능성을 높였다. Matrigel은 인간 대상체의 임상 연구에 사용되지 않을 것이며, 비임상 약리학 또는 GLP 체내분포 연구에도 사용되지 않았다.
NR1의 효능, 체내분포 및 독성학을 평가하기 위해 수행된 연구 중 일부는 "조합된 연구"였으며, 즉, 이들의 연구 종점은 동시에 수집된 데이터와 함께 다수의 전술한 종점을 포함하였다. 예를 들어, 연구는 약리학 및 독성학 종점을 포함할 수 있지만, 체내분포 종점은 포함하지 않거나 또는 3개의 영역 모두를 포함할 수 있다. 단일 연구에서의 다학체적 종점을 평가하면 동일한 동물 모델 시스템에서 활성 및 독성의 상호관계를 통합적으로 평가할 수 있어, 효능, 활성 및 체내분포뿐만 아니라 안전성의 관계에 대한 고유한 통찰력을 얻을 수 있다. NR1 세포가 뇌 외부에 분포되어 있는지 또는 NR1 세포가 장기간 생존하는지 여부와 같은 의문은 독성에 대한 예상치 못한 표적 기관에 대한 로드맵을 제공할 것이다. 이 통합된 비임상 테스트 전략은 NR1 세포 요법의 효능 및 안전성의 가장 관련이 높은 비임상 평가 및 임상 환경에 대한 외삽을 제공한다.
1차 약동학
허혈성 피질하 뇌졸중(ISS) 및 허혈성 피질 뇌졸중(ICS)의 비임상 래트 모델에서 IC NR1 처리의 효능 및 안전성을 테스트하기 위해 두 가지 비-GLP 약리학 연구를 수행하였다. 감각운동 기능의 손상 후 회복을 정량화하기 위해 일련의 운동 및 행동 테스트를 사용하여 기능 회복을 측정하였다. 조직학적 평가를 사용하여 두 연구에서 NR1 효과와의 잠재적 상관관계에 대한 후보 작용 메커니즘을 탐색하였다. 두 약리학 연구에서, 잠재적 독성의 평가는 회복의 평가와의 추론을 피하기 위해 유해 효과, 체중 변화 및 생존의 임상 징후의 기록으로 제한하였다. NR1 완제 의약품의 작용 메커니즘을 평가하기 위해 여러 소규모 조사 연구를 수행하였다. 이러한 전문화된 연구에서 NR1-관련 감각운동 회복에 대한 세포 생존, 염증, 미세아교세포 및 자연 살해 세포, 신경 가소성 및 염증의 역할을 평가하고, NR1의 세크레톰(secretome) 분석을 수행하고, 뇌졸중 후 NR1-유도성 기능 회복의 예측인자로서 TSPO-PET의 사용을 검사하였다.
중추적 효능 연구는 ISS의 중간 대뇌동맥 폐색 모델의 면역 억제된 스프래그-다우리(SD) 래트에서 NR1의 뇌내(IC) 이식의 잠재적 치료 가치를 평가하였다. 이 시스템은 뇌졸중 분야에서 일상적으로 사용되는 잘 특성화된 ISS 모델이며, 인간 만성 ISS가 있는 피험자의 제안된 표적 적응증에 가장 근접한 일치를 제공한다. 연구의 1차 종점은 뇌졸중 후 제7일 또는 제28일에 NR1 치료가 신체 거상 스윙 테스트(EBST)에 통계적 개선을 초래할 것이라는 가설을 테스트하는 것이고, 2차 종점은 신경학적 검사 및 로타로드 테스트의 개선이다. ISS의 모델에서 NR1의 IC 이식이 일반적인 운동 행동, 신경학적 기능 및 운동 협응의 회복을 촉진하는 것으로 나타났다. 테스트 전반에 걸친 기능 회복의 시작은 이식 후 2개월에 발생하였으며, 이식 후 적어도 3개월(연구 종료)까지 지속되었다. 전반적으로, 뇌졸중의 급성기와 만성기 모두에서 그리고 낮은 세포 용량과 높은 세포 용량 모두에서의 이식은 지속적인 기능 회복을 상당히 촉진하였지만, 만성기 및 고용량에서의 이식이 EBST 및 로타로드 테스트 결과에 기초하여 가장 최적의 이식 양생법으로 나타나다.
조직학적 분석은 허혈성 손상이 편측성이며, 운동 기능 및 운동 협응에서 가장 현저한 기능적 손실이 관찰되었음을 확인하였다. 처리 후 3개월에 조직학적 평가는 NR1을 뇌졸중 후 급성기(7일) 동안 투여하였을 때 증가된 경색 주변 혈관 밀도와 NR1-관련 기능 회복의 향상 사이의 연관성 및 뇌졸중 후 만성기(28일)에 고용량 NR1을 투여하였을 때 감소된 경색 주변 미세아교세포/면역 세포 활성화와 NR1-관련 기능 회복의 향상 사이의 연관성을 시사하였다. 숙주 뇌 복구의 추가적인 메커니즘이 또한 기능 회복에 대해 관찰된 효과에 기여할 가능성이 있는 반면, 혈관신생 및 면역조절은 NR1의 후보 작용 메커니즘으로서 추가 조사를 필요로 한다. 이식 후 3개월에 주입 부위 또는 그 근처에서 생존하는 NR1 세포가 발견되지 않았지만, 기능 회복의 개선은 처리 후 2개월부터 시작하여 처리 후 적어도 3개월(연구 종료)까지 지속되는 것으로 관찰되었으며, 이는 장기적인 NR1 지속성이 명백히 없는 상태에서 만성 회복 향상이 일어났음을 나타낸다.
지지적 효능 연구는 또 다른 널리 사용되는 뇌졸중 모델인 ICS 모델을 사용하여 무흉선 래트에서 NR1의 IC 이식의 치료적 효과를 평가하였다. 감각운동 기능 테스트는 뇌졸중 손상 1주 전에 시작한 다음, 처리 후 8주까지 매주 시작하였다. 생전(in-life) 평가를 완료한 후, 조직학적 평가를 위해 처리 후 제9주에 뇌 조직을 수집하였다. 스탠포드-5에서 기능 회복의 주요 척도는 수염-발 테스트로 알려진 감각운동 행동 테스트이다. 2차 테스트 양식 및 조직학적 평가도 포함시켰다. 테스트 결과는 저용량이 아닌 고용량의 NR1 세포로 처리하면 감각운동 기능이 개선됨을 보여주었다. 처리 후 제4주에 처음 나타난 개선은 연구가 끝날 때까지 지속되었다. 조직학적 평가는 고용량-처리한 래트가 처리 후 제9주에 비히클 대조군에 비해 경색 주변 피질에서 감소된 미세아교세포/면역 세포 활성화를 나타내었지만, 이는 기능 회복과 상관관계가 없음을 보여주었다. 경색 크기, 경색 주변 혈관 밀도 또는 경색 주변 축색돌기 보존/성장에서 유의한 차이는 비히클 처리에 비해 NR1 용량에서 관찰되지 않았다. 투여 후 제9주에 어떤 생존 인간 세포(NR1 세포)도 임의의 동물에서 검출되지 않았으며, 이는 NR1 세포가 이 이종이식 손상 모델에서의 이 실험에서 장기간 지속될 수 없음을 시사한다.
동물에서 뇌졸중 후 기능 회복을 자극하는 NR1 세포의 효과를 조사할 뿐만 아니라 설치류에서 인간 NR1 세포의 생존을 증가시키는 최적의 방법을 결정하기 위해 몇몇 전문화된 조사 연구를 수행하였다. 연구에는 기능 회복에 대한 염증 및 세포 가소성의 상대적인 역할의 평가, 이식된 NR1 세포의 세크레톰 분석, NR1 세포 지속성에 대한 NK 세포 또는 미세아교세포의 고갈 효과 평가 및 T2-FLAIR 신호가 NR1 세포-관련 기능 회복의 예측인자로서 역할을 할 수 있고 치료의 면역조절 기능을 평가할 수 있는지 여부를 포함시켰다.
본 발명자들은 뇌졸중이 있는 래트 뇌로의 NR1 이식에 의해 촉발된 염증성 반응의 역할을 평가하였다. NR1-처리된 동물은 대조군 동물보다 더 다양한 면역 반응을 나타내었지만, NR1에 의한 이식 후 초기 면역 반응은 대식세포를 M1/전염증성 상태에서 M2/항-염증성 상태로 변화시켰으며, 이는 시험관내 가소성 연구의 결과와 상관관계가 있었다. 만성 뇌졸중에서 NR1 이식의 면역조절 효과를 추가로 평가하기 위해, T2-FLAIR MRI 신호를 뇌졸중 피험자의 NR1-유도성 기능 회복의 잠재적 임상적 예측인자로서 래트 뇌졸중 모델에서 사용하였다. T2-MRI FLAIR 신호는 종종 염증과 관련이 있다. 이것과 두 번째 비침습적 이미징 양식인 TSPO-PET라고 하는 전위 단백질 18kDa(TSPO)의 PET 이미징을 사용하여 래트에서 뇌 염증을 모니터링하였다. TSPO는 뇌 상주 면역 세포, 미세아교세포 및 성상세포 및 침윤성 골수 세포, 예컨대, 단핵구/대식세포, 호중구 및 수지상 세포를 포함하는 활성화된 면역 세포를 포함한다. TSPO 수준은 건강한 뇌에서는 낮지만 염증성 병태하에서는 상향 조절된다. 따라서, TSPO-PET 방사성 리간드는 신경 염증의 유용한 지표 역할을 하고, 증가된 TSPO-PET 신호는 뇌졸중 피험자에서 뇌졸중 후 5일 내지 24개월 범위의 시간에 뇌졸중 병변 및 원격 뇌 영역 모두에서 관찰되었다. FLAIR 병변과 관련된 니들 트랙 영역의 면역조직화학 분석은 NR1-처리된 동물과 비히클-처리된 동물 사이에 염증성 반응의 질적 차이를 보여주었으며, 여기서 처리된 동물은 주입 트랙의 경계에서 더 활성화된 대식세포/미세아교세포를 갖는다. 뇌졸중이 있는 누드 래트로부터의 TSPO-PET 데이터는 FLAIR 소견과 일치하였으며, 이식 부위 근처에서 면역 세포 활성이 더 높았고 비히클-처리한 래트에 비해 NR1-처리한 래트에서 더 멀리 떨어져 있었다. 면역 세포 활성의 대부분은 뇌의 연결된 영역에서 발생하였으며, 이는 hNSC의 광범위한 면역조절 효과를 암시한다. 특히 아래에서 논의되는 NR1-처리한 래트에서 수행된 생체내 세크레톰 분석과 함께 고려되는 이 연구의 결과는 뇌졸중 회복을 촉진하는 NR1의 주요 작용 메커니즘으로서 면역조절을 강력하게 암시한다.
NR1의 활성에서 분비된 인자의 역할을 평가하는 두 가지 연구를 수행하였다. 하나는 NR1 세포가 뇌졸중 후 누드 래트의 경색 주변 영역에서 피질 활동에 어떻게 영향을 미치는지 분석함으로써 신경 가소성에 대한 NR1 세포의 효과를 평가하였다. 뇌 가소성 또는 리와이어링(rewiring)은 인간 및 설치류에서 뇌졸중 후 관찰되는 자발적 회복에 중요한 역할을 하며, 리와이어링은 건강한 뇌 영역이 손상된 영역의 기능을 보상할 수 있도록 하는 경색 주변 영역에 인접한 생존 회로에서 발생한다. NR1 이식은 이식 후 제7일에 경색 주변 피질에서 증가된 운동 회로 활동을 상당히(p<0.05) 증가시켰으며, 피질층 2 및 3에서 가장 현저하게 증가하였다. 반대로, 저해성 연결은 크기가 상당히(p<0.05) 감소하였고, 개시가 지연되었다. 흥분성 연결에 대한 NR1의 유의한 영향은 관찰되지 않았다. 이러한 소견은 NR1 세포가 저해성 제어로부터 경색 주변 영역에서 개별 뉴런을 방출함으로써 운동 회로 활동을 증가시킴을 시사한다. 시험관내 연구는 NR1 세포가 특별히 망막 신경절 신경 세포(RGC)의 시냅스생성을 향상시킴으로써 신경 세포의 가소성에 영향을 미침을 보여주었다. 유전자 온톨로지 분석은 NR1 이식을 가소성과 관련된 유전자의 발현과 연관시켰으며, 이는 NR1-관련 초기 조절 신경 활동 및 초기 단계의 가소성이 늦은 기능 회복을 초래함을 시사한다. NR1 세포는 성체 신경 전구세포 증식, 신경 분화, 뉴런의 전기생리학적 특성에 직접 관여하는 개폐형 채널, 축색돌기 유도, 축색돌기형성 및 시냅스생성을 자극하는 것과 관련된 유전자의 특이적이고 차별적인 발현을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 전반적으로, NR1 세포는 저해성 제어로부터 경색 주변 피질에서 개별 뉴런을 방출하는 것뿐만 아니라 시냅스생성을 자극하는 인자를 분비함으로써 가소성을 조절함으로써 뇌졸중 후 경색 주변 영역의 가소성에 기여하는 것으로 보인다. 뇌졸중이 있는 래트가 GFP-표지된 NR1을 주입받은 후 제2일에 TRAP 분석 및 RNA 시퀀싱(TRAP/RNAseq)을 사용하여 NR1 세포의 세크레톰 분석을 수행하였다. 이는 분비된 단백질에 대한 175개의 유전자를 확인하였으며, 세포외 기질(ECM) 리모델링(대부분의 뇌 복구 메커니즘에 관여함) 및 염증과 축색돌기 유도와 관련된 프로세스를 포함하여 뇌 복구와 관련된 상위 20개의 많은 프로세스를 확인하였다. 다시 한 번, NR1-분비된 인자는 뇌 복구 및 축색돌기 유도의 조절에 역할을 하는 것으로 보인다. 시험관내 분석에서, 염증, 주로 사이토카인 활성 및 기타 세포외 기질(ECM) 조직화와 관련된 거의 200개와 함께 분비된 인자를 암호화하는 약 400개의 유전자를 확인하였다. 구체적으로, NRG3 및 TGFb3는 생체내 뇌졸중 환경에서 상향 조절되었다. 전반적으로, 이러한 두 가지 연구는 NR1 세포가 뇌의 후기 기능 회복에 관여하는 다양한 다른 인자를 조절할 수 있는 인자를 분비함을 보여주었다.
체내분포 및 독성학 연구를 위한 동물 모델을 개선하기 위한 노력으로, 이식 후 뇌에서 NR1 세포의 생존에 관련된 인자를 평가하기 위해 두 가지 연구를 수행하였다. ISS 유발 후 만성기(28일) 동안 경색 미세아교세포/단핵구 세포 활성화 감소의 영향은 조직학적 분석의 결과에 의해 제안되었다. 미세아교세포가 대식세포로서 작용함으로써 CNS에서 면역 반응을 매개하기 때문에, 이들(미세아교세포)은 이식 후 NR1의 생존에 해로운 영향을 미칠 수 있다. 미세아교세포를 고갈시키는 피드(feed)에 PX5622를 사용하면, 이식 후 1주 동안 미세아교세포 수가 뇌에서 최대 40% 및 혈액에서 52% 감소하였다. NR1 세포 생존에 대한 영향은 이식 후 1주일에 관찰되지 않았다. 두 번째 연구는 NR1 이식 전후에 항-아시알로/GM1 항체로 처리함으로써 자연 살해(NK) 세포 수를 고갈시키는 NR1 생존에 미치는 영향을 조사하였다. 이전 연구에서와 같이, NR1 생존은 NK 수준이 약 80% 내지 90% 고갈되었음에도 불구하고 개선되지 않았다. 이 두 연구 모두에서 NR1 생존만이 측정되었고 뇌졸중 회복에 대한 직접적인 영향은 없었으며, 회복 과정의 복잡성으로 인해 NR1 세포 생존과 뇌졸중 회복의 관계에 대한 이해가 어려울 수 있다. 두 번째 결론은 미세아교세포나 NK 세포의 고갈이 NR1 생존을 개선하지 않으며 NR1의 효능 및 안전성을 테스트하기 위한 더 나은 동물 모델을 만들 수 없을 것이라는 것이다.
분석적 방법
정량적 실시간 PCR(qPCR) 방법은 설치류 조직에서 인간 핵 gDNA의 수준을 정량화하기 위해 찰스 리버 래보래토리즈(Charles River Laboratories)(마타완 소재)(CRL-MTWN, 이전 회사명 엠피아이, 인크. (MPI, Inc.))에 의해 개발되었다. 검정은 래트의 GLP 체내분포 및 독성학 연구에 사용하도록 완전히 적격화되고 검증되었다. 검증된 검정은 연구 USF-1로부터 고정되고 냉동된 래트 조직에서 NR1 gDNA에 대한 표준 곡선을 준비하기 위해 HK293 세포로부터의 DNA를 사용할 수 있도록 교차 검증되었다. 인간 핵 DNA의 검출을 위한 프라이머 및 프로브 서열은 이러한 연구에서 사용된 모든 검정에서 동일하였다.
MPI SOP CMB-19 및 CMB-78에 따라 래트 조직으로부터 총 DNA를 추출하였다. qPCR 반응을 CMB 방법, CMB-2122-007-B를 따라 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 각 플레이트를 표준 곡선, QC 샘플 및 연구 샘플의 세트로 실행하였다. 표준 곡선은 반응당 104, 105, 103, 2×102, 102, 50, 20 및 0(제로) 카피에서 기준점에 대해 3회 반복으로 실행하였다. 시약 순도를 확인하기 위해 기질만을 포함하는 0개의 카피를 갖는 표준을 포함시켰다.
농도 한계는 다음과 같았다: 검출 한계(LOD): 10 카피의 gDNA/조직의 ㎍; LOD 미만의 샘플은 BLOD로 확인되었다; 정량 하한(lower limit of quantification: LLOQ): 20 카피의 gDNA/조직의 ㎍; 반응당 10개 카피 내지 20개 카피 사이의 결과를 제공하는 샘플은 BLOQ로 확인되었다; 정량 상한(Upper limit of quantification: ULOQ): 104개 카피의 gDNA
qPCR 방법은 완전히 적격화되고 검증되었다.
흡수
NR1에 대한 흡수 연구는 수행하지 않았다.
분포
NR1을 사용한 단백질 결합, 분포 또는 태반 이동 연구는 수행하지 않았다. 체내분포는 여러 연구에서 평가하였다.
허혈성 피질하 뇌졸중(ISS) 절차에 이어 NR1로 IC 치료를 받은 면역 억제된 정상 래트에서 GLP-준수 2-개월 체내분포 연구를 수행하였다. NR1의 수준을 이식 후 최대 60일까지 여러 시점에서 검증된 qPCR 검정을 사용하여 정량화하였다. 세포 지속성 및 분포에 대한 추가적인 연구를 GLP 독성학 연구의 일부로서 수행하였다. 이식 후 삼(3)개월에 IHC 및/또는 qPCR을 사용한 NR1 세포의 정량화를 위해 ISS을 겪은 SD 래트(USF-1)로부터 부검 시 선택된 조직을 수집하였다. 유사하게는, NR1의 정량화를 위해 ICS를 겪은 무흉선 래트로부터 이식 후 제9주에 선택된 조직을 수집하였다.
본 발명자들은 "뇌졸중 모델" 래트의 뇌에 이식된 테스트 물품 NR1의 분포를 모니터링하였다. 이 모델에서, ISS는 중간 대뇌동맥 폐색에 의해 외과적으로 유도하였고, NR1 세포는 뇌졸중 후 3일 내지 5일(급성 뇌졸중) 또는 뇌졸중 후 28일 내지 30일(만성 뇌졸중)에 IC로 주입하였다. 인간 NR1 세포의 면역 거부 가능성을 줄이기 위해 사이클로스포린 A를 복강내 주사하여 래트의 면역을 억제하였다. 이식 후 24시간 내지 60일 범위의 시점에서, 인간 세포를 확인하기 위해 H&E 염색 및 IHC 염색을 사용한 현미경적 검사를 위해 뇌 및 선택된 말초 조직으로부터 슬라이드를 준비하였다. 인간 핵 DNA를 검출하기 위해 검증된 실시간 qPCR 검정으로 분석하기 위해 엄격한 무균 기법을 사용하여 비-CNS 조직(위에 열거됨) 및 뇌 조직의 샘플을 수집하였다. IHC는 발생률 및 크기 모두에서 일반적인 감소 경향을 보이는 이식 후 45일까지 급성 및 만성 뇌졸중 그룹 모두의 동물의 뇌에서의 NR1 세포의 최소에서 중간 크기의 NR1의 발생을 보여주었다. NR1 세포의 존재는 세포가 주입된 뇌의 반구로 제한되었으며, 임의의 래트에서 검사한 임의의 다른 기관에서는 세포가 검출되지 않았다.
아마도 주입 부위에 가장 가까운 조직이 조직병리학 연구에 사용되고 더 먼 조직만 qPCR에 사용되는 조직 샘플링 절차로 인해 NR1 세포 gDNA는 qPCR 검정을 사용하여 급성 뇌졸중 그룹에 있는 동물의 임의의 뇌 샘플에서 검출되지 않았다. 대조적으로, 만성 뇌졸중 그룹의 두 분석을 위한 주입 부위 및 그 근처의 조직을 수집하였다. 이 경우, NR1 세포 gDNA는 투여 후 24시간에 10마리 중 6마리의 동물에서 검출되었고(카피 수 범위는 33개 내지 601개 카피/㎍ 샘플 DNA), 투여 후 제3일에 10마리 중 2마리의 동물에서 검출되었으며(68개 및 91개의 카피 수), 투여 후 제1주에 10마리 중 2마리의 동물에서 검출되었다(둘 다 BLOQ). qPCR을 사용하여 투여 후 제30일, 제45일 또는 제60일에 NR1 세포는 검출되지 않았다. 급성 그룹과 비교하여 만성 그룹의 초기 시점에서 NR1 gDNA의 존재는 NR1 세포 생존의 진정한 차이가 아니라 qPCR 분석을 위한 조직 수집 부위의 변화로 인한 것으로 보인다.
몇몇 동물에서 세포가 부주의하게 뇌실로 주입된 가능성을 제외하면, IHC 또는 qPCR을 사용하여 주입 부위로부터 떨어진 뇌의 임의의 영역 또는 말초 조직에서 NR1 세포는 검출되지 않았다. NR1 세포는 이식된 NR1 세포가 IHC 염색에 의해 현미경으로 확인될 수 있는 모든 래트에서 뇌의 반구, 특히 주입 트랙으로 제한되었다. 주입 부위로부터 떨어진 부위의 뇌 또는 임의의 말초 기관에서 NR1 세포는 검출되지 않았다. 6마리의 동물에서, 매우 낮은 수준의 NR1가 qPCR 검정의 정량 한계 근처 또는 그 이하의 수준으로 단일 척수 절편에서 검출되었다(가장 높은 카피 수는 단일 동물에서 22개, 다른 5마리의 동물에서 BLOQ 값이었음). 이러한 소견을 평가하기 위해 동물들로부터의 척수 절편을 인간 세포에 대한 IHC HuNu 염색을 하기로 하였다. 영향을 받은 동물 중 한 마리를 제외한 모든 샘플에서 때때로 HuNu-양성 세포(영향을 받은 슬라이드당 1개 내지 3개 세포 범위의 단일 개별 세포)가 포함되어 있었다. 모든 세포는 척수의 수막의 경계/외부에 존재하거나 또는 척수 조직 절편과 동일한 단면의 평면에 존재하지 않았다. 이러한 소견은 NR1 세포가 주입 부위에서 척수로 직접 이동하였음을 나타내지 않았지만, 설치류의 두개골 및 뇌의 작은 작업 영역과 관련된 수술 절차, 뇌실 및 지주막하 CSF 공간으로의 부주의한 주입 및/또는 부검 또는 조직 처리 절차의 결과로 가끔 세포의 도입으로부터 오염되었을 가능성이 가장 높다. 이는 래트에 비해 훨씬 큰 인간 두개골 수술 분야에서의 오염을 피하는 능력 때문에 인간의 수술 절차에 문제가 되지 않을 것이며, 따라서 뇌실 및 지주막하 CSF 공간으로의 부주의한 주입은 제거된다. 기형종의 증거는 뇌 또는 임의의 다른 조직에서 육안으로나 또는 현미경으로나 검출되지 않았다.
이식 후 제30일 및 제180일에 뇌에서 NR1의 지속성을 또한 면역결핍성 미경험(뇌졸중이 없는) 누드 래트에서 수행된 GLP 독성학 연구에서 평가하였다. IHC 염색을 사용하여, NR1 세포는 투여 후 제180일 이식 후 6개월에 저용량(30마리 중 22마리) 및 고용량(30마리 중 23마리) 동물에서의 최소 내지 현저한 수준과 비교하여 저용량(20마리 중 17마리) 및 고용량(20마리 중 16마리) 동물에서의 주입 부위 또는 그 근처에서 NR1 투여 후 제30일에 최소 내지 중간 수준으로 존재하는 것으로 나타났다. 체내분포 연구에서와 같이, NR1 세포는 대부분 주입 부위에 존재하였으며, 뇌 실질 내에서 또는 이보다 덜 빈번하게 뇌실 공간 내에서 현미경으로 공동화된 공간으로 시각화된 주입 부위에서 NR1 세포가 이동하였다는 증거는 없었다. 뇌실 내 NR1 세포의 존재는 이식하는 동안 뇌실로의 세포의 부주의한 주입으로 인한 것일 수 있다(위의 설명 참조). qPCR 분석 결과는 일관적이었다: NR1 세포는 이식 후 제30일 및 제180일 모두에서 저용량 및 고용량 IC 주입된 동물에 존재하였다. 투여 후 제30일에, 뇌 용해물 gDNA의 ㎍당 21개 내지 54개 카피의 NR1 gDNA 범위(20마리 중 6마리의 동물)가 고용량(20마리 중 14마리의 동물)에서의 21개 내지 37개 카피의 범위와 비교하여 저용량에서 측정되었다. 투여 후 제180일에, 20마리 중 18마리의 고용량 동물에서의 25개 내지 97개의 카피와 비교하여 20마리 중 17마리의 저용량 동물에서 25개 내지 73개의 카피가 검출되었다. 1×107개의 NR1 세포를 주입한 그룹의 11마리의 동물에서 IM 주입 부위에 NR1 gDNA는 검출되지 않았으며, 대조군 동물에서도 NR1 gDNA는 검출되지 않았다.
뇌에서 NR1 지속성을 평가하는 다른 연구는 미경험(뇌졸중이 없는) NSG 마우스 또는 누드 래트에서의 세 가지 파일럿 독성학 연구뿐만 아니라 미경험 누드 래트에서 수행한 소규모 작용 메커니즘 연구를 포함한다.
가장 큰 연구에서 30% Matrigel이 있거나 없는 DMEM/F12 배지 + 0.5% HSA에서 미경험(뇌졸중이 없는) 누드 래트에 IC 주입된 NR1 세포의 지속성을 평가하였다. 인간 핵 단백질 항원인 HuNu에 대한 반-정량적 IHC 염색을 사용하여 약 88일 동안 세포 지속성을 추적하였다. 제88일에, Matrigel-함유 그룹에서만 낮은 수준(4마리 중 2마리의 동물에서 원래의 세포 용량의 0.2% 미만)으로 세포가 검출되었으며, 비-Matrigel 그룹에서는 검출 가능한 세포가 없었다. 두 GLP 연구에서 검출된 세포의 수보다 훨씬 적지만, 결과는 또한 IC-이식된 NR1 세포의 연장된 생존을 보여준다. 두 소규모 연구는 또한 투여 후 60일 동안 낮은 수준의 생존뿐만 아니라 Matrigel이 없는 경우와 비교하여 Matrigel이 세포 배지에 포함되었을 때 개선된 NR1 생존을 일관되게 보여주었다.
전반적으로, 다중 세포 분포 또는 지속성 연구의 결과는 뇌내로 이식된 NR1 세포가 주입 후 최대 180일 동안 뇌에서 지속됨을 보여주었다. 이러한 소견은 가장 긴 연구의 종료인 이식 후 3개월까지 지속되는 여러 가지 상이한 평가에 의해 측정된 바와 같이 일반적인 운동 행동, 신경학적 기능 및 운동 협응의 NR1에 의해 유도된 지속적인 부분적 회복을 보여준 두 가지 약리학 연구의 결과와 함께 고려하였다. NR1 체내분포 연구는 뇌내 주입 부위로부터 NR1 세포가 이동하지 않음을 명확하게 보여주었다. 뇌실 내 NR1 세포의 간헐적인 소견은 뇌실로의 세포의 부주의한 주입(이는 인간 피험자의 더 큰 수술 영역으로 인해 NR1의 임상적 사용에서는 발생하지 않을 것임) 또는 수집 동안의 오염의 결과로 여겨진다.
단일-용량 독성학
세 가지 파일럿 연구 및 180-일 GLP-준수 연구를 포함하여 여러 단일-용량 연구 NR1 독성학 연구를 설치류에서 수행하였다. 수컷 및 암컷 미경험(뇌졸중이 없는) 무흉선 래트에서 cGMP NR1 완제 의약품을 사용하여 GLP 연구를 수행하였으며, 기간은 180일이었다. 이 연구의 1차 목적은 NR1 완제 의약품의 내약성 및 일반적인 독성을 평가하기 위한 것이었다. 연구는 또한 세포 이식 후 6-개월의 시간에 걸쳐 NR1 세포의 주입 부위에서의 지속성 및 이로부터 이동할 가능성을 평가하였다. 또한, 연구 설계에는 무흉선 래트 모델이 줄기 세포-관련 기형종의 형성을 검출하는 능력을 결정하기 위해 2×106개 세포 NR1 용량의 0.1% 내지 50% 범위(2×103개 내지 1×106개의 H9 세포/동물)의 특정 수준으로 H9 hESC를 스파이킹한 NR1 세포로 처리한 동물의 그룹을 포함시켰다.
GLP 독성학 연구를 수행하기 전에, 파일럿 연구를 수행하여 최적의 동물 모델을 선택하고, 이식 후 28일에 걸쳐 3가지 면역결핍성 동물 모델인 NSG 마우스, 신생아 무흉선 래트 및 성체 무흉선 래트의 적합성을 결정하였다. 그 결과에 기초하여, 성체 무흉선 래트를 추가 평가를 위해 선택하였다. 두 번째 파일럿은 주입 후 최대 2개월 동안 뇌에서의 NR1 지속성에 따라 성체 무흉선 래트 모델을 추가로 특성화하였다. 또한, 세포 생존을 지원하기 위해 세포 배지에 포함된 Matrigel이 주입 부위에서 NR1 지속성에 미치는 영향을 평가하였다. NR1을 사용한 최초의 파일럿 연구는 성인 누드 래트에서도 수행하였지만, 중추적 독성학 연구 및 두 가지 파일럿 연구(위에 기재됨)에서 사용된 Plasmalyte-A + 0.5% HSA 대신 상이한 세포 배지(DMEM/F12 + 0.5% HSA)를 사용하였다. DMEM/F12 배지는 인간 피험자에게 사용하기에 적합하지 않은 것으로 판단되어 이 연구 이후에는 사용하지 않았다. 이 연구에는 또한 모델의 적합성을 평가하고 또한 이식 후 세포 지속성에 대한 Matrigel이 효과를 평가하기 위해 H9 hESC를 포함시켰다. 다른 연구에서와 같이, NR1은 내약성이 양호하였다. 제한된 NR1 지속성 데이터는 대규모 GLP 연구에서 관찰된 것과 일치하였다. Matrigel은 NR1 세포의 생존 및 기형종의 잠재적인 성장을 평가하는 데 도움이 되도록 세포 성장을 위한 최적의 환경을 제공하기 위해 세 가지 파일럿 연구에서 세포 배지에 포함시켰다. Matrigel을 포함시킨 것에 대한 효과를 평가한 두 연구에서, 뇌에서 NR1 세포의 지속성은 Matrigel을 포함시킴으로써 개선되었다.
GLP 독성학 연구의 동물 모델 및 설계는 이식 후 뇌에서의 세포 지속성에 대한 Matrigel의 유익한 효과 및 신생아 누드 래트 또는 NSG 마우스와 비교하여 성체 무흉선 래트에서 상대적으로 증가된 지속성을 보여주는 파일럿 연구에서의 소견을 기반으로 하였다. 미세아교세포 또는 NK 세포의 수를 감소시키는 NR1 지속성에 대한 효과가 없음을 보여주는 2건의 조사 연구는 GLP 연구 동물 모델을 선택하기 위한 이러한 접근법을 폐기하도록 하였다. 예비 작업에 기초하여, 특정 세포 집단을 선택적으로 감소시키기 위한 전처리 없이 세포 생존을 개선하기 위해 세포 배지에 Matrigel을 첨가하는 것을 포함하는 GLP 독성학 연구를 위해 성체 무흉선 래트를 선택하였다.
GLP 연구에서, 그룹당 미경험(뇌졸중이 없는) 수컷 및 암컷 누드 래트의 9개의 처리 그룹에 시티 오브 호프 국립 메디컬 센터에서 제조된 cGMP NR1, 또는 양성 대조군으로서 H9 hESC, 또는 NR1 세포와 H9 세포의 조합물을 IC 이식하였다. 세포는 뇌의 반구당 2개의 피질 및 1개의 선조체 주입 부위에 입체 정위적으로 주입하였다. 구조적 단백질과 세포 성장 인자의 이종성 혼합물인 Matrigel을 세포 생존 및 기형종의 성장 가능성을 향상시키기 위해 세포 배지에 포함시켰다. 3개의 처리 그룹에 테스트 물품 또는 양성 대조군과 테스트 물품의 조합물을 왼쪽 뒷다리의 대퇴 이두근에 근육내(IM) 주사를 통해 투여하였다. 용량은 4×105 또는 2×106 IC 또는 1×107 IM이었다. 최종 부검을 위해 대략 30일 또는 180일까지 동물을 유지시켰다. 조합 그룹은 2×106 NR1 용량의 50%(1×106개 H9 세포) 내지 0.1%(2000개의 H9 세포) 범위의 NR1 수준으로 스파이킹된 NR1 세포를 포함하였다. 표준 독성학 종점을 모니터링하였다. 부검은 NR1의 이식 후 대략 30일 및 180일에 수행하였다. 조직으로부터 슬라이드를 준비하고, H&E로 염색하거나 또는 IHC 염색을 거쳐 인간 세포를 확인하였다. qPCR 분석을 위해 뇌의 좌반구 또는 허벅지 근육 및 잠재적 표적 기관을 수집하였다.
최대 2×106개의 NR1 세포 IC 또는 1×107개의 세포 IM 용량의 NR1의 투여는 임의의 예상치 못한 사망, 임상 소견, 체중 또는 음식 소비의 변화, 임상 병리학 또는 골수 종점의 변화 또는 거시적 또는 현미경적 관찰과 관련이 없었다. NR1-관련 조기 사망 및/또는 안락사는 없었으며, NR1 단독으로 처리한 임의의 그룹에서의 뇌 또는 말초 조직에서 기형종 형성은 관찰되지 않았다. NR1 180일의 연구 기간 동안 고용량의 2×106개 세포/동물에서 내약성이 양호하였다.
그룹 1 내지 그룹 10에서 뇌의 우반구의 주입 트랙 및 그룹 11 내지 그룹 13의 동물의 IM 주입 부위에서 NR1에 대한 HuNu 염색을 수행하였다. NR1 완제 의약품만을 IC로 주입한 그룹 2 및 그룹 3에서, NR1 세포는 투여 후 제28일에 저용량(20마리 중 17마리 동물) 및 고용량(20마리 중 16마리 동물)에서 최소 내지 중간 수준으로 존재하였다. 제180일에 부검 시, NR1 세포는 저용량(30마리 중 22마리 동물) 및 고용량(30마리 중 23마리 동물) 동물에서 최소 내지 현저한 수준으로 존재하였다. 이식 후 제28일 및 제180일 모두에서, NR1 세포는 대부분 주입 부위에 존재하였으며, 뇌 실질 내에서 또는 이보다 덜 빈번하게 뇌실 공간 내에서 현미경으로 공동화된 공간으로 시각화되었고, 주입 부위에서 NR1 세포가 이동하였다는 증거는 없었다. 몇몇 동물은 수막 및/또는 주입 트랙에서 경미한 연골성/골성 화생을 나타내었으며, 이는 래트에서 이러한 투여 절차의 이전에 관찰된 인공물인 개두술로부터의 잔류 잔해에 기인한 것이다. 한 마리의 수컷(동물 번호 3018)에서, 연골(island of cartilage), 최소 골(minimal bone) 및 치밀한 섬유질 결합 조직의 두꺼운 피막을 특징으로 하는 잘 분화된 비신생물성 중간엽 화생의 작은 피막화된 병소로 설명됨)은 투여 절차 동안 NR1 세포 배지의 일부 침착에 기인한 산재한 HuNu-양성 세포를 나타내었다.
이전 연구에서 예측되고 이 GLP 연구에서 확인된 무흉선 래트 모델은 줄기 세포-관련 기형종의 형성을 검출할 수 있었으며, NR1의 독성 및 기형종/발암성 평가에 대한 적합성을 보여주었다. 동물에게 H9 세포를 스파이킹한 NR1 세포의 조합물을 주입하였을 때, 육안으로 눈에 보이는 기형종이 뇌 주입 부위서 명백하였으며, 그 결과 그룹 4에서 20마리 중 9마리의 동물(50% H9), 그룹 5에서 20마리 중 7마리의 동물(25% H9) 및 그룹 6에서 10마리 중 2마리의 동물(10% H9)을 조기에 종료하였다. 그룹 7(1% H9) 및 그룹 8(0.1% H9)에서는 거시적 기형종이 발생하지 않았다. H9 세포를 10% 미만으로 스파이킹한 일부를 주입한 그룹에서 조기 종료 사망은 없었다. 전체 데이터는 표 2.4.4.1.A: 기형종 형성의 발생률에 제시되어 있다. 예상한 바와 같이, 기형종은 더 높은 농도의 H9 세포를 스파이킹한 용액을 투여한 그룹에서 더 일찍 볼 수 있었다. 현미경적 검사는 모든 H9-스파이킹 처리 그룹에서 기형종의 용량-의존적 발생과 일치하였다. 현미경으로, 그룹 4 내지 그룹 6에 존재하는 기형종은 피부, 선, 연골 및/또는 뼈 형성과 같은 조직의 혼합물뿐만 아니라 신경 조직을 포함하여 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 3개의 배엽으로부터의 조직으로 구성되어 있다. 이러한 기형종은 형태 큰 덩어리를 형성하는 경향이 있다. 상대적으로, 그룹 7(1% H9를 스파이킹한 NR1; 20마리 중 4마리의 동물) 및 그룹 8(0.1% H9를 스파이킹한 NR1; 19마리 중 1마리의 동물)의 동물에서의 기형종은 더 작았고, 주로 맥락막-유사 형성, 뇌실막 상피 및/또는 거의 정상으로 보이는 백질의 팽출 영역이 있는 무작위로 나타나는 신경 조직의 작은 형성으로 구성되어 있었으며, 기형종의 특징으로 간주되는 3개의 배엽 모두로부터 유래되는 조직을 포함하지 않는다. H9-스파이킹 처리 그룹에서 육안으로 및/또는 현미경으로 관찰한 모든 기형종은 HuNu에 대해 양성으로 염색되었다. 뇌의 외부 또는 주입 부위에서 멀리 떨어진 기형종 형성의 증거는 임의의 H9-스파이킹 또는 임의의 NR1 완제 의약품-단독 처리 그룹에서 관찰되지 않았다.
이식 후 180일까지 처리 후 관찰 동안 H9 세포 단독을 뇌 또는 NR1 세포에 IC 투여하였을 때 또는 H9 세포를 스파이킹한 NR1 세포를 말초에 IM 주입하였을 때 인간 세포 또는 기형종은 검출되지 않았다. H9-처리한 그룹에서, 공동화가 뇌의 투여 부위에서 관찰되었으며, 이는 세포가 생존하거나 또는 생착하지 않았음을 시사하였다. 1×106의 용량으로 단독 투여하였을 때 뇌에서 H9 세포의 성장이 부족한 이유는 명확하지 않지만, 분명히 H9 생착은 지원하지 않았다. 이는 사용된 H9 세포 로트의 생존력 부족 때문은 아니었지만, 동일한 수의 H9 세포를 1×106개의 NR1 세포에 스파이킹하였을 때 그룹 5 내지 그룹 8에서 사용된 H9 세포의 수가 더 적었을 때와 마찬가지로 기형종을 형성하였다(그룹 4). 상이한 세포 배지인 40%가 아닌 30% Matrigel이 포함된 DMEM/F12 + 0.5% HSA 중 1×106개 H9 세포/동물을 IC 주입한 래트에서 처리 후 대략 50일까지 눈에 보이는 기형종이 발생하였다. 최대 1×107의 용량으로 IM-주입된 세포(NR1, H9 및 NR1 + H9)의 성장 부족은 IM 주입 부위에서 덜 허용적인 성장 환경으로 인한 것으로 보인다.
본 연구의 결과는 cGMP NR1 완제 의약품을 IC 주입을 통해 뇌의 실질에 최대 2×106개 세포의 용량으로 투여하는 것에 대해 내약성이 양호하였고, 동물 사망, 또는 국부 또는 전신 독성, 종양형성 또는 기형종 형성의 증거가 없었으며, NR1은 연구 기간 동안 생착하고 지속되어 투여 부위에 남아 있었고, 제형화된 완제 의약품인 NR1은 성장-촉진 Matrigel의 존재하에서도 180-일의 무처치 관찰 기간 동안 뇌 또는 임의의 말초 조직에서 최대 2×106개 NR1 세포/동물의 용량에서 기형종을 형성하지 않았으며, 사용된 무흉선 래트 모델은 H9 세포를 특정 농도로 NR1에 스파이킹하고 2000개의 H9 세포(NR1 용량의 0.1%)만큼 저용량으로 IC 주입하였을 때 기형종의 발생을 검출할 수 있었음을 보여주었다.
cGMP NR1 완제 의약품 단독(0.01% 미만의 잔여 H9 세포를 가짐)의 최대 2×106개 세포/동물의 용량을 사용한 치료는 세포 성장 가능성을 최대화하기 위해 40% Matrigel을 포함하는 세포 배지에 이식한 경우에도 6-개월의 연구 기간 동안 기형종을 형성하지 않았다. Matrigel은 뮤린 성장 인자를 포함하는 것으로 보고된 마우스 엥겔브레스-홀름-스웜 육종 세포로부터 유래되는 복합 단백질 혼합물이다. Matrigel은 설치류에서 인간 세포의 생존을 촉진하는 데에만 사용하였으며, 임상 NR1 완제 의약품 주입 배지에는 포함시키지 않을 것이다.
개요 및 결론
위에 요약한 바와 같이, 다수의 약리학, 체내분포 및 독성학 연구를 NR1 완제 의약품으로 수행하였다. 관련 연구 수행의 핵심은 관련 동물 모델을 사용하는 것이다. 사용된 모델(들)은 효능, 분포 및 독성을 평가하기에 충분한 수와 충분한 기간 동안 설치류에서 인간 NR1 세포의 생존을 지원해야 한다. 면역결핍성 또는 면역 억제된 설치류 모델을 사용하여 설치류 테스트 시스템에서 인간 NR1 완제 의약품의 거부 가능성을 최소화하였다. 구체적으로, 약리학 연구의 경우 효능을 가장 잘 판단하기 위해, 동물 모델 및 실험 조건은 치료 방식 및 경로, NR1 활성에 대한 표적 및 인간 피험자와 관련된 방법 및 종점을 사용한 결과의 측정을 포함하여 가능한 한 인간 집단의 임상 상태를 유사하게 복제하여야 한다. 체내분포 연구의 경우, 모델은 또한 인간 피험자의 허혈성 피질하 뇌졸중을 포함한 임상 상태를 가능한 한 유사하게 모방하여야 하며, 즉, 뇌졸중이 있는 뇌에서의 NR1 분포에 대한 적절한 평가를 제공하기 위해서는 뇌졸증이 있는 동물을 사용하여야만 한다. 독성학 연구의 경우, 동물 모델은 NR1의 일반적인 독성을 평가할 수 있어야 하며, 이 줄기 세포-유래 세포 요법의 경우에는 줄기 세포-관련 기형종 및 종양의 성장 및 발달을 지원하는 동물 모델이 가능하여야 한다. 독성, 종양형성 및 기형종 형성의 평가에 대한 뇌졸중의 교란 효과 가능성을 피하기 위해, 독성학 모델은 미경험, 즉, 뇌졸중이 없는 동물이어야 한다.
동물 모델
약리학: 사용된 1차 모델은 면역 억제된 스프래그-다우리 래트의 허혈성 피질하 뇌졸중(ISS)의 중간 대뇌동맥 폐색 모델이었다. 이는 뇌졸중 분야에서 일상적으로 사용되는 잘 특성화된 비임상 모델이며, 만성 ISS가 있는 환자의 제안된 NR1 표적 임상 적응증에 가장 근접한 일치를 제공한다. 면역 억제된 스프래그-다우리 래트의 ISS의 이 중간 대뇌동맥 폐색 모델을 사용하여 급성(뇌졸중 후 제7일에 NR1 처리) 및 만성 환경(뇌졸중 후 제28일에 NR1 처리)에서 NR1 처리의 효과를 평가하였으며, 총 연구 기간은 3개월이었다. 또 다른 임상적으로 관련 동물 모델인 원위 중간 대뇌동맥의 폐색을 통해 허혈성 피질 뇌졸중(ICS)을 발생시킨 면역결핍성 무흉선 래트에서 지원 효능 연구를 수행하였다.
체내분포: 뇌졸증이 있는 동물에서 IC-주입된 NR1 세포의 지속성 및 이동의 가장 완전한 평가를 제공하기 위해 만성 뇌졸중이 있는 인간 피험자의 임상 상태를 가장 잘 모델링하는 면역 억제된 스프래그-다우리 래트의 ISS 모델에서 GLP 체내분포 연구를 또한 수행하였다.
독성학: NR1 생존 및 기형종의 성장 및 발달 가능성을 최대화하기 위해 Matrigel의 존재하에 면역결핍성 무흉선 래트에서 GLP 독성학 연구를 수행하였다. Matrigel은 뮤린 성장 인자를 포함하는 것으로 보고된 마우스 엥겔브레스-홀름-스웜 육종 세포로부터 유래되는 복합 단백질 혼합물이다(Hughes et al., 2010). H9 hESC를 주입한 처리 그룹을 포함시켜 무흉선 래트 모델이 기형종의 발생을 지원할 수 있으며 매우 낮은 수준의 오염된 hESC를 검출하기에 충분한 수준의 민감도를 가짐을 확인하였다. 추가적으로, 연구는 기형종이 발생하는 경우 기형종이 발생할 시간을 허용하기에 충분한 기간(180일) 동안 수행하였다.
동물 모델에서 NR1 세포의 생존(지속성). 모델에서 NR1 세포의 지속성은 인간 활동, 분포 및 독성에 대한 정확한 예측을 얻기 위해 중요하다. NR1 세포 생존 및 지속성을 개선하기 위해 다음의 접근법을 취하였다:
정확한 동물 모델을 선택하는 첫 번째 단계에서, 상이한 면역결핍성 설치류 모델에서 NR1 생존을 비교하였다. 이 연구에서는 성체 및 신생아 무흉선 래트와 성체 NSG 마우스를 비교하였다. 가장 높은 세포 생존률 및 지속성을 면역결핍성 성체 무흉선 래트에서 측정하였으며, 이를 지속성을 개선하기 위한 추가 테스트 접근법에 사용하였다.
다음으로, 인간-기원 NR1 세포 생존을 개선하기 위한 노력으로 성체 무흉선 래트에서 특정 면역 세포 집단을 고갈시켰다. CNS에서 대식세포로 작용하는 미세아교세포의 수는 파일럿 연구에서 40% 내지 50% 고갈되었지만, 이러한 감소가 NR1 지속성을 증가시키지는 않았다. 유사하게는, 자연 살해 세포 수의 최대 80% 내지 90%의 고갈도 NR1 세포 지속성에 영향을 미치지 않았다. 후속 연구에서는 두 가지 접근법은 모두 사용하지 않았다.
마지막으로, 세포 주입 배지에 Matrigel을 포함시키는 것의 효과를 평가하였다. 파일럿 연구는 Matrigel이 성체 무흉선 래트에서 장기 NR1 세포 생존을 상당히 개선함을 보여주었다. 따라서, NR1 생존 및 성장을 개선시키기 위해 독성학 연구에서 주입 배지에 Matrigel을 포함시켰다. 이는 교란 효과의 가능성 때문에 약리학 및 분포 연구에는 사용하지 않았다.
NR1의 존재를 확인하기 위해 중추적 GLP 체내분포 및 독성학 연구에서 동물 모델에서 세포 지속성을 측정하였다. 약리학 연구에서, NR1 처리의 긍정적인 효과에도 불구하고, 뇌에 NR1 세포가 존재한다는 증거는 없었다. 그러나, 1차 약리학 연구에서 사용된 동일한 모델인 ISS 뇌졸중 모델에서의 GLP 체내분포 연구에서, IHC 및 qPCR 방법을 사용하여 투여 후 45일 동안 적은 수의 NR1 세포의 지속성이 검출되었다. 연구 소견의 차이는 아마도 세포 지속성을 측정하기 위한 조직 샘플이 다른 종점에 대한 중요한 조직이 수확된 후에만 수집되는 약리학 연구와 비교하여 체내분포 연구에 사용된 더 나은 샘플 보존 및 더 민감한 검출 방법과 관련이 있을 것이다. 체내분포 연구의 결과는 테스트 시스템에서의 NR1 세포의 장기 지속성을 정확하게 보여준다. Matrigel의 존재하에 성체 무흉선 래트에서의 세포 지속성은 여러 파일럿 연구 및 GLP 독성학 연구에서 나타났다. 후자의 연구에서 IHC 및 qPCR 검정은 Matrigel의 존재하에 처리 후 180일 동안 미경험 무흉선 래트에서 NR1 세포의 지속성을 보여주었다.
결론적으로, 지속성 연구 결과는 가변적이기는 하지만, NR1 세포가 IC 주입 후 수개월 동안 그리고 무흉선 래트 모델에서 6개월 동안 지속됨을 보여주는 증거력을 제공한다.
기형종의 검출. NR1 완제 의약품의 잠재적 유해 효과에 대한 적절한 평가를 제공하기 위해, 독성학 모델은 줄기 세포-유래 기형종의 발생을 지원할 수 있어야 한다. Matrigel을 포함시킨 성체 무흉선 래트 모델이 기형종을 검출할 수 있는지 확인하기 위해, GLP 독성학 연구에서 선택된 처리 그룹에 총 NR1 세포 용량의 0.1% 내지 50%로 구성된 미리 지정된 수준의 H9 hESC를 스파이킹한 NR1 세포의 혼합물을 IC 주입하였다. 이식 후 제28일에 기형종은 검출되지 않았지만, 처리 후 제180일까지 50% H9-스파이킹 용량으로 처리한 동물의 최대 2/3에 영향을 미치는 용량-관련 기형종의 발생이 관찰되어 무흉선 래트 모델이 기형종의 발생 지원 요건을 충족함을 확인하였다.
NR1 독성의 측정. 여러 면역력이 저하된 실험실 설치류 모델에 대한 파일럿 독성학 연구로부터의 결과는 기형종의 형성을 포함하여 독성을 완전히 평가하는 데 필요한 연장된 NR1 세포 생존을 입증함으로써 GLP 독성학 평가를 위한 최적의 모델로서 무흉선 래트 모델을 선택하도록 안내하였다. Matrigel을 세포 주입 배지에 포함시킨 성체 무흉선 래트 모델은 향상된 NR1 생존 및 지속성을 보여주었다. 이 연구의 주요 종점은 NR1의 일반적인 독성의 평가, 뇌에서 NR1 지속성의 확인, 치료 부위에서 이의 이동 부족의 입증 및 기형종 유발 가능성의 평가뿐만 아니라 다른 독성학 종점이었다.
일반적인 독성. 최대 2×106개의 NR1 세포 IC 또는 1×107개의 세포 IM 용량의 NR1은 내약성이 양호하였다. 예상치 못한 사망, 임상 소견, 체중 또는 음식 소비의 변화, 임상 병리학 또는 골수 종점 또는 육안 및 현미경적 관찰에서의 변화는 없었다. NR1-관련 조기 사망은 없었고, NR1은 투여 후 180일 동안 내약성이 양호하였다.
세포 지속성 및 이동. NR1은 뇌내 투여 부위에서 뇌의 다른 영역 또는 말초 조직에 분포하거나 또는 이로 이동하지 않았다. 민감한 IHC 및 qPCR 평가는 180-일의 연구 기간 동안 적은 수의 NR1 세포의 장기 생존을 확인하였다.
기형종 형성. NR1 완제 의약품만으로 처리한 임의의 래트의 뇌 또는 말초 조직에서 기형종은 검출되지 않았다. 총 100마리의 무흉선 래트에 동물당 최대 2×106개의 NR1 세포를 주입하고, 이식 후 최대 6개월 동안 추적 관찰하였다. 모델은 NR1과 H9 세포의 준비된 혼합물 내 낮은 0.1% H9 세포(2×106개 NR1 세포/동물의 용량에 2000개의 H9 세포가 첨가됨)의 H9 스파이킹 수준에서 기형종을 검출할 수 있었다. NR1 완제 의약품은 0.01% 미만의 H9 세포를 포함하는 것으로 나타났다.
이 연구의 결과는 NR1 완제 의약품이 고용량에서 내약성이 양호하였고, 뇌내 투여 부위에서 이동하지 않았으며, 연구 기간 동안 주입 부위에 지속되었고, 투여 후 최대 180일 동안 기형종의 발생을 유발하지 않았음을 보여주었다.
효능의 측정 및 작용 메커니즘
효능 측정. NR1 처리는 다수의 평가에 의해 측정되고 잘 알려진 측정 기기에서 긍정적인 결과로 반영된 바와 같이 뇌졸중이 있는 면역 억제된 SD 래트에서 감각운동 기능의 부분적 회복을 가져왔다:
효능의 1차 입증은 ISS의 중간 대뇌동맥 폐색 모델(USF-1)을 사용하여 사이클로스포린-면역 억제된 스프래그-다우리(SD) 래트에서 수행하였다. 여기서, NR1의 IC 이식은 일반적인 운동 행동, 신경학적 기능 및 운동 협응의 회복을 촉진하였다. 테스트 전반에 걸친 기능 회복의 시작은 이식 후 2개월에 발생하였으며, 이식 후 적어도 3개월까지 지속되었다.
지지 연구 결과는 무흉선 래트의 ICS 모델(스탠포드-5)에서 관찰되었으며, 이는 다음과 유사한 결과를 나타내었다: NR1 세포의 IC 이식은 여러 성능 측정 기기에 의해 평가된 바와 같이 감각운동 기능을 개선시켰다. 처리 후 제4주에 처음 나타난 개선은 투여 후 제8주에 동물의 안락사(animal termination) 때까지 지속되었다.
작용 메커니즘. 연구는 NR1 세포의 활성이 다음과 같이 부분적으로 면역조절 기능 및 활성 조절 인자의 분비의 NR1-관련 자극과 관련이 있음을 시사하는 증거를 제공한다: 감소된 경색 주변 미세아교세포/면역 세포 활성화와 NR1-관련 기능 회복의 향상 사이의 연관성을 시사하는 약리학 연구의 조직학적 평가.
주로 자극되지 않은 그리고 M1-/M2-자극된 대식세포를 모두 유익한 M2/항-염증성 상태로 유도하는 분비 인자에 의한 대식세포의 M1/전염증성 상태에서 M2/항-염증성 상태로의 NR1-관련 분극화를 나타내는 증거.
NR1-처리한 뇌졸중이 있는 래트가 비히클-처리된 동물 및 대조군 래트보다 더 활성화된 대식세포/미세아교세포를 나타냄을 정성적으로 입증하는 IHC 분석.
NR1의 광범위한 면역조절 효과를 암시하는 이식 부위 근처 및 더 멀리 떨어져 있지만 연결된 뇌 영역 모두에서 비히클-처리한 래트와 비교하여 NR1-처리한 래트에서 증가된 면역 세포 활성을 보이는 뇌졸중이 있는 래트에서의 TSPO-PET 이미징.
세포외 기질(ECM) 리모델링(대부분의 뇌 복구 메커니즘에 관여함) 및 염증과 축색돌기 유도와 관련된 다른 프로세스를 포함하여 뇌 복구와 관련된 상위 20개의 많은 프로세스를 사용한 분비된 단백질을 암호화하는 175개의 고도로 발현된 유전자를 확인하는 세크레톰 TRAP 분석. 배양된 NR1의 TRAP/RNAseq 분석은 NR1-관련 뇌졸중 회복에 중요한 생물학적 프로세스를 가진 분비된 인자를 암호화하는 400개 이상의 유전자를 확인하였다: 염증(162개의 유전자, 그 중 144개의 유전자는 사이토카인 활성과 관련된 단백질을 코딩함) 및 ECM 조직화(65개의 유전자). 생체내에서 확인된 관심 유전자 중, NRG3 및 TGFb3은 뇌졸중 환경에 반응하여 상향 조절되었다.
NR1 이식이 이식 후 제7일에 살아있는 뇌 절편의 경색 주변 피질층에서 운동 회로 활동을 상당히 증가시켰음을 보여주는 뇌 가소성 연구. NR1 세포로 처리된 동물로부터의 뇌는 성체 신경 전구세포 증식, 신경 분화, 뉴런의 전기생리학적 특성에 직접 관여하는 개폐형 채널, 축색돌기 유도, 축색돌기 형성 및 시냅스생성을 자극하는 것으로 알려진 약 300개의 유전자를 차별적으로 발현하였다.
조사 연구는 NR1의 작용 메커니즘에서 경색 주변 영역의 가소성에 기여하는 조절 인자의 NR1 세포에 의한 분비를 통한 면역조절 효과를 강하게 시사한다. 증거는 생체내에서 면역 기능에 영향을 미치며 뇌 가소성을 자극하는 것으로 알려진 유전자의 부분적으로 증가된 발현을 통한 염증 및 세포외 기질의 조직화를 포함하는 뇌졸중 회복에 중심적인 것으로 여겨지는 과정의 자극으로 인해 이러한 효과가 있음을 시사한다.
체내분포
GLP 체내분포 연구는 만성 뇌졸중이 있는 인간 피험자의 임상 상태를 가장 잘 모델링하기 위해 ISS의 중간 대뇌동맥 폐색 모델을 사용하여 면역 억제된 스프래그-다우리 래트에서 수행하였다. 1차 효능 연구에서 사용된 치료 용량 및 시점을 중복하여 래트를 NR1으로 처리하였다. NR1 gDNA에 대한 민감하고 검증된 실시간 qPCR 검정 및 인간 항-핵 항체 HuNu를 이용한 조직의 IHC 염색을 사용하여 뇌 및 신경 축, 말초 조직 및 전체 병변에서 NR1 세포를 정량화하였다. 최대 4×105개 세포/동물의 용량에서 NR1 세포는 급성 및 만성 뇌졸중 동물에서 뇌의 피질 및 선조체에 이식 후 적어도 45일 동안 뇌 내에서 지속되었다. NR1 세포는 투여 부위의 외부 영역에서 검출되지 않았으며, 뇌의 인접한 영역 또는 말초 조직으로 이동하지 않았다.
결론
면역 억제된 스프래그-다우리 래트의 허혈성 피질하 뇌졸중(ISS) 모델에서 NR1 처리는 여러 잘 알려진 측정 기기에서 긍정적인 결과로 반영된 바와 같이 감각운동 기능의 부분적 회복을 촉진한다. 회복의 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았지만, NR1 처리 후 관찰된 부분적 및 잠재적으로 완전한 기능 회복과 상관관계가 있는 면역 세포 활성화의 치료-관련 감소를 포함하여 면역조절 기능에 적어도 부분적으로 관련이 있는 것으로 보인다. 연구는 NR1이 생체내에서 면역조절 인자의 분비를 통한 염증 및 세포외 기질의 조직화를 포함하여 뇌졸중 회복에 중요한 과정의 자극을 통해 작용함을 시사한다. NR1 세포 지속성 연구는 NR1 세포가 뇌내(IC) 주입 후 장기간 동안 뇌에 존재함을 보여주었으며, 이는 약리학 연구에서 관찰된 감각운동 기능의 개선과 상관관계가 있지만 뇌내 주입 부위에서 NR1 세포의 이동은 없었다. 독성학 연구는 NR1 완제 의약품(0.01% 미만의 H9 세포를 포함하는 것으로 나타났음)의 IC 이식이 동물의 사망을 초래하지 않았고, 치료 부위에서 세포가 이동하지 않았으며, NR1 세포 단독 주입 후 성장-촉진 Matrigel을 주입 배지에 포함시켰음에도 불구하고 NR1 세포 단독으로 처리한 후 6개월 동안 전신 독성 또는 기형종 형성을 초래하지 않는다는 것을 확립하였다.
요약하면, NR1 완제 의약품은 인간 피험자에서 투여당 148×106개의 세포로 추정되는 최대 2×106개 세포/동물의 용량에서 내약성이 양호하였으며, 뇌내 투여 부위에서 이동하지 않았고, 주입 부위에서 수개월 동안 지속되었으며, 내약성이 양호하였고, 기형종 또는 종양을 발생시키지 않았다.
실시예 3
허혈성 뇌졸중 모델에서 NR1 신경 전구세포(NPC)의 신경 이식
동물 요건
종: 래트
연령/체중: 2개월령/250g 내지 300g
성별: 수컷
계통: 스프래그-다우리 래트
동물의 수: 연구에 등록된 95마리의 성체 수컷 래트
면역억제 양생법: 래트에 세포 이식 2일 전 및 그 후 1주 동안 매일 사이클로스포린 A(20 mg/㎖, 산디뮨(Sandimmune), 노바티스 파마슈티칼스(Novartis Pharmaceuticals), 멸균 생리 식염수에 희석)를 i.p. 주사하여 면역억제시켰다. 그 후, 경구용 사이클로스포린을 안락사 때까지 음용수(멸균 탈이온수)에 210 mg/㎖로 사용하였다.
이 연구는 성인 허혈성 뇌졸중의 동물 모델에서 NR1 NPC(스탠포드 대학 제공)의 뇌내 이식의 잠재적 치료 가치를 평가하기 위해 설계하였다. 뇌졸중 후 제7일 또는 제28일에 두 가지 용량 수준의 세포로 이식을 수행하고, 이식 후 후속 3-개월 기간 동안 수행된 행동 및 조직학적 결손의 기능적 판독을 수행하였다. 본 발명자들은 기준선(뇌졸중 전), 뇌졸중(이식 전) 후 제7일 또는 제28일 및 이식 후 월간 간격으로 다시 운동 및 신경학적 성능을 특성화하였다. 이식 후 3개월에 행동 테스트를 완료한 후, 동물을 경심장 관류로 안락사시키고, 뇌를 수집하고, 조직학적 검사를 위해 스탠포드 대학으로 발송하였다(스캔된 문헌[Logbook, pages 57-61] 참조). 1차 종점은 뇌졸중 후 제7일 또는 제28일에 NR1 NPC의 뇌내 이식이 신체 거상 스윙 테스트(EBST)에서 통계적 개선을 나타낸 바와 같이 행동 회복을 개선하였다는 것이다. 2차 종점은 뇌졸중 후 제7일 또는 제28일에 NR1 NPC의 뇌내 이식이 신경학적 검사 및 로타로드 테스트에서 통계적 개선을 나타낸 바와 같이 행동 회복을 개선하였다는 것이다.
테스트 및 대조군 물품
테스트 물품. 시티 오브 호프에서 GMP하에 제조된 18회 계대 세포인 NR1 NPC(배취 번호 1299-128-0002).
대조군(비히클). 0.5% 인간 혈청 알부민(HSA)(탈레크리스 바이오테라퓨틱스, 인크.(Talecris Biotherapeutics, Inc.) cat #13533-684-20, lot# 26NJ6H1)을 포함하는 Plasmalyte-A(박스터(Baxter) cat# 2B2544, lot# C878264).
실험 설계
1. 처리 조건은 표 4에 나타나 있다.
총 100마리의 동물(90마리의 연구 동물과 10마리의 예비 동물)에게 MCAo 뇌졸중을 유발하였다. 95마리의 동물을 생전 연구에 등록하였으며; 모든 뇌졸중 동물을 그룹 A 내지 그룹 F에 무작위로 할당하고, 뇌졸중 후 제7일 또는 제28일에 처리하였다. 동물의 일반적인 건강을 매주 임상 관찰 및 체중 기록으로 모니터링하였다. 이식 후 3개월에 4% 파라폼알데하이드를 이용한 경심장 관류에 의해 동물을 안락사시켰다.
결과 측정: 이식 결과를 다음 매개변수를 사용하여 평가하였다: 1) 신체 거상 스윙 테스트(EBST), 로타로드를 통한 운동 행동 및 신경학적 검사를 통한 신경학적 성능. 이러한 행동 테스트를 USF에서 수행하였다; 2) 니슬(Nissl)/H&E 조직학적 염색을 통한 경색 부피; 3) 인간 세포를 검출하는 것으로 나타난 특정 항체를 사용한 면역조직화학을 통한 이식 생존; 및 4) 경색 주변 영역에서 혈관신생, 변경된 염증성 반응 및 숙주 세포 생존의 예비 메커니즘-기반 면역조직화학 분석. 결과 검정 #2, #3 및 #4의 경우, 이들은 스탠포드 대학에서 수행하였다.
세포 이식 결과의 매개변수
실험 절차
MCAo 뇌졸중 수술: 모든 수술 절차는 무균 상태에서 수행하였다. 동물 1.5% 아이소플루오레인으로 마취시키고, 통증 반사를 확인할 것이다. 깊은 마취하에, 동물에 MCAo 수술을 하였다. MCA 봉합사 기법은 경동맥을 통해 필라멘트를 삽입하여 MCA의 접합부에 도달하게 하여 총경동맥뿐만 아니라 대뇌 동맥륜(circle of Willis)으로부터의 혈류를 차단하는 것을 포함한다. 복측 정중선 경부 절개를 통해 오른쪽 총경동맥을 확인하고 단리하였다. 봉합사 크기는 4-0으로 멸균된 비흡수성 봉합사(에티콘, 인크. (Ethicon, Inc.))로 만들었으며, 봉합사 끝의 직경은 고무 시멘트를 사용하여 24-게이지 내지 26-게이지 크기로 가늘어지게 하였다. 외경동맥과 내경동맥의 접합부로부터 약 15㎜ 내지 17㎜의 필라멘트를 삽입하여 MCA를 차단하였다. 오른쪽 MCA를 1시간 동안 폐색시켰다. 본 발명의 연구 및 여러 연구에 기초하면, MCA의 1-시간 폐색은 최대 경색을 초래한다. 또한, 봉합사 끝의 길이 및 크기는 250g 내지 350g 체중의 동물에서 완전한 MCA 폐색을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 히팅 패드 및 직장 직장 온도계로 정상 범위 내로 체온을 유지시켰다. 성공적인 폐색 및 재관류를 결정하기 위해, 레이저 도플러를 사용하였다. 레이저 도플러 프로브로 폐색 이전, 도중 및 이후의 대뇌 혈류를 측정하였다. 레이저 도플러에 의해 나타난 바와 같이 MCA 폐색 기간 동안 80% 초과의 대뇌 혈류 감소를 나타낸 동물만을 후속 절차(즉, 이식)에 포함시켰다. 다른 모든 동물은 연구로부터 즉시 제외하였다. 동물은 건강 관찰 및 체중에 기초한 인도적 이유로도 동물을 제외(즉, 안락사)하였다(n=8은 뇌졸중 수술 중 사망). 마지막으로, 다음과 같이 처리 그룹에 대한 샘플링을 통해 동물을 무작위로 처리 그룹에 할당하였다: 각 수술일에 적어도 15마리의 동물이 성공적인 MCA 폐색(80% 초과의 대뇌 혈류)을 나타내었고; 적어도 15마리의 동물에게 시점 뇌졸중 후 사전 설정된 시점(제7일 또는 제28일)에 이식을 하였고; 각 이식일에, 5마리의 동물을 고용량의 NR1 NPC에 무작위로 할당하고, 5마리의 동물을 저용량의 NR1 NPC에 무작위로 할당하고, 5마리의 동물을 비히클에 무작위로 할당하였다. 모든 그룹의 래트를 세포 또는 비히클 이식 2일 전에 면역억제시키고, 그 후 1주 동안 매일 사이클로스포린 A(20 mg/㎖, 산디뮨, 노바티스 파마슈티칼스)을 i.p. 주사하였다. 그 후, 경구 사이클로스포린을 안락사 때까지 음용수에 210 mg/㎖로 사용하였다.
동물을 연구 과정 동안 일반적인 건강에 대해 매주 관찰하였다. 치료 시작 시, 연구 동안 매주 및 연구 종료 시 체중을 기록하였다.
이식 절차: 하루에 15마리의 동물에 이식을 하였다. 모든 수술 절차는 무균 상태에서 수행하였다. 동물을 1.5% 아이소플루오레인으로 마취시켰다. 일단 깊은 마취가 이루어지면(통증 반사의 확인에 의해), 수술 부위의 오염을 방지하기 위해 충분한 경계부로 외과적 절개 영역(두개골 영역) 주변의 털을 깎은 다음, 수술 부위를 2회 살균 스크럽하고, 멸균 수술포로 방포하였다. 그런 다음, 동물을 입체 정위 장치(stereotaxic apparatus)(코프 인스트루먼츠(Kopf Instruments))에 고정시켰다. 그런 다음, 26-게이지 Hamilton 701 마이크로시린지 니들을 작은 구멍이 뚫린 두개골 개구부로 내렸다(이식 좌표는 선조체와 일치하도록 조정함: 정수리점(bregma)을 기준으로 앞쪽으로 0.5㎜ 그리고 측면으로 2.8㎜ 및 경막 표면 아래 5.0㎜, 4.0㎜ 및 3.0㎜; 문헌[the atlas of Paxinos and Watson, 1998]을 기반으로 함). 이 단일 바늘 천자 내에, 선조체에 2개 및 피질에 1개를 포함하여 3개의 테스트 물품의 침착이 이루어졌다(위에 언급한 바와 같이: 경막 표면 아래 5.0㎜, 4.0㎜ 및 3.0㎜). 표적 영역은 유사한 입체 정위 임플란트에 대해 이전에 확립된 표적 부위를 기반으로 허혈성 경색 주변(또는 반음영부(penumbra)) 영역에 해당하는 내측 선조체 및 내측 피질이었다(Yasuhara et al., Stem Cells and Dev, 2009). 각 침착물은 3분에 걸쳐 주입되는 3㎕의 부피(예를 들어, 400,000개의 세포 용량이 9㎕의 총 부피로 주입됨)로 구성되었다. 추가적인 2-분의 흡수 시간 후, 니들을 빼내고, 상처를 스테인리스 스틸 상처 봉합용 클립으로 봉합하였다. 히팅 패드 및 직장 직장 온도계로 수술 내내 그리고 마취에서 회복된 후에도 체온을 약 37℃로 유지하였다.
행동 및 신경학적 테스트: 테스트 동물을 테스트하는 모든 조사자는 처리 조건에 대해 맹검이었다. 동물에 신체 거상 스윙 테스트(EBST), 신경학적 검사 및 로타로드를 수행하였다. 이러한 테스트는 편측성 뇌졸중 수술에 의해 발생한 운동/감각 결손의 민감한 검정으로 나타났다. EBST는 꼬리로 동물을 핸들링하고 스윙의 방향을 기록하는 것을 포함하였다. 테스트 장치는 투명한 플렉시글라스 상자(Plexiglas box)(40×40×35.5㎝)로 구성하였다. 동물의 꼬리 밑부분에서 부드럽게 들어 올려 동물의 코가 표면에서 2인치(5㎝) 높이에 올 때까지 꼬리로 들어올렸다. 동물의 머리가 몸의 정중선 위치에서 대략 10도 옆으로 움직이면, 왼쪽 또는 오른쪽 스윙의 방향을 세었다. 1회 스윙 후, 동물을 플렉시글라스 상자에 다시 넣고, 재 테스트 전 30초 동안 자유롭게 움직이게 하였다. 이러한 단계를 각 동물에 대해 20회 반복하였다. 일반적으로, 손상되지 않은 래트는 50%의 스윙 편향, 즉, 왼쪽과 오른쪽으로 동일한 수의 스윙을 나타낸다. 75%의 스윙 편향은 20회의 시험 동안 한 방향으로 15회 스윙 그리고 다른 방향으로 5회 스윙을 나타낼 것이다. 본 발명자들은 이전에 EBST를 활용하였으며, 병변이 있는 동물이 흑질선조체 병변 후 1개월에 75% 초과의 편향된 스윙 활동을 나타내며; 비대칭성은 최대 6개월 동안 안정적이라는 점에 주목하였다. EBST 약 1시간 후, 약간의 수정을 거친 이전에 설명한 절차에 따라 신경학적 검사를 수행하였다. 다음을 포함하는 3가지 테스트를 사용하여 각 래트에 대한 신경학적 점수를 얻었다: (1) 앞다리 오므리기(forelimb retraction), 앞다리를 측면으로 2㎝ 내지 3㎝ 움직인 후 앞다리를 교체하는 동물의 능력의 능력을 측정하며, 0(즉시 교체)에서 3(몇 초 후 교체 또는 교체 없음)으로 등급을 매김; (2) 가로대 걷기 능력(beam walking ability), 폭 2.4-㎝, 길이 80-㎝의 가로대를 쉽게 횡단하는 래트의 경우 0에서 가로대에서 10초 동안 머물 수 없는 래트의 경우 3으로 등급을 매김; 및 (3) 양측 앞발 잡기(bilateral forepaw grasp), 2-㎜-직경의 강철 막대를 잡을 수 있는 능력을 측정하며, 정상적인 앞발 잡기 행동을 하는 래트의 경우 0에서 앞발로 잡을 수 없는 래트의 경우 3으로 등급을 매김. 각 평가일에 약 15분 동안 수행한 모든 3가지 테스트로부터의 점수를 더하여 평균 신경학적 결손 점수를 얻었다(가능한 최대 점수, 9점을 3개의 테스트로 나눈 값 = 3). 신경학적 테스트 후, 동물을 로타로드에서 테스트하였으며, 이는 로타로드 실린더에 래트를 배치하는 것을 포함하였다. 동물이 로타로드에 남아 있는 시간을 측정하였다. 속도는 60초 내에 4rpm에서 40rpm으로 천천히 증가하였다. 시험은 동물이 가로대에서 떨어지거나 또는 장치를 잡고 2회 연속 회전하며 돌면 종료하였다. 동물을 뇌졸중 유발 전 3일 동안 트레이닝하였다. 장치에서의 최대 지속 시간(초 단위)를 뇌졸중 유발 1일 전(기준선) 3회의 로타로드 측정으로 기록하였다. 동물에게 기준선(뇌졸중 전)에서, 뇌졸중 후 제7일 및 제28일(이식 전)에 그리고 이식 후 이후 3개월 동안 매달 간격으로 3가지의 테스트를 모두 수행하였다.
조직학: 이식 후 3개월 후, 동물을 안락사시키고, 뇌를 수집하고 조직학적 검사를 위해 스탠포드 대학으로 발송하였다.
통계적 분석: 연구 완료 시, 평균 행동 데이터를 계산하고, 다른 처리 그룹과 비교하였다. 다중 비교 ANOVA 및 Bonferonni 사후 분석을 사용하여 처리 그룹을 대조군(비히클 투여)과 비교하기 위해 통계적 분석을 수행하였다.
결과
도 4에 도시된 바와 같이, NR1 NPC의 뇌내 이식은 EBST에 의해 나타난 바와 같이 운동 기능장애를 개선한다. ANOVA에 의하면 처리(p<0.0001) 및 시험(p<0.0001)의 주요 효과뿐만 아니라 상호작용 효과(p<0.0001)도 유의한 것으로 나타났다. 그룹 내 비교는 비히클 단독(C, F)을 주입받은 뇌졸중 동물이 뇌졸중 후 상당한 운동 결함을 나타내며 3-개월 연구 기간 동안 지속됨을 보여주었다(기준선 대비 p<0.005). 대조적으로, NR1 NPC(A, B, D, E)를 주입받은 뇌졸중 동물도 뇌졸중 후 및 이식 후 1개월에 운동 장애를 나타내었지만(기준선 대비 p<0.005), 그 후 이식 후 2개월 및 3개월에 시작하여 운동 기능의 회복을 보여주었다(뇌졸중 후 대비 p<0.005). 이러한 이식된 뇌졸중 동물은 이식 후 2개월 및 3개월에 회복되었지만, 기준선과 비교하여 손상된 상태를 유지하였다(p<0.005). 그룹 간 비교는 모든 그룹이 기준선에서 유사한 운동 기능을 보였으며, 또한 뇌졸중 후 및 이식 후 1개월에 유사한 운동 장애를 나타내었음을 보여주었다. 그러나, 이식 후 2개월 및 3개월에, NR1 NPC(A, B, D, E)를 주입받은 뇌졸중 동물은 비히클-주입된 뇌졸중 동물(C,F)과 비교하여 운동 행동에 있어서 유의한 개선을 나타내었다(p<0.0033). 일반적으로, 뇌졸중의 급성 및 만성기에서의 이식과 저용량 및 고용량의 세포는 모두 운동 기능의 회복을 상당히 촉진하였지만, 만성기에서 그리고 고용량의 이식이 가장 최적의 이식 양생법인 것으로 나타났다(E 대 A, B 또는 D 간의 비교 참조, p<0.0033).
도 5. NR1 NPC NSC의 뇌내 이식은 신경학적 테스트에 의해 나타난 바와 같이 신경학적 장애를 약화시킨다. ANOVA에 의하면 처리(p<0.0001) 및 시험(p<0.0001)의 주요 효과뿐만 아니라 상호작용 효과(p<0.0001)도 유의한 것으로 나타났다. 그룹 내 비교는 비히클 단독(C,F)을 주입받은 뇌졸중 동물이 뇌졸중 후 상당한 신경학적 결손을 나타내며 3-개월 연구 기간 동안 지속됨을 보여주었다(기준선 대비 p<0.005). 대조적으로, NR1 NPC(A, B, D, E)를 주입받은 뇌졸중 동물도 뇌졸중 후 및 이식 후 1개월에 신경학적 기능장애를 나타내었지만(기준선 대비 p<0.005), 그 후 이식 후 2개월 및 3개월에 시작하여 신경학적 기능의 회복을 보여주었다(뇌졸중 후 대비 p<0.005). 이러한 이식된 뇌졸중 동물은 이식 후 2개월 및 3개월에 회복되었지만, 기준선과 비교하여 손상된 상태를 유지하였다(p<0.005). 그룹 간 비교는 모든 그룹이 기준선에서 유사한 신경학적 기능을 보였으며, 또한 뇌졸중 후 및 이식 후 1개월에 유사한 신경학적 장애를 나타내었음을 보여주었다. 그러나, 이식 후 2개월 및 3개월에, NR1 NPC(A, B, D, E)를 주입받은 뇌졸중 동물은 비히클-주입된 뇌졸중 동물(C,F)과 비교하여 신경학적 성능에 있어서 유의한 개선을 나타내었다(p<0.0033). 뇌졸중의 급성 및 만성기에서의 이식과 저용량 및 고용량의 세포는 모두 신경학적 결과를 개선하는 데 있어서 이들 사이에 유의한 차이는 없었다(p>0.0033).
도 6: NR1 NPC의 뇌내 이식은 로타로드 테스트에 의해 나타난 바와 같이 운동 협응의 회복을 촉진한다. ANOVA에 의하면 처리(p<0.0001) 및 시험(p<0.0001)의 주요 효과뿐만 아니라 상호작용 효과(p<0.0001)도 유의한 것으로 나타났다. 그룹 내 비교는 비히클 단독(C,F)을 주입받은 뇌졸중 동물이 뇌졸중 후 운동 협응에 상당한 결손을 나타내며 3-개월 연구 기간 동안 지속됨을 보여주었다(기준선 대비 p<0.005). 대조적으로, NR1 NPC(A, B, D, E)를 주입받은 뇌졸중 동물도 뇌졸중 후 및 이식 후 1개월에 손상된 운동 협응을 나타내었지만(기준선 대비 p<0.005), 그 후 이식 후 2개월 및 3개월에 시작하여 운동 협응의 회복을 보여주었다(뇌졸중 후 대비 p<0.005). 이러한 이식된 뇌졸중 동물은 이식 후 2개월 및 3개월에 회복되었지만, 기준선과 비교하여 손상된 상태를 유지하였다(p<0.005). 그룹 간 비교는 모든 그룹이 기준선에서 유사한 운동 협응을 보였으며, 또한 뇌졸중 후 및 이식 후 1개월에 운동 협응에 있어서 유사한 장애를 나타내었음을 보여주었다. 그러나, 이식 후 2개월 및 3개월에, NR1 NPC(A, B, D, E)를 주입받은 뇌졸중 동물은 비히클-주입된 뇌졸중 동물(C,F)과 비교하여 운동 협응에 있어서 유의한 개선을 나타내었다(p<0.0033). 일반적으로, 뇌졸중의 급성 및 만성기에서의 이식과 저용량 및 고용량의 세포 모두가 운동 협응의 회복을 유의하게 촉진하였지만, 만성기에서 그리고 고용량의 이식이 가장 최적의 이식 양생법인 것으로 나타났다(E 대 A, B 또는 D 간의 비교 참조, p<0.0033).
본 데이터에 의하면 NR1 NPC의 뇌내 이식은 각각 EBST, 신경학적 테스트 및 로타로드 테스트에 의해 나타난 바와 같이 일반적인 운동 행동, 신경학적 기능 및 운동 협응의 회복을 촉진하는 것으로 나타났다. 테스트 전반에 걸친 기능 회복의 시작은 이식 후 2개월이었으며, 이식 후 적어도 3개월(연구 종료)까지 지속되었다. 전반적으로, 뇌졸중의 급성 및 만성기에서의 이식 및 저용량 및 고용량의 세포 모두가 기능 회복을 유의하게 촉진하였지만, 만성기에서 그리고 고용량의 이식이 EBST 및 로타로드 테스트에 기초하여 가장 최적의 이식 양생법인 것으로 나타났다. 체중과 일반적인 건강 상태가 유사한 이식을 받은 뇌졸중 동물과 비히클을 주입받은 뇌졸중 동물 사이에 관찰 가능한 명백한 부작용은 없었다. 요약하면, 이 연구로부터의 소견은 뇌졸중에서 뇌내 이식을 위한 공여 세포로서 NR1 NPC의 사용을 뒷받침한다.
실시예 4
누드 래트 피질 뇌졸중 모델에서의 효능에 대한
NR1 인간 신경 전구세포 용량-반응 연구
이 비-GLP 연구의 목적은 허혈성 뇌졸중의 무흉선(NIH) 래트 피질 모델에서 기능 회복을 증가시키는 NR1 인간 신경 전구세포(hNPC)의 효능을 테스트하는 것이었다. 본 발명자 그룹에 의한 이전의 연구는 NR1 또는 다른 hNPC 계통의 직접적인 실질내 이식이 뇌졸중 후 제1주에 이 모델에서 기능 회복을 증가시킴을 보여주었다. 이 연구의 1차 종점은 w테스트 비히클 단독(Plasmalyte-A + 0.5% 인간 혈청 알부민)으로 처리한 동물 대 이전에 유사한 hNPC로 테스트하고 처리 후 제1주 내지 제5주에 회복을 증가시키는 것으로 나타난 것과 동일한 용량(4×105 세포/래트)으로 NR1을 포함하는 테스트 비히클로 처리한 동물의 기능 회복을 비교하는 것이었다. 수염-발 테스트로 알려진 감각운동 행동 테스트는 피질 허혈성 뇌졸중 및 hNPC 치료 후 기능 회복의 증가를 재현 가능하게 보여주었기 때문에 이를 기능 회복의 주요 척도로 선택하였다. 2차 종점에는 추가적인 행동 테스트, 수염-발 테스트와 양의 상관관계가 있는 것으로 밝혀진 자세-반사 테스트, 행동 테스트의 3개의 추가적인 시점에서 기능 회복의 지속 가능성 평가(이식 후 6주 내지 8주) 및 비히클 단독과 비교하여 더 낮은 2차 NR1 용량(100,000개 세포/래트)의 기능 회복 및 지속 가능성의 평가를 포함시켰다. 3차 종점에는 용량 효과의 경향에 대한 두 가지 활성 치료법 간의 비교, 기능 회복뿐만 아니라 숙주 뇌 병변 크기 및 숙주 뇌 복구 경로, 예컨대, 혈관신생, 염증 및 가소성으로 지칭되는 숙주 뉴런에 의한 축색돌기 발아 증가를 포함하는 여러 조직학-기반 정량화 종점에 대한 잠재적인 테스트로 조사된 3차 행동 테스트(수정된 신경학적 점수 테스트)를 포함시켰다. 이러한 내인성 복구 경로는 이전에 회복 및 잠재적 hNPC 생체내 작용 메커니즘의 대리 측정으로 조사되었다. 또한, 뇌에 이식된 세포의 생존을 평가하여 NR1 지속성 및 이식 후 분화, 이동, 이소성 조직 형성 및 종양형성의 가능성을 특성화하였다.
수컷 무흉선 래트에 이전에 설명한 바와 같이 허혈성 피질 뇌졸중(ICS)을 유발시켰다. ICS 유도 후 제7일에, NR1을 제안된 임상 제형(Plasmalyte-A + 0.5% 인간 혈청 알부민)의 2개의 용량 수준(1×105개 세포/래트 또는 4×105개 세포/래트) 중 하나로 뇌내(IC) 주입으로 투여하였다. 의도된 임상 전달 장치를 모델로 한 Hamilton 마이크로시린지를 사용하여 추정되는 뇌졸중 병변의 중앙에 있는 4개의 주입 부위에 NR1 투여를 수행하였으며, 2.5×104개 또는 1×105개의 세포를 각 부위에 1㎕로 주입하였다. 별도의 동물 코호트에 동일한 주사 방법을 사용하여 비히클 대조군(Plasmalyte-A + 0.5% 인간 혈청)을 주입하였다. 처리 그룹은 표 1에 나타나 있다. 처리 그룹에 대해 맹검인 조사자에 의해 감각운동 기능의 행동 테스트를 뇌졸중 손상 1주 전 및 그 후 처리 후 최대 8주 동안 매주 수행하였다. 또한, 임상 관찰 및 체중 기록에 의해 동물의 일반적인 건강을 매주 모니터링하였다. 생전 평가의 완료 후, 후속 조직학적 평가를 위해 처리 후 제9주에 뇌 조직을 수집하였다.
NR1 파일럿 로트 #1은 cGMP NR1 생산에 사용된 것과 동일한 절차를 사용하여 스탠포드 대학에서 제조하였다. NR1 파일럿 로트 #1은 시티 오브 호프 p15 마스터 세포 은행으로부터 p18로 확장시켰으며, 이식 당일까지 기체상 액체 질소에 동결보존하였다.
NR1 파일럿 로트 # 1의 분석적 특성화
NR1의 투여 준비. 각 이식일에, 부록 1(연구 프로토콜)의 부록 1로 포함된 세포 준비를 위한 SOP에 따라 NR1 세포를 준비하였다. 간략하게는, 세포를 해동시키고, 테스트 비히클로 3회 세척하였다. 최종 원심분리 후, 각각 고용량 및 저용량 NR1 투여를 위해 세포를 테스트 비히클에 1×108개 세포/㎖ 또는 2.5×107개 세포/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 이식 절차 동안 세포를 얼음에 보관하고, 준비 후 6.5시간 내에 투여하였다. NR1 세포 농도 및 생존력을 이식 전 최종 세척 단계 후 및 이식 수술 완료 시 표준 혈구계를 사용하여 트립판 블루로 점수를 매겼다.
비히클 대조군
실험 방법
동물 대상체. 대략 5주령 내지 6주령의 성인 수컷 Cr:NIH-RNU 누드 래트(계통 코드 02N01)를 엔씨아이-프레데릭(NCI-Frederick)(레메릴렌드주 프레데릭 소재)으로부터 얻고, 8주령 내지 12주령 (수술 시 대략 230그램 내지 350그램)까지 수용 시설에 적응하도록 하였다. 동물을 케이지당 2마리 내지 3마리로 수용하고, 자외선 조사된 음식과 및 오토클레이브된 물을 임의로 제공하였다. 동물을 12/12시간의 명/암 주기로 유지하고, 표준 조명하에서 주간에 행동 관찰을 수행하였다. 모든 동물은 건강이 양호하였으며, 연구에 등록하기에 적합한 것으로 간주되었다. 모든 절차는 스탠포드 IACUC에서 승인한 프로토콜하에 수행하였다.
허혈성 피질 뇌졸중의 유발. 기술된 바와 같은 허혈성 뇌졸중의 영구적 원위 중간 대뇌동맥(MCA) 폐색 모델을 동물에 적용하였다(Kelly et al. 2004). 간략하게는, 아이소플루레인 마취하에, 복측 정중선 절개를 통해 총경동맥(CCA)을 노출시켰다. 원위 MCA를 왼쪽 귀와 눈 사이의 구멍을 통해 노출시키고, 바이폴라 포셉으로 소작하여 영구적으로 폐색시키고, 후열(rhinal fissure) 바로 위를 절단하였다. 30분 동안 각 혈관에 미세동맥류 클립을 적용하여 CCA를 일시적으로 폐색시켰다. 그런 다음, 클립을 제거하고, 상처를 봉합하고, 동물이 완전히 걸을 수 있을 때까지 회복시킨 후 케이지로 돌려보냈다.
처리 그룹으로의 동물의 할당. 결손의 평균 및 표준 편차가 3개의 처리 그룹에 걸쳐 가능한 한 동등하도록 동물을 뇌졸중 후, 이식 전 기준선 행동 점수에 기초하여 처리 그룹에 할당하였다. 수염-발 테스트를 처리 그룹 할당의 주요 결정 요인으로 사용하였으며, 이는 이 테스트가 이전에 강력한 결손 및 처리 후 회복 능력을 나타내었기 때문이다(Horie et al. 2011, Andres et al. 2011). 각 처리 그룹에 대한 뇌졸중 후 제6일에서의 수염-발 테스트에 대한 평균 점수 및 표준 편차가 가능한 한 동등하도록 동물을 처리 그룹(비히클, 1×105개 NR1, 4×105개 NR1)에 걸쳐 분포시켰다. 2마리의 동물이 수염-발 테스트에서 동일한 결손 점수를 받으면, 자세-반사 테스트를 사용하여 처리 그룹 할당을 결정하였다. 또한, 다음 기준을 충족하는 동물만을 연구에 등록시켰다: 뇌졸중 유발 전 수염-발 테스트 또는 자세-반사 테스트에서 결손이 관찰되지 않음. 뇌졸중 후 제1일 내지 제6일 동안 심각하지 않은 체중 감소(체중의 40% 미만) 후 제6일에 수염-발 테스트에서 10회 중 7회 초과의 시도에서 오른쪽 앞다리 기능의 상실.
세포 이식을 위한 수술. 허혈성 뇌졸중 유발 후 제7일에, 테스트 비히클, 1×105개의 NR1 세포 또는 4×105개의 NR1 세포를 뇌졸중 병변 내측 피질 내의 4개의 부위에 입체 정위적으로 주입하였다. 아이소플루레인 마취하에 동물에서, 두개골에 정중선 피부 절개를 하고 피부를 당겼다. 25-게이지 니들을 사용하여 수동으로 두개골에 천두공을 뚫어 다음 4개의 부위에 펌프-제어식 26-게이지 마이크로시린지 니들을 삽입할 수 있게 하였다: 1) 전방-후방(anterior-posterior: AP): +1.0㎜, 내측-외측(medial-lateral: ML): +1.2㎜, 배측-복측(dorsal-ventral: DV, 경막으로부터): -1.5㎜; 2) AP: -0.3㎜, ML: +1.2㎜, DV: -1.4㎜; 3) AP: -1.8㎜, ML: +1.2㎜, DV: -1.4㎜; 4) AP: -2.8㎜, ML: +1.4㎜, DV: -1.4㎜. 세포를 포함하거나 또는 포함하지 않은 테스트 비히클을 부위당 2분에 걸쳐 전달된 1㎕의 총 주사 부피에 대해 0.5 ㎕/분으로 투여하였다. 주입 후, 마이크로시린지 니들을 추가로 2분 동안 제자리에 둔 후 조심스럽게 빼내었다. 4회의 주입을 모두 완료한 후, 노출된 영역을 멸균 봉합사로 봉합하였다.
동물 수술 후 관리 및 유지. 뇌졸중 수술 전 이식 후 1주까지, 감염의 위험을 줄이기 위해 음용수(1 g/ℓ) 중 암피실린(암피실린 캡슐, USP, 다바 파마슈티칼스, 인크. (DAVA Pharmaceuticals, Inc.))을 주었다. 뇌졸중 및 이식 수술 후, 탈수, 명백한 불편함, 자가 포식 또는 수술 합병증에 대해 매일 래트를 검사하였다. 관찰 시점에서 임의의 건강 합병증을 기록하였으며, 동물은 수의사의 지도하에 동물 시설 기술자에 의해 적절한 보살핌을 받았다. 수술 전, 뇌졸중 수술 후 1주 동안 매일, 그 후 매주 체중을 기록하였다.
감각운동 기능의 행동 테스트를 위한 방법. 행동 테스트를 사용하여 기준선(뇌졸중 전 및 뇌졸중 후/이식 전 6일) 및 이식 후 제1주 내지 제8주(뇌졸중 후 제2주 내지 제9주)에 감각운동 및 운동 회복을 평가하였다. 연구 시작 및 손상 전 기준선 테스트 전 3일 동안 모든 행동 테스트에 대해 래트를 훈련시켰다. 각 래트를 수염-발 테스트, 자세-반사 테스트 및 수정된 신경학적 점수 테스트로 순차적으로 평가하였으며, 각 테스트 일의 일련의 총 테스트는 래트당 10분 미만으로 지속하였다. 모든 행동 테스트는 처리 그룹에 대해 맹검인 조사자가 수행하였다.
수염-발 테스트. 수염-발 테스트를 사용하여 테스트 동물의 동측 수염의 자극 시 앞다리를 이용한 반사 능력을 테스트하였으며, 감각 및 운동 기능을 모두 평가하였다(Schallert et al. 2000). 왼쪽 체감각 운동 피질에 허혈성 뇌졸중의 유발 후, 동물은 오른쪽에서 손상된 반사를 나타내는 반면, 왼쪽에서의 반사 능력은 온전하게 유지되었다(따라서 양성 대조군의 역할을 함). 테스트를 수행하기 위해, 동물을 테스트 앞다리를 제외한 모든 사지를 다시 당겨 잡고, 동측 수염을 테이블 모서리에 쓸어 반사 능력을 평가하였다. 테스트 당일, 각 측면당 10회의 시험을 수행하였고, '10'점은 결손이 없음을 나타내는 반면, '0'점은 완전한 기능 상실을 나타낸다.
자세-반사 테스트. 자세-반사 테스트를 사용하여 동물이 테이블에 내려졌을 때 양쪽 앞다리를 대칭적으로 사용할 수 있는 능력뿐만 아니라 정지 상태에서 좌우로 미는 것을 견디는 능력을 측정하였다(Andres et al 2011). 테스트를 수행하기 위해, 동물의 꼬리의 맨 아래 부분을 들고, 테이블 표면으로 낮추어 대칭 대 비대칭 앞다리 착지를 관찰하였다. 비대칭 앞다리 착지에는 '1'의 결손 점수를 부여하였고, 대칭 착지는 '0'(결손 없음)으로 점수를 매겼다. 그런 다음, 동물을 테이블 위에 놓고, 좌우로 부드럽게 밀었다. 밀어내기에 저항하지 못하는 것에 '1'의 추가적인 결손 점수를 부여하여 최대 가능한 결손 점수 = 2였다.
수정된 신경학적 점수 테스트. 사용된 수정된 신경학적 점수 테스트는 이전에 기술된 방법(Chen et al. 2001)을 개작한 것으로, 이 연구에서 탐색적 종점으로 수행하였다. 이 테스트로 누적 점수를 매기는 일련의 행동 테스트를 통해 감각 및 운동 기능의 능력을 측정하여 최종 결손 점수를 얻었다. 피험자가 테스트를 수행할 수 없거나 또는 주어진 반사가 부족하여 기능적 측정을 기반으로 가능한 최대 결손 점수가 14점인 경우, 점수를 부여하였다.
조직학적 처리, 염색 및 면역조직화학. 뇌졸중 후 제10주에, 촉진 가능한 덩어리를 포함하여 외부 이상에 대해 래트를 주의 깊게 검사하였다. 아이소플루레인 마취하에, 래트를 식염수로 경심 관류시킨 후 4% 파라폼알데하이드로 관류시켰다. 뇌를 해부하고, 4% 파라폼알데하이드로 사후 고정시킨 다음, 30% 수크로스/PBS에 72시간 동안 동결보존하였다. 또한, 관류 후 다음의 말초 기관을 수집하고, 동일한 방식으로 동결보존하여 가능한 차후 검사를 위해 -80℃에 보관하였다: 폐, 심장, 비장, 간. 후속 조직학적 분석을 위해 Leica 동결절편기를 사용하여 40㎛의 자유 부유 관상 뇌 절편을 준비하였다. 모든 조직학적 분석은 처리 그룹에 대해 맹검으로 수행하였다.
니슬 염색에 의한 경색 크기의 정량화. 경색 영역(각 절편 사이에 960㎛ 증분)에 걸친 뇌당 6개의 동결보존된 절편을 Superfrost Plus 현미경 슬라이드(VWA)에 마운팅하고, 실온(RT)에서 1시간 동안 공기 건조시켰다. 그런 다음, 슬라이드에 마운팅된 뇌 절편을 실온에서 다음 용액에서 인큐베이션하였다: 95% 에탄올(EtOH)에서 2분, 100% EtOH에서 2분, 톨루엔에서 5분, 95% EtOH에서 2분, 95% EtOH에서 2분, 물에서 1분, 크레실 바이올렛 용액(물 중 1% 크레실 바이올렛 아세테이트/0.25% 빙초산)에서 15분, 물에 10 초/액침으로 10회 액침(dip), 70% EtOH에서 1분, 95% EtOH에서 1분, 100% EtOH에서 1분, 톨루엔에서 5분, 새로운 톨루엔에서 5분. 염색된 절편에 즉시 DPX 마운팅 배지(시그마(Sigma))를 사용하여 커버슬립을 덮고, 흄 후드에서 실온에서 밤새 공기 건조시켰다.
염색된 절편을 평판 스캐너에서 300dpi로 이미지화하고, 생성된 이미지를 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 분석하여 손상되지 않은(니슬 염색에 대해 양성) 조직 및 병변이 있는(니슬 염색에 대해 음성) 조직 면적의 척도를 얻었다. 각 동물에 대한 경색 크기를 기술되어 있는 바와 같이 6개의 뇌 절편에 걸쳐 손상되지 않은 우반구의 총 반구 면적에 대한 병변이 있는 좌반구의 총 반구 면적의 차이로 정량화하였다(Kelly et al. 2004).
면역형광 염색에 의한 혈관 밀도의 정량화. 각 래트에 대해, 내피-특이적 항체인 래트 내피 세포 항원-1(RECA1, 압캠(Abcam) 카탈로그 번호 AB9774)을 사용한 면역형광 염색에 의해 손상된 부위에 인접한 경색 주변 조직에서 상대적 혈관신생의 척도로서 혈관 밀도(BVD)를 검사하였다.
면역형광 염색을 수행하기 위해, 자유 부유 뇌 절편을 PBS에서 세척하고, 예열된 항원 복구 용액(10mM 소듐 시트레이트/0.05% tween-20/PBS, pH 6.0)으로 65℃에서 20분 동안 처리하였다. 그런 다음, 절편을 실온에서 차단 용액(PBS 중 2% 정상 염소 혈청/1% 소 혈청 알부민/0.5% triton x-100, pH 7.2 내지 7.4)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 용액을 제거하고, 절편을 4℃에서 차단 용액(1:200)에서 1차 항체(항-RECA1)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 절편을 회전식 진탕기에서 PBS에서 3×10분 세척한 다음, 회전식 진탕기에서 실온에서 PBS에 1:250으로 희석된 2차 항체(염소-항-토끼 IgG-Alexa555, 인비트로젠(Invitrogen) 카탈로그 번호 A-21428)와 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 4',6'-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 0.5 ㎍/㎖, 시그마)을 2차 항체 인큐베이션 기간의 마지막 5분 동안 첨가하여 핵을 대조 염색하였다. 절편을 PBS에서 3×5분 세척하고, Superfrost Plus 현미경 슬라이드(VWA)에 마운팅하고, 실온에서 10분 내지 20분 동안 공기 건조시키고, 폴리바이닐 알코올(PVA, 시그마)로 커버슬립을 덮고, 실온에서 1시간 동안 공기 건조시키고, 이미징까지 암소에서 4℃에 보관하였다.
Zeiss 형광 현미경에서 이미징을 수행하고, 각각의 뇌 절편에 대해 경색 주변 조직 내의 2개의 이미지를 획득하였다(래트당 6개의 절편, 총 12개의 이미지). 각 이미지에 대해, ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 BVD를 측정하여 역치화된 RECA-1 양성의 평균 형광 면적(mean fluorescent area: MFA)을 결정하였다. 그런 다음, 각 래트의 모든 이미지에 대한 평균 MFA를 계산하고, 처리 그룹 평균을 통계적으로 비교하였다.
면역형광 염색에 의한 미세아교세포/면역 세포 활성화의 정량화. 각 래트에 대해, 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1(Iba1, 와코 케미칼스 유에스에이(Waco Chemicals USA) 카탈로그 번호 019-19741)에 대한 항체를 사용한 면역형광 염색에 의해 손상 부위에 인접한 경색 주변 조직에서 미세아교세포/면역 세포 활성화를 정량화하였다.
자유 부유 뇌 절편에서 면역형광 염색을 수행하고, 위의 BVD의 정량화에 대해 기술된 바와 같이 상응하는 경색 주변 이미지를 획득하였다. 각 이미지에 대해, ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 미세아교세포/면역 세포 활성화를 측정하여 역치화된 Iba1 양성의 평균 형광 면적(MFA)을 결정하였다. 그런 다음, 각 래트의 모든 이미지에 대한 평균 MFA를 계산하고, 처리 그룹 평균을 통계적으로 비교하였다.
면역형광 염색에 의한 축색돌기 밀도의 정량화. 각 래트에 대해, 범-신경필라멘트 항체(SMI312, 압캠 카탈로그 번호 ab24574)를 사용한 면역형광 염색에 의해 병변 경계에서 축색돌기 밀도를 정량화하였다.
위의 BVD의 정량화에 대해 기술된 바와 같이 면역형광 염색을 자유 부유 뇌 절편에서 수행하였으며, 병변 경계의 이미지를 획득하였다 (2개의 이미지/절편, 12개의 이미지/래트). 각 이미지에 대해, ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 축색돌기 밀도를 측정하여 역치화된 SM312 양성의 평균 형광 면적(MFA)을 결정하였다. 그런 다음, 각 래트의 모든 이미지에 대한 평균 MFA를 계산하고, 처리 그룹 평균을 비교하였다.
면역형광 염색에 의한 NR1 생존의 정량화. 뇌졸중 손상된 뇌에서 이식된 NR1 세포의 생존 및 이동을 인간 핵(항-hNUC, 밀리포어(Millipore) 카탈로그 번호 MAB1281)에 특이적인 항체를 사용하여 면역형광 염색에 의해 조사하였다. 4개의 이식 부위에 해당하는 절편 및 니들 트랙이 보이는 절편을 염색에 사용하였다. 임의의 잠재적인 hNUC 양성이 검출된 경우, hNUC 양성이 검출되지 않을 때까지 AP 양 방향에서 80㎛ 간격으로 추가적인 절편을 염색하였다(즉, 각 간격에서 1개의 인접한 절편을 공동 염색 연구를 위해 보관함).
BVD의 정량화에 대해 기술된 바와 같이 면역형광 염색을 자유 부유 뇌 절편에서 수행하였다. 1차 항체(항-hNUC)를 1:200으로 희석하고, 1:250으로 희석된 염소-항-마우스 IgG-Alexa488 2차 항체(인비트로젠 카탈로그 번호 A11001)를 사용하여 검출하였다. 4',6'-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 0.5 ㎍/㎖, 시그마)을 2차 항체 인큐베이션 기간의 마지막 5분 동안 첨가하여 핵을 대조 염색하였다. 이전에 이식된 인간 배아 신장 세포(HEK 293T 세포)를 포함하는 것으로 확인된 별도의 동물 코호트로부터의 양성 대조군 뇌 절편과 같이 각각의 염색된 슬라이드 세트에 대해 비히클-처리한 음성 대조군 뇌 절편을 포함시켰다.
염색된 모든 절편을 처리 그룹에 대한 지식 없이 Zeiss 에피형광 현미경을 사용하여 hNUC 양성에 대해 수동으로 스크리닝하였다. 각 동물에 대해, 최소 4개의 뇌 절편을 hNUC로 염색하였고, 각 염색된 절편에 대해 hNUC 양성에 대해 전체 조직을 스캔하였다.
데이터 분석 및 통계적 방법. 각 처리 그룹에 대한 평균 체중을 JMP 소프트웨어(V 11.0.0, 사스 인스티튜트, 인크., 노스캐롤라이나주 캐리 소재)를 사용하여 반복 측정 ANOVA에 의해 비교하였다.
모든 행동 테스트는 처리 그룹에 대해 맹검인 조사자가 수행하였다. 각 행동 테스트의 분석을 위해, 처리 후 각 시점에서 개별 동물의 행동 점수를 뇌졸중 후/처리 전 기준선(뇌졸중 후 1주)으로 정규화하였다. 그런 다음, 정규화된 행동 점수를 사용하여 각 시점에서 처리 그룹 평균을 계산하였다.
수염-발 테스트에 대해, 처리 후 제1주 내지 제5주(뇌졸중 후 2주 내지 6주)에 4×105개의 NR1 및 비히클 처리 그룹 평균에 대해 JMP 소프트웨어(V 11.0.0, 사스 인스티튜트, 인크., 노스캐롤라이나주 캐리 소재)를 사용하는 Bonferonni 포스트-혹 테스트를 사용한 다중 비교 ANOVA에 의해 통계적 비교를 수행하였다. 또한, 3개의 처리 그룹 모두에 대해 JMP 소프트웨어(V 11.0.0, 사스 인스티튜트, 인크., 노스캐롤라이나주 캐리 소재)를 사용하는 Bonferroni 사후 테스트를 사용한 다중 비교 ANOVA에 의해 시간 경과에 따른 전체 행동(처리 후 1주 내지 8주)의 통계적 분석을 수행하였다. R(R Development Core Team, 2010)의 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 처리 후 제1주 내지 제5주에 4×105개의 NR1 및 비히클 처리 그룹 평균에 대한 수염-발 점수 합계에 대해 비모수적 통계적 분석을 수행하였다. 또한, R(R Development Core Team, 2010)의 Benjami-Hochberg 조정을 사용한 Wilcox 다중 비교 테스트에 의해 4×105 NR1 및 비히클 처리 그룹에 대해 시간 경과에 따른 전체 행동(처리 후 1주 내지 8주)의 비모수적 분석을 수행하였다.
자세-반사 테스트 및 수정된 신경학적 점수 테스트에 대해, 다중 비교 ANOVA와 JMP 소프트웨어(V 11.0.0, 사스 인스티튜트, 인크., 노스캐롤라이나주 캐리 소재)를 사용하는 Bonferroni 사후 테스트에 의해 3개의 처리 그룹 모두에 대해 시간 경과에 따른 전체 행동(처리 후 1주 내지 8주)의 통계적 분석을 수행하였다.
모든 조직학 데이터 수집 및 처리는 처리 그룹에 대해 맹검인 조사자가 수행하였다. 이미지 수집 및 데이터 처리 후, 처리 그룹은 통계적 비교를 위해 맹검하지 않았다. 각 조직학 종점에 대해, JMP 소프트웨어(V 11.0.0, 사스 인스티튜트, 인크., 노스캐롤라이나주 캐리 소재)에서 스튜던트 t-검정에 의해 고용량 및 저용량 NR1 처리 그룹 평균을 비히클 그룹 평균과 개별적으로 비교하였다.
처리 후 제8주에 수염-발 테스트에서의 각 개별 동물의 행동 점수 및 조직학적 종점의 선형 회귀 분석을 JMP 소프트웨어(V 11.0.0, 사스 인스티튜트, 인크., 노스캐롤라이나주 캐리 소재)를 사용하여 수행하였다.
결과 요약
동물의 운명 및 처분(Disposition). 총 42마리의 동물이 허혈성 뇌졸중 수술을 받았으며, 이들 중 7마리는 이식 전 수술 죽었거나 또는 연구 포함 기준을 충족하지 못하였다. 연구 포함 기준을 충족한 동물 중 12마리의 동물은 4×105개의 NR1 세포를 주입받았고, 11마리의 동물은 1×105개의 NR1 세포를 주입받았으며, 12마리의 동물은 비히클을 주입받았다. 이식 수술을 받은 모든 동물은 생존하였으며, 이식 후 9주에 예정된 연구 종료시까지 연구를 계속하였다.
도 7: 히트 맵 오버레이가 있는 수염-발 테스트 미가공 데이터. 각 처리 그룹(개별 동물 ID는 1열에 열거되어 있음) 내의 각 개별 동물에 대한 수염-발(V-P) 테스트로부터의 미가공 행동 데이터를 나타내는 히트 맵. 점수 '10'(노란색)은 뇌졸중 전 모든 동물(2열)에서 볼 수 있는 바와 같이 이 테스트에서 완전한 기능(즉, 결손 없음)을 나타낸다. 점수 '0'(어두운 회색)은 이식 전날 뇌졸중 유발 후(빨간색 세로 화살표) 대부분의 동물에서 볼 수 있는 바와 같이 기능의 완전한 상실(즉, 완전한 결손)을 나타낸다.
통계적 분석을 위해, 각 동물의 이식 후 점수를 이식 전 기준선 점수로 정규화하고, 그룹 평균을 비교하였다. Bonferonni 사후 테스트를 사용한 다중 비교 ANOVA에 의한 1차 종점(처리 후 1주 내지 5주, 뇌졸중 후 2주 내지 6주)의 통계적 분석은 처리 후 제4주에 시작하는 비히클 치료에 비해 4×105개의 NR1 세포의 유의한 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 뇌졸중 후 2주 내지 6주 동안 수염-발 점수 합계의 Mann-Whitney 테스트를 사용한 비모수적 분석에 의해 추가로 확증되었으며, 이는 비히클(p = 0.0106)에 비해 4×105개의 NR1 세포를 이용한 치료의 유의한 효과를 나타내었다. 지속적인 기능 회복(뇌졸중 후 7주 내지 9주)에 대한 테스트를 위해 1차 종점을 넘어 3개의 추가적인 시점에서 수염-발 테스트에서 모든 동물을 평가하였다. Bonferroni 사후 테스트를 사용한 다중 비교 ANOVA에 의한 시간 경과에 따른 전체 행동(뇌졸중 후 2주 내지 9주)의 통계적 분석은 뇌졸중 후 제7주, 제8 주 및 제9주에 비히클에 비해 4×105개의 NR1 세포를 사용한 치료의 유의한 효과를 나타내었다(각각 p = 0.0004, 0.0021 및 0.0001). Benjami-Hochberg 조정을 사용한 Wilcox 다중 비교 테스트를 사용한 비모수적 분석은 뇌졸중 후 제5주, 제6주, 제7주 및 제9주에 4×105개의 NR1 세포를 사용한 치료의 유의한 효과를 나타내었다(p = 0.0469). 대조적으로, 비히클 대조군 그룹에 비해 1×105개의 NR1 세포로 처리한 동물에 대한 유의한 치료 관련 효과는 관찰되지 않았다.
도 8: 각 처리 그룹에 대해, V-P 테스트에서의 평균 기능 회복은 시간 경과에 따라 나타내었다. 각 동물에 대해, 기능 회복은 처리 전 기준선(X주 - 1주 V-P 점수)으로 정규화된 처리 후 주어진 시점에서의 V-P 점수로 계산하였다. 오차 막대 = 평균의 표준 오차(SEM). *, **, ***는 Bonferroni 사후 테스트를 사용한 다중 비교 ANOVA에 의한 비히클 대조군에 비해 4×105개의 NR1 처리에 대해 각각 p<0.05, p<0.01, p<0.001을 나타낸다.
자세-반사 테스트. 자세-반사 테스트를 뇌졸중 및 NR1 처리 후 운동 기능 및 운동 협응의 추가적인 2차 척도로 사용하였다. 수염-발 테스트와 유사하게, Bonferroni 사후 테스트를 사용한 다중 비교 ANOVA에 의해 뇌졸중 후 제5주 내지 제9주에 비히클 대조군 그룹에 비해 4×105개의 NR1을 처리한 자세 반사 테스트에서 유의한 효과가 관찰되었다(각각 뇌졸중 후 5주, 6주, 7주, 8주 및 9주의 경우 p = 0.0194, 0.0115, 0.0007, 0.0028 및 0.0003). 결과는 도 9에 도시되어 있다.
도 9: 각 처리 그룹에 대한 시간에 따른 자세-반사 테스트에서의 평균 기능 회복. 처리 후 각 시점에서의 평균 기능 회복을 계산하기 위해, 각 동물에 대해 미가공 자세-반사 점수를 처리 전 기준선(X주 - 1주)으로 정규화하고, 각 처리 그룹에 대한 평균 회복을 결정하였다. 오차 막대 = SEM. *, **, ***는 Bonferroni 사후 테스트를 사용한 다중 비교 ANOVA에 의한 비히클 대조군에 비해 4×105개의 NR1 처리에 대해 각각 p<0.05, p<0.01, p<0.001을 나타낸다.
수정된 신경학적 점수 테스트. 수정된 신경학적 점수 테스트를 사용하여 일련의 행동 테스트(표 5, 부문 3.6.3 참조)를 통해 감각 및 운동 기능 둘 다의 능력을 측정하였으며, 이는 이 연구에서 추가적인 탐색적 종점의 역할을 하였다. 결과를 다른 행동 테스트와 동일한 방식으로 분석하고, 각 처리 후 점수를 개체의 처리 전 기준선으로 정규화하고, 다중 비교 ANOVA에 의해 그룹 평균을 비교하였다. 수염-발 테스트 및 자세-반사 테스트와 대조적으로, 수정된 신경학적 점수 테스트에서 처리 그룹 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 결과는 도 10에 도시되어 있다.
도 10: 각 처리 그룹에 대한 시간 경과에 따른 수정된 신경학적 점수 테스트에서의 평균 기능 회복. 처리 후 각 시점에서 평균 기능 회복을 계산하기 위해, 각 동물에 대한 미가공 누적 점수를 처리 전 기준선(X주 - 1주)으로 정규화하고, 각 처리 그룹에 대한 평균 회복을 각 시점에 대해 결정하였다. 오차 막대 = SEM.
해부학적 결과 측정. 행동 테스트의 완료 시, 이식 후 제9주(뇌졸중 후 10주)에 동물을 관류시키고, 뇌 조직을 조직학적으로 검사하였다. 관상 뇌 절편(40㎛)의 병렬 세트를 사용하여 경색 크기를 정량화하고, 경색 주변 피질에서 혈관 밀도, 미세아교세포/면역 세포 활성화 및 축색돌기 밀도의 정량적 척도를 얻었다. 또한, 눈에 보이는 니들 트랙 또는 대략적인 이식 좌표를 포함하는 절편을 NR1 지속성뿐만 아니라 임의의 치료-관련 종양 또는 이소성 조직 형성에 대해 평가하였다.
조직학적 종점의 대표 이미지. 크레실 바이올렛 염색된 절편의 대표적인 현미경 사진은 도 11에 도시되어 있으며, 이는 비히클 또는 4×105개의 NR1 세포로 처리된 동물에서의 중등도 및 중증 경색의 예를 제공한다.
도 11: 뇌졸중 후 제10주의 경색 크기를 보여주는 크레실 바이올렛-염색된 관상 뇌 절편의 대표적인 현미경 사진. 비히클 그룹 및 4×105개 NR1 그룹으로부터 각각 2마리의 동물이 나타나 있으며, 이는 왼쪽 대뇌 피질에서의 중등도(동물 번호 36, 40) 또는 중증(동물 번호 10, 31) 경색을 반영한다. 일부 경우에는, 측뇌실의 확장으로 인해 추가적인 조직 손실이 발생한 것으로 보인다(예를 들어, 동물 번호 10, 36, 40).
숙주 뇌 복구에 대한 NR1 치료의 잠재적 효과를 조사하기 위해, 각각 RECA1, Iba1 및 SMI-312로 면역형광 표지함으로써 혈관 밀도, 미세아교세포/면역 세포 활성화 및 축색돌기 밀도에 대해 경색 주변 피질을 평가하였다. 비히클 또는 4×105개의 NR1 세포로 처리한 동물에 대한 각 염색의 대표 이미지는 도 12에 도시되어 있다.
도 12. 처리 후 제9주(뇌졸중 후 10주)에 경색 주변 피질에서의 면역형광 염색의 대표적인 현미경 사진. 2마리의 비히클-처리된 동물(동물 번호 15 및 40, 1행 및 2행) 및 2마리의 4×105개의 NR1 세포를 처리한 동물(동물 번호 36 및 39, 3행 및 4행)을 포함하여 4마리의 대표적인 동물이 도시되어 있다. 각 동물에 대해, 도면 패널은 1.) 항-RECA1 항체를 사용한 혈관(왼쪽 열), 2.) 항-Iba1 항체를 사용한 활성화된 미세아교세포/면역 세포(중간 열) 및 3.) SMI-312 항체를 사용한 축색돌기 밀도(오른쪽 열)의 면역형광 표지를 보여준다.
기능 회복 및 조직학적 종점의 선형 회귀 분석. 기능 회복 및 해부학적 결과 척μ결과 측정 사이의 잠재적 상관관계를 확인하기 위해, 행동 및 조직학적 데이터의 선형 회귀 분석을 수행하였다. 처리 후 제8주에 수염-발 테스트로부터의 개별 동물 데이터를 다음의 해부학적 결과 측정 각각에 대해 개별적으로 플로팅하였다: 경색 크기, 경색 주변 혈관 밀도, 경색 주변 미세아교세포/면역 세포 활성화 및 경색 주변 축색돌기 밀도. 이 접근법에 기초하여, 처리 후 제9주에서의 경색 크기는 비히클 및 1×105개의 NR1 처리 그룹의 동물에 대한 처리 후 제8주의 수염-발 테스트에서의 성능과 상당한 상관관계를 보였으며, 여기서 증가된 경색 크기는 수염-발 테스트에서의 감소된 성능과 상관관계가 있었다. 대조적으로, 경색 크기는 4×105개의 NR1 처리 그룹의 동물에 대한 수염-발 테스트에서의 감소된 성능과 상관관계가 없었으며, 이는 이 처리 그룹에서 관찰된 상당한 회복 향상을 나타낸다. 처리 후 제8주의 기능 회복과 임의의 다른 조직학적 종점 사이에는 유의한 상관관계가 관찰되지 않았다. 각각의 비교에 대해, 상응하는 R2 값 및 p 값은 표 9, 처리 후 제8주에서의 수염-발 테스트의 선형 회귀 분석 및 조직학적 종점에서 처리 그룹의 함수로서 나타나 있다.
처리 그룹에 의한 평균 경색 크기의 정량화. 각 동물에 대해, 6개의 관상 절편 세트를 크레실 바이올렛으로 염색하고, 처리 그룹에 대해 맹검인 조사자가 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 각 절편의 각 반구에서 온전한 전체 조직을 측정하였다. 6개의 모든 절편에 걸쳐 온전한 조직의 합계를 각 반구에 대해 계산하였으며, [(1-(병변이 있는 반구 내 온전한 조직의 총 면적/손상되지 않은 반대측 반구의 총 면적))*100]으로 경색 크기를 계산하였다. 스튜던트 t-검정에 의해 비히클 그룹에 비해 1×105개의 NR1 처리 그룹 또는 4×105 처리 그룹에 대해 경색 크기의 유의한 차이는 관찰되지 않았다(1×105개 NR1 대 비히클, p = 0.3825; 4×105개 NR1 대 비히클, p = 0.888).
경색당 피질에서의 해부학적 결과 측정의 정량화. 경색 주변 피질에서의 해부학적 결과 측정의 정량화를 위해, 병변에 걸쳐 있는 4개의 관상 절편을 면역형광 염색을 위해 처리하고, 각 절편에 대해 복측 경색 주변 피질 내 2개의 이미징 필드를 얻었다(8개 이미징 필드/동물). 처리 그룹에 대해 맹검인 조사자가 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 각 염색의 역치화된 영역 척도를 계산하였다. 그런 다음, 처리 그룹 평균을 JMP 11(SAS)을 사용하여 비교하였으며, NR1 고용량 그룹(4×105개 세포/래트)과 NR1 저용량 그룹(1×105개 세포/래트)을 스튜던트 t-검정에 의해 비히클 그룹과 별도로 비교하였다.
처리 그룹에 의한 평균 경색 주변 혈관 밀도의 정량화. RECA1 양성의 평균 형광 면적을 각 처리 그룹에 대해 계산하고, 2개의 NR1 처리 그룹을 독립적으로 스튜던트 t-검정에 의해 비히클 그룹과 비교하였다. 처리 그룹 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다(4×105개의 NR1 대 비히클, p = 0.3352; 1×105개의 NR1 대 비히클, p = 0.4420).
처리 그룹에 의한 평균 경색 주변 미세아교세포/면역 세포 활성화의 정량화. Iba1 양성의 평균 형광 면적을 각 처리 그룹에 대해 계산하고, 2개의 NR1 처리 그룹을 독립적으로 스튜던트 t-검정에 의해 비히클 그룹과 비교하였다. 이 분석에 기초하여, 4×105개의 NR1 처리는 경색 주변 미세아교세포/면역 세포 활성화에 유의한 감소를 나타내었다(p = 0.0340). 대조적으로, 1×105개의 NR1 대 비히클에 대한 그룹 평균 사이에는 유의한 차이가 없었다(p = 0.0690).
처리 그룹에 의한 평균 경색 주변 축색돌기 밀도의 정량화. SMI-312 양성의 평균 형광 면적을 각 처리 그룹에 대해 계산하고, 2개의 NR1 처리 그룹을 독립적으로 스튜던트 t-검정에 의해 비히클 그룹과 비교하였다. 처리 그룹 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다(4×105개의 NR1 대 비히클, p = 0.7838; 1×105개의 NR1 대 비히클, p = 0.2538).
NR1 지속성의 평가. 처리 후 제9주(뇌졸중 후 10주)에, 눈에 보이는 니들 트랙 또는 대략적인 이식 좌표를 포함하는 절편을 NR1 지속성뿐만 아니라 임의의 치료-관련 종양 또는 이소성 조직 형성에 대해 평가하였다. NR1 지속성은 항-hNUC로 면역형광 표지함으로써 평가하였다. 이 접근법에 기초하여, 처리 후 제9주에 어떠한 평가된 동물에서도 hNUC-양성 세포는 검출되지 않았다. 또한, 어떠한 평가된 동물에서도 이소성 조직 또는 종양 형성의 징후는 관찰되지 않았다.
결과의 해석
행동 평가 결과 측정. 다음 행동 테스트를 사용하여 손상 전, 손상 후/치료 전, 및 처리 후 1주에서 8주까지 매주 동물을 행동에 의해 평가하였다: 수염-발 테스트, 자세-반사 테스트, 수정된 신경학적 점수 테스트.
동물은 뇌졸중 손상 전에 어떠한 행동 테스트에서도 결손을 나타내지 않았다. 뇌졸중 손상 후 제1주(치료 전)에서의 행동 평가는 3개의 테스트 모두에 기초하여 유사하게 광범위한 기능적 결손을 나타내었고, 수염-발 테스트에 기초한 반대쪽 수염/앞다리 반사 시스템(뇌졸중 측에 대해 반대측)의 감각운동 기능의 상당한 장애와 자세-반사 테스트 및 수정된 신경학적 점수 테스트에 기초한 전반적인 운동 협응 및 균형의 그 보다 덜 한 장애를 나타낸다.
수염-발 테스트. 반대쪽 수염과 앞다리의 결합된 감각운동 기능을 평가하기 위해, 수염-발 테스트를 사용하였다. 수염-발 테스트의 결과는 부문 4.3.1에 제시되어 있다. 뇌졸중 손상 후, 대부분의 동물은 이 테스트에서 뇌졸중 후 제1주에 10회의 시도 중 10회의 반대쪽 수염 자극에 반응하지 않는 완전한 결손을 나타내었다. 처리 후, 비히클을 주입받은 동물은 이 테스트에서 최소의 기능 회복을 나타내었으며, 7주에 28% 및 8주에 26%(뇌졸중 후 8주 및 9주)의 평균 회복에 도달하였다. 1×105개의 NR1 세포로 처리한 동물에 대해 유사한 회복이 관찰되었으며, 그룹 평균 회복은 처리 후 제7주 및 제8주에 31% 및 38%에 도달하였다. 대조적으로, 4×105개의 NR1 세포로 처리한 동물은 비히클-처리된 동물에 비해 수염-발 테스트에서 기능 회복에 유의한 증가를 나타내었으며, 그룹 평균 회복은 처리 후 4주까지 34%에 도달하였고(비히클 그룹 평균 = 10%) 처리 후 제8주에는 61%로 증가하였다(Benjami-Hochberg 조정을 사용한 Wilcox 다중 비교 테스트에 의한 처리 후 제4주, 제5주, 제6주 및 제8주에 p = 0.0469). 수염-발 테스트에서 비히클-처리된 동물에 의한 낮은 정도의 자발적 회복은 이 모델에 대한 뇌졸중 병변의 특정 위치를 반영할 가능성이 높으며, 이는 전형적으로 왼쪽 수염 배럴 피질(오른쪽 수염에서 감각 자극을 받는 역할을 함)과 오른쪽 앞다리를 제어하는 역할을 하는 운동 피질 모두를 포함한다. 이와 같이, 이 연구의 결과는 수염-발 테스트가 허혈성 피질 뇌졸중의 영구 모델에 대한 기능적 결손 및 회복의 민감한 척도를 제공할 수 있으며, 추가로 병변 부위 내측 및 이의 바로 인접한 부위로의 1×105개의 NR1 세포가 아닌 4×105개 NR1 세포의 투여는 이러한 뇌 영역의 기능 회복을 선택적으로 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
자세-반사 테스트. 앞다리 운동 기능의 두 번째 척도 및 운동 협응의 척도를 제공하기 위해, 자세-반사 테스트를 사용하였다. 자세-반사 테스트의 결과는 부문 4.3.2에 제시되어 있다. 뇌졸중 손상 후, 대부분의 동물은 이 테스트에서 상당한 결손을 나타내었으며, 대부분의 동물이 테이블에 내려지는 동안 대칭적인 앞다리 착지를 수행하지 못하였고, 많은 동물이 정지상태에서 부드러운 좌우 밀기에 저항하는 능력의 손상을 나타내었다. 비히클-처리한 동물은 이 테스트에서 중간 정도의 기능 회복을 나타내었으며, 제8주에 50%의 평균 회복에 도달하였다. 1×105개의 NR1 세포를 처리한 동물에서 유사한 회복이 관찰되었으며, 그룹 평균 회복은 처리 후 제8주에 35%에 도달하였다. 대조적으로, 4×105개의 NR1 세포로 처리한 동물은 비히클-처리된 동물에 비해 자세-반사 테스트에서 기능 회복의 유의한 증가를 나타내었으며, 그룹 평균 회복은 처리 후 4주까지 46%에 도달하였으며(비히클 그룹 평균 = 29%) 처리 후 제8주에 88%로 증가하였다(Bonferroni 사후 테스트를 사용한 다중 비교 ANOVA에 의한 처리 후 제4주, 제5주, 제6주, 제7주 및 제8주에 대해 각각 p = 0.0194, 0.0115, 0.0007, 0.0028 및 0.0003). 이 테스트에서 수염-발 테스트에 비해 비히클 그룹의 더 큰 정도의 자발적 회복이 관찰되었으며, 이는 오른쪽 앞다리 운동 결함의 지속에도 불구하고 일반적인 운동 협응의 회복으로 인한 것일 수 있다.
수정된 신경학적 점수 테스트. 수정된 신경학적 점수 테스트를 뇌졸중 후 기능적 결손 및 회복의 세 번째 탐색적 척도로 사용하여 앞다리 감각운동 기능, 보행하는 동안 사지 협응 및 균형의 누적 평가를 제공한다(테스트된 매개변수에 대해 표 6 참조). 수정된 신경학적 테스트의 결과는 부문 4.3.3에 제시되어 있다. 뇌졸중 손상 후, 대부분의 동물은 이 테스트에서 중간 정도의 결손을 나타내었으며, 이는 오른쪽 앞다리 구부리기, 오른쪽 앞다리 감각운동 기능 및 평균대를 탐색하는 능력의 장애로 나타난다. 다른 행동 테스트와 달리, 수정된 신경학적 점수 테스트에서 모든 처리 그룹은 상당한 회복을 나타내었으며, 이는 주로 평균대 성능의 개선으로 인한 것이었다. 비히클에 비해 1×105개의 NR1 세포 또는 4×105개의 NR1 세포로 처리한 동물의 경우 회복의 유의한 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 비히클-처리된 동물에서도 관찰된 자발적 회복 및/또는 적응의 정도로 인한 것일 수 있다.
해부학적 결과 측정. 조직학적 분석을 위해, 처리 후 제9주(뇌졸중 후 10주)에 뇌 조직을 수집하고, 경색 크기, 경색 주변 피질의 온전성/복구(혈관 밀도, 활성화된 미세아교세포/면역 세포의 존재 및 축색돌기 성장에 의해 결정됨), 인간 세포 지속성의 조직학적 평가뿐만 아니라 임의의 이소성 조직 또는 종양 형성의 확인을 위해 처리하였다.
오른쪽 수염/앞다리 감각운동 기능의 관찰된 장애를 뒷받침하기 위해, 뇌졸중 유발된 경색을 수염 배럴 피질 및 오른쪽 앞다리의 제어를 담당하는 운동 피질의 영역을 포함하는 왼쪽 체감각 운동 피질로 우세하게 제한하였다. 경색 크기는 전체 평가된 좌반구의 7% 내지 49%의 범위였으며, 일부 경색은 동측 측뇌실의 확장을 포함하였다(예를 들어, 도 6 참조). 비히클 그룹에 비해 NR1 처리 그룹(1×105개의 NR1 세포 또는 4×105개의 NR1 세포)에 대해 경색 크기의 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
뇌졸중 후 제10주에 경색 주변 피질의 조직학적 평가를 수행하여 뇌졸중 후 기능 회복의 NR1-관련 향상과 상관관계가 있을 수 있는 숙주-뇌 조직 보존 및/또는 복구의 변화를 확인하였다. 혈관구조(RECA1), 활성화된 미세아교세포/면역 세포(Iba1) 및 축삭의 면역형광 표지를 사용하여 각각 경색 주변 혈관 밀도, 염증 및 축색돌기 보존/성장의 정량적 측정을 얻었다. 결과는 부문 4.4.2 내지 4.4.8에 제시되어 있다. 이러한 분석에 기초하여, 4×105개의 NR1 처리 그룹은 뇌졸중 후 제10주에 비히클 그룹에 비해 활성화된 미세아교세포/면역 세포의 유의한 감소를 나타내었다(스튜던트 t-검정에 의해 p = 0.0340). 그러나, 선형 회귀 분석은 뇌졸중 후 제9주에 각 동물의 기능 회복(수염-발 테스트에 의해 결정됨)과 경색 주변 미세아교세포/면역 세포 활성화 사이에 상관관계가 없음을 나타내었으며, 이는 경색 주변 조직의 염증 조절이 이 뇌졸중 모델에서 고용량 NR1 치료와 관련된 관찰된 회복 향상을 주도하는 주된 메커니즘이 아닐 수 있음을 나타낸다. 또한, 경색 주변 혈관 밀도 및 축색돌기 보존/성장의 조직학적 평가는 처리 그룹 평균 사이에 유의한 차이가 없음을 나타내었고, 선형 회귀 분석에 의해 뇌졸중 후 제9주에 개별 행동 회복과는 상관관계가 없었다.
NR1 세포 지속성은 항-인간 핵 항체(hNUC)로 면역형광 표지함으로써 처리 후 제9주(뇌졸중 후 10주)에 조직학을 평가하였다. 결과는 표 9에 제시되어 있다. NR1으로 처리한 각 동물에 대해, 눈에 보이는 니들 트랙을 포함하는 뇌 절편뿐만 아니라 표적 이식 좌표를 포함하는 뇌 절편을 hNUC 양성 세포의 존재에 대해 수동으로 평가하였다. 평가된 모든 동물에 대해, 처리 후 제9주에 hNUC 양성 세포는 검출되지 않았으며, 이는 NR1 세포가 이 이종이식 손상 모델에서 장기간 지속될 수 없음을 시사한다. 또한, 어떤 평가된 동물에서도 이소성 조직 또는 종양 형성의 징후는 관찰되지 않았다.
결론
현재 연구의 목적은 면역력이 저하된 래트에서 허혈성 피질 뇌졸중 후 제7일에 NR1 이식의 기능적 및 해부학적 효과를 평가하는 것이었다. 뇌 조직의 행동 평가 및 조직학적 평가는 허혈성 손상이 편측성이며, 반대측(오른쪽) 앞다리의 기능에서 가장 두드러진 기능적 손실이 관찰되었음을 확인하였다. NR1 용량의 투여는 연구 기간 동안 동물 건강, 체중 또는 사망률에 악영향을 미치지 않았다.
1×105개의 NR1 세포가 아닌 4×105개의 NR1 세포로의 처리는 비히클 대조군과 비교하여 반대쪽 수염 및 앞다리의 감각운동 기능을 개선하였으며, 이는 이 모델에서 NR1의 잠재적 용량 효과를 나타낸다.
뇌졸중 후 제10주에서의 조직학적 평가는 1×105개의 NR1 세포가 아닌 4×105개의 NR1 세포로 처리한 동물이 처리 그룹 평균에 기초하여 비히클 대조군에 비해 경색 주변 피질에서 감소된 미세아교세포/면역 세포 활성화를 나타내었으며, 그러나 이 결과는 처리 후 제8주에 개별 기능 회복과는 상관관계가 없었다.
평가된 모든 동물에 대해, 투여 후 제9주에 살아있는 인간 세포는 검출되지 않았으며, 이는 NR1 세포가 이 이종이식 손상 모델에서 장기간 지속될 수 없음을 시사한다. 개선된 행동 회복이 4×105개의 NR1 세포로 처리한 동물에서 처리 후 제4주에 시작하여 처리 후 적어도 제8주(연구 종료)까지 지속되는 것으로 관찰되었으며, 이는 장기적인 NR1 지속성이 없을 때 만성적인 회복 향상이 발생하였음을 나타낸다. 어떤 평가된 동물에서도 이소성 조직 또는 종양 형성은 관찰되지 않았다.
실시예 5
NR1은 완제 의약품이다. 이는 NR1 마스터 세포 은행(MCB)에서 만들어지며, NR1 원료 의약품(DS)를 거쳐 제품인 NR1으로 만들어진다. 표 2는 다양한 세포 은행 및 사용된 약물 물질의 명칭을 제공한다.
NR1은 WiCell Research Institute WA09(H9) 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통으로부터 유래되는 확장 가능한 인간 신경 줄기 세포주이다. NR1은 표현형 잠재력 또는 핵형 안정성의 손실 없이 시험관내에서 확장 가능하며 균질한 장기 배양물을 형성한다. NR1에 대한 제조 공정은 hESC의 반복 사용 및 신경 줄기 세포로의 분화를 필요로 하지 않으며, 오히려 15회 계대(p15)에서 동결보존된 NR1 마스터 세포 은행(MCB)의 바이알을 해동시키고, 피더가 없는 부착 배양에서 정의된 배양 배지에서 p18로 확장시켜 NR1 원료 의약품(DS)을 생산하였다.
완제 의약품의 하나의 바이알은 활성 물질로서 6×106개의 NR1 신경 줄기 세포를 포함한다. 세포는 이들이 확장된 배지의 50%와 상업적으로 이용 가능한 동결보존 용액(85%)(ProFreeze CDM, 론자(Lonza)와 DMSO(15%)로 구성된 동결보존 배지 50%에 동결보존하였다.
용량 증량 코호트에 따라, 환자당 2개 내지 12개의 바이알이 해동될 것이고, 세포는 세척되고 다양한 세포 농도로 0.5% HSA가 포함된 PlasmaLyte-A™의 투여 제형으로 농축될 것이며, 주사 부피는 용량 증량 전체에 걸쳐 일정하게 유지될 것이다. 세포는 입체 정위적 두개내 주사를 사용하여 투여될 것이다.
적응증은 안전성, 내약성을 평가를 평가하고 만성 허혈성 피질하 뇌졸중(cISS)이 있는 피험자에서 NR1의 뇌내 이식(ICT)의 효능에 대한 지표를 얻기 위해 설계된 조합된 1상/2상 임상 연구에 사용하기 위한 것이다. 이는 안정적인 허혈성 뇌졸중으로 인한 편측 부전마비가 있는 18세 내지 75세의 피험자에서 NR1 세포의 입체 정위적 두개내 주사를 사용하는 오픈-라벨 안전성 및 내약성 연구로 제안되었다.
의약품 개발
완제 의약품 NR1의 제조가 분병(vialing) 및 동결보존으로 끝나는 공정 중 제어를 최소화하는 하나의 연속 공정이기 때문에, 공정 개발은 원료 의약품과 제품 간에 분리되지 않았다.
생산 종료(End Of Production: EOP) 시 cGMP MCB 유래 NR1 완제 의약품 성장 거동을 조사하기 위해 탐색적 조사 연구를 수행하였다. p18 NR1의 단 하나의 배양물만이 이러한 더 높은 계대 수로 성장하였다. 이 조사는 두 가지 생산 영역; 제로 성장에 도달하기 위한 연산자 효과 및 계대의 수의 변경을 다루었다. 1) EOP 실행은 스탠포드에서 7개의 파일럿 로트와 1개의 연구 로트를 성장시킨 기술자와 다른 기술자에 의해 수행되었으며, 2) EOP는 특정 성장률이 0에 도달하기 전에 얼마나 많은 계대가 발생할 수 있는지 조사하였다.
EOP 샘플의 핵형 분석
세포가 p18 이후에 성장함에 따라 핵형 안정성이 유지되었는지를 결정하기 위해, p28로부터의 동결보존된 세포 샘플을 핵형 분석을 위해 2014년 6월 26일에 위스콘신주 메디슨 소재의 셀 라인 제네틱스(Cell Line Genetics)로 보냈다. 결과는 p28까지의 세포가 정상 핵형임을 나타내었다. p30 물질의 대표적인 샘플은 이 계대에 의한 이론적인 수율이 너무 컸기 때문에 이 계대 수가 cGMP 또는 비임상 생산에서는 결코 발생하지 않을 것으로 결정하였기 때문에 핵형 평가를 위해 제출하지 않았다. 18회 계대와 28회 계대 사이에 세포는 비정상으로 전환된 다음 정상 핵형으로 되돌아간 것 같지는 않다.
EOP 샘플의 마이크로어레이 및 면역조직화학 분석
추가적으로, 이 탐색적 연구의 일환으로, 18회 계대, 24회 계대, 28회 계대 및 30회 계대의 세포 샘플을 UCLA의 William Lowry 박사에게 보내어 NR1 EOP 세포의 전사체(transcriptome) 및 시험관내 분화 특성을 평가하였다. 해당 기법은 현재 cGMP NR1의 출시 테스트를 수행하는 데 사용되는 적격화된 방법이 아니다. 오히려, 이러한 연구는 1) 면역형광 염색의 밀도 또는 밝기의 정성적 관찰을 기반으로 점수를 매긴 계대 시점당 하나의 배양물로부터 배양된 세포의 조직 면역조직화학 염색 또는 2) 재현성이 결정되지 않은 연구-기반 마이크로어레이 분석이었다.
간략하게는, 이 예비 실험으로부터의 결과는 상이한 계대로부터의 NR1 세포가 서로 전사적으로 클러스터링하며, 프로파일링된 임의의 다른 세포 유형(hESC, hiPSC, NSC, 혈관 내피, 평활근, 각질형성세포, 중피, 간세포, 뉴런, 신장 및 근상피)보다 섬유아세포와 더 유사(그러나 고유하게 다름)함을 시사한다. 또한, 제공된 NR1 계대 샘플 중에서, 초기 계대는 이후 계대와 구별되는 것으로 나타났으며, 이는 시간 경과에 따른 일부 선택을 나타낸다. p18의 NR1은 p24 내지 p30에 의해 나타난 것과 유사한 개별 유전자 발현 프로파일을 보여주며, p24 내지 p30은 p18 NR1 DS 세포처럼 함께 클러스터링된다. hESC 계통으로부터 유래되었음에도 불구하고, 주요 다능성 유전자가 분석된 임의의 NR1 계대에서 재활성화되었다는 RNA 또는 단백질 수준의 증거는 없었다. 테스트된 모든 계대에서 NR1 세포는 뉴런, 성상세포 또는 희소돌기아교세포로 분화하는 제한된 능력에 차이를 보이지 않았다.
제조 공정
NR1은 안정적이며 표현형 잠재력 또는 핵형 안정성의 손실 없이 적어도 15회 계대될 수 있는 확장 가능하며 균질한 배양물로부터 형성된다. NR1에 대한 제조 공정은 hESC의 반복 사용 및 신경 줄기 세포로의 분화를 필요로 하지 않으며, 오히려 15회 계대(p15)에서 동결보존된 NR1 마스터 세포 은행(MCB)의 바이알을 해동시키고, 피더가 없는 부착 배양에서 정의된 배양 배지에서 p18로 확장시켜 NR1 원료 의약품(DS)을 생산하였다. 이와 같이, DS의 제조는 DS를 NR1에 채우고, 마무리하고 동결보존하는 연속적인 공정의 일부이기 때문에 NR1 DS의 바이알은 생산되지 않는다.
COH에서 원료 의약품 및 완제 의약품의 cGMP 생산은 2012년 9월 1일에 분병되어 동결보존된 cGMP NR1 MCB의 생성으로 시작되었다. 따라서, 이 "소스(source)" MCB 물질로부터 지금까지 NR1을 제조하기 위해 3회의 cGMP 실행을 수행하였다. 완제 의약품은 원료 의약품으로부터의 연속 공정의 결과이다. 연속 생산 내에서 원료 의약품 및 완제 의약품 단계를 설명하는 데 도움이 되도록 전체 과정의 개략도(도 2)가 본 명세서에 제공된다. 명확성을 위해, 원료 의약품 및 완제 의약품 설명은 다이어그램 내에서 검은색 수평선으로 표시될 뿐만 아니라 수직의 첫 번째 패널에 표시된다. p15, p16 및 p17의 세포는 NR1 MCB 해동 및 후속 확장 시 플레이팅하였지만, 계대 수는 효소적 방출 및 수확 시 1씩 증가한다. 세포 확장 동안, 배양 계대 수는 단층이 트립신에 노출된 후 1씩 증가한다(예를 들어, 16회 계대 세포를 시딩한 다음, 거의 컨플루언트한 단층으로 확장시키고 트립신 처리하면, 생성된 현탁액은 17회 계대로 간주됨).
벌크 원료 의약품(Bulk Drug Substance: BDS)은 효소적 세포 배양 용기 방출 및 초기 풀링된 세포 재현탁에 의한 최종 계대(p18) 수확으로 간주되며, 이는 세포 농도 및 수확된 총 세포를 결정하기 위해 계수된다. 이때, p18의 최종 제형화가 NR1의 분병되고 동결보존된 제제를 위해 시작된다.
완제 의약품인 NR1의 생산 과정은 4일 전에 시딩된 17회 계대 세포로부터 트립신 소화된(방출된) 초기 수확되고, 원심분리되고, 재현탁되어 풀링된 세포로 시작한다.
BDS에 완성된 냉동된 NR1을 채우기까지의 모든 공정 단계는 BDS 수확과 같은 날에 발생한다. 간략하게는, 수확된 세포 농도 및 총 세포 수율을 계산하기 위해 세포를 계수하였다. 그런 다음, 세포를 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 완전 배지에 1.2×107개 세포/㎖로 재현탁시켰다. 세포 농도 충전 정확도를 보장하기 위해 세포를 재계수한 다음, 2x ProFreeze/DMSO 동결 용액으로 1:1(v:v) 희석하여 최종 DMSO 농도가 7.5%가 되도록 하였다. 그런 다음, 이 세포 현탁액을 폴리프로필렌 극저온 바이알당 1㎖의 공칭 부피로 수동으로 채웠다. 분병된 NR1은 제어 속도 극저온 냉동고를 사용하여 동결시킴으로써 동결보존하였다. NR1(완제 의약품)은 기체상 LN2 극저온 냉동고에 보관하였다.
중요 단계 및 중간체의 제어
완제 의약품 제조의 중요 단계는 세포 계수, 원심분리 및 제어 속도 동결보존을 포함한다.
세포 계수: 세포 생존력의 시각화 및 평가를 위해 트립판 블루 염료를 사용하여 수동으로 세포를 계수하였다.
원심분리: 원심분리는 임의의 원심분리기/회전자 조합에 대해 계산될 수 있는 NNN x g로 지정된 속도에 대한 배취 기록 사양에 의해 제어된다. 장비는 cGMP IOQ 문서에 따라 설치하고, COH PM 및 교정 프로그램에 따라 교정하고 유지하였다.
제어 속도 동결보존: 완제 의약품은 평면 제어 속도 냉동고를 사용하여 1.2㎖ 냉동 바이알(부문 3.2.P.7)에 동결보존하였다. COH는 챔버 온도를 -40℃에 도달할 때까지 분당 대략 1℃씩 낮춘 다음 냉각 속도를 가속화하는 "표준" 1.0㎖ 동결보존 동결 프로그램을 사용한다. 프로토콜 SOP-0948A에 따라 동결보존을 수행하였다.
실시예 6
뇌졸중의 설치류 모델에서 신경 가소성 및 이식된 NR1 세포
이 연구의 목적은 NR1 세포가 원위 피질 뇌졸중 후 누드 래트의 경색 주변 영역에서 피질 활동에 어떻게 영향을 미치는지 분석함으로써 가소성에 대한 NR1 세포의 효과를 조사하는 것이었다.
뇌 가소성 또는 리와이어링은 뇌졸중 부위(즉, 경색 주변 영역)에 인접한 생존 회로에서 발생하는 리와이어링과 함께 인간 및 설치류에서 뇌졸중 후 관찰되는 자발적 회복에서 중요한 역할을 한다. 이 가소성은 건강한 뇌 영역이 뇌졸중으로 손상된 영역의 기능을 보상할 수 있도록 한다. 이식된 줄기 세포는 뇌졸중 후 뇌 가소성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 NR1 세포가 누드 래트의 경색 주변 영역에서 피질 활동에 어떻게 영향을 미치는지 연구함으로써 NR1 세포가 가소성에 미치는 영향을 조사하였다.
NR1 파일럿 로트 #7은 cGMP NR1 생산에 사용된 것과 동일한 절차를 사용하여 스탠포드 대학에서 제조하였다:
물질 및 방법
연구 설계의 요약 ― 고속 대량 전기생리학 검정. 이 연구에 사용된 고속 대량 전기생리학 접근법은 다음과 같았다: 원위 피질 뇌졸중을 겪은 후 1주에, 누드 래트에게 NR1 세포 또는 비히클 대조군을 이식하였다. 이식 후 제7일에, 래트를 안락사시키고, 뇌를 수집하고, 살아있는 슬라이스를 만들고, 기록 부위가 모든 피질층에 걸쳐 있도록 다중 채널 기록 프로브를 피질에서 수직으로 경색 주변 운동 피질(M1 영역)에 배치하였다. (전극을 통해 전달되는 짧은 전기 자극을 사용하여) 피질 회로를 활성화한 후, 신경 집단 활동의 척도인 국부장 전위(Local Field Potential)를 모든 피질층에서 동시에 측정하였다.
망막 신경절 신경 세포(RGC)의 시험관내 시냅스생성. 망막 신경절 신경 세포(RGC)를 스탠포드 대학 Barres 실험실의 표준 실험실 프로토콜에 따라 배양하였다. 그런 다음, NR1 세포를 세포 간 접촉은 방지하지만 분비된 인자의 교환은 허용하는 RGC 위의 챔버에서 공동 배양하였다. 대조군으로서, 성상세포를 RGC와 동시에 공동 배양하였다. 24시간 후, RGC를 처리하고, 세포체의 수를 계수함으로써 시냅스생성의 정도를 결정하였다.
NR1 이식 부위를 둘러싼 뇌조직의 RNA 시퀀싱. NR1 및 대조군 비히클을 주입한 래트 뇌의 유전자 발현 패턴을 다음과 같이 조립하였다: 이식 후 제7일에, 래트 뇌 생검으로부터 총 RNA를 추출하고, 표준 분자 생물학 절차에 따라 cDNA 라이브러리를 생성하였다. 7마리의 NR1-처리한 래트 및 4마리의 대조군 비히클-처리한 래트로부터 cDNA 라이브러리를 준비한 후, LuminexR Hiseq 2500 고속 대량 시퀀서를 사용하여 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 후속 유전자 온톨로지 분석은 DESeq2 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
결과 요약
NR1 세포는 저해성 제어로부터 경색 주변 영역에서 개별 뉴런을 방출함으로써 운동 회로 활동을 증가시킨다. 전기 자극 시, 대조군 및 NR1 이식된 그룹은 모두 뇌 표면 근처의 표면층에서 시작하여 더 깊은 층으로 전파되는 특징적인 반응을 생성하였다. 특히, NR1 이식은 이식 후 제7일에 경색 주변 피질에서 운동 회로 활동을 유의하게 증가시켰고(P<0.05), 피질층 2/3에서 가장 현저하게 증가시켰다.
추가적인 실험은 전기 자극을 적용한 후 층 2/3에 있는 개별 피라미드 뉴런으로부터의 반응을 측정함으로써 경색 주변 영역 내의 단일 뉴런이 NR1 처리에 의해 어떻게 영향을 받는지 조사하였다. 후속 분석은 뉴런에서의 전반적인 측정된 반응에 대한 저해성 대 흥분성 연결의 기여도를 확실히 추정할 수 있다. NR1 그룹에서, 기록된 저해성 연결은 크기가 유의하게(P<0.05) 감소하고 발생이 지연된 반면, 흥분성 연결에 대한 NR1의 유의한 효과는 없었다(도 1c). 종합하면, 이러한 데이터는 저해성 제어로부터 경색 주변 영역에서 개별 뉴런을 방출함으로써 운동 회로 활동을 증가시킴을 시사하며, NR1 세포가 뇌 활성을 유리하게 변경함을 보여준다. 생체내에서 가장 고도로 발현된 NR1 인자 중 하나인 NR1-분비된 TGFβ3은 TGFβ3이 뇌졸중 후 피질층 2/3에 있는 뉴런에서 특별히 상향 조절되기 때문에 층 2/3 가소성에 대한 NR1 효과에 관여할 수 있다.
도 13. 경색 주변 영역의 뉴런은 이식된 NR1 세포에 의한 저해성 제어로부터 방출된다. 뇌졸중이 유발된 뇌의 경색 주변 영역에 NR1 세포를 주입하였다. 7일 후, 살아있는 슬라이스에 전기 자극을 주고, 모든 피질층에서 국부장 전위를 동시에 측정하였다. a) L2(흥분성) 및 L3(저해성) 자극에 대한 운동 피질 반응의 시공간적 패턴을 보여주는 히트 맵. b) 다양한 자극에 걸친 피질층 2의 최대 흥분. 데이터는 평균 + SEM이다. c) 층 2 및 층 3에 있는 개별 뉴런으로부터의 반응은 흥분성(Ge) 및 저해성(gi) 구성요소로 분리하였으며, 반응의 크기는 y-축으로 시간은 x-축으로 하였다. 각 조건으로부터의 대표적인 트레이스(trace)가 나타나 있다.
NR1 세포는 시험관내 시냅스생성을 증가시킨다: 생체내에서 가소성을 변경하는 것 외에도, NR1 세포는 시험관내에서 가소성을 변경할 수 있으며, 이 경우에는 시냅스 형성에 의해 변경될 수 있다. 스탠포드 대학의 Barres 실험실과 공동으로 수행한 연구로부터의 결과는 망막 신경절 신경 세포(RGC)와 비접촉 공동 배양한 NR1 세포가 성상세포와 같은 정도로 RGC 시냅스생성을 향상시킴을 나타낸다(도 14 참조). 이 예비 결과는 잠재적 효능 검정 및 가소성 조절과 관련된 NR1-분비 인자를 확인하는 방법을 제공한다.
도 14: 시냅스생성은 NR1 세포의 첨가에 의해 시험관내에서 향상된다. 망막 신경절 신경 세포(RGC)를 성상세포 또는 NR1 세포와 함께 비접촉 조건하에 공동 배양하였다. 세포체를 계수함으로써 시냅스생성을 정량화하였다. 대조군 성상세포와 성상세포 및 NR1 세포 사이에 유의한 차이가 관찰되었다(NR1 세포가 인자의 분비에 의해 시냅스생성을 자극함을 나타냄). 그래프 = 평균 + 평균의 표준 오차(SEM). Dunn의 사후 테스트에 의한 **P<0.01. Kruskal-Wallis 테스트에 의한 ***P=0.003.
저해성 회로의 감소 시 이식된 NR1의 역할을 조사하기 위해, 본 발명자들은 NR1 및 대조군 비히클을 주입받은 래트 뇌의 유전자 발현 패턴을 비교하였다. 이식 후 제7일에, NR1 및 대조군 비히클 이식 부위로부터의 래트 뇌 생검으로부터 RNA를 추출하였다. 7마리의 NR1-처리한 래트 및 4마리의 대조군 비히클-처리한 래트로부터 cDNA 라이브러리를 준비한 후, Hiseq 2500(50개의 페어드-엔드 리드(paired-end read))에 의해 시퀀싱을 수행하였다. 유전자 온톨로지 분석은 NR1 이식을 가소성과 관련된 유전자의 발현과 연결하였으며, 이는 NR1 세포가 초기 단계에서 신경 활동 및 가소성을 조절하여 기능 회복이 늦어짐을 시사한다. 총 267개의 유전자가 NR1 및 대조군 비히클 샘플로부터의 cDNA 라이브러리를 비교할 때 차등적으로 발현되었다(DEG, p<0.05, 도 15).
도 15: NR1 세포가 초기 단계에서 신경 활동 및 가소성을 조절하여 기능 회복이 늦어진다. 뇌졸중 유발된 성인 누드 래트에게 NR1 또는 대조군 비히클을 주입하고, 이식 후 제7일에 희생시켰다. NR1 및 대조군 비히클 샘플의 이식 부위의 뇌 생검으로부터 생성된 cDNA 라이브러리의 유전자 온톨로지 분석은 NR1 세포를 주입받은 뇌가 성체 신경 전구세포 증식, 신경 분화, 뉴런의 전기생리학적 특성에 직접 관여하는 개폐형 채널, 축색돌기 유도, 축색돌기 형성 및 시냅스생성을 자극하는 것과 관련된 유전자를 차등적으로 발현함을 나타낸다.
피질층 2/3에서 차등적으로 발현된 유전자 중에는 Hapln4/Bral2, Kcnc1/Kv3.1, SCN1a, Slit3 및 Slitkr1이 있다(표 3). 이러한 데이터는 이식된 NR1이 초기 단계에서 신경 활동 및 가소성을 조절하여 기능 회복이 늦어짐을 시사한다.
결론. NR1 세포는 저해성 제어로부터 경색 주변 피질에서 개별 뉴런을 방출함으로써 경색 주변 영역의 가소성에 기여한다. NR1 세포는 시냅스생성을 자극하는 분비 인자를 분비함으로써 가소성을 조절한다.
실시예 7
뇌졸중 설치류 모델에서의 염증성 반응
이 연구의 목적은 뇌졸중으로 손상된 누드 래트 뇌로의 NR1 세포의 이식에 의해 촉발된 염증성 반응을 특성화하는 것이다.
만성 뇌졸중에 대한 줄기 세포 요법은 설치류의 기능 회복을 상당히 개선하는 뇌졸중 후 몇 주 내지 몇 달 후에 수행되는 줄기 세포 이식과 함께 전임상 연구에서 흥미로운 가능성을 보여주었다. 전임상 작업은 이식된 세포가 가소성, 염증 및 혈관신생과 같은 뇌의 자연 복구 과정을 조절하는 측분비 인자(예를 들어, VEGF)를 분비함으로써 뇌졸중 후 회복을 향상시킨다는 가설을 뒷받침한다. 따라서, 이식된 줄기 세포가 뇌졸중 후 회복을 유도하는 가능한 작용 메커니즘은 면역 반응/염증의 조절이다. 본 발명자들은 이식된 줄기 세포에 의해 시작된 뇌졸중 회복에서 염증의 역할에 대한 테스트 가능한 모델을 제공하는 장기적인 목표와 함께 뇌졸중 뇌에서의 염증성 반응뿐만 아니라 시험관내 대식세포에 대한 NR1 세포의 효과를 연구하였다.
물질 및 방법
뇌졸중이 유발된 뇌에서 NR1 세포의 이식. 뇌졸중 유발 후 제1주에, 누드 래트를 마취시키고, 스탠포드 대학 승인 프로토콜에 따라 입체 정위 장치에 고정시켰다. 표준 프로토콜(NCP-001.01)에 따라 NR1 세포를 준비하고, Plasmalyte-A 및 0.5% HSA를 포함하는 용액에 1×105개 세포/㎕의 농도로 희석하였다. NR1 세포를 피질 및 선조체에 이식하였다. 피질의 경우, 1.0㎕ 용량의 NR1(총 2×105개의 세포가 주입된 경우 1×05개 세포/주사)을 2회 다음과 같은 미리 결정된 좌표에 이식하였다: AP 1.0, ML 1.2, DV -1.5: AP -1.8, ML 2.0, DV -2.0. 선조체의 경우, 1㎕ 용량의 NR1(1×105개 세포/주사)을 1회 다음과 같은 미리 결정된 좌표에 이식하였다: AP -1.8, ML 2.0, DV -5.0. 세포는 0.5 ㎕/분의 속도로 이식하였다. 모든 세포를 이식한 후, 이식 니들을 천천히 제거하기 전에 추가로 2분 동안 좌표 부위에 유지하였다. 이는 이식 니들의 제거 시 이식 부위에서 "흡입되는" NR1 세포의 발생을 최소화하기 위해 수행하였다.
M1/M2 대식세포의 정량화. 모든 래트 조직을 처리하고, 세포를 단리하고, Steinberg 실험실 프로토콜에 따라 준비하였다. 스탠포드 Shared FACS 시설에서 LSR II 분류기를 사용하여 대식세포/단핵구 세포를 CD11b+ Lin- 세포로 분류하고, M1 전염증성/M2 항-염증성 대식세포를 각각 Ly6C+/- F4/80+ 세포로 분류하였다. 생성된 데이터를 FlowJo 소프트웨어(플로우조 엘엘씨(FlowJo LLC))를 사용하여 분석하였다.
시험관내 방법. 골수-유래 대식세포(BMDM)를 먼저 지질다당류를 사용하여 M1/전염증성 상태로 또는 IL-4를 사용하여 M2/항-염증성 상태로 분극화시켰다. 그런 다음, NR1 세포를 BMDM과 동일한 웰 또는 세포 간의 접촉은 방지하지만 분비된 인자의 교환은 허용하는 대식세포 위의 챔버에서 공동 배양하였다. 24시간 후, BMDM을 처리하고, M1/M2 대식세포에 특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 qPCR 분석을 수행하였다(M1/전염증성 마커 = TNFα CCL3/MIP1a. M2/항-염증성 마커 = CD206, Arg1, TGFβ).
결과 요약
NR1 세포는 이식 후 초기에 면역 반응을 변경한다: 염증성/면역 세포의 서브세트는 손상 후 CNS 회복에 기여한다는 것이 확립되었다. 따라서, 뇌졸중 후 면역 반응을 조절하는 것은 NR1 세포가 회복을 유도하는 메커니즘이 될 수 있다. 위에 기재된 뇌졸중 및 이식 패러다임을 사용하여, 이식 후 서로 다른 시간에 뇌, 혈액 및 비장을 수집하고, 이들의 면역 세포 프로파일을 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 데이터는 면역 반응이 NR1-이식된 래트와 완충액-이식된 래트 사이에서 다름을 나타낸다(도 16a 내지 도 16c). NR1로 처리한 뇌졸중이 유발된 래트는 완충액-처리한 그룹에 비해 더 다양한 반응을 나타내었다. NR1-처리한 래트는 또한 이식 후 제3일에 뇌에서 과립구 및 M1-유사 및 M2-유사 단핵구/대식세포의 수를 증가시키는 경향을 보였다. 5일까지, 이러한 하위집단의 수준은 NR1 그룹에서 감소하였다. 대조적으로, 완충액만으로 처리한 래트는 제5일에(제3일과 비교하여) 단핵구/대식세포의 하위유형 둘 모두에서 증가하는 경향을 보였다. 이는 이러한 집단의 시간적 반응이 처리 그룹 간에 다르다는 것을 시사한다. 혈액에서의 주요 효과는 제5일에 NR1 그룹에서 더 많은 "M2" 단핵구 및 B 조절세포(Breg)이다.
도 16: 래트 뇌졸중으로 손상된 뇌로의 NR1 주입은 면역 반응을 변경한다. NR1 세포를 스탠포드-5 효능 연구에 따라 뇌졸중 유발된 래트의 피질 및 선조체에 이식하였다. 제3일 및 제5일에, 면역 조절 세포의 프로파일을 분석하기 위해 동물을 희생시키고, 뇌, 혈액 및 비장 조직을 FACS를 위해 처리하였다. a) 제3일 및 제5일에 M1-유사 단핵구/대식세포의 프로파일. b) 제3일 및 제5일에 M2-유사 단핵구/대식세포의 프로파일. c) 제3일 및 제5일에 과립구의 프로파일.
NR1 세포는 시험관내에서 대식세포의 분극화를 전염증성에서 항-염증성으로 이동시킨다: 대식세포는 다양한 기능적 하위유형(전/항-염증성)으로 분류되었으며, 이들이 마주하는 미세환경에 따라 하위유형 사이를 전환할 수 있다. 스펙트럼의 한 쪽 끝에는 전형적으로 전염증성인 M1 대식세포가 있으며; 다른 한 쪽 끝에는 일반적으로 항-염증성 매개체를 생성하고 면역조절 및 조직 복구 반응과 관련된 M2 대식세포가 있다. NR1 세포가 대식세포 분극화에 미치는 영향을 결정하기 위해, 골수-유래 대식세포를 전염증성 M1(LPS에 의해) 또는 항-염증성 M2(IL-4에 의해) 하위유형으로 분극화시킨 다음, NR1 세포와 함께 인큐베이션하고, M1-관련 또는 M2-관련 마커의 qPCR 분석을 위해 24시간 후에 수확하였다(도 17a). M1/LPS-자극된 대식세포의 경우, NR1은 M1 전염증성 인자인 TNFα 및 CCL3의 발현을 유의하게 감소시켰고, M2 항-염증성 사이토카인인 IL-10의 발현을 증가시켰다. M2/IL-4 자극된 대식세포의 경우, NR1 세포는 M2 마커(Arg1, CD206, TGFβ)의 발현을 증가시켰다. 이러한 데이터는 NR1 세포가 M2를 증가시키고 M1 대식세포 유전자 발현을 감소시킴으로써 대식세포를 유익한 M2-유사 상태로 유도함을 나타낸다.
도 17: NR1 세포에 의한 대식세포의 시험관내 분극화. 골수-유래 대식세포를 먼저 LPS 또는 IL-4에 의해 각각 M1/전염증성 상태 또는 M2/항-염증성 상태로 분극화시켰다. 그런 다음, M1 및 M2 대식세포를 NR1 세포 또는 대조군 비히클과 함께 배양하였다(참고: 대식세포와 NR1 세포는 서로 접촉하였음). 24시간 후, 세포를 처리하고, M1/M2 대식세포에 특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 qPCR 분석을 수행하였다. a) NR1 세포 또는 대조군 비히클의 존재하에 M1/전염증성 대식세포의 상대적인 유전자 발현. b) NR1 세포 또는 대조군 비히클의 존재하에 M2/항-염증성 대식세포의 상대적인 유전자 발현. 이러한 데이터는 NR1 세포가 M2를 증가시키고 M1 대식세포 유전자 발현을 감소시킴으로써 대식세포를 유익한 M2-유사 상태로 유도함을 나타낸다. 참고: M1/전염증성 마커 = TNFα CCL3/MIP1α. M2/항-염증성 마커 = CD206, Arg1, TGFβ.
이전의 시험관내 실험에서, NR1 세포 및 대식세포는 서로 접촉하고 있었다. 대식세포 분극화에 대한 NR1에 의해 분비된 인자의 효과를 결정하기 위하여, NR1 세포를 대식세포 위의 챔버에서 공동 배양하였다. NR1과 대식세포가 접촉한 공동 배양 실험에서 볼 수 있는 바와 같이, NR1 세포는 또한 이 연구에서 대식세포를 M2/항-염증성 표현형으로 분극화시켰으며, 이는 이러한 효과가 NR1 세포에 의해 분비된 인자 때문임을 나타낸다(도 18). M1 분극화된 대식세포에서, M1 마커 TNFα의 발현은 현저하게 감소하고, M2 마커 TGFβ의 발현은 증가하며, M2 마커 ARG-1은 현저하게 증가한다(도 18a). M2-분극화된 대식세포에서, M1 마커 MIP1a/CCL3 및 TNFα는 현저하게 감소하고, M2 마커 ARG-1은 현저하게 증가한다(도 18b).
도 18: NR1-분비된 인자에 의한 시험관내 분극화. 골수-유래 대식세포를 먼저 이전에 설명한 바와 같이 M1 또는 M2 상태로 분극화시켰다. 그런 다음, NR1 세포를 세포 간의 접촉은 방지하지만 분비된 인자의 교환은 허용하는 대식세포 위의 챔버에서 공동 배양하였다. 24시간 후, 대식세포를 처리하고, M1 또는 M2 대식세포에 특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 qPCR 분석을 수행하였다. a) NR1 분비된 인자 또는 대조군 비히클의 존재하에 M1/전염증성 대식세포의 상대적인 유전자 발현. b) NR1 세포 또는 대조군 비히클의 존재하에 M2/항-염증성 대식세포의 상대적인 유전자 발현. b) NR1 분비된 인자 또는 대조군 비히클의 존재하에 M2/항-염증성 대식세포의 상대적인 유전자 발현. 이러한 데이터는 NR1에 의한 M2/항-염증성 상태로의 관찰된 이동은 분비된 인자로 인한 것임을 나타낸다. 참고: M1/전염증성 마커 = TNFα CCL3/MIP1a. M2/항-염증성 마커 = CD206, Arg1, TGFβ.
NR1-분비된 인자가 자극된 M1/M2 대식세포에만 이러한 분극 효과를 발휘하는지 결정하기 위해, 자극되지 않은 대식세포를 챔버 이전에 설명한 바와 같이 챔버에 배치된 NR1 세포와 함께 공동 배양하였다. M1 마커 MIP1a는 현저한 감소, M2 마커 CD206 및 ARG1의 현저한 증가는 NR1 분비된 인자가 또한 감소하는 M1 마커 유전자 및 증가하는 M2 마커 유전자 발현에 의해 나타나는 바와 같이 자극되지 않은 대식세포를 M2 상태로 유도함을 나타낸다(도 19).
도 19: NR1-분비된 인자에 의한 자극되지 않은 대식세포의 시험관내 분극화. BMDM을 NR1과 함께 공동 배양하되, NR1 세포는 세포 간의 접촉은 방지하지만 분비된 인자의 교환은 허용하는 대식세포 위의 챔버에 배치하였다. 24시간 후, 대식세포를 처리하고, M1 또는 M2 대식세포에 특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 qPCR 분석을 수행하였다. M1 마커(MIP1a)의 상대적인 감소 및 M2 마커(CD206, ARG1 및 TGFβ)의 증가는 NR1 분비된 인자가 또한 M1 마커 유전자를 감소시키고 M2 마커 유전자 발현을 증가시킴으로써 자극되지 않은 대식세포를 M2 상태로 유도함을 나타낸다. 참고: M1/전염증성 마커 = TNFα CCL3/MIP1a. M2/항-염증성 마커 = CD206, Arg1, TGFβ.
결론. NR1 세포는 대식세포를 M1/전염증성 상태에서 M2/항-염증성 상태로 분극화시킴으로써 이식 후 초기에 면역 반응을 변경한다. 시험관내에서, NR1 세포는 M2-대식세포 유전자 발현을 증가시키고 M1-대식세포 유전자 발현을 감소시킴으로써 자극되지 않은 및 M1-/M2-자극된 대식세포를 유익한 M2/항-염증성 상태로 유도하는 인자를 분비함으로써 면역 반응을 변경한다.
실시예 8
미경험 설치류 뇌에서의 NR1 세포 생존 연구.
이 연구의 목적은 이식 후 제1일, 제3일 및 제7일에 미경험 설치류 뇌로 이식된 NR1 세포의 생존 수준을 결정하는 것이다.
설치류의 뇌졸중 유발된 뇌에 NR1 세포를 포함하는 신경 줄기 세포 또는 재생성 세포의 이식이 기능 회복을 상당히 개선한다는 것이 확립되었다. 이 과정의 초기 특성화로서, 이식 후 시간 경과에 따른 NR1 세포의 생존 프로파일을 결정하는 것이 관심사였다. 따라서, 본 발명자들은 미경험 누드 래트의 뇌에 이식된 NR1 세포의 생존율에 대한 연구를 수행하였다.
물질 및 방법
미경험 누드 래트 뇌로의 NR1 세포의 이식. 스탠포드 대학-승인 프로토콜에 따라 성체 래트를 마취시키고, 입체 정위 장치에 고정시켰다. 직장 직장 온도계를 사용하여 동물의 체온을 측정하고, 실험 동안 항온 담요 장치를 사용하여 온도를 유지하였다. 표준 프로토콜(NCP-001.01)에 따라 NR1 세포를 준비하고, Plasma-Lyte A 및 0.5% HSA를 포함하는 용액에 1×105 세포/㎕의 농도로 희석하였다. NR1 세포를 피질 및 선조체에 이식하였다. 피질에서, 1.0㎕ 용량의 NR1(총 2×105개의 세포가 주입된 경우 1×105개 세포/주사)을 2회 다음과 같은 미리 결정된 좌표에 이식하였다: AP 1.0, ML 1.2, DV -1.5: AP -1.8, ML 2.0, DV -2.0. 선조체에서, 1㎕ 용량의 NR1(1×105개 세포/주사)을 1회 다음과 같은 미리 결정된 좌표에 이식하였다: AP -1.8, ML 2.0, DV -5.0. 세포는 0.5㎕/분의 속도로 이식하였다. 모든 세포를 이식한 후, 이식 니들을 천천히 제거하기 전에 추가로 2분 동안 좌표 부위에 유지하였다. 이는 이식 니들의 제거 시 이식 부위에서 "흡입되는" NR1 세포를 최소화하기 위해 수행하였다.
조직 처리. 래트를 세포 이식 후 제1일, 제3일 및 제7일에 1X PBS 및 4% PFA로 관류시켰다. 전체 뇌를 조심스럽게 제거하고, 밤새 고정시킨 후, 30% 수크로스로 평형화하였다. 관상 절편을 AP +1.2에서 시작하여 AP -2.0까지 30㎛로 절단하였다. 동결보호제가 채워진 24-웰 플레이트에 연속 절편을 수집하였다. A-P +1.1에서 시작하여 0.18㎜ 간격의 연속 절편 6개 중 1개가 이식 부위를 포함하므로, 뇌당 이를 수집하였다. 선택된 모든 절편은 표준 면역조직화학 절차를 사용하여 처리하였다.
면역조직화학. 인간 핵을 특이적으로 염색하는 마우스 항-HuNu 1차 항체를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다(1:1000x 희석, MAB1281, 밀리포어, 인크. (Millipore, Inc.)). 1차 항체를 염소-항-마우스-바이오티닐화된 2차 항체(1:1000, 벡터 래보래토리즈(Vector Laboratories))와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척한 다음, 아비딘-바이오틴-퍼옥시데이스 복합체(30분, ABC, Vectastain Elite; 벡터 래보래토리즈)와 함께 인큐베이션하였다. NR1 세포를 시각화하기 위해, 3,3'-다이아미노벤지딘(DAB) 염색을 사용하였으며, 인간 NR1 세포만이 갈색으로 염색되었다. 그런 다음, 절편을 유리 슬라이드에 전방에서 후방 순서로 마운팅하였다.
입체해석학적 세포 계수(Stereological cell count). Stereo Investigator 소프트웨어(엠비에프 바이오사이언스(MBF Bioscience), 미국 버몬트주 윌리스턴 소재)를 사용하여 HuNu-양성 핵의 총 수를 추정하기 위해 광학 분별기 입체해석학적 방법을 사용하였다. 피질 및 선조체는 별도로 계수하였다. 간략하게는, AP +1.2에서 AP -2.0까지(절편 간격 180㎛) 상하부(rostral and caudal)로 확장하여 6번째마다 절편을 샘플링하여 총 3.2㎜에 걸쳐 측정하였다(동물당 약 18개의 절편). 이식된 NR1 세포를 2.5x 대물렌즈를 사용하여 묘사하고, 75×75㎛의 계수 그리드를 생성하였다. 편향되지 않은 계수 프레임을 첫 번째 계수 영역에 놓고, 전체 묘사된 영역을 샘플링할 때까지 모든 계수 영역을 통해 체계적으로 이동시켰다. 63x 유침용 대물렌즈(oil objective)를 사용하여 실제 계수를 수행하였다.
염색된 NR1 세포의 총 수의 추정치를 다음 공식을 사용하여 얻었다: E = k∑N, 여기서 E는 각 동물에서 염색된 NR1 세포의 총 수의 추정치이고, ∑N은 분석된 모든 절편에서의 n값의 합이며, k는 모든 k번째 절편을 고려하였음을 나타낸다.
결과 요약
피질 및 선조체에 이식된 NR1의 생존은 이식 후 제1일 내지 제7일까지 상당히 감소하고: 이식 후 제1일에 피질 및 선조체에서의 생존한 NR1 세포의 백분율은 각각 12.1% 및 29.2%였다. 제3일에, 피질 및 선조체에서 생존한 NR1 세포의 백분율은 각각 10.1% 및 17.5%였다. 제7일에, 피질/선조체에서 생존한 NR1 세포의 백분율은 각각 2.1% 및 2.8%로 유사하였다(도 20). 피질 또는 선조체 이식에서 제1일과 제3일 사이에 생존한 NR1 세포의 백분율에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 그러나, 피질 및 선조체 이식 모두에서 1일 및 7일과 3일 및 7일 사이에 유의한 차이가 관찰되었다.
도 20: 미경험 누드 래트에서 피질/선조체 이식에서의 NR1 세포의 생존. 래트의 피질(1×105개 세포/주사로 1㎕ 주사 2회) 또는 선조체(1×105개 세포/주사로 1㎕ 주사 1회)에 NR1 세포를 이식하였다. 래트를 이식 후 제1일, 제3일 및 제7일에 희생시키고, 각 시점으로부터의 뇌 조직의 30㎛ 절편을 DAB 및 Iba1(인간/NR1 핵만을 검출함)으로 염색하였다. NR1 핵의 수를 광학 분별기 입체해석학적 방법을 사용하여 각 절편 내에서 염색된 핵을 계수함으로써 광학 현미경으로 정량화하였다. 1일 및 7일과 3일 및 7일 사이에 피질 및 선조체 이식 모두에서 생존한 NR1 세포의 백분율에 유의한 차이가 관찰되었다.
결론. 생존한 NR1 세포의 백분율은 피질 및 선조체 모두에 이식한 후 1일에서 3일까지 크게 감소하지 않았다. 생존한 NR1 세포의 백분율은 피질 및 선조체 이식 모두에서 이식 후 1일에서 7일까지 그리고 3일에서 7일까지 크게 감소하였다. 피질 및 선조체 이식 모두에서 생존한 NR1 세포의 백분율은 이식 후 제7일에 약 2% 내지 3%였다.
실시예 9
NR1 세크레톰 분석 연구
이 연구의 목적은 NR1 세포의 세크레톰을 특성화하는 것이다.
설치류의 뇌졸중 유발된 뇌로의 NR1 세포의 이식은 설치류에서 기능 회복을 상당히 개선한다는 것이 확립되었다. 이 과정의 초기 특성화로서, 시간 경과에 따른 NR1 세포의 세크레톰 프로파일을 결정할 필요가 있다. 따라서, 본 발명자들은 시험관내 및 생체내에서 NR1의 세크레톰에 대한 연구를 수행하였다.
물질 및 방법
연구 설계의 요약
뇌졸중 유발된 뇌에서 NR1 GFP-태깅된 세포의 이식. 뇌졸중의 유발 후 제1주에, 누드 래트를 마취시키고, 스탠포드 대학 승인 프로토콜에 따라 입체 정위 장치에 고정하였다. 직장 온도계를 사용하여 동물 온도를 측정하고, 실험 동안 항온 담요 장치를 사용하여 온도를 유지하였다. GFP-태깅된 리보솜 서브유닛을 포함하는 NR1 세포를 표준 프로토콜에 따라 처리하고, Plasma-Lyte A 및 0.5% HSA를 포함하는 용액에 1×105개 세포/㎕의 농도로 희석하였다. NR1 세포를 선조체에 이식하였다. 1㎕ 용량의 NR1GFP-태깅된 세포(1×105개 세포/주사)를 1회 다음과 같이 미리 결정된 좌표에 이식하였다: AP -1.8, ML 2.0, DV -5.0. 세포는 0.5 ㎕/분의 속도로 이식하였다. 모든 세포를 이식한 후, 이식 니들을 천천히 제거하기 전에 추가로 2분 동안 좌표 부위에 유지하였다. 이는 이식 니들의 제거 시 이식 부위에서 "흡입"되는 NR1 세포를 최소화하기 위해 수행하였다.
TRAP. 생체내 세크레톰: 2일 후, 래트를 희생시키고, NR1-GFP 이식을 받은 뇌 조직의 영역을 확립된 절차에 따라 TRAP 분석을 위해 처리하였다. 간략하게는, 리보솜 및 이들의 결합된 mRNA를 항-GFP 항체를 사용한 친화성 정제를 통해 단리하였다. 결합된 mRNA 종을 추가로 단리하고, RNA 시퀀싱 및 분석을 수행하였다.
시험관내 세크레톰: NR1 GFP-태깅된 세포를 NR1 완전 배지(0.1% 및 1% 인간 혈청 포함)에서 24시간 동안 배양하였다. 유전자 수준에서 시험관내 세크레톰을 분석하기 위해, NR1 세포를 단리하고, 위에 기재된 바와 같이 TRAP/RNA seq 분석을 수행하였다.
단백질 분석. 단백질 수준에서 시험관내 세크레톰을 분석하기 위해, NR1 배양물로부터의 조건화된 완전 배지를 알려진 분비된 인자에 특이적인 항체를 포함하는 단백질 마이크로어레이 칩 및 면역 조절 인자에 대한 편향이 있는 63-plex Luminex 검정(Immune Monitoring 63-Plex Human ProCartaPlexR Panel, 카탈로그 번호 EPX650-10065-901)에 의해 분석하였다. 완전 배지는 1% 인간 혈청(PHS)을 포함하기 때문에, 혈청 단백질이 NR1 세크레톰 시그니처를 차폐할 가능성이 있다. 이를 제어하기 위해, 낮은(0.1%) 인간 혈청에서 성장시킨 세포를 사용하여 NR1 세크레톰 분석을 실행하였다. 낮은 혈청 조건이 NR1 세크레톰 분석을 변경시킬 수 있다는 우려를 해결하기 위해, 정상(1%) 인간 혈청에서 성장시킨 NR1으로부터의 조건화 배지(conditioned media: CM)에 대한 동시 세크레톰 분석을 실행하였다.
결과 요약
생체내 세크레톰의 TRAP 분석은 NR1 세포가 뇌 복구 및 축색돌기 유도를 조절하는 인자를 발현함을 나타낸다: 생체내 세크레톰: TRAP 및 RNA 시퀀싱을 사용하여, 이식된 NR1 세포의 생체내 세크레톰의 분석은 분비된 단백질을 암호화하는 175개의 유전자를 확인하였다. 이러한 유전자의 유전자 온톨로지 분석은 상위 20개의 많은 프로세스(도 21)가 세포외 기질(ECM) 리모델링(대부분의 뇌 복구 메커니즘에 관여함), 염증 및 축색돌기 유도와 관련된 프로세스를 포함하는 뇌 복구와 관련이 있음을 나타내었다. 이러한 데이터는 NR1 분비된 인자가 뇌 복구 및 축색돌기 유도의 조절에 역할을 한다는 가설을 뒷받침한다.
생체내에서 NR1에 의해 대부분 고도로 발현되는 분비된 유전자 중 일부는 다음을 포함한다: ECM 조직화에 관여하며 백혈구 이동 및 염증에 영향을 미칠 수 있는 Col1A1(콜라겐 유형 1 알파 1 사슬)4; 뇌졸중 후 생체내에서 대식세포 분극화를 M2-유사(보다 항-염증성) 상태로 이동시키는 것으로 나타난 LGALS1(갈렉틴 1); ECM 형성을 조절하며 전염증성 및 항-염증성 효과 모두를 갖는 TGFβ3; ECM 분해에 관여하는 MMP의 저해제인 TIMP1. 또한, 이는 마이엘린 복구 역할을 하는 성장 인자로 작용하는 MMP-독립적인 작용을 한다. DAVID Bioinformatics Resources에 의해 가소성에 관여하는 것으로 확인된 생체내 세크레톰에서 NR1에서 더 고도로 발현되는 유전자 중 일부는 다음을 포함한다: COL6A1, COL3A1, MMP2, SPARC, NRG3 및 SDF1.
도 21: NR1 생체내 세크레톰의 유전자 온톨로지는 NR1 세포가 뇌졸중 회복과 관련된 유전자를 발현함을 나타낸다. NR1 세포를 이전에 설명한 바와 같은 뇌졸중 유발된 래트에 이식하였다. 이식 후 제2일에, 뇌 조직을 처리하고, NR1 세포로부터 GFP-태깅된 리보솜을 확립된 프로토콜에 따라 단리하였다. 단리된 RNA 전사체를 단리하고, 시퀀싱한 다음 분석하였다. a) 생물학적 프로세스를 기반으로 발현된 유전자를 그룹화하는 유전자 온톨로지 분석. b) 분자 기능을 기반으로 발현된 유전자를 그룹화하는 유전자 온톨로지 분석.
시험관내 세크레톰: 배양된 NR1 세포의 TRAP/RNAseq는 분비된 인자를 암호화하는 433개의 유전자를 시험관 내에서 확인하였다. 후속 유전자 온톨로지 분석은 상위 5개의 생물학적 프로세스가 NR1-관련 뇌졸중 회복에 중심이 되는 프로세스를 포함함을 보여주었다: 염증(162개의 유전자, 이들 중 144개의 유전자는 사이토카인 활성과 관련된 단백질을 코딩함) 및 ECM 조직화(65개의 유전자). DESeq2 소프트웨어를 사용하여 NR1의 시험관내 및 생체내 RNA 서열-세크레톰 데이터를 비교한 결과 뇌졸중 미세환경에 대한 반응으로 이들 중 생체내에서 발현된 175개의 분비된 유전자가 하향 조절되었으며, 34개는 상당히 상향 조절되는 것으로 나타났다. 생체내에서 확인된 관심 유전자 중, NRG3 및 TGFb3은 뇌졸중 환경에 대한 반응으로 상향 조절된 반면, 대부분의 유전자의 발현은 시험관내 및 생체내에서 크게 다르지 않았다. 이는 임의의 이러한 관심 유전자가 NR1 효능 마커의 잠재적 후보가 될 수 있음을 시사한다.
단백질 수준에서 시험관내 세크레톰을 특성화하기 위해, NR1 배양물로부터의 CM에 대해 두 가지 검정을 수행하였다.
검정 1: 알려진 분비된 인자에 특이적인 항체를 포함하는 단백질 마이크로어레이 칩에서 CM을 테스트하였다. 5개의 단백질(FGF18, CSF3, CCL2, FGF7 및 FGF17)이 가소성, 염증 및 혈관신생에 대한 알려진 효과를 기반으로 NR1 작용 메커니즘에 잠재적으로 관여하는 것으로 밝혀졌다. 이 중, CCL2만이 시험관내 RNA 서열 분석에서 강력한 발현을 보였다.
검정 2: CM에 대해 63-plex Luminex 검정(면역 조절 인자에 대한 편향 포함)을 실행하였다. 확인된 25개 인자 중, 가장 두드러진 요인은 다음과 같다: 플라스미노겐 활성인자 저해제 1(PAI1/세르핀 1) ― 세포외 기질 리모델링의 조절인자; VEGF ― 축색돌기 발아, 신경발생 및 시냅스생성을 또한 촉진하는 혈관신생 인자; MCP1 ― 단핵구 및 DC를 포함하는 면역 세포에 대한 화학주성; 및 SDF1a ― 혈관신생 인자, 및 림프구 및 신경 전구체 화학주성(도 22). 이러한 결과는 NR1 세포가 낮거나 또는 정상적인 인간 혈청 수준(각각 0.1% 및 1%)에서 배양될 때 관찰되었다.
도 22: NR1은 뇌졸중 회복과 관련된 단백질을 분비한다. NR1 세포를 낮은(0.1%) 인간 혈청 또는 정상적인 인간 혈청(1%)의 완전 배지에서 배양하였다. 24시간 후 CM을 수집하고, 63-plex Luminex 검정을 실행하였다. a). CM으로부터의 샘플 및 배지-단독(대조군) 샘플의 낮은(0.1%) 및 정상적인(1%) 인간 혈청(0.1%) 샘플 모두에 대한 평균 형광 강도(Mean fluorescence intensity: MFI). b). 가장 두드러진 NR1-분비된 인자는 단핵구 및 수지상 세포의 화학주성(MCP-1), ECM 리모델링(PAI1), 림프구 및 신경 전구체(SDF-1)에 대한 화학주성 및 혈관신생(VEGF)에 관여한다.
결론. NR1 세포의 생체내/시험관내 세크레톰은 NR1 세포가 늦은 기능 회복과 관련된 과정에 관여하는 다양한 인자를 조절하는 인자를 분비함을 나타낸다.
실시예 10
미경험 NSG 마우스 뇌에서 이식된 NR1 생존에 대한 미세아교세포 고갈의 효과
이 연구의 목적은 미경험 NSG 마우스 뇌로의 NR1 이식 전 및 후에 PLX5622를 사용하여 미세아교세포를 고갈시키는 것이 NR1 생존을 증가시킬 것인지를 결정하는 것이다.
NR1 세포는 설치류 뇌로의 이식 후 매우 짧은 생존 기간을 가지며, 약 2%의 세포만이 이식 후 제1주에 생존한다. 세포에 대한 숙주 면역 반응은 NR1 생존에 해로운 영향을 미칠 수 있다. 미세아교세포는 뇌 상주 대식세포이며 이식된 NR1 세포에 대한 최초 반응자일 가능성이 높기 때문에, 본 발명자들은 PLX5622에 의한 미세아교세포 고갈이 미경험 NSG 마우스 뇌에서 이식된 NR1 생존에 미치는 영향을 연구하였다.
연구 설계의 요약. 실험의 개요
a) NSG 마우스에서 PLX5622에 의한 미세아교세포 고갈의 테스트
b) PLX5622로 미세아교세포 고갈 후 NR1 생존의 테스트
i. 연구 1: 선조체 + 피질 NR1 이식
ii. 연구 2: 선조체 NR1 이식만
PLX5622에 대한 노출에 의한 성체 NSG 마우스에서의 미세아교세포 고갈. 케이지당 5마리의 마우스가 수용된 성체 NOD scid 감마(NOD scid gamma: NSG) 마우스에 표준 사료 또는 CSF1-/미세아교세포 세포를 표적으로 하는 약물인 PLX5622를 ㎏당 1200㎎ 포함하는 표준 사료를 공급하였다. 화학 물질 PLX5622는 플렉시콘(Plexxikon)(캘리포니아주 버클리 소재)으로부터 제공받았으며, 리서치 다이어트(Research Diets)(뉴저지주 뉴 브런즈윅 소재)에 의해 AIN-76A 표준 사료로 제형화하였다. NSG 마우스에게 1주 또는 3주 동안 대조군 또는 PLX5622 사료를 임의로 공급하였다. 3주의 처리 후, 마우스의 뇌에 NR1 세포 이식을 하였다. 이식 후, 마우스에게 추가적인 7일 동안 표준 사료 또는 PLX5622 사료를 유지하였다. 처리 동안, 마우스가 건강하다는 것을 확인하기 위해 먹이를 공급하는 간격으로 마우스를 모니터링하였다. 먹이는 마우스에게 공급할 때까지 멸균 백에 보관하였다. 동물을 화학 물질의 이름(PLX5622), 투여량, 동물에게 투여된 날짜/시간, 예상 치료 종료 날짜 및 노란색의 위험 약물 스티커를 포함하는 구체적인 정보가 적인 분홍색 카드로 내용이 표기된 케이지에 넣어 Steinberg 실험실의 마우스 룸(SCORE, P059N)에 수용하였다. 먹이의 수준 및 적절한 라벨링을 보장하기 위해 주당 2회 케이지를 점검하였다.
미경험 NSG 마우스로의 NR1 세포의 이식을 위한 수술 절차. Steinberg 실험실에서 확립된 수술 절차에 따라 NR1 이식 수술을 위해 성체 미경험 NSG 마우스를 준비하였다. NR1 세포를 PCP-001.01을 사용하여 1×105개 세포/㎕의 최종 농도로 준비하고, 제안된 임상 제형(Plasma-Lyte A + 0.5% HSA)으로 뇌내 주사로 투여하였다. 연구 1의 경우, 세포를 다음 좌표로 선조체(2㎕/주입 부위, 즉, 2×105개 세포/침착물; 4×105개 세포 총) 및 피질(1㎕/주입 부위, 즉, 1×105개 세포/침착물, 2×105개 세포 총)에 주입하였다:
AP: -0.34, ML: +2.5, DV: -2.5(선조체)
AP: -0.34, ML: +2.5, DV: -0.95(피질)
AP: +0.96, ML: +1.5, DV: -2.25(선조체)
AP: +0.96, ML: +1.5, DV: -0.75(피질)
연구 2의 경우, 피질의 '누출(leaking out)'로 인한 세포의 잠재적 손실을 줄이기 위해 세포를 선조체에만 주입하였다. 동일한 선조체 좌표 및 주사 부피를 위와 같이 사용하였다. 의도된 임상 전달 후 모델링된 Hamilton 마이크로시린지를 사용하여 NR1 투여를 수행하였다. 별도의 동물 그룹에 동일한 주사 방법을 사용하여 비히클 대조군(Plasma-Lyte A + 0.5% HSA)을 주입하였다. 세포는 0.5 ㎕/분의 속도로 이식하였다. 모든 세포를 이식한 후, 이식 니들을 천천히 제거하기 전에 추가로 2분 동안 좌표 부위에 유지하였다. 이는 이식 니들의 제거 시 이식 부위에서 "흡입"되는 NR1 세포를 최소화하기 위해 수행하였다. 임상 관찰 및 체중 기록에 의해 동물의 일반적인 건강을 매주 모니터링하였다. 생전 평가의 완료 후, 후속 FACS 분석을 위해 지정된 처리 후 시점에서 뇌 조직을 수집하였다.
미세아교세포 세포의 정량화. 모든 마우스 조직을 처리하고, 세포를 단리하고, 실험실 프로토콜에 따라 준비하였다. 미세아교세포는 계통 마커 B220, CD3, CD11c, CD49b, CD90.2, Ly6G, NK1.1, Ter119를 포함하는 'Lin'과 함께 CD45int/CD11b + /Lin-으로 정의하였다. 미세아교세포 세포를 스탠포드 공유 FACS 시설에서 LSR II 분류기를 사용하여 정량화하고, FlowJo 소프트웨어(플로우조 엘엘씨)를 사용하여 생성된 데이터를 분석하였다.
생존한 NR1 세포의 정량화를 위한 조직 처리. 세포 이식 후 제7일에 1 X PBS 및 4% PFA로 마우스 뇌를 관류하였다. 전체 뇌를 조심스럽게 제거하고, 밤새 고정시킨 후, 30% 수크로스로 평형화하였다. 관상 절편을 AP +1.2에서 시작하여 AP -2.0까지 30㎛로 절단하였다. 동결보호제가 채워진 24-웰 플레이트에 30㎛ 두께의 연속 절편을 수집하였다. 연구 1의 경우, 0.18㎜ 간격의 연속 절편 6개 중 1개를 전체 뇌에 걸쳐 수집하고; 연구 2의 경우, 0.12㎜ 간격의 연속 절편 4개 중 1개를 수집하였다. 모든 선택된 절편은 표준 면역조직화학 절차를 사용하여 처리하였다.
뇌 절편의 면역조직화학. 뇌 절편을 항-인간 항체(1:1000x 희석의 항 HuNu, MAB1281, 밀리포어, 인크.)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 2차 항체를 바이오티닐화된 2차 항체(1:1000, 벡터 래보래토리즈)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 아비딘-바이오틴-퍼옥시데이스 복합체(30분, ABC, Vectastain Elite; 벡터 래보래토리즈)와 함께 인큐베이션하였다. 3,3'-다이아미노벤지딘(DAB) 염색을 사용하였으며, 인간 줄기 세포만이 갈색이었다. 그런 다음, 절편을 유리 슬라이드에 전방-후방 순서로 마운팅하였다.
NR1 세포 계수. Stereo Investigator 소프트웨어(엠비에프 바이오사이언스, 미국 버몬트주 윌리스턴 소재)를 사용하여 NR1 세포를 계수하였다. 뇌 슬라이스당 생존한 세포 수가 적기 때문에, 입체해석학적 계수 방법을 사용하지 않고 염색된 절편의 모든 세포를 계수하였다. 맹검 방식으로 63x 유침용 대물렌즈를 사용하여 계수를 수행하였다. 간략하게는, 전체 뇌에 걸쳐 확장되는 모든 여섯 번째 절편(연구 1) 또는 네 번째 절편(연구 2)을 샘플링하였다. 총 NR1 세포 수는 1:6 시리즈에서 계수된 세포 수의 6x 또는 1:4 시리즈에서 계수된 세포 수의 4x로 계산하였다.
결과
PLX5622 사료를 먹인 마우스는 미세아교세포 수준이 감소하였다. PLX5622를 먹인 NSG 마우스는 뇌에서 미세아교세포 수준의 상당한 감소를 보였고, PLX5622 처리 1주에 비해 3주 후 더 큰 미세아교세포 고갈이 관찰되었다. NR1 이식 전 1주 동안 PLX5622를 먹인 마우스에서, 미세아교세포 수준은 대조군 그룹의 61%였으며, 즉, 40% 감소하였다. NR1 이식 전 3주 동안 PLX5622를 먹인 마우스에서, 미세아교세포 수준은 대조군 그룹의 25%였으며, 즉, 75% 감소하였다. 이러한 데이터에 기초하여, 후속 NR1 생존 연구를 위해 PLX5622를 이용한 3주 전처치를 선택하였다.
도 23: PLX5622는 뇌 미세아교세포를 유의하게 고갈시켰다. NSG 마우스에 희생시키기 전 a) 1주 또는 b) 3주 동안 PLX5622 또는 대조군 사료를 먹였다. 평균 ± SD. 양측 t-검정에 의해 *p<0.05; Welch 보정을 사용한 양측 t-검정에 의해 ***p<0.001.
NR1 생존에 대한 미세아교세포 고갈의 효과. NSG 마우스에게 NR1 뇌내 이식 전 3주 동안 그리고 NR1 이식 후 1주 동안 PLX5622 사료 또는 대조군 사료를 먹였으며, 그 후 동물을 희생시켰다. NR1 생존이 대조군 및 PLX5622 그룹 모두에서 관찰되었다(도 24).
도 24: NSG 마우스 뇌에서의 NR1 생존. 미경험 NSG 마우스에게 위에 설명한 바와 같이 대조군/PLX5622 마우스 사료를 먹이고, NR1 이식 후 제7일에 희생시켰다. 마우스 선조에서 생존한 NR1을 검출하기 위해, 대조군 및 PLX5622 샘플로부터의 뇌 조직의 30㎛ 절편을 인간/NR1 핵만을 검출할 수 있는 HuNu로 염색하였다. a) 염색된 NR1 세포(빨간 화살표)를 보여주는 대조군 마우스 먹이를 먹인 미경험 NSG 마우스 30㎛ 뇌 절편의 대표 이미지. b) LX5622 마우스 먹이를 먹인 미경험 NSG 마우스로부터의 해당 염색 절편.
연구 1: 이 연구에서, NR1 세포는 동일한 니들 트랙을 사용하여 선조체 및 피질 모두에 이식하였다. 전반적으로, PLX5622-처리된 동물에서 NR1 생존이 증가하는 경향이 있었지만, 이는 통계적으로 유의하지 않았으며, NR1 생존은 2.37%로 매우 낮았다.
연구 2: 이 연구에서, NR1 세포는 니들 트랙을 따라 뇌로부터 세포가 누출될 가능성을 최소화하기 위해 선조체에만 이식하였다. NR1 생존의 정량화는 PLX5622-처리된 동물에서 증가된 NR1 생존에 대한 약간의 경향을 보여주었다.
결론. PLX5622는 뇌에서 미세아교세포 세포의 수를 유의하게 감소시킨다. NSG 마우스에서 미세아교세포의 수가 고갈되면 이식 후 제7일에 생존한 NR1 세포의 백분율은 약간만 증가한다.
실시예 11
만성 뇌졸중에서 NR1-유도성 기능 회복의 예측인자로서
T2-FLAIR 신호 및 TSPO-PET
뇌졸중 환자에서 NR1-유도성 기능 회복의 임상적 예측인자로서 래트 모델에서 T2-FLAIR MRI 신호를 사용하여 만성 뇌졸중에서 NR1 이식의 면역조절 효과를 조사하기 위한 것이다.
뇌졸중으로 인한 만성 장애에 대한 '치유'를 달성하는 것은 최근 2건의 줄기 세포 임상 시험 후에 현실에 한 걸음 더 가까워졌다. 이러한 초기 단계 시험에서, 줄기 세포를 모든 자연 회복 이 정체된 뇌졸중 발생 후 6개월에서 1년이 지난(즉, 만성 시점) 환자의 뇌에 주입하였다. 그러나, 줄기 세포 치료를 통해, 대부분의 환자는 임상적으로 의미 있는 개선을 경험하였다. 특히, SanBio 시험에서 두 명의 환자가 상당한 사지 사용을 회복하는 놀라운 회복을 나타내었다.
이러한 결과는 이러한 회복을 촉발하기 위해 이들 환자의 뇌에서 발생한 일에 대한 근본적인 질문을 제기한다. 잠재적인 단서는 이식 후 6개월, 12개월 및 24개월에 운동 회복의 정도가 뇌 MRI 신호― 특히, 주로 전운동 피질에 주로 위치한 T2-FLAIR 신호의 크기와 양의 상관관계가 있다는 SanBio 시험의 놀라운 발견이다. 이는 FLAIR 신호를 유발하는 줄기 세포-유도성 뇌 변화를 확인함으로써 본 발명자들이 뇌졸중 회복과 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 분석할 수 있음을 의미한다.
연구 목적. 줄기 세포-유도성 FLAIR 신호의 기저에 있는 뇌 변화를 조사하기 위해, 본 발명자들은 뇌졸중의 만성기에서 줄기 세포 이식을 통해 만성 피질하 뇌졸중의 래트 모델에서 이 현상을 재현하였다.
T2-MRI FLAIR 신호는 종종 염증과 관련되기 때문에, 본 발명자들은 염증과 일치하는 래트에서의 FLAIR 병변에 대한 예비 면역조직화학 분석을 수행하였다. SanBio 시험에서 FLAIR 신호와 회복 사이의 상관관계를 고려할 때, 이는 뇌 염증이 만성 단계에서 뇌졸중 회복에 유용한 바이오마커가 될 수 있음을 의미한다.
이를 더 큰 민감도와 특이도로 조사하기 위해, 본 발명자들은 래트에서 뇌 염증을 모니터링하기 위한 두 번째 비침습적 이미징 양식 ― 전위 단백질 18kDa(TSPO)의 PET, 즉, TSPO-PET 이미징을 확립하였다. 건강한 뇌에서, TSPO 수준은 낮지만, 신경 염증성 조건하에 TSPO는 현저하게 상향 조절된다. TSPO를 발현하는 우세한 세포 유형은 뇌 상주 면역 세포, 미세아교세포 및 성상세포 및 침윤성 골수 세포, 예컨대, 단핵구/대식세포, 호중구 및 수지상 세포를 포함하여 활성화된 면역 세포이다. 따라서, TSPO-PET 방사성 리간드는 신경 염증의 유용한 지표의 역할을 하며, 뇌졸중 후 5일에서 24개월에 이르는 연구에서 뇌졸중 환자의 뇌졸중 병변 및 원격 뇌 영역 모두에서 증가된 TSPO-PET 신호가 관찰되었다.
연구 설계/방법
피질하 뇌졸중의 봉합사 모델을 사용하여 스프래그 다우리(SD) 래트에서 T2-FLAIR 연구를 수행하였다. 줄기 세포 이식은 SanBio 임상 시험의 매개변수를 가장 잘 모방하기 위해 만성기(뇌졸중 후 1개월)에 수행하였다. 처리 그룹에 대해 맹검인 실험자가 FLAIR 병변 분석을 수행하였다. Steinberg 실험실 IHC 프로토콜에 따라 FLAIR 병변과 관련된 니들 트랙 영역의 면역조직화학 분석을 수행하였다.
피질 뇌졸중의 dMCAO 모델을 사용하여 누드 래트에서 뇌졸중의 아급성기(뇌졸중 후 7일)에 NR1 세포의 피질 이식을 이용한 TSPO-PET 연구를 수행하였다.
결과
T2-MRI FLAIR. 설치류 FLAIR 신호는 이식 후 첫 주에 니들 트랙을 따라 일시적으로 나타나지만 세포가 피질하로 이식되고 있음에도 불구하고 운동 피질에서 가장 널리 퍼져 있다는 점에서 인간 대응물을 모방한다. 음성인 확산 가중 이미징(diffusion weighted imaging: DWI)은 FLAIR 신호가 새로운 급성 허혈성 경색으로 인한 것이 아님을 나타낸다(DWI는 보다 전통적인 MRI 측정보다 뇌졸중 후 초기 변화에 더 민감하다). 특히, 본 발명자들은 비히클 주입 후 FLAIR 신호가 관찰되지 않아 FLAIR 신호가 세포-특이적 현상임을 확인하였다. 이러한 데이터는 세 가지 별도의 실험에서 일관되게 발견되었다.
면역조직화학 분석. FLAIR 병변과 관련된 니들 트랙 영역의 면역조직화학 분석은 NR1-처리한 동물과 비히클-처리한 동물 사이에 염증성 반응의 정성적 차이를 보여준다. 이식 후 제1일에, 세포-처리한 동물은 더 많은 Iba1-양성 대식세포/미세아교세포를 갖는 것으로 보이며, 특히 니들 트랙의 경계에서 더 활성화된 아메바형 세포를 나타내었다. 성상세포(GFAP) 수는 크게 다르지 않지만, 세포 동물에서 성상세포는 비히클 동물보다 더 농밀한 기본 프로세스 및 더 적은 분기를 가지고 있어, A1 대 A2 분극화를 형태학으로 확인할 수는 없지만 더 활성화된 상태를 나타낸다. 이러한 데이터는 FLAIR 병변에서 염증성 반응을 수정하는 NR1의 선례를 확립한다.
도 25. NR1 이식 전후 래트 피질에서의 T2-FLAIR 신호. (A) 뇌졸중 위치(회색) 및 이식 좌표의 도식. (B) 이식(tx) 전후 래트로부터의 니들 트랙 영역의 T2-FLAIR MR 이미지(빨간색 화살표는 FLAIR 신호를 나타냄). (C) FLAIR 신호의 정량적 분석. 평균 ± SEM; 별도의 실험에서 n=5/그룹. 이 작은 n에서 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
도 26. FLAIR 병변과 관련된 니들 트랙 영역의 면역조직화학 분석. NR1 또는 비히클로 처리 후 제1일에 피질 뇌졸중 손상이 있는 SD 래트의 분석. GFAP는 성상세포를 나타낸다. *는 니들 트랙을 나타낸다.
도 27. NR1 이식은 뇌졸중 후 TSPO-PET 신호를 증가시킨다. 피질 뇌졸중 손상이 있고 뇌졸중의 아급성기(뇌졸중 후 7일)에 NR1의 피질 이식을 받은 누드 래트(A)는 NR1의 이식 후 처음 3일 동안 증가된 피질 TSPO 신호를 나타내었지만, 비히클-처리한 래트에서는 그렇지 않았다(B, C: 평균 ± sem; n=6). 이식 후 제3일에 증가된 TSPO 신호는 이식 부근(B), 경색 코어(B: 빨간색 점선 영역이 코어를 나타냄), 기저핵(D의 화살표: 방사선사진 및 크레실 바이올렛 염색) 및 해마(미도시)에 있었다.
본 발명의 TSPO-PET 데이터는 FLAIR 데이터와 일치하며, 이는 비히클-처리한 래트에 비해 NR1에서 더 높은 면역 세포 활성을 보여준다. 이는 이식 부위 근처와 더 멀리 떨어져 있지만 연결된 뇌 영역 모두에서 관찰되었으며, 이는 NR1의 광범위한 면역조절 효과를 암시한다. 원격 염증은 해로운 것으로 간주된다. 그러나, 만성 뇌졸중 환자에서, 원격 뇌 영역의 TSPI-PET 신호는 기능 회복과 상관관계가 있었다. 따라서, 원격 염증은 뇌졸중의 이 단계에서 유익할 수 있다.
본 발명의 생체내 세크레톰 분석 및 SanBio 임상 시험과 함께 이 작업은 뇌졸중 회복에서 줄기 세포의 주요 작용 메커니즘으로서 면역조절을 강력하게 암시한다.
실시예 12
NR1 독성학 요약
NR1 약물을 사용하여 수행된 GLP 독성학 연구 및 3개의 파일럿 독성학 연구는 뇌의 실질에 뇌내로 주입된 NR1 세포 제품의 안전성 및 내약성을 보여주는 일관된 결과를 제공하였다. 또한, GLP 체내분포 연구, 2개의 약리학 연구 및 7개의 다른 조사 연구에서 NR1 완제 의약품이 내약성이 우수하고, 동물당 2×106개의 세포만큼 높은 NR1 뇌내 용량에서 뇌 또는 말초 조직에서의 기형종의 형성과 관련이 없음을 입증하는 유사한 결과가 있었다.
중추적인 단일-용량 GLP 독성학 연구는 NR1 완제 의약품을 사용한 처리와 잠재적으로 관련된 천천히 형성되는 기형종의 검출을 위한 상당한 기간을 허용하기 위해 180-일의 긴 무치료 추적 관찰 기간을 통합하였다. 연구에 사용된 세포 주입 배지는 뮤린 성장 인자를 포함하는 것으로 보고된 마우스 엥겔브레스-홀름-스웜 육종 세포로부터 유래되는 복합 단백질 혼합물인 Matrigel을 포함하였다. Matrigel은 체성 조직에서 줄기 세포-유래 신경 전구체의 생존을 촉진하는 것으로 알려져 있다. Matrigel을 포함시키는 목적은 세포 성장을 완전히 지원하기 위한 것이었으며, NR1 세포 및 임의의 오염된 줄기 세포는 모두 "최악의 시나리오(worst-case-scenario)"를 만들어 최적의 성장 조건을 제공함으로써 기형종의 발생 및 성장 가능성을 증가시킴으로써 NR1의 안전성 평가를 위한 가능한 가장 높은 기준을 부과한다. 40% Matrigel을 포함한 성장-지원 기질이 존재하는 경우에도, NR1을 사용하여 수행된 임의의 연구에서 기형종은 관찰되지 않았으며, 구체적으로 100마리의 수컷 및 암컷 무흉선 래트에 동물당 최대 2×106개의 NR1 세포를 주입하고 이식 후 최대 6개월 동안 추적 관찰한 GLP 독성학 연구에서 어떠한 것도 검출되지 않았다.
이 연구에 사용된 무흉선 래트 모델은 연구 조건하에 줄기 세포-유래 기형종의 성장을 지원할 수 있었다. 동물당 2×103개 내지 1×106개의 H9 세포(각각 총 NR1 용량의 0.1% 내지 50%) 범위의 수준으로 스파이킹된 H9 hESC를 포함한 두 NR1 세포를 포함하는 처리 그룹은 기형종의 형성을 초래하였다. 기형종은 그룹 4(50% H9 스파이킹)의 67%(18마리 중 12마리의 동물 )에서 그룹 8(0.1% H9 스파이킹)의 5.3%(19마리 중 1마리의 동물)의 범위로 H9-스파이킹된 그룹에서 용량-의존적 방식으로 발생하였다. 스파이킹하지 않은 NR1 완제 의약품 단독으로 처리한 그룹 중 어느 것도 기형종을 형성하지 않았다. 현미경으로 볼 때, 10% 이상의 수준에서 H9-스파이킹된 NR1를 주입받은 처리 그룹에 존재하는 기형종은 대부분 피부, 선, 연골 및/또는 뼈 형성과 같은 조직의 혼합물뿐만 아니라 신경 조직을 포함하여 내배엽, 중배엽 및 외배엽으로부터의 조직으로 구성되었다. 이러한 그룹의 기형종은 큰 경향이 있다. 1% 및 0.1%의 H9-스파이킹을 주입받은 그룹(그룹 7 및 그룹 8)에서 거시적 기형종이 아닌 현미경적 기형종이 관찰되었으며, 이러한 기형종은 주로 맥락막-유사 형성, 뇌실막 상피 및/또는 거의 정상으로 보이는 백질의 팽출 영역이 있는 무작위로 나타나는 신경 조직의 더 작은 형성으로 구성되었다. 이들은 3개의 배엽 모두로부터 유래되는 조직을 포함하지 않았다. NR1 완제 의약품만으로 처리된 그룹 중 어느 것도 기형종을 형성하지 않았다. 임의의 H9-스파이킹 또는 NR1 IC 또는 IM-처리한 그룹에서 뇌 외부 또는 주입 부위에서 멀리 떨어진 기형종 형성의 증거는 관찰되지 않았다.
기형종의 성장을 촉진하는 Matrigel의 역할은 완전히 이해되지는 않았지만, 인간 세포 주입 배지에서 Matrigel의 존재 및 부재하에 NR1 세포 지속성을 비교한 연구에서 나타난 바와 같이, 기질이 또한 NR1의 성장 및 지속성을 지원한다는 것은 분명하다. 모든 비임상 연구에서, Matrigel이 세포 주입 배지에 있었을 때 NR1 생존이 항상 개선되었다. 그러나, 40% Matrigel이 존재하는 경우에도, cGMP NR1 완제 의약품 단독(0.01% 미만의 잔여 H9 세포를 가짐)의 최대 2×106개 세포 용량으로의 처리는 독성학 연구의 6-개월의 기간 동안 성체 무흉선 래트에서 독성 또는 기형종 또는 종양의 형성을 초래하지 않았으며, 이는 장기간의 추적 관찰을 통해 안전성을 입증한다.
실시예 13
효능 검정 연구
전임상 연구는 NR1 세포가 뇌졸중으로 손상된 뇌 조직의 복구에 기여할 수 있는 기능을 가진 광범위한 단백질을 분비함을 보여주었다. 본 발명자들은 축색돌기 발아, 신경발생, 시냅스생성 및 기질/조직 리모델링에서의 알려진 역할을 기반으로 NR1 생물학적 활성의 척도인 후보 효능 검정 마커로서 이들 단백질 중 6개를 선택하였다.
아래 열거된 각 후보 단백질에 대해, FDA 요건을 충족하는 상업적으로 이용 가능한 키트를 확인하였다(3개의 ELISA 키트 및 3개의 ProCartaPlexR/Luminex 키트).
효능 검정의 구성 성분으로서 각 키트의 허용 여부는 다음 기준을 충족하는 키트에 따라 달라진다:
목적-1: 효능 검정을 위한 후보로서 NR1 세포에 의해 분비되는 여러 단백질을 선택한다. 이러한 후보를 선택하는 데 사용되는 기준은 전임상 연구를 기반으로 한다.
목적-2: 포획 및 검출 항체 모두에 대한 단일클론 항체의 FDA 요건을 충족하는 상업적으로 이용 가능한 키트를 식별한다.
목적-3: 이용 가능한 키트의 성능이 완전 배지(CM)의 존재하에 변경되지 않는지 결정한다. NR1 완전 배지의 존재하에 검정 키트의 성능 표준 역가를 결정한다.
목적-4: 효능 검정의 각 부분의 특이도를 확인한다.
목적-5: 제한된 수의 성장 인자가 검출되는지 또는 표적 항원의 임의의 간섭을 유발하는지 결정한다.
목적-6: 표적(on-target) 후보가 표적외(off target) 후보의 다양한 농도로 여전히 정확하게 정량화되는지 확인하며, 효능 검정의 각 부분은 a) 음성 대조군으로서 표적외 후보 및 b) 표적 후보가 표적외 후보의 다양한 농도로 희석되는 일련의 샘플로 테스트될 것이다.
목적-7: 다양한 성장 조건하에 생성된 NR1 조건화 배지(CM)를 사용하여 각 후보의 자격에 대한 적절한 희석을 결정한다. 그것이 확립되면, 검정의 각 구성 요소는 검정내/검정간 정밀도, 선형 희석의 정확도, 동적 범위 및 재현성에 대해 테스트될 것이다.
3개의 ELISA 키트 및 4개의 ProCartaPlexR/Luminex 키트 중 3개가 목적 1 내지 목적 6을 충족하였다. 본 발명자들은 모든 키트에 대해 목적 7을 완료하는 과정에 있다. 본 발명자들은 임의의 III상 임상 시험 및 후속 라이센싱/마케팅 신청을 위한 NR1 줄기 세포 요법의 제출을 위해 적시에 나머지 목적 및 검정 자격을 완료할 것으로 기대한다.
전술한 내용은 단지 본 발명의 원리를 설명한다. 당업자는 본 명세서에 명시적으로 기술되거나 도시되지는 않았지만 본 발명의 원리를 구현하고 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함되는 다양한 구성을 고안할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 명세서에 인용된 모든 예 및 조건부 언어는 주로 독자가 본 발명의 원리 및 기술을 발전시키기 위해 발명자가 기여한 개념을 이해하는 데 도움을 주기 위한 것이며, 구체적으로 인용된 예 및 조건에 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 더욱이, 본 발명의 원리, 양태 및 실시형태뿐만 아니라 이의 구체적인 예를 인용하는 모든 진술은 이의 구조적 및 기능적 등가물을 모두 포함하도록 의도된다. 추가적으로, 이러한 등가물은 현재 알려진 등가물과 미래에 개발될 등가물, 즉, 구조에 관계없이 동일한 기능을 수행하는 개발되는 임의의 요소를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 범위는 본 명세서에 도시되고 설명된 예시적인 실시형태로 제한되도록 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 청구범위에 의해 구체화된다.
Claims (41)
- 뇌졸중 또는 외상성 뇌 손상을 앓고 있는 대상체의 내인성 신경 복구 과정을 증대시키기 위해 대뇌 피질에서 외인성 영양 인자를 증가시킴으로써 상기 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 대상체의 신경학적 기능을 회복시켜 뇌졸중 또는 외상성 뇌 손상을 앓고 있는 상기 대상체를 치료하기 위해, 치료학적 유효량의 정상 핵형을 가지며 영양 인자를 발현하는 비유전적으로 변형된 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포는 단리된 비유전적으로 변형된 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중 또는 출혈성 뇌졸중인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 피질 또는 피질하 뇌 이식을 통한, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포의 투여는 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포의 대상체의 대뇌 피질 내 또는 그 근처로의 이식을 포함하는, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 대상체의 대뇌 피질은 임의의 전전두 피질, 운동 연합 피질, 1차 운동 피질 또는 1차 체감각 피질을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 뇌졸중 또는 외상성 뇌 손상 후 적어도 1주에 상기 대상체의 피질하 영역 또는 뇌의 피질 영역으로의 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포의 이식을 포함하는, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 뇌의 피질하 영역은 임의의 해마, 편도체, 확장된 편도체, 대상핵, 기저핵 또는 기저 전뇌인, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 뇌의 피질 영역은 임의의 전전두 피질, 운동 연합 피질, 1차 운동 피질 또는 1차 체감각 피질인, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포는 ColA1, LGALS1, TGF-B3, TIMP1, COL6A1, COL3A1, MMP2, SPARC, NRG3, SDF1(a), 갈렉틴 1, FGF18, CSF3, CCL2(MCP-1이라고도 함), FGF7, FGF17, PAI1/세르핀 1, VEGF-A, MCP1(CCL2) 및/또는 SDF1α 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 발현하는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영양 인자는 상기 피질 및/또는 피질하 뇌 영역 내의 혈류 및 혈관 신호를 증가시키고 구조적 가소성을 증가시킴으로써 신경 혈관신생에서 복구 과정을 증대시킬 수 있는 인자인, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 영양 인자는 성장 인자, 사이토카인 및/또는 세포외 기질 단백질의 조합을 포함하는, 방법.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 세포외 기질 단백질은 임의의 ColA1, LGALS1, TGF-B3, TIMP1, COL6A1, COL3A1, MMP2, SPARC, NRG3, SDF1(a), 갈렉틴 1, FGF18, CSF3, CCL2(MCP-1이라고도 함), FGF7, FGF17, PAI1/세르핀 1, VEGF-A, MCP1(CCL2) 및/또는 SDF1a 또는 이들의 조합인, 방법.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증가된 구조적 가소성은 임의의 시냅스생성, 수지상 분지 및 축색돌기 발아를 수반하는, 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 회복된 신경학적 기능은 상지 기능을 부분적으로 또는 완전히 회복시키는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 상지 기능은 상기 대상체의 팔을 들거나 또는 들어올리는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경학적 기능을 회복시키는 것은 걷거나 또는 균형을 잡는 능력의 회복 또는 보행 장애, 보행 불능 또는 균형 상실을 역전시키는 것을 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 보행 장애는 임의의 보행 속도의 감소, 비대칭 보행 패턴, 걸음 거리의 감소, 보폭의 증가, 영향을 받는 사지의 유각기(swing phase) 연장, 물리적 장애물을 극복하는 능력의 감소, 지형의 변화에 대한 보행 조정 능력의 감소, 리드미컬한 움직임의 상실, 가로대를 가로질러 이동하는 능력의 감소 및 이들의 조합을 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 대상체에서 손상된 이동성을 역전시키는 것은 임의의 더 큰 보행 속도, 대칭 보행 패턴의 증가, 더 큰 걸음 거리, 보폭 감소, 영향을 받는 사지의 유각기 기간의 감소, 물리적 장애물을 극복하는 더 큰 능력, 지형의 변화에 대한 보행을 조정하는 더 큰 능력, 리드미컬한 움직임의 증가, 기둥 또는 사다리를 가로질러 이동하는 더 큰 능력 및 이들의 조합을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뇌 병변은 상기 대상체의 피질 또는 피질하 뇌 영역의 외부에 위치하는, 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뇌 병변은 상기 대상체의 피질 또는 피질하 뇌 영역에 또는 그 주위에 위치하는, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간, 원숭이, 침팬지, 유인원, 여우원숭이, 마우스, 래트, 다람쥐, 기니피그, 햄스터, 토끼, 뒤쥐, 두더지, 밍크, 고양이, 개, 돼지, 소, 염소, 당나귀, 말, 양 및 비인간 영장류로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물인, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
- 뇌졸중 후 대상체의 내인성 신경 복구 과정을 증대시키기 위해 대뇌 피질에서 외인성 영양 인자를 증가시킴으로써 상기 대상체에서 운동 결함을 저해, 감소 또는 역전시키는 방법으로서,
상기 대상체의 운동 결함을 저해, 감소 또는 역전시키고 상기 대상체의 신경학적 기능을 회복시키기 위해, 치료학적 유효량의, 영양 인자를 발현하는 신경 줄기 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 뇌졸중 후 대상체의 내인성 신경 복구 과정을 증대시키기 위해 대뇌 피질에서 외인성 영양 인자를 증가시킴으로써 상기 대상체의 운동 결함을 치료하는 방법으로서,
상기 대상체의 신경학적 기능을 회복시켜 상기 대상체의 운동 결함을 치료하기 위해, 치료학적 유효량의, 영양 인자를 발현하는 신경 줄기 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 제24항의 방법에 의해 운동 결함을 저해, 감소 또는 역전시킴으로써 대상체의 운동 결함을 감소 또는 역전시킴으로써 뇌졸중의 결과로서 운동 결함을 앓고 있는 대상체를 재활시키는 방법.
- 제25항의 방법에 의해 대상체의 운동 결함을 치료함으로써 뇌졸중의 결과로서 운동 결함을 앓고 있는 대상체를 재활시키는 방법.
- 포유동물 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포의 단리된 집단으로서, 성장 인자, 사이토카인 및/또는 세포외 기질 단백질의 조합을 포함하는 영양 인자를 분비하는 정상 핵형을 갖는, 포유동물 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포.
- 제28항에 있어서, ATCC 기탁 번호 xxxx로 기탁된, 포유동물 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포.
- 제28항 또는 제29항에 있어서, 비정상 핵형을 갖는 비유전적으로 변형된 NR1 ES 신경 줄기 세포로부터 유래되고, 정상 핵형을 나타내도록 적어도 15회 계대배양되는, 포유동물 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포.
- 제30항에 있어서, 상기 비정상 핵형을 갖는 비유전적으로 변형된 NR1 ES 신경 줄기 세포는 정상 핵형을 나타내도록 적어도 16회 계대 후에 배양되는, 포유동물 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포.
- 제30항에 있어서, 상기 비정상 핵형을 갖는 비유전적으로 변형된 NR1 ES 신경 줄기 세포는 정상 핵형을 나타내도록 적어도 17회 계대배양되는, 포유동물 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포.
- 제30항에 있어서, 상기 비정상 핵형을 갖는 비유전적으로 변형된 NR1 ES 신경 줄기 세포는 정상 핵형을 나타내도록 적어도 18회 계대배양되는, 포유동물 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포.
- 제30항에 있어서, 상기 비정상 핵형을 갖는 비유전적으로 변형된 NR1 ES 신경 줄기 세포는 정상 핵형을 나타내도록 적어도 19회 계대배양되는, 포유동물 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포.
- 제30항에 있어서, 상기 비정상 핵형을 갖는 비유전적으로 변형된 NR1 ES 신경 줄기 세포는 정상 핵형을 나타내도록 적어도 20회 계대배양되는, 포유동물 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포.
- 정의된 세포 집단으로서, 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항의 복수의 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포를 포함하는, 세포 집단.
- 조성물로서, 제36항의 포유동물 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포의 정의된 집단; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 조성물.
- 미분화 인간 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포의 지속적인 배양물로서,
사전 조정된 피더 기질,
조건화 배지; 및
정상 핵형을 갖는 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포
를 포함하는, 지속적인 배양물. - 정의된 세포 배양 조건하에 정상 핵형을 갖는 인간 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포를 생산하는 방법으로서,
(a) 피더 세포의 부재하에 RA, EGF, FGF, LIF 및 PHS 없이 글루타맥스, N2 보충제, B27이 포함된 배양 배지에서 고체 지지체 상에서 인간 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포를 배양하는 단계; 및
이로 인해, 정의된 세포 배양 조건하에 시험관내에서 인간 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포를 생산하는 단계
를 포함하는, 방법. - 대상체의 뇌 병변과 관련된 이동 장애를 치료하기 위한 키트로서,
(a) 영양 인자를 발현하는 정상 핵형을 갖는 NR1 ES-유래 신경 줄기 세포; 및
(b) 키트 사용 방법에 대한 라벨 및 지침
을 포함하는, 키트. - 제40항에 있어서, NR1 ES-유래 신경 줄기 세포를 포함하는 주사기를 추가로 포함하는, 키트.
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