JP2021518331A - 細胞加齢の反転のための一過性細胞リプログラミング - Google Patents

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Abstract

細胞の若返り、組織工学及び再生医学において有用な方法及び組成物が本明細書に提供される。加齢した細胞及び組織を若返らせて、機能性を回復させるための組成物及び方法が開示されている。特に、細胞は、細胞を分化した状態に保持しつつ細胞を若返らせるための、リプログラミング因子をコードする非組込みｍＲＮＡへの一過性曝露によって若返る。

Description

本願は、２０１８年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／６４２５３８号に対する優先権を主張し、これによりあらゆる目的のため参照によりその全体を本明細書に組み込む。
（連邦政府の支援による研究開発の下に為された開示の権利に関する記載）
本開示は、助成金番号Ｒ０１ ＡＲ０７０８６５及びＲ０１ ＡＲ０７０８６４（国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ／ＮＩＡＭＳ））、助成金番号Ｐ０１ ＡＧ０３６６９５、Ｒ０１ ＡＧ２３８０６（Ｒ３７ ＭＥＲＩＴ賞）、Ｒ０１ ＡＧ０５７４３３及びＲ０１ ＡＧ０４７８２０（国立衛生研究所（ＮＩＨ））、退役軍人省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒａｎｓ Ａｆｆａｉｒ）（ＢＬＲ＆Ｄ及びＲＲ＆Ｄメリットレビュー（Ｍｅｒｉｔ Ｒｅｖｉｅｗ））並びにＣａｌＰｏｌｙ基金授賞＃ＴＢ１−０１１７５に基づく政府支援により為された。政府は、本開示に一定の権利を有する。
加齢は、分子、細胞、組織及び生物レベルで生じる漸進的な機能喪失によって特徴付けられる。クロマチンレベルでは、加齢は、異常な遺伝子調節、幹細胞消耗、老化及び調節解除された細胞／組織恒常性を最終的にもたらす、進行性のエピジェネティックエラー蓄積に伴う。少数の転写因子の過剰発現による多能性への核リプログラミングの技術は、エピジェネティックリプログラミングを駆動することにより、いずれかの細胞の齢及び同一性の両方を、胚細胞のそれへと復帰させることができる。細胞独自性の望ましくない抹消は、その結果生じる構造、機能並びに組織及び臓器における細胞型分布の破壊のため、若返り療法の開発にとって問題がある。
（発明の要旨）
前述を考慮すると、脱分化及び細胞独自性の喪失を回避する、細胞を若返らせる改善された方法の必要がある。本開示は、このような必要に取り組み、その上、さらなる利益を提供する。
本開示は、全般的に、細胞の若返り、組織工学及び再生医学に関係する。特に、本開示は、細胞を分化した状態に保持しつつ細胞を若返らせるリプログラミング因子をコードする非組込みｍＲＮＡへの一過性曝露によって、加齢した細胞及び組織を若返らせて、機能性を回復させるための組成物及び方法に関する。
本開示は、若返った細胞を利用した、細胞ベースの治療法に関する。特に、本開示は、細胞を分化した状態に保持しつつ細胞を若返らせるリプログラミング因子をコードする非組込みｍＲＮＡへの一過性曝露によって、加齢した細胞及び組織を若返らせて、機能性を回復させるための方法に関する。
ある態様では、細胞を若返らせる方法であって、連続した５日以下の間、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、細胞にトランスフェクトし、これにより、若返った細胞を産生するステップを含む方法が本明細書に提供される。
ある態様では、対象の加齢性疾患若しくは状態、軟骨変性障害、神経変性障害及び／又は筋骨格機能不全を治療するための方法が本明細書に提供される。本方法は、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを含む治療有効量の細胞を投与するステップを含む。
ある態様では、対象の加齢性疾患若しくは状態、軟骨変性障害を治療する、及び／又は筋骨格機能不全を有する対象を治療するための方法が本明細書に提供される。本方法は、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、治療有効量の１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを投与するステップを含む。
ある態様では、操作された組織をエクスビボで若返らせる方法が本明細書に提供される。本方法は、連続した５日以下の間、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、組織にトランスフェクトし、これにより、若返った操作された組織を産生するステップを含む。
ある態様では、連続した５日以下の間、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、細胞にトランスフェクトするステップによって得られる若返った細胞を含む医薬組成物が本明細書に提供される。
よって、一態様では、本開示は、細胞を若返らせる方法であって、ａ）１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、細胞にトランスフェクトするステップであって、前記トランスフェクトするステップが、少なくとも２日かつ４日以下の間、１日１回行われる、ステップ、及びｂ）１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを翻訳し、細胞において１種以上の細胞リプログラミング因子を産生し、細胞の一過性リプログラミングをもたらすステップであって、細胞が、幹細胞へと脱分化することなく若返る、ステップを含む方法を含む。本方法は、インビトロ、エクスビボ又はインビボで細胞において行われ得る。
ある特定の実施形態では、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡによるトランスフェクションは、２日間、３日間又は４日間、１日１回行われる。
ある特定の実施形態では、１種以上の細胞リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される。一実施形態では、１種以上の細胞リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを含む。
本方法は、いずれかの型の細胞において行われ得る。一部の実施形態では、細胞は、哺乳類細胞（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギなど）である。例えば、本方法は、線維芽細胞、内皮細胞、軟骨細胞又は骨格筋幹細胞において行われ得る。別の実施形態では、細胞は、高齢対象に由来する。
ある特定の実施形態では、一過性リプログラミングは、ＨＰ１γ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、ラミナ支持タンパク質ＬＡＰ２α及びＳＩＲＴ１の増加した発現、ＧＭＳＣＦ、ＩＬ１８及びＴＮＦαの減少した発現、減少した核の折畳み、減少した小疱形成、増加した細胞オートファゴソーム形成、増加したキモトリプシン様プロテアソーム活性、増加したミトコンドリア膜電位、又は減少した活性酸素種（ＲＯＳ）をもたらす。
ある特定の実施形態では、細胞は、組織又は臓器内にある。本明細書に記載されている方法に従った一過性リプログラミングは、組織若しくは臓器における細胞の機能を回復させることができる、組織若しくは臓器における細胞の分化能を増加させることができる、組織若しくは臓器内の老化した細胞の数を低下させることができる、組織若しくは臓器内の細胞の複製能を増強することができる、又は組織若しくは臓器内の細胞の寿命を延伸することができる。
別の態様では、本開示は、対象の加齢性疾患又は状態を治療するための方法であって、ａ）１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、対象の細胞にトランスフェクトするステップであって、前記トランスフェクトするステップが、少なくとも２日かつ４日以下の間、１日１回行われる、ステップ、及びｂ）対象における細胞において１種以上の細胞リプログラミング因子を発現させ、細胞の一過性リプログラミングをもたらすステップであって、細胞が、幹細胞へと脱分化することなく若返る、ステップを含む方法を含む。細胞は、エクスビボ又はインビボでトランスフェクトされ得る。
ある特定の実施形態では、１種以上の細胞リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される。一実施形態では、１種以上の細胞リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを含む。
ある特定の実施形態では、加齢性疾患又は状態は、変性疾患、神経変性疾患、心血管疾患、末梢血管疾患、皮膚疾患、眼疾患、自己免疫性疾患、内分泌障害、代謝性障害、筋骨格障害、消化器系の疾患又は呼吸器疾患である。
別の実施形態では、本開示は、対象の軟骨変性が関与する疾患又は障害を治療するための方法であって、ａ）１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、対象の軟骨細胞にトランスフェクトするステップであって、前記トランスフェクトするステップが、少なくとも２日かつ４日以下の間、１日１回行われる、ステップ、及びｂ）軟骨細胞において１種以上の細胞リプログラミング因子を発現させ、軟骨細胞の一過性リプログラミングをもたらすステップであって、軟骨細胞が、幹細胞へと脱分化することなく若返る、ステップを含む方法を含む。若返った軟骨細胞は、例えば、対象の関節炎の関節へと移植され得る。
本方法は、エクスビボ、インビトロ又はインビボで行われ得る。一実施形態では、軟骨細胞は、対象から得られる軟骨試料から単離され、エクスビボでトランスフェクトされ、次いで対象へと移植される。
ある特定の実施形態では、軟骨変性が関与する疾患又は障害は、関節炎（例えば、変形性関節症又は関節リウマチ）である。
ある特定の実施形態では、治療は、対象における炎症を低下させる。
ある特定の実施形態では、治療／処置は、軟骨細胞によりＲＡＮＫＬ、ｉＮＯＳ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＢＤＮＦ、ＩＦＮα、ＩＦＮγ及びＬＩＦの発現を低下させ、ＣＯＬ２Ａ１の発現を増加させる。
別の態様では、本開示は、対象における筋肉変性が関与する疾患又は障害を治療するための方法であって、ａ）１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、対象の骨格筋幹細胞にトランスフェクトするステップであって、前記トランスフェクトするステップが、少なくとも２日かつ４日以下の間、１日１回行われる、ステップ、及びｂ）骨格筋幹細胞において１種以上の細胞リプログラミング因子を発現させ、骨格筋幹細胞の一過性リプログラミングをもたらすステップであって、骨格筋幹細胞が、筋肉細胞へと分化するその能力を喪失することなく若返る、ステップを含む方法を含む。
本方法は、エクスビボ、インビトロ又はインビボで行われ得る。一実施形態では、骨格筋幹細胞は、対象から得られる筋肉組織試料から単離され、エクスビボでトランスフェクトされ、次いで対象における修復又は再生を必要とする筋肉へと移植される。
ある特定の実施形態では、１種以上の細胞リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される。一実施形態では、１種以上の細胞リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを含む。
ある特定の実施形態では、治療／処置は、骨格筋幹細胞の分化能を回復させる。ある特定の実施形態では、治療／処置は、筋線維の再生をもたらす。
本開示の方法は、いずれかの対象において行われ得る。ある特定の実施形態では、対象は、哺乳類、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ又はヤギである。一部の実施形態では、対象は、高齢者である。
対象開示の上述及び他の実施形態は、本明細書における開示を考慮して、当業者に容易に想定される。
一過性リプログラミングが、線維芽細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。処置の持続時間による効果（ＲＯＳ）の分散を実証する代表的なプロットを示す図である：一過性リプログラミングの２日間対４日間であり、両者共に２日間のその後のリラクゼーションを行う。全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、全ての個々の細胞、生物学的及び技術的複製にわたってデータを組み合わせた後に生成される。示されている有意性レベルは、患者間の可変性に関して、１つのペアワイズ比較における柔軟性（ｇｒａｃｅ）を可能にする。 一過性リプログラミングが、線維芽細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。免疫細胞化学を使用して、ヘテロクロマチンマーカーＨ３Ｋ９ｍｅ３及びＨＰ１γの単細胞レベルの定量化を示す図である。 一過性リプログラミングが、線維芽細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。免疫細胞化学を使用して、単細胞における核ラミナ支持ポリペプチドＬＡＰ２αの存在の定量化、及び各集団における異常な核（折り畳まれた又は小疱形成した）のパーセントを示す図である。 一過性リプログラミングが、線維芽細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。単細胞におけるオートファゴソーム形成の際に切断される蛍光（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ）タグ付けされた基質による生細胞イメージング、及び総集団におけるキモトリプシン様２０Ｓタンパク質分解活性の結果を示す。 一過性リプログラミングが、線維芽細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。ミトコンドリア特異的色素により定量化された個々の細胞ミトコンドリア膜電位及びＲＯＳレベルを示す図である。 一過性リプログラミングが、線維芽細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。ＳＩＲＴ１に関する免疫染色の単細胞定量化を示す図である。 一過性リプログラミングが、線維芽細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。単細胞におけるテロメア定量的蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＱＦＩＳＨ）の結果を示す図である。 一過性リプログラミングが、線維芽細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。老化した集団に関するＳＡβＧａｌ染色の結果を示す図である。 一過性リプログラミングが、線維芽細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。マルチプレックスサイトメトリーのための分析物抗体コンジュゲートされたビーズのパネルを使用して、炎症性サイトカインプロファイリングの定量化を示す図である。 一過性リプログラミングが、線維芽細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。４日間の一過性リプログラミング後の４及び６日間の、より長い期間のリラクゼーションにおける、若々しいシフトの維持を示す代表的なプロットを示す図である。次に、各コホートにおける細胞を、８０塩基対ペアードエンド読み取りデータＲＮＡ配列決定に付して、群（若齢、加齢及び処置 − Ｒ４Ｘ２）毎にトランスクリプトームプロファイルを得た。 一過性リプログラミングが、線維芽細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。加齢シグネチャーによって定義された部分空間における主成分分析を示す図である。 一過性リプログラミングが、線維芽細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。若齢及び加齢（ｘ軸）並びに処置及び加齢（ｙ軸）の間の対数倍数変化の比較を示す図である。暗灰色の点は全て、加齢シグネチャーの遺伝子である一方、薄灰色の点は、処置及び加齢の間で有意に異なる、処置シグネチャーとも重複する遺伝子である。遺伝子の大部分は、ｙ＝ｘ線に沿って位置し、処置による変化の規模が、若齢及び加齢の間の差の規模に密接にマッチしたことを示す。有意性は、処置及び加齢の間はペアワイズで、若齢患者と比較する場合はグループワイズで（ｇｒｏｕｐ ｗｉｓｅ）、スチューデントｔ検定により計算される。Ｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、アステリスクの色は、比較されている集団にマッチする。 一過性リプログラミングが、内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。処置の持続時間による効果（ＲＯＳ）における分散を実証する代表的なプロットを示す図である：一過性リプログラミングの２日間対４日間であり、両者共に、２日間のその後のリラクゼーションを行う。全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、全ての個々の細胞、生物学的及び技術的複製にわたってデータを組み合わせた後に生成される。示されている有意性レベルは、患者間の可変性に関して、１つのペアワイズ比較における柔軟性（ｇｒａｃｅ）を可能にする。 一過性リプログラミングが、内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。免疫細胞化学を使用して、ヘテロクロマチンマーカーＨ３Ｋ９ｍｅ３及びＨＰ１γの単細胞レベルの定量化を示す図である。 一過性リプログラミングが、内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。免疫細胞化学を使用して、単細胞における核ラミナ支持ポリペプチドＬＡＰ２αの存在の定量化、及び各集団における異常な核（折り畳まれた又は小疱形成した）のパーセントを示す図である。 一過性リプログラミングが、内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。単細胞におけるオートファゴソーム形成の際に切断される蛍光（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ）タグ付けされた基質による生細胞イメージング、及び総集団におけるキモトリプシン様２０Ｓタンパク質分解活性の結果を示す図である。 一過性リプログラミングが、内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。ミトコンドリア特異的色素により定量化された個々の細胞ミトコンドリア膜電位及びＲＯＳレベルを示す図である。 一過性リプログラミングが、内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。ＳＩＲＴ１に関する免疫染色の単細胞定量化を示す。 一過性リプログラミングが、内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。単細胞におけるテロメア定量的蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＱＦＩＳＨ）の結果を示す図である。 一過性リプログラミングが、内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。老化した集団に関するＳＡβＧａｌ染色の結果を示す図である。 一過性リプログラミングが、内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。４日間の一過性リプログラミング後の４及び６日間の、より長い期間のリラクゼーションにおける、若々しいシフトの維持を示す代表的なプロットを示す図である。次に、各コホートにおける細胞を、８０塩基対ペアードエンド読み取りデータＲＮＡ配列決定に付して、群（若齢、加齢及び処置 − Ｒ４Ｘ２）毎にトランスクリプトームプロファイルを得た。 一過性リプログラミングが、内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。加齢シグネチャーによって定義された部分空間における主成分分析を示す図である。 一過性リプログラミングが、内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。若齢及び加齢（ｘ軸）並びに処置及び加齢（ｙ軸）の間の対数倍数変化の比較を示す図である。暗灰色の点は全て、加齢シグネチャーの遺伝子である一方、薄灰色の点は、処置及び加齢の間で有意に異なる、処置シグネチャーとも重複する遺伝子である。遺伝子の大部分は、ｙ＝ｘ線に沿って位置し、処置による変化の規模が、若齢及び加齢の間の差の規模に密接にマッチしたことを示す。有意性は、処置及び加齢の間はペアワイズで、若齢患者と比較する場合はグループワイズで（ｇｒｏｕｐ ｗｉｓｅ）、スチューデントｔ検定により計算される。Ｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、アステリスクの色は、比較されている集団にマッチする 図３Ａ〜図３Ｉは、一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における変形性関節症表現型を軽減することを示す：全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。示されている有意性レベルは、患者間の可変性に関して、１つのペアワイズ比較における柔軟性を可能にする。処置は、最適化された３日間のリプログラミング及び２日間のリラクゼーションを指す。細胞生存率染色の集団結果を示す図である。 一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における変形性関節症表現型を軽減することを示す：全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。示されている有意性レベルは、患者間の可変性に関して、１つのペアワイズ比較における柔軟性を可能にする。処置は、最適化された３日間のリプログラミング及び２日間のリラクゼーションを指す。タンパク質同化因子ＣＯＬ２Ａ１のＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ評価を示す図である。 一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における変形性関節症表現型を軽減することを示す：全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。示されている有意性レベルは、患者間の可変性に関して、１つのペアワイズ比較における柔軟性を可能にする。処置は、最適化された３日間のリプログラミング及び２日間のリラクゼーションを指す。各コホートにおけるＡＴＰ濃度の定量化を示す図である。 一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における変形性関節症表現型を軽減することを示す：全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。示されている有意性レベルは、患者間の可変性に関して、１つのペアワイズ比較における柔軟性を可能にする。処置は、最適化された３日間のリプログラミング及び２日間のリラクゼーションを指す。抗酸化剤ＳＯＤ２のＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ評価を示す図である。ＳＯＤ２上昇は、ＲＯＳが存在する、すなわち、ＯＡ状態である場合にのみ利益があるため（図３Ｅ）、若齢レベルがＯＡを下回ることに留意されたい。 一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における変形性関節症表現型を軽減することを示す：全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。示されている有意性レベルは、患者間の可変性に関して、１つのペアワイズ比較における柔軟性を可能にする。処置は、最適化された３日間のリプログラミング及び２日間のリラクゼーションを指す。抗酸化剤ＳＯＤ２のＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ評価を示す図であるＳＯＤ２上昇は、ＲＯＳが存在する、すなわち、ＯＡ状態である場合にのみ利益があるため（図３Ｅ）、若齢レベルがＯＡを下回ることに留意されたい。 一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における変形性関節症表現型を軽減することを示す：全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。示されている有意性レベルは、患者間の可変性に関して、１つのペアワイズ比較における柔軟性を可能にする。処置は、最適化された３日間のリプログラミング及び２日間のリラクゼーションを指す。異化因子ＭＭＰ１３（図３Ｆ）のＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ評価を示す図である。 一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における変形性関節症表現型を軽減することを示す：全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。示されている有意性レベルは、患者間の可変性に関して、１つのペアワイズ比較における柔軟性を可能にする。処置は、最適化された３日間のリプログラミング及び２日間のリラクゼーションを指す。異化因子ＭＭＰ３（図３Ｇ）のＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ評価を示す図である。 一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における変形性関節症表現型を軽減することを示す：全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。示されている有意性レベルは、患者間の可変性に関して、１つのペアワイズ比較における柔軟性を可能にする。処置は、最適化された３日間のリプログラミング及び２日間のリラクゼーションを指す。マルチプレックスサイトメトリー解析のための分析物抗体コンジュゲートされたビーズのパネルを使用して、炎症促進性因子ＲＡＮＫＬ（図３Ｈ）プロファイリングのＲＮＡレベルのＲＴ−ＰＣＲ評価を示す図である。有意性は、処置及び加齢の間はペアワイズで、若齢患者と比較する場合はグループワイズで、スチューデントｔ検定により計算される、Ｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１。 一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における変形性関節症表現型を軽減することを示す：全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。示されている有意性レベルは、患者間の可変性に関して、１つのペアワイズ比較における柔軟性を可能にする。処置は、最適化された３日間のリプログラミング及び２日間のリラクゼーションを指す。マルチプレックスサイトメトリー解析のための分析物抗体コンジュゲートされたビーズのパネルを使用して、炎症促進性因子ｉＮＯＳ（図３Ｉ）プロファイリングのＲＮＡレベルのＲＴ−ＰＣＲ評価を示す図である。有意性は、処置及び加齢の間はペアワイズで、若齢患者と比較する場合はグループワイズで、スチューデントｔ検定により計算される、Ｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１。 一過性リプログラミングが、加齢した筋肉幹細胞分化能を回復させることを示す。静止状態からのＭｕＳＣ活性化の測定を示す図である。新鮮に単離された加齢したＭｕＳＣを、ＥｄＵと共にインキュベートし、２日間の処置及び１又は２日間のリラクゼーションの後に固定した。全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。示されている有意性レベルは、患者間の可変性に関して、１つのペアワイズ比較における柔軟性を可能にする。 一過性リプログラミングが、加齢した筋肉幹細胞分化能を回復させることを示す。移植及び傷害後の異なる時点における、処置／無処置＋ルシフェラーゼマウスＭｕＳＣのＴＡ筋肉中における移植１１日後のマウスから測定された、バイオルミネセンスの定量化された結果を示す図である。 一過性リプログラミングが、加齢した筋肉幹細胞分化能を回復させることを示す。図４Ｂにおいて撮像及び定量化された、マウスのＴＡ筋肉横断面におけるＧＦＰ発現の免疫蛍光染色の定量化を示す図である。 一過性リプログラミングが、加齢した筋肉幹細胞分化能を回復させることを示す。移植されたＭｕＳＣのレシピエントであったＴＡ筋肉におけるドナー由来のＧＦＰ＋線維の横断面の面積の定量化を示す図である。 一過性リプログラミングが、加齢した筋肉幹細胞分化能を回復させることを示す。移植後６０日後に再度傷害された（第２の傷害）ＴＡ筋肉のバイオルミネセンスイメージングの結果を示す図である。第２の傷害を行って、バイオルミネセンスシグナルが、初期に移植され、基底層の下に生着したルシフェラーゼ＋／ＧＦＰ＋ＭｕＳＣの活性化及び増大化の結果として増加したかを検査した。 一過性リプログラミングが、加齢した筋肉幹細胞分化能を回復させることを示す。処置したルシフェラーゼ＋ヒトＭｕＳＣのＴＡ筋肉中における移植１１日後のマウスから測定された、バイオルミネセンスの定量化された結果を示す図である。 一過性リプログラミングが、加齢した筋肉幹細胞分化能を回復させることを示す。異なる年齢群の健康なドナーから得た処置及び無処置ＭｕＳＣの間のバイオルミネセンスの比の差異を示す図である。有意性は、処置及び加齢の間はペアワイズで、若齢患者と比較する場合はグループワイズで、スチューデントｔ検定により計算される。Ｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、アステリスクの色は、比較されている集団にマッチする。 一過性リプログラミングが、ヒト線維芽細胞及び内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。線維芽細胞及び内皮細胞は、他の面では健康な若齢及び加齢個体から得た。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３に関するエピジェネティック及び核マーカーの分布を示す図である。 一過性リプログラミングが、ヒト線維芽細胞及び内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。線維芽細胞及び内皮細胞は、他の面では健康な若齢及び加齢個体から得た。ＨＰ１γに関するエピジェネティック及び核マーカーの分布を示す図である。 一過性リプログラミングが、ヒト線維芽細胞及び内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。線維芽細胞及び内皮細胞は、他の面では健康な若齢及び加齢個体から得た。ＬＡＰ２αに関するエピジェネティック及び核マーカーの分布を示す図である。 一過性リプログラミングが、ヒト線維芽細胞及び内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。線維芽細胞及び内皮細胞は、他の面では健康な若齢及び加齢個体から得た。ＳＩＲＴ１に関する栄養及びエネルギー調節の分布を示す図である。 一過性リプログラミングが、ヒト線維芽細胞及び内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。線維芽細胞及び内皮細胞は、他の面では健康な若齢及び加齢個体から得た。Ｍｉｔｏ膜電位に関する栄養及びエネルギー調節の分布を示す図である。 一過性リプログラミングが、ヒト線維芽細胞及び内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。線維芽細胞及び内皮細胞は、他の面では健康な若齢及び加齢個体から得た。Ｍｉｔｏ ＲＯＳに関する栄養及びエネルギー調節の分布を示す図である。 一過性リプログラミングが、ヒト線維芽細胞及び内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。線維芽細胞及び内皮細胞は、他の面では健康な若齢及び加齢個体から得た。オートファゴソームにおける分布及び大量老廃物クリアランス及び老化を示す図である。 一過性リプログラミングが、ヒト線維芽細胞及び内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。線維芽細胞及び内皮細胞は、他の面では健康な若齢及び加齢個体から得た。若齢、加齢及び処置細胞のプロテアソーム活性を示す図である。 一過性リプログラミングが、ヒト線維芽細胞及び内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。線維芽細胞及び内皮細胞は、他の面では健康な若齢及び加齢個体から得た。若齢、加齢及び処置細胞の老化活性を示す図である。 一過性リプログラミングが、ヒト線維芽細胞及び内皮細胞において加齢した生理機能をより若々しい状態に向けて復帰させることを示す。線維芽細胞及び内皮細胞は、他の面では健康な若齢及び加齢個体から得た。若齢、加齢及び処置細胞における分泌されたサイトカインを示す図である。 加齢した線維芽細胞及び内皮細胞のトランスクリプトーム及びメチローム解析を示す。線維芽細胞の若齢対加齢トランスクリプトームプロファイルを示す図である。データは、線維芽細胞における９６１種の遺伝子（５．８５％）（６７８種が上方調節、２８９種が下方調節。）が、有意性基準ｐ＜０．０５及び対数倍数変化カットオフ＋／−０．５で、若齢及び加齢細胞の間で異なったことを示す。 加齢した線維芽細胞及び内皮細胞のトランスクリプトーム及びメチローム解析を示す。線維芽細胞のＰＣＡ解析を示す図である。 加齢した線維芽細胞及び内皮細胞のトランスクリプトーム及びメチローム解析を示す。線維芽細胞の発現解析を示す図である。 加齢した線維芽細胞及び内皮細胞のトランスクリプトーム及びメチローム解析を示す。内皮細胞の若齢対加齢プロファイルを示す図である。データは、内皮細胞における７４８種の遺伝子（４．８０％）（３８９種が上方調節、３７７種が下方調節。）が、有意性基準ｐ＜０．０５及び対数倍数変化カットオフ＋／−０．５で、若齢及び加齢細胞の間で異なったことを示す。 加齢した線維芽細胞及び内皮細胞のトランスクリプトーム及びメチローム解析を示す。内皮細胞のＰＣＡ解析を示す図である。 加齢した線維芽細胞及び内皮細胞のトランスクリプトーム及びメチローム解析を示す。内皮細胞の発現解析を示す図である。 加齢した線維芽細胞及び内皮細胞のトランスクリプトーム及びメチローム解析を示す。処置前後にＨｏｒｖａｔｈ時計によって評価された、線維芽細胞のメチル化年齢のグラフであり、データは、低下の全般的傾向を示す図である。 加齢した線維芽細胞及び内皮細胞のトランスクリプトーム及びメチローム解析を示す。処置前後にＨｏｒｖａｔｈ時計によって評価された、内皮細胞のメチル化年齢のグラフであり、データは、低下の全般的傾向を示す図である。 加齢した線維芽細胞及び内皮細胞のトランスクリプトーム及びメチローム解析を示す。図６Ｉは、処置状態、性別、患者及び細胞型によって分離されるメチル化パターンにおける教師なしクラスタリングを示すデンドログラム（ｄｅｎｄｏｇｒａｍ）である。クラスタリングは、少なくとも線維芽細胞及び内皮細胞を比較した場合に、細胞独自性の集団的保持を実証する。 骨関節炎軟骨細胞及び間葉系幹細胞における一過性リプログラミングを示す。一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における炎症性表現型を軽減することを示すデータである。軟骨細胞は、加齢した、後期変形性関節症（ＯＡ）と診断された患者からの、軟骨生検から得た。加齢したＯＡ細胞及び一過性にリプログラミングされたＯＡ細胞は、ＯＡ特異的表現型に関して評価された。全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。全体的な有意性ランク付けは、２番目に厳密なｐ値によって設定される。有意性は、スチューデントｔ検定により計算した。Ｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１。エラーバーは、ＲＭＳＥ（二乗平均平方根誤差）を示す。フルオロフォアに基づくグリセロールを使用したＡＴＰ濃度の測定による、軟骨細胞における処置によるＡＴＰレベルの上昇を示す図である。 骨関節炎軟骨細胞及び間葉系幹細胞における一過性リプログラミングを示す。一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における炎症性表現型を軽減することを示すデータである。軟骨細胞は、加齢した、後期変形性関節症（ＯＡ）と診断された患者からの、軟骨生検から得た。加齢したＯＡ細胞及び一過性にリプログラミングされたＯＡ細胞は、ＯＡ特異的表現型に関して評価された。全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。全体的な有意性ランク付けは、２番目に厳密なｐ値によって設定される。有意性は、スチューデントｔ検定により計算した。Ｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１。エラーバーは、ＲＭＳＥ（二乗平均平方根誤差）を示す。スーパーオキシド誘発性蛍光色素を取り込む細胞の生きた単細胞画像の追跡によるＲＯＳ活性が、処置後に縮小されたシグナルを示すことを示す図である。 骨関節炎軟骨細胞及び間葉系幹細胞における一過性リプログラミングを示す。一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における炎症性表現型を軽減することを示すデータである。軟骨細胞は、加齢した、後期変形性関節症（ＯＡ）と診断された患者からの、軟骨生検から得た。加齢したＯＡ細胞及び一過性にリプログラミングされたＯＡ細胞は、ＯＡ特異的表現型に関して評価された。全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。全体的な有意性ランク付けは、２番目に厳密なｐ値によって設定される。有意性は、スチューデントｔ検定により計算した。Ｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１。エラーバーは、ＲＭＳＥ（二乗平均平方根誤差）を示す。処置により上昇された、抗酸化剤ＳＯＤ２のＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ評価の結果を示す図である。 骨関節炎軟骨細胞及び間葉系幹細胞における一過性リプログラミングを示す。一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における炎症性表現型を軽減することを示すデータである。軟骨細胞は、加齢した、後期変形性関節症（ＯＡ）と診断された患者からの、軟骨生検から得た。加齢したＯＡ細胞及び一過性にリプログラミングされたＯＡ細胞は、ＯＡ特異的表現型に関して評価された。全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。全体的な有意性ランク付けは、２番目に厳密なｐ値によって設定される。有意性は、スチューデントｔ検定により計算した。Ｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１。エラーバーは、ＲＭＳＥ（二乗平均平方根誤差）を示す。若齢、加齢及び加齢・処置軟骨細胞における細胞増殖を示す図である。加齢・処置細胞は、若齢細胞近くのレベルに向かってシフトする。 骨関節炎軟骨細胞及び間葉系幹細胞における一過性リプログラミングを示す。一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における炎症性表現型を軽減することを示すデータである。軟骨細胞は、加齢した、後期変形性関節症（ＯＡ）と診断された患者からの、軟骨生検から得た。加齢したＯＡ細胞及び一過性にリプログラミングされたＯＡ細胞は、ＯＡ特異的表現型に関して評価された。全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。全体的な有意性ランク付けは、２番目に厳密なｐ値によって設定される。有意性は、スチューデントｔ検定により計算した。Ｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１。エラーバーは、ＲＭＳＥ（二乗平均平方根誤差）を示す。若齢、加齢及び加齢・処置軟骨細胞における細胞外マトリックスタンパク質成分ＣＯＬ２Ａ１のＲＮＡレベルの上昇を反映するｑＲＴ−ＰＣＲからのデータを示す図である。加齢・処置細胞は、若齢細胞近くのレベルに向かってシフトする。 骨関節炎軟骨細胞及び間葉系幹細胞における一過性リプログラミングを示す。一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における炎症性表現型を軽減することを示すデータである。軟骨細胞は、加齢した、後期変形性関節症（ＯＡ）と診断された患者からの、軟骨生検から得た。加齢したＯＡ細胞及び一過性にリプログラミングされたＯＡ細胞は、ＯＡ特異的表現型に関して評価された。全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。全体的な有意性ランク付けは、２番目に厳密なｐ値によって設定される。有意性は、スチューデントｔ検定により計算した。Ｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１。エラーバーは、ＲＭＳＥ（二乗平均平方根誤差）を示す。軟骨形成同一性及び機能転写因子ＳＯＸ９のｑＲＴ−ＰＣＲレベルが、処置後に保持されていることを示すデータである。 骨関節炎軟骨細胞及び間葉系幹細胞における一過性リプログラミングを示す。一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における炎症性表現型を軽減することを示すデータである。軟骨細胞は、加齢した、後期変形性関節症（ＯＡ）と診断された患者からの、軟骨生検から得た。加齢したＯＡ細胞及び一過性にリプログラミングされたＯＡ細胞は、ＯＡ特異的表現型に関して評価された。全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。全体的な有意性ランク付けは、２番目に厳密なｐ値によって設定される。有意性は、スチューデントｔ検定により計算した。Ｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１。エラーバーは、ＲＭＳＥ（二乗平均平方根誤差）を示す。処置が、ＮＦ−κＢリガンドＲＡＮＫＬの細胞内ＲＮＡレベルを縮小することを示すＲＴ−ＰＣＲ評価を要約する図である。 骨関節炎軟骨細胞及び間葉系幹細胞における一過性リプログラミングを示す。一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における炎症性表現型を軽減することを示すデータである。軟骨細胞は、加齢した、後期変形性関節症（ＯＡ）と診断された患者からの、軟骨生検から得た。加齢したＯＡ細胞及び一過性にリプログラミングされたＯＡ細胞は、ＯＡ特異的表現型に関して評価された。全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。全体的な有意性ランク付けは、２番目に厳密なｐ値によって設定される。有意性は、スチューデントｔ検定により計算した。Ｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１。エラーバーは、ＲＭＳＥ（二乗平均平方根誤差）を示す。処置が、応答として一酸化窒素を産生するためのｉＮＯＳのレベルを下落させて、若齢軟骨細胞のものへのより近いシフトにより炎症性刺激を伝播することを示すＲＴ−ＰＣＲ評価を要約する図である。 骨関節炎軟骨細胞及び間葉系幹細胞における一過性リプログラミングを示す。一過性リプログラミングが、罹患した軟骨細胞における炎症性表現型を軽減することを示すデータである。軟骨細胞は、加齢した、後期変形性関節症（ＯＡ）と診断された患者からの、軟骨生検から得た。加齢したＯＡ細胞及び一過性にリプログラミングされたＯＡ細胞は、ＯＡ特異的表現型に関して評価された。全ての箱ひげ及び棒のプロットは、見易くなるように、生物学的及び技術的複製にわたって組み合わされる。全体的な有意性ランク付けは、２番目に厳密なｐ値によって設定される。有意性は、スチューデントｔ検定により計算した。Ｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１。エラーバーは、ＲＭＳＥ（二乗平均平方根誤差）を示す。軟骨細胞分泌のサイトカインプロファイリングが、処置により縮小する増加した炎症促進性サイトカインを示すことを反映するデータである。 骨関節炎軟骨細胞及び間葉系幹細胞における一過性リプログラミングを示す。間葉系幹細胞における処置により低下したレベルのｐ１６に向かう患者毎の分布シフトを示すグラフである。 骨関節炎軟骨細胞及び間葉系幹細胞における一過性リプログラミングを示す。間葉系幹細胞における処置により低下したレベルのｐ２１に向かう患者毎の分布シフトを示すグラフである。 骨関節炎軟骨細胞及び間葉系幹細胞における一過性リプログラミングを示す。加齢及び処置間葉系幹細胞における細胞増殖の増加に対応する倍数変化を示す図である。 骨関節炎軟骨細胞及び間葉系幹細胞における一過性リプログラミングを示す。細胞老化の減少に対応する、老化した加齢及び処置間葉系幹細胞のパーセンテージを示す図である。 操作された皮膚組織の一過性リプログラミングの効果を示す。線維芽細胞及びケラチノサイトの皮膚老化パラメータを示す。形態、構造及び組織化の測定基準を取り込む組織学スコアが、ｍＲＮＡ処置による改善を示すが、一般的に販売されている皮膚処置のレチノイン酸による改善を示さないことを示す図である。 操作された皮膚組織の一過性リプログラミングの効果を示す。線維芽細胞及びケラチノサイトの皮膚老化パラメータを示す。ｍＲＮＡ処置により、老化パラメータの低下が、図８Ｂ（ＳａβＧａｌ）及び図８Ｃ左パネル（ｐ１６）に示され、炎症性パラメータが、図８Ｃ中央パネル（ＩＬ−８）及び図８Ｃ右パネル（ＭＭＰ−１）に示されることを、レチノイン酸の効果とのさらなる比較と共に示す図である。 操作された皮膚組織の一過性リプログラミングの効果を示す。線維芽細胞及びケラチノサイトの皮膚老化パラメータを示す。ｍＲＮＡ処置により、老化パラメータの低下が、図８Ｂ（ＳａβＧａｌ）及び図８Ｃ左パネル（ｐ１６）に示され、炎症性パラメータが、図８Ｃ中央パネル（ＩＬ−８）及び図８Ｃ右パネル（ＭＭＰ−１）に示されることを、レチノイン酸の効果とのさらなる比較と共に示す図である。 操作された皮膚組織の一過性リプログラミングの効果を示す。サテライト細胞における筋肉再生を示す。処置したルシフェラーゼ＋ヒトＭｕＳＣのＴＡ筋肉中における移植１１日後のマウスから測定された、バイオルミネセンスの定量化された結果を示す図である。 操作された皮膚組織の一過性リプログラミングの効果を示す。サテライト細胞における筋肉再生を示す。コホート１０〜３０日齢、３０〜５５日齢及び６０〜８０日齢のバイオルミネセンスを示す図である。異なる年齢群の健康なドナーから得た処置及び無処置ＭｕＳＣの間のバイオルミネセンスの比の差異。有意性は、処置及び加齢の間はペアワイズで、若齢患者と比較する場合はグループワイズで、スチューデントｔ検定により計算される（年齢群。１０〜３０：ｎ＝５；３０〜５５：ｎ＝７；６０〜８０：ｎ＝５）。Ｐ値：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、アステリスクの色は、比較されている集団にマッチする。 操作された皮膚組織の一過性リプログラミングの効果を示す。サテライト細胞における筋肉再生を示す。傷害され、加齢ＭｕＳＣを移植された、加齢筋肉の強縮力（ｔｅｔａｎｉｃ ｆｏｒｃｅ）測定を示す図である。ＴＡ筋肉を解剖し、強縮測定のためのエクスビボでの電気生理学的検査を行った。移植されていない筋肉の力の産生のベースラインを、若齢（４カ月、青色破線）及び加齢（２７カ月、赤色破線）マウスにおいて測定した。処置された加齢ＭｕＳＣを、加齢マウスのＴＡ筋肉へと移植し、３０日後に力の産生を測定した（ｎ＝５）。 操作された皮膚組織の一過性リプログラミングの効果を示す。サテライト細胞における筋肉再生を示す。移植及び傷害後の異なる時点における、処置、加齢及び若齢細胞のバイオルミネセンスの定量化された結果を示す図である（ｎ＝１０）。 操作された皮膚組織の一過性リプログラミングの効果を示す。サテライト細胞における筋肉再生を示す。加齢・処置及び加齢・無処置細胞を移植されたマウスのＴＡ筋肉横断面における免疫蛍光染色の定量化を示す図である（ｎ＝５）。 操作された皮膚組織の一過性リプログラミングの効果を示す。サテライト細胞における筋肉再生を示す。移植されたＭｕＳＣのレシピエントであったＴＡ筋肉におけるドナー由来のＧＦＰ＋線維の横断面の面積の定量化を示すグラフである（ｎ＝５）。 操作された皮膚組織の一過性リプログラミングの効果を示す。サテライト細胞における筋肉再生を示す。ＭｕＳＣ移植後の６０日後に再度傷害された（第２の傷害）ＴＡ筋肉のバイオルミネセンスイメージングの結果を示す図である（ｎ＝６）。第２の傷害を行って、バイオルミネセンスシグナルが、初期に移植され、基底層の下に生着したルシフェラーゼ＋／ＧＦＰ＋ＭｕＳＣの活性化及び増大化の結果として増加したかを検査した。 一過性にリプログラミングされた細胞による角膜上皮細胞のトランスフェクションを示す。加齢対処置細胞におけるｐ１６の発現によって測定される、老化の低下を示す図である。 一過性にリプログラミングされた細胞による角膜上皮細胞のトランスフェクションを示す。加齢対処置細胞におけるｐ２１の発現によって測定される、老化の低下を示す図である。 一過性にリプログラミングされた細胞による角膜上皮細胞のトランスフェクションを示す。加齢対処置細胞における炎症性因子ＩＬ８の低下を示す図である。 一過性にリプログラミングされた細胞による角膜上皮細胞のトランスフェクションを示す。ＰＧＣ１α発現によって測定される、ミトコンドリア新生の増加を示す図である。 ＲＮＡｓｅｑ解析を使用して、処置及び加齢細胞の間の細胞特異的マーカーの変化のＰ値を示すチャートである。８種の線維芽細胞及び５０種の内皮細胞マーカーのうち、それぞれの細胞型において処置により有意な変化を示したものはなく、細胞独自性の保持を示唆する。 ＲＮＡｓｅｑ解析を使用して、処置及び加齢細胞の間の細胞特異的マーカーの変化のＰ値を示すチャートである。８種の線維芽細胞及び５０種の内皮細胞マーカーのうち、それぞれの細胞型において処置により有意な変化を示したものはなく、細胞独自性の保持を示唆する。 ＲＮＡｓｅｑ解析を使用して、処置及び加齢細胞の間の細胞特異的マーカーの変化のＰ値を示すチャートである。８種の線維芽細胞及び５０種の内皮細胞マーカーのうち、それぞれの細胞型において処置により有意な変化を示したものはなく、細胞独自性の保持を示唆する。 １１種の確立されたアッセイのパネルを使用して解析された、加齢の特徴を示す図である。
本明細書に記載されている技術の実施は、特に指示がない限り、当業者の技能範囲内で、医学、細胞生物学、薬理学、化学、生化学、分子生物学及び組換えＤＮＡ技法及び免疫学の従来方法を用いる。斯かる技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｇ．Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ及びＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、第１版、２００６）；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１及び２巻：（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｃｏｐｅ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００７）；Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ａｎｄ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｍ．Ｓａｂａｔｉｎｉ Ｐ．Ｐａｓｔｏｕｒｅａｕ及びＦ．Ｄｅ Ｃｅｕｎｉｎｃｋ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；２００４）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ． Ｗｅｉｒ及びＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、現行版）；並びにＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１）を参照されたい。
本明細書に引用されているあらゆる刊行物、特許及び特許出願は、上記であれ下記であれ、これによりそれらの全体を参照により本明細書に組み込む。
Ｉ．定義
本開示の記載において、次の用語が用いられ、下に示す通りに定義されることが意図される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、内容がそれ以外を明らかに指示しない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」が、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。よって、例えば、「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」の参照は、２つ以上の細胞の混合物、その他を含む。
本明細書を通じて、例えば、「一実施形態」、「ある実施形態」、「別の実施形態」、「特定の実施形態」、「関係する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加的な実施形態」若しくは「さらなる実施形態」又はこれらの組合せの参照は、当該実施形態に関連して記載されている特定の特色、構造又は特徴が、本開示の少なくとも一実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書を通じて、様々な箇所における前述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を参照する訳ではない。さらに、特定の特色、構造又は特徴は、１種以上の実施形態においていずれか適した様式で組み合わされてよい。
本明細書において、用語「約」は、当業者が指定の値と合理的に同様であると考慮する、指定の値を含む値の範囲を意味する。実施形態では、用語「約」は、当技術分野で一般に許容される測定を使用した、標準偏差内を意味する。実施形態では、約は、指定の値の＋／−１０％に延伸する範囲を意味する。実施形態では、約は、指定の値を意味する。
本明細書を通じて、文脈がそれ以外を要求しない限り、単語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記述されているステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素の群の包含を暗示するが、他のいかなるステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素の群の除外も暗示しないものと理解される。「からなる」とは、語句「からなる」に続くいかなるものを含み、これに限定されることを意味する。よって、語句「からなる」は、収載されている要素が、要求される又は必須であり、他の要素は存在しなくてもよいことを示す。「から本質的になる」とは、この語句の後に収載されているいずれかの要素を含み、収載されている要素に関して本開示に指定されている活性又は作用を妨害若しくは貢献しない他の要素に限定されることを意味する。よって、語句「から本質的になる」は、収載されている要素が、要求される又は必須であるが、他の要素が任意選択的でなく、収載されている要素の活性又は作用に影響を与えるか否かに応じて存在しても存在しなくてもよいことを示す。
本明細書において、用語「生体適合性」は一般に、レシピエントにとって一般に無毒性であり、対象にいかなる有意な有害効果も引き起こさない、材料及びそのいずれかの代謝物又は分解産物を指す。
本明細書において、用語「細胞」は、天然起源の又は修飾された、インタクトな生細胞を指す。培養物中で又は組織（部分的又はインタクトな）若しくは生物内で他の細胞と混合されている細胞は、他の細胞から単離され得る。本明細書に記載されている方法は、例えば、単細胞、細胞の集団、又は細胞を含む組織若しくは臓器を含む試料において行われ得る。
本明細書において、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を参照した用語「非組込み」は、宿主ゲノムへと染色体内又は染色体外に組み込まれておらず、ベクターへと組み込まれてもいない、ｍＲＮＡ分子を指す。
本明細書において、用語「トランスフェクション」は、細胞による外因性ＤＮＡ又はＲＮＡの取込みを指す。外因性ＤＮＡ又はＲＮＡが、細胞膜の内側に導入された場合、細胞は、「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技法が一般に、当技術分野で知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６頁、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（１９９５）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ及びＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７頁を参照されたい。斯かる技法は、細胞への１種以上の外因性ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の導入に使用され得る。この用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の安定した及び一過性の取込みの両方を指す。例えば、トランスフェクションは、若返りを必要とする細胞内への細胞リプログラミング因子をコードするｍＲＮＡの一過性取込みに使用され得る。
本明細書において、用語「一過性リプログラミング」は、細胞を若返らせる（すなわち、加齢の全て又は一部の特徴を排除する。）のに十分であるが、幹細胞への脱分化を引き起こすほど十分な長さでない期間における、細胞リプログラミング因子への細胞の曝露を指す。斯かる一過性リプログラミングは、その同一性（すなわち、分化した細胞型）を保持する若返った細胞をもたらす。
本明細書において、用語「若返った細胞（複数可）」は、細胞が、１種以上の細胞独自性マーカーを依然として保持しつつ、より若齢の細胞のトランスクリプトームプロファイルを有するように、１種以上の細胞リプログラミング因子により処置又は一過性にリプログラミングされた、加齢した細胞を指す。
本明細書において、用語「哺乳類細胞」は、同じ又は異なる対象への移植に適した哺乳類対象に由来するいずれかの細胞を指す。細胞は、異種間、自家又は同種異系であってもよい。細胞は、哺乳類対象から直接的に得られる初代細胞であってもよい。細胞は、対象から得られる細胞の培養及び増大化に由来する細胞であってもよい。一部の実施形態では、細胞は、組換えタンパク質及び／又は核酸を発現するように遺伝子操作されている。
本明細書において、用語「幹細胞」は、有糸細胞分裂により自己を再生する能力を保持し、多様な範囲の特殊化された細胞型へと分化することができる細胞を指す。哺乳類幹細胞は、３つの幅広いカテゴリーへと分けることができる：胚盤胞に由来する胚性幹細胞、成体組織に見出される成体幹細胞、及び臍帯に見出される臍帯血幹細胞。発生中の胚において、幹細胞は、特殊化された胚性組織の全てへと分化することができる。成体の生物において、幹細胞及び前駆細胞は、特殊化された細胞を補充することにより、身体の修復系として作用する。全能性幹細胞は、卵及び精子細胞の融合から産生される。受精卵の最初の数回の分裂によって産生された細胞も全能性である。これらの細胞は、胚性及び胚外細胞型へと分化することができる。多能性幹細胞は、全能性細胞の子孫であり、３つの胚葉のいずれかに由来する細胞へと分化することができる。複能性幹細胞は、細胞の近縁のファミリーの細胞のみを産生することができる（例えば、造血幹細胞は、赤血球細胞、白血球細胞、血小板などへと分化する。）。単能性細胞は、１種の細胞型のみを産生することができるが、自己再生の特性を有し、この特性により、非幹細胞から区別される。人工多能性幹細胞は、胚性様多能性状態へとリプログラミングされた成体細胞に由来する多能性幹細胞の一型である。人工多能性幹細胞は、例えば、皮膚又は血球細胞などの成体体細胞から得ることができる。
本明細書において、用語「トランスクリプトームプロファイル」は、１個の細胞又は細胞集団における全ＲＮＡ分子のセットを指す。これは、特定の実験に応じて、全ＲＮＡ又は単にｍＲＮＡを指すように使用されることもある。これは、指定の細胞集団に見出されるＲＮＡ分子のみを含み、通常、分子同一性に加えて各ＲＮＡ分子の量又は濃度を含むという点において、エクソームとは異なる。トランスクリプトームプロファイルを得る方法は、ＲＮＡ−ＳｅｑなどのＤＮＡマイクロアレイ及び次世代配列決定技術を含む。転写は、単細胞トランスクリプトミクスによって、個々の細胞のレベルで試験され得る。トランスクリプトーム配列を推論する２種の一般方法が存在する。一方のアプローチは、生物それ自身（そのトランスクリプトームが試験されている。）又は近縁の種のいずれかの参照ゲノムに配列読み取りデータをマッピングする。他方のアプローチであるデノボトランスクリプトームアセンブリは、短い配列読み取りデータから直接的に転写物を推論するソフトウェアを使用する。
本明細書において、用語「二乗平均平方根誤差」又は「ＲＭＳＥ」は、残差の標準偏差を指す（予測誤差）。残差は、データ点の回帰線からの遠さの尺度である。ＲＭＳＥは、これらの残差の広がりの尺度である。換言すると、これは、最良のフィットの線の周囲にデータがどの程度集中しているかを示す。
本明細書において、用語「細胞生存率」は、総細胞試料に基づく、生存している又は死亡している細胞の数の尺度を指す。本明細書に定義されている高い細胞生存率は、全細胞の８５％超が生存可能であり、好ましくは９０〜９５％超が生存可能である細胞集団、より好ましくは、９９％超の生存可能細胞を含有する高い細胞生存率によって特徴付けられる集団を指す。
本明細書において、用語「オートファゴソーム」は、二重層膜を有する球状構造を指す。これは、細胞質内容物（例えば、異常な細胞内タンパク質、過剰な又は損傷したオルガネラ）の、また、侵入した微生物の細胞内分解系でもある、マクロオートファジーにおける鍵となる構造である。形成後に、オートファゴソームは、リソソームに細胞質成分を送達する。オートファゴソームの外膜は、リソソームと融合して、オートリソソームを形成する。リソソームのヒドロラーゼは、オートファゴソームに送達された内容物及びその内膜を分解する。
本明細書において、用語「プロテアソーム活性」は、ペプチド結合を切断する化学反応であるタンパク質分解による、タンパク質複合体であるプロテアソームによる不必要な又は損傷したタンパク質の分解を指す。用語「キモトリプシン様プロテアソーム活性」は、プロテアソームの別個の触媒活性を指す。
本明細書において、用語「ミトコンドリア膜電位」は、クレブス回路の活性に伴うレドックス転換に起因し、ＡＴＰを作製するためのエネルギー貯蔵の中間形態として機能する、電位及びプロトン勾配を指す。これは、プロトンポンプによって生成され、酸化的リン酸化におけるエネルギー貯蔵の必須プロセスである。これは、機能不全ミトコンドリアの選択的な排除により、ミトコンドリア恒常性において鍵となる役割を果たす。
本明細書において、用語「薬学的に許容される賦形剤又は担体」は、本開示の組成物中に任意選択的に含まれ得、患者に有意な有害毒性学的効果を引き起こさない、賦形剤を指す。
本明細書において、用語「活性酸素種」又は「ＲＯＳ」は、酸素を含有する化学的に反応性の化学種である。例として、過酸化物、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素及びアルファ−酸素が挙げられる。生物学的な文脈において、ＲＯＳは、酸素の正常な代謝の天然副産物として形成され、細胞のシグナリング及び恒常性において重要な役割を有する。
本明細書において、用語「細胞老化関連分泌現象」又は「ＳＡＳＰ」は、老化した細胞の特徴的な特色である数々の多様なサイトカイン、ケモカイン、成長因子及びプロテアーゼを指す。老化した細胞は、依然として代謝性的に活性であり、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞外マトリックスリモデリング因子及び成長因子などの分泌型タンパク質をコードする遺伝子を含む広範囲の遺伝子の上方調節を示す、安定した非分裂細胞である。これらの分泌型タンパク質は、組織微小環境において生理学的に機能し、それによると、分泌型タンパク質は、ストレス応答を伝播し、近隣の細胞と連絡することができる。細胞老化関連分泌現象（ＳＡＳＰ）と命名されたこの表現型は、老化した細胞のパラクリン機能を明らかにし、老化した細胞を、静止状態細胞及び終末分化細胞などの老化していない細胞周期停止細胞から区別する重要な特徴である。「ＳＡＳＰサイトカイン」は、老化した細胞によって産生されて細胞老化関連分泌現象を創出するサイトカインを特に指す。サイトカインとして、ＩＬ１８、ＩＬ１Ａ、ＧＲＯＡ、ＩＬ２２及びＩＬ９が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において、用語「メチル化ランドスケープ」は、細胞又は細胞集団のＤＮＡメチル化パターンを指す。
本明細書において、用語「エピジェネティック時計」は、年齢の測定に使用され得る生化学的検査を指す。この検査は、ＤＮＡメチル化レベルに基づく。最初の複数組織エピジェネティック時計であるＨｏｒｖａｔｈのエピジェネティック時計又は「Ｈｏｒｖａｔｈ時計」は、Ｓｔｅｖｅ Ｈｏｒｖａｔｈ（Ｈｏｒｖａｔｈ ２０１３）によって開発された。
本明細書において、用語「細胞リプログラミング因子」は、成体の又は分化した細胞を多能性幹細胞へと変換することができる転写因子のセットを指す。本明細書における実施形態では、この因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを含む。
「薬学的に許容される塩」として、アミノ酸塩、塩化物、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化物及び硝酸塩などの無機酸により調製された塩、又は先行物のいずれかの対応する無機酸形態から調製された塩、例えば、塩酸塩など、又はリンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、エチルコハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、パラ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、サリチル酸塩及びステアリン酸塩などの有機酸により調製された塩、並びにエストレート、グルセプト酸塩及びラクトビオン酸塩が挙げられるがこれらに限定されない。同様に、薬学的に許容されるカチオンを含有する塩として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム及びアンモニウム（置換アンモニウムを含む）が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において、用語「移植」は、別の供給源から対象への細胞、組織又は臓器の移動を指す。この用語は、特定の移動機序に限定されない。細胞は、注射又は外科的埋植などのいずれか適した方法によって移植され得る。
本明細書において、用語「関節炎」として、変形性関節症、関節リウマチ、ループス関連関節炎、若年性特発性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎及び乾癬性関節炎が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において、用語「加齢性疾患又は状態」は、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、認知症及び脳卒中）、心血管及び末梢血管疾患（例えば、粥状動脈硬化、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、血腫、石灰化、血栓症、塞栓症及び動脈瘤）、眼疾患（例えば、加齢性黄斑変性、緑内障、白内障、ドライアイ、糖尿病性網膜症、視力喪失）、皮膚疾患（皮膚の萎縮及び皮膚が薄くなること、弾性線維分解（ｅｌａｓｔｏｌｙｓｉｓ）及び皮膚のしわ、皮脂腺過形成又は低形成、老人性黒子及び他の色素沈着異常、白髪、抜け毛又は髪が薄くなること、並びに慢性皮膚潰瘍）、自己免疫性疾患（例えば、リウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）、巨細胞動脈炎（ＧＣＡ）、関節リウマチ（ＲＡ）、結晶性関節炎及び脊椎関節症（ＳＰＡ））、内分泌及び代謝性機能不全（例えば、成人下垂体機能低下症、甲状腺機能低下症、無欲性甲状腺中毒症、骨粗鬆症、真性糖尿病、副腎不全、様々な形態の性腺機能低下症及び内分泌悪性病変）、筋骨格障害（例えば、関節炎、骨粗鬆症、骨髄腫、痛風、パジェット病、骨折、骨髄不全症候群、関節強直、広汎性特発性骨増殖症、血行性骨髄炎、筋萎縮、末梢性ニューロパチー、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、原発性側索硬化症及び重症筋無力症）、消化器系の疾患（例えば、肝硬変、肝線維症、バレット食道）、呼吸器疾患（例えば、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、慢性気管支炎、肺塞栓症（ＰＥ）、肺がん及び感染症）、並びに加齢に伴う他のいずれかの疾患及び障害などが挙げられるがこれらに限定されない、加齢に伴ういずれかの状態、疾患又は障害を指す。
本明細書において、用語「軟骨変性が関与する疾患又は障害」は、軟骨及び／又は関節変性が関与するいずれかの疾患又は障害である。用語「軟骨変性が関与する疾患又は障害」は、ヒトを含む動物における脊椎円板又は関節（例えば、関節接合部）に罹患する状態、障害、症候群、疾患及び傷害を含み、そのようなものとして、関節炎、軟骨無形成症（ｃｈｏｎｄｒｏｐｈａｓｉａ）、脊椎関節症、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、再発性多発軟骨炎及びシェーグレン症候群が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において、用語「筋肉変性疾患又は障害」は、筋肉変性が関与するいずれかの疾患又は障害である。この用語は、筋萎縮、廃用性筋肉、筋断裂、熱傷、外科手術、末梢性ニューロパチー、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、原発性側索硬化症、重症筋無力症、がん、ＡＩＤＳ、うっ血性心不全、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝臓疾患、腎不全、摂食障害、栄養不良、飢餓、感染症、又はグルココルチコイドによる処置などが挙げられるがこれらに限定されない、筋肉組織に影響する状態、障害、症候群、疾患及び傷害を含む。
「治療有効用量又は量」とは、処置部位における機能を回復させる、及び／又は新たな組織の生成をもたらす量などの、組織修復又は再生を必要とする対象に肯定的な治療応答をもたらす、若返った細胞又は非組込みメッセンジャーＲＮＡの量を意図するものである。若返った細胞は、本明細書に記載されている通り、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡによる、インビトロ、エクスビボ又はインビボでのトランスフェクションによって産生され得る。よって、例えば、「肯定的な治療応答」は、回復された組織機能性、低下された疼痛、改善されたスタミナ、増加された強度、増加された移動性及び／又は改善された認知機能などの、治療法に関連した加齢性疾患若しくは状態における改善、及び／又は治療法に関連した加齢性疾患若しくは状態の１種以上の症状における改善である。要求される正確な量（細胞又はｍＲＮＡの）は、対象の種、年齢及び全身状態、処置されている状態の重篤度、投与機序その他に応じて、対象間で変動する。いずれか個々の事例における適切な「有効」量は、本明細書に提供される情報に基づき、ルーチン実験法を使用した当業者によって決定され得る。
例えば、若返った軟骨細胞の治療有効用量又は量は、処置部位（例えば、損傷した関節）に新たな軟骨の生成をもたらす量などの、本明細書に記載されている通りに投与されると、軟骨損傷又は喪失を有する対象に肯定的な治療応答をもたらす量を意図する。例えば、治療有効用量又は量は、外傷性傷害に起因する軟骨損傷若しくは喪失、又は関節炎若しくは軟骨変性が関与する他の疾患などの変性疾患の治療に使用され得る。好ましくは、治療有効量は、機能を回復させる、及び／又は軟骨損傷若しくは喪失に伴う疼痛及び炎症を軽減する。
別の例では、若返った骨格筋幹細胞の治療有効用量又は量は、処置部位（例えば、損傷した筋肉）における新たな筋線維の生成をもたらす量などの、本明細書に記載されている通りに投与されると、筋肉損傷又は喪失を有する対象に肯定的な治療応答をもたらす量を意図する。例えば、治療有効用量又は量は、外傷性傷害に起因する筋肉損傷若しくは喪失、又は筋肉変性が関与する疾患若しくは障害の治療に使用され得る。好ましくは、治療有効量は、筋力及び筋機能を改善する。
本明細書において、用語「対象」、「個体」及び「患者」は、本明細書で互換的に使用され、ヒト、並びにチンパンジー及び他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類を含む他の霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマなどの家畜；イヌ及びネコなどの飼育哺乳類；マウス、ラット、ウサギ、ハムスター及びモルモットなどの齧歯類；ニワトリ、シチメンチョウ及び他の家禽鳥類、アヒル、ガチョウその他などの飼育、野生及び狩猟（ｇａｍｅ）鳥類を含む鳥類を限定することなく含む、いずれかの脊椎動物対象を指す。一部の事例では、本開示の方法は、実験動物、獣医学適用、及び疾患のための動物モデルの開発における使用を見出す。この用語は、特定の年齢を表示しない。よって、成体及び新生児個体の両方が網羅されることを意図する。
ＩＩ．方法
本開示について詳細に記載する前に、特定の製剤又はプロセスパラメータは、当然ながら変動し得るため、本開示が、斯かる特定の製剤又はプロセスパラメータに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用されている用語法が、単に本開示の特定の実施形態のみを記載することを目的とし、限定を意図するものではないことも理解されたい。
本明細書に記載されているものと同様又は同等の多数の方法及び材料が、本開示の実施において使用されてよいが、好まれる材料及び方法が本明細書に記載されている。
本開示は、例えば、ミトコンドリア機能、タンパク質分解活性、ヘテロクロマチンレベル、ヒストンメチル化、核ラミナポリペプチド、サイトカイン分泌又は老化に影響を与えるｍＲＮＡの一過性過剰発現によって、加齢した細胞及び組織を若返らせて、機能性を回復させる方法に関する。特に、本発明者らは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧをコードするｍＲＮＡが、分化した細胞状態に細胞を保持しつつ、線維芽細胞、内皮細胞、軟骨細胞及び骨格筋幹細胞を含む種々の細胞型の若返りに使用され得ることを示した。
本開示のさらなる理解のため、ｍＲＮＡによる一過性リプログラミングによって細胞を若返らせる方法、及び斯かる若返った細胞を使用した細胞に基づく治療法に関するより詳細な記述を下に示す。
ａ．細胞の若返り
ある態様では、細胞を若返らせる方法であって、細胞に、連続した５日以下の間、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡをトランスフェクトし、これにより、若返った細胞を産生するステップを含む方法が本明細書に提供される。
実施形態では、若返った細胞は、若齢細胞と同様の表現型又は活性プロファイルを有する。表現型又は活性プロファイルは、トランスクリプトームプロファイル、１種以上の核及び／又はエピジェネティックマーカーの遺伝子発現、タンパク質分解活性、ミトコンドリアの健康及び機能、ＳＡＳＰサイトカイン発現並びにメチル化ランドスケープのうち１種以上を含む。
実施形態では、若返った細胞は、若齢細胞のトランスクリプトームプロファイルに類似したトランスクリプトーム（ｔｒａｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ）プロファイルを有する。実施形態では、若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルは、ＲＰＬ３７、ＲＨＯＡ、ＳＲＳＦ３、ＥＰＨＢ４、ＡＲＨＧＡＰ１８、ＲＰＬ３１、ＦＫＢＰ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ２、Ｅｌｆ１、Ｐｈｆ８、Ｐｏｌ２ｓ２、Ｔａｆ１及びＳｉｎ３ａから選択される１種以上の遺伝子の遺伝子発現の増加を含む。実施形態では、若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルは、ＲＰＬ３７の遺伝子発現の増加を含む。実施形態では、若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルは、ＲＨＯＡの遺伝子発現の増加を含む。実施形態では、若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルは、ＳＲＳＦ３の遺伝子発現の増加を含む。実施形態では、若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルは、ＥＰＨＢ４の遺伝子発現の増加を含む。実施形態では、若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルは、ＡＲＨＧＡＰ１８の遺伝子発現の増加を含む。実施形態では、若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルは、ＲＰＬ３１の遺伝子発現の増加を含む。実施形態では、若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルは、ＦＫＢＰ２の遺伝子発現の増加を含む。実施形態では、若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルは、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ２の遺伝子発現の増加を含む。実施形態では、若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルは、Ｅｌｆ１の遺伝子発現の増加を含む。実施形態では、若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルは、Ｐｈｆ８の遺伝子発現の増加を含む。実施形態では、若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルは、Ｐｏｌ２ｓ２の遺伝子発現の増加を含む。実施形態では、若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルは、Ｔａｆ１の遺伝子発現の増加を含む。実施形態では、若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルは、Ｓｉｎ３ａの遺伝子発現の増加を含む。実施形態では、若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルは、ＲＰＬ３７、ＲＨＯＡ、ＳＲＳＦ３、ＥＰＨＢ４、ＡＲＨＧＡＰ１８、ＲＰＬ３１、ＦＫＢＰ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ２、Ｅｌｆ１、Ｐｈｆ８、Ｐｏｌ２ｓ２、Ｔａｆ１及びＳｉｎ３ａの遺伝子発現の増加を含む。
実施形態では、若返った細胞は、参照値と比較して、１種以上の核及び／又はエピジェネティックマーカーの増加した遺伝子発現を示す。実施形態では、１種以上の核及び／又はエピジェネティックマーカーは、ＨＰ１ガンマ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、ラミナ支持タンパク質ＬＡＰ２アルファ及びＳＩＲＴ１タンパク質から選択される。実施形態では、若返った細胞は、ＨＰ１ガンマの増加した遺伝子発現を示す。実施形態では、若返った細胞は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の増加した遺伝子発現を示す。実施形態では、若返った細胞は、ラミナ支持タンパク質ＬＡＰ２アルファの増加した遺伝子発現を示す。実施形態では、若返った細胞は、ＳＩＲＴ１タンパク質の増加した遺伝子発現を示す。実施形態では、若返った細胞は、ＨＰ１ガンマ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、ラミナ支持タンパク質ＬＡＰ２アルファ及びＳＩＲＴ１タンパク質の増加した遺伝子発現を示す。
実施形態では、若返った細胞は、若齢細胞のタンパク質分解活性に類似したタンパク質分解活性を有する。実施形態では、タンパク質分解活性は、増加した細胞オートファゴソーム形成、増加したキモトリプシン様プロテアソーム活性、又はこれらの組合せとして測定される。実施形態では、タンパク質分解活性は、増加した細胞オートファゴソーム形成として測定される。実施形態では、タンパク質分解活性は、増加したキモトリプシン様プロテアソーム活性として測定される。実施形態では、タンパク質分解活性は、増加した細胞オートファゴソーム形成及び増加したキモトリプシン様プロテアソーム活性として測定される。
実施形態では、若返った細胞は、参照値と比較して、改善されたミトコンドリアの健康及び機能を示す。実施形態では、改善されたミトコンドリアの健康及び機能は、増加したミトコンドリア膜電位、減少した活性酸素種（ＲＯＳ）、又はこれらの組合せとして測定される。実施形態では、改善されたミトコンドリアの健康及び機能は、増加したミトコンドリア膜電位として測定される。実施形態では、改善されたミトコンドリアの健康及び機能は、減少した活性酸素種（ＲＯＳ）として測定される。実施形態では、改善されたミトコンドリアの健康及び機能は、増加したミトコンドリア膜電位及び減少した活性酸素種（ＲＯＳ）として測定される。
実施形態では、若返った細胞は、参照値と比較して、１種以上のＳＡＳＰサイトカインの減少した発現を示す。実施形態では、１種以上のＳＡＳＰサイトカインは、ＩＬ１８、ＩＬ１Ａ、ＧＲＯＡ、ＩＬ２２及びＩＬ９を含む。実施形態では、若返った細胞は、ＩＬ１８の減少した発現を示す。実施形態では、若返った細胞は、ＩＬ１Ａの減少した発現を示す。実施形態では、若返った細胞は、ＧＲＯＡの減少した発現を示す。実施形態では、若返った細胞は、ＩＬ２２の減少した発現を示す。実施形態では、若返った細胞は、ＩＬ９の減少した発現を示す。実施形態では、若返った細胞は、ＩＬ１８、ＩＬ１Ａ、ＧＲＯＡ、ＩＬ２２及びＩＬ９の減少した発現を示す。
実施形態では、若返った細胞は、メチル化ランドスケープの反転を示す。実施形態では、メチル化ランドスケープの反転は、Ｈｏｒｖａｔｈ時計による推定によって測定される。
実施形態では、参照値は、加齢した細胞から得られる。
実施形態では、細胞は、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードするｍＲＮＡによる一過性リプログラミングによって若返る。一過性リプログラミングは、少なくとも２日かつ５日以下の間、非組込みｍＲＮＡを細胞に１日１回トランスフェクトすることにより達成される。「非組込み」とは、リプログラミングが一過性となり、若返った細胞の同一性を破壊しない（すなわち、細胞が、その成体細胞型へと分化する能力を保持する。）ように、ｍＲＮＡ分子が、宿主ゲノムへと染色体内又は染色体外に組み込まれておらず、ベクターへと組み込まれてもいないことを意味する。実施形態では、細胞の一過性リプログラミングは、幹細胞への細胞の完全脱分化を回避しつつ、加齢の様々な特徴を排除する。
実施形態では、細胞にメッセンジャーＲＮＡをトランスフェクトするステップは、リポフェクタミン及びＬＴ−１媒介トランスフェクション、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームにおけるｍＲＮＡの封入、並びに直接的マイクロインジェクションから選択されるトランスフェクション方法によって達成され得る。実施形態では、細胞にメッセンジャーＲＮＡをトランスフェクトするステップは、リポフェクタミン及びＬＴ−１媒介トランスフェクションによって達成され得る。実施形態では、細胞にメッセンジャーＲＮＡをトランスフェクトするステップは、デキストラン媒介トランスフェクションによって達成され得る。実施形態では、細胞にメッセンジャーＲＮＡをトランスフェクトするステップは、リン酸カルシウム沈殿によって達成され得る。実施形態では、細胞にメッセンジャーＲＮＡをトランスフェクトするステップは、ポリブレン媒介トランスフェクションによって達成され得る。実施形態では、細胞にメッセンジャーＲＮＡをトランスフェクトするステップは、エレクトロポレーションによって達成され得る。実施形態では、細胞にメッセンジャーＲＮＡをトランスフェクトするステップは、リポソームにおけるｍＲＮＡの封入によって達成され得る。実施形態では、細胞にメッセンジャーＲＮＡをトランスフェクトするステップは、直接的マイクロインジェクションによって達成され得る。
細胞の加齢反転又は若返りは、細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上のｍＲＮＡの一過性過剰発現によって達成される。斯かる細胞リプログラミング因子は、ミトコンドリア機能、タンパク質分解活性、ヘテロクロマチンレベル、ヒストンメチル化、核ラミナポリペプチド、サイトカイン分泌又は老化に影響を与える、転写因子、エピジェネティックリモデリング因子（ｒｅｍｏｄｅｌｅｒ）又は小分子を含むことができる。実施形態では、細胞リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧのうち１種以上を含む。別の実施形態では、細胞リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを含む。ある特定の実施形態では、細胞リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧからなる。
実施形態では、本明細書に提供される方法は、若返りを必要とするいずれかの型の細胞に適用され得る。培養中で又は組織（部分的又はインタクトな）若しくは生存している生物内で他の細胞と混合されている細胞は、他の細胞から単離され得る。本明細書に記載されている方法は、例えば、単細胞、細胞の集団、又は細胞を含む組織若しくは臓器を含む試料において行われ得る。若返りに選ばれる細胞は、加齢性疾患又は状態の処置に対する所望の治療効果に依存する。
実施形態では、細胞は、哺乳類細胞である。実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。実施形態では、細胞は、高齢対象に由来する。
実施形態では、本明細書に提供される方法は、神経系、筋肉系、呼吸器系、心血管系、骨格系、生殖器系、外皮系、リンパ系、排泄系、内分泌系（例えば、内分泌及び外分泌）又は消化器系の細胞、組織又は臓器において行われ得る。上皮細胞（例えば、扁平上皮、立方状、円柱状及び偽重層上皮細胞）、内皮細胞（例えば、静脈、動脈及びリンパ管内皮細胞）、並びに結合組織、筋肉及び神経系の細胞が挙げられるがこれらに限定されない、いずれの型の細胞が、本明細書に記載されている通り、潜在的に若返ってもよい。斯かる細胞として、表皮細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、サテライト細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、ケラチノサイト、基底細胞、エナメル芽細胞、外分泌の分泌細胞、筋上皮細胞、骨芽細胞、破骨細胞、ニューロン（例えば、感覚ニューロン、運動ニューロン及び介在ニューロン）、グリア細胞（例えば、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、上衣細胞、マイクログリア、シュワン細胞及びサテライト細胞）、柱細胞、脂肪細胞、ペリサイト、星状細胞、肺細胞、血液及び免疫系細胞（例えば、赤血球、単球、樹状細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）、ホルモン分泌細胞、生殖細胞、間質細胞、水晶体細胞、光受容体細胞、味覚受容体細胞並びに嗅細胞；並びに腎臓、肝臓、膵臓、胃、脾臓、胆嚢、腸、膀胱、肺、前立腺、乳房、尿生殖路、下垂体細胞、口腔、食道、皮膚、毛髪、爪、甲状腺、副甲状腺、副腎、眼、鼻又は脳由来の細胞及び／又は組織を挙げることができるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞、内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋幹細胞、ケラチノサイト、間葉系幹細胞及び角膜上皮細胞から選択される。実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。実施形態では、細胞は、内皮細胞である。実施形態では、細胞は、軟骨細胞である。実施形態では、細胞は、骨格筋幹細胞である。実施形態では、細胞は、ケラチノサイトである。実施形態では、細胞は、間葉系幹細胞である。実施形態では、細胞は、角膜上皮細胞である。
実施形態では、若返った線維芽細胞は、若齢線維芽細胞のトランスクリプトームプロファイルと同様のトランスクリプトームプロファイルを示す。実施形態では、若返った線維芽細胞は、上に記載されている参照値と比較して、１種以上の核及び／又はエピジェネティックマーカーの増加した遺伝子発現を示す。実施形態では、若返った線維芽細胞は、上に記載されている若齢細胞のタンパク質分解活性に類似したタンパク質分解活性を有する。実施形態では、若返った線維芽細胞は、上に記載されている参照値と比較して、改善されたミトコンドリアの健康及び機能を示す。実施形態では、若返った線維芽細胞は、メチル化ランドスケープの反転を示す。
実施形態では、若返った内皮細胞は、若齢内皮細胞のトランスクリプトームプロファイルと同様のトランスクリプトームプロファイルを示す。実施形態では、若返った内皮細胞は、上に記載されている参照値と比較して、１種以上の核及び／又はエピジェネティックマーカーの増加した遺伝子発現を示す。実施形態では、若返った内皮細胞は、上に記載されている若齢細胞のタンパク質分解活性に類似したタンパク質分解活性を有する。実施形態では、若返った内皮細胞は、上に記載されている参照値と比較して、改善されたミトコンドリアの健康及び機能を示す。実施形態では、若返った内皮細胞は、メチル化ランドスケープの反転を示す。
実施形態では、若返った軟骨細胞は、炎症性因子の低下した発現、及び／又は増加したＡＴＰ及びコラーゲン代謝を示す。実施形態では、炎症性因子は、ＲＡＮＫＬ、ｉＮＯＳ２、ＩＬ６、ＩＦＮα、ＭＣＰ３及びＭＩＰ１Ａを含む。実施形態では、若返った軟骨細胞は、ＲＡＮＫＬの低下した発現を示す。実施形態では、若返った軟骨細胞は、ｉＮＯＳ２の低下した発現を示す。実施形態では、若返った軟骨細胞は、ＩＬ６の低下した発現を示す。実施形態では、若返った軟骨細胞は、ＩＦＮαの低下した発現を示す。実施形態では、若返った軟骨細胞は、ＭＣＰ３の低下した発現を示す。実施形態では、若返った軟骨細胞は、ＭＩＰ１Ａの低下した発現を示す。実施形態では、若返った軟骨細胞は、ＲＡＮＫＬ、ｉＮＯＳ２、ＩＬ６、ＩＦＮα、ＭＣＰ３及びＭＩＰ１Ａの低下した発現を示す。実施形態では、若返った軟骨細胞は、増加したＡＴＰ及びコラーゲン代謝を示す。実施形態では、ＡＴＰ及びコラーゲン代謝は、増加したＡＴＰレベル、減少したＲＯＳ及び増加したＳＯＤ２発現、増加したＣＯＬ２Ａ１発現及び軟骨細胞による全体的な増殖のうち１種以上によって測定される。実施形態では、ＡＴＰ及びコラーゲン代謝は、増加したＡＴＰレベルによって測定される。実施形態では、ＡＴＰ及びコラーゲン代謝は、減少したＲＯＳ及び増加したＳＯＤ２発現によって測定される。実施形態では、ＡＴＰ及びコラーゲン代謝は、増加したＣＯＬ２Ａ１発現及び軟骨細胞による全体的な増殖によって測定される。
実施形態では、若返った骨格筋幹細胞は、より高い増殖能、筋芽細胞及び筋線維へと分化する能力の増強、より低い、静止状態からの活性化動態の回復、筋肉マイクロニッチ（ｍｉｃｒｏｎｉｃｈｅ）を若返らせる能力、筋肉における若々しい力の回復、又はこれらの組合せを示す。
実施形態では、若返ったケラチノサイトは、より高い増殖能、低下した炎症性表現型、より低いＲＮＡＫＬ及びＩＮＯＳ２発現、サイトカインＭＩＰ１Ａ、ＩＬ６、ＩＦＮａ、ＭＣＰ３の低下した発現、増加したＡＴＰ、増加したレベルのＳＯＤ２及びＣＯＬ２Ａ１発現を示す。
実施形態では、若返った間葉系幹細胞は、老化パラメータの低下、増加した細胞増殖及び／又はＲＯＳレベルの減少を示す。実施形態では、若返った間葉系幹細胞は、老化パラメータの低下を示す。実施形態では、老化パラメータは、ｐ１６発現、ｐ２１発現及び陽性ＳＡβＧａｌ染色を含む。実施形態では、若返った間葉系幹細胞は、増加した細胞増殖を示す。実施形態では、若返った間葉系幹細胞は、ＲＯＳレベルの減少を示す。実施形態では、若返った間葉系幹細胞は、老化パラメータの低下、増加した細胞増殖及びＲＯＳレベルの減少を示す。
実施形態では、若返った角膜上皮細胞は、老化パラメータの低下を示す。実施形態では、老化パラメータは、ｐ２１の発現、ｐ１６の発現、ミトコンドリア新生ＰＧＣ１α、及び炎症性因子ＩＬ８の発現のうち１種以上を含む。実施形態では、老化パラメータは、ｐ２１を含む。実施形態では、老化パラメータは、ｐ１６の発現を含む。実施形態では、老化パラメータは、ミトコンドリア新生ＰＧＣ１αを含む。実施形態では、老化パラメータは、炎症性因子ＩＬ８の発現を含む。実施形態では、老化パラメータは、ｐ２１の発現、ｐ１６の発現、ミトコンドリア新生ＰＧＣ１α、及び炎症性因子ＩＬ８の発現のうち１種以上を含む。
本開示の方法は、細胞療法における使用のために機能及び分化能を改善するために、培養（例えば、エクスビボ又はインビトロ）における細胞を若返らせるために使用され得る。患者の治療において使用される細胞は、自家又は同種異系であってもよい。好ましくは、細胞は、患者又はマッチしたドナーに由来する。例えば、エクスビボ療法において、細胞は、治療されるべき患者から直接的に得られ、本明細書に記載されている細胞リプログラミング因子をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトされ、患者に再び移植される。斯かる細胞は、例えば、患者において行われた生検又は外科的手技から得ることができる。その代わりに、若返りを必要とする細胞は、細胞リプログラミング因子をコードするｍＲＮＡをインビボで直接的にトランスフェクトされてよい。
トランスフェクションは、若返りを必要とする細胞への細胞リプログラミング因子をコードするｍＲＮＡの一過性取込みをもたらす（すなわち、一過性リプログラミングのための）、当技術分野で知られているいずれか適した方法を使用して行われ得る。実施形態では、対象の細胞へのｍＲＮＡのエクスビボ、インビトロ又はインビボ送達のための方法は、リポフェクタミン及びＬＴ−１媒介トランスフェクション、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームにおけるｍＲＮＡの封入、細胞へのｍＲＮＡの直接的マイクロインジェクション、又はこれらの組合せから選択される方法を含むことができる。
ｂ．組成物
ある態様では、細胞に、連続した５日以下の間、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡをトランスフェクトするステップによって得られる若返った細胞を含む医薬組成物が本明細書に提供される。
実施形態では、若返った細胞は、自家である。実施形態では、若返った細胞は、同種異系である。
実施形態では、１種以上の細胞リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧから選択される。実施形態では、細胞リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧである。
実施形態では、若返った細胞は、次のうち１種以上を呈する：ＨＰ１ガンマ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、ＬＡＰ２アルファ、ＳＩＲＴ１の増加した発現、増加したミトコンドリア膜電位及び減少した活性酸素種、並びにＳＡＳＰサイトカインの減少した発現。実施形態では、ＳＡＳＰサイトカインは、ＩＬ１８、ＩＬ１Ａ、ＧＲＯＡ、ＩＬ２２及びＩＬ９のうち１種以上を含む。
ある特定の実施形態では、細胞療法における使用のための若返った細胞を含む組成物は、細胞機能又は生存率を改善するために、栄養素、サイトカイン、成長因子、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、抗生物質、抗酸化剤又は免疫抑制剤などの１種以上の追加的な因子をさらに含むことができる。組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むこともできる。
成長因子の例として、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、エピレギュリン、上皮成長因子（「ＥＧＦ」）、内皮細胞成長因子（「ＥＣＧＦ」）、神経成長因子（「ＮＧＦ」）、白血病抑制因子（「ＬＩＦ」）、骨形成タンパク質−４（「ＢＭＰ−４」）、肝細胞成長因子（「ＨＧＦ」）、血管内皮成長因子−Ａ（「ＶＥＧＦ−Ａ」）及びコレシストキニンオクタペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。
ＥＣＭ成分の例として、プロテオグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸及びケラタン硫酸）、非プロテオグリカン多糖（例えば、ヒアルロン酸）、線維（例えば、コラーゲン及びエラスチン）及び他のＥＣＭ成分（例えば、フィブロネクチン及びラミニン）が挙げられるがこれらに限定されない。
免疫抑制剤の例として、ステロイド系（例えば、プレドニゾン）又は非ステロイド系（例えば、シロリムス（ラパミューン、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ Ｃａｎａｄａ）、タクロリムス（プログラフ、Ｆｕｊｉｓａｗａ Ｃａｎａｄａ）及び抗ＩＬ２Ｒダクリズマブ（ゼナパックス、Ｒｏｃｈｅ Ｃａｎａｄａ）が挙げられるがこれらに限定されない。他の免疫抑制薬剤は、１５−デオキシスパガリン、シクロスポリン、メトトレキセート、ラパマイシン、ラパミューン（シロリムス／ラパマイシン）、ＦＫ５０６又はリソフィリン（ＬＳＦ）を含む。
１種以上の薬学的に許容される賦形剤が含まれていてもよい。例として、炭水化物、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性物質、バッファー、酸、塩基、及びこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
例えば、微生物の成長を防止又は阻止するための抗菌剤が含まれていてよい。本開示に適した抗菌剤の非限定的な例として、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、及びこれらの組合せが挙げられる。抗菌剤（Ａｎｔｉｂｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ）は、細菌感染症の防止に使用することもできる抗生物質も含む。抗生物質の例として、アモキシシリン、ペニシリン、サルファ剤、セファロスポリン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、クラリスロマイシン（ｃｈｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、シプロフロキサシン（ｃｉｐｒｏｆｌｏｚａｃｉｎ）、アジスロマイシンその他が挙げられる。ミコナゾール（ｍｙｃｏｎａｚｏｌｅ）及びテルコナゾールなどの抗真菌剤も含まれる。
還元型グルタチオン（ＧＳＨ）又はその前駆体、グルタチオン若しくはグルタチオンアナログ、グルタチオンモノエステル、及びＮ−アセチルシステインなどのチオール基を有する分子などの、様々な抗酸化剤が含まれていてもよい。他の適した抗酸化剤は、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ビタミンＥ、トロロクス、リポ酸、ラザロイド（ｌａｚａｒｏｉｄ）、ブチルヒドロキシアニソール（ｈｖｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ）（ＢＨＡ）、ビタミンＫその他を含む。
注射用組成物に適した賦形剤は、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油、リン脂質及び界面活性物質を含む。糖、アルジトール、アルドン酸などの誘導体化糖、エステル化糖及び／又は糖ポリマーなどの炭水化物は、賦形剤として存在することができる。特異的な炭水化物賦形剤は、例えば：フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースその他などの単糖；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースその他などの二糖；ラフィノース、メレジトース（ｍｅｌｅｚｉｔｏｓｅ）、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンその他などの多糖；及びマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトールその他などのアルジトールを含む。賦形剤は、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、及びこれらの組合せなどの無機塩又はバッファーを含むこともできる。
酸又は塩基が、賦形剤として存在することもできる。使用することができる酸の非限定的な例として、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、及びこれらの組合せからなる群から選択される酸が挙げられる。適した塩基の例は、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｆｕｍｅｒａｔｅ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される塩基を限定することなく含む。
典型的に、いずれか個々の賦形剤の最適な量は、ルーチン実験法により、すなわち、変動する量の賦形剤（少量〜多量に及ぶ）を含有する組成物を調製し、安定性及び他のパラメータを試験し、次いで、有意な有害効果なしで最適な成績が達成される範囲を決定することにより決定される。しかし、一般に、賦形剤（複数可）は、重量で約１％〜約９９％、好ましくは、重量で約５％〜約９８％、より好ましくは、重量で約１５〜約９５％の賦形剤の量で組成物中に存在し、重量で３０％未満の濃度が最も好まれる。これらの前述の医薬賦形剤は、他の賦形剤と共に、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」第１９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９９５）、「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」第５２版、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ（１９９８）及びＫｉｂｂｅ，Ａ．Ｈ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、２０００に記載されている。
ｃ．投与
本開示の方法は、加齢性疾患又は状態に関する対象の治療に使用され得る。例えば、リプログラミング因子をコードする非組込みｍＲＮＡによるトランスフェクションによる細胞の一過性リプログラミングが関与する細胞療法（例えば、インビトロ、エクスビボ又はインビボでの）は、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、認知症及び脳卒中）、心血管及び末梢血管疾患（例えば、粥状動脈硬化、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、血腫、石灰化、血栓症、塞栓症及び動脈瘤）、眼疾患（例えば、加齢性黄斑変性、緑内障、白内障、ドライアイ、糖尿病性網膜症、視力喪失）、皮膚疾患（皮膚の萎縮及び皮膚が薄くなること、弾性線維分解（ｅｌａｓｔｏｌｙｓｉｓ）及び皮膚のしわ、皮脂腺過形成又は低形成、老人性黒子及び他の色素沈着異常、白髪、抜け毛又は髪が薄くなること、並びに慢性皮膚潰瘍）、自己免疫性疾患（例えば、リウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）、巨細胞動脈炎（ＧＣＡ）、関節リウマチ（ＲＡ）、結晶性関節炎及び脊椎関節症（ＳＰＡ））、内分泌及び代謝性機能不全（例えば、成人下垂体機能低下症、甲状腺機能低下症、無欲性甲状腺中毒症、骨粗鬆症、真性糖尿病、副腎不全、様々な形態の性腺機能低下症及び内分泌悪性病変）、筋骨格障害（例えば、関節炎、骨粗鬆症、骨髄腫、痛風、パジェット病、骨折、骨髄不全症候群、関節強直、広汎性特発性骨増殖症、血行性骨髄炎、筋萎縮、末梢性ニューロパチー、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、原発性側索硬化症及び重症筋無力症）、消化器系の疾患（例えば、肝硬変、肝線維症、バレット食道）、呼吸器疾患（例えば、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、慢性気管支炎、肺塞栓症（ＰＥ）、肺がん及び感染症）、並びに加齢に伴う他のいずれかの疾患及び障害などが挙げられるがこれらに限定されない、種々の加齢性疾患及び状態に関する対象の治療に使用され得る。
ある態様では、対象の加齢性疾患若しくは状態、軟骨変性障害、神経変性障害及び／又は筋骨格機能不全を治療するための方法が本明細書に提供される。本方法は、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを含む治療有効量の細胞を投与するステップを含む。
１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡによるトランスフェクションによる少なくとも１回の治療有効処置サイクルは、加齢性疾患又は状態の治療のために対象に投与され得る。
実施形態では、加齢性疾患又は状態は、眼、皮膚又は筋骨格機能不全から選択される。
実施形態では、対象は、軟骨変性障害を有する。実施形態では、障害は、関節炎、軟骨無形成症（ｃｈｏｎｄｒｏｐｈａｓｉａ）、脊椎関節症、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、再発性多発軟骨炎及びシェーグレン症候群から選択される。実施形態では、障害は、関節炎である。実施形態では、障害は、軟骨無形成症（ｃｈｏｎｄｒｏｐｈａｓｉａ）である。実施形態では、障害は、脊椎関節症である。実施形態では、障害は、強直性脊椎炎である。実施形態では、障害は、エリテマトーデスである。実施形態では、障害は、再発性多発軟骨炎である。実施形態では、障害は、シェーグレン症候群である。
実施形態では、処置は、１種以上の炎症性因子の発現を低下させる、及び／又はＡＴＰ及びコラーゲン代謝を増加させる。実施形態では、炎症性因子は、ＲＡＮＫＬ、ｉＮＯＳ２、ＩＬ６、ＩＦＮα、ＭＣＰ３及びＭＩＰ１Ａから選択される。実施形態では、ＡＴＰ及びコラーゲン代謝は、増加したＡＴＰレベル、減少したＲＯＳ及び増加したＳＯＤ２、増加したＣＯＬ２Ａ１、及び軟骨細胞による全体的な増殖のうち１種以上によって測定される。
実施形態では、細胞培養におけるエクスビボ又はインビトロでのトランスフェクションによって若返った細胞、若返った細胞を移植するための組成物による対象の治療は、典型的に、組織再生又は修復を要求する領域への注射又は外科的埋植によって投与されるが、必ずしもそうであるとは限らない。
実施形態では、治療有効量の若返った細胞は、線維芽細胞、内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋幹細胞、ケラチノサイト、間葉系幹細胞及び角膜上皮細胞から選択される。実施形態では、治療有効量の若返った細胞は、線維芽細胞である。実施形態では、治療有効量の若返った細胞は、内皮細胞である。実施形態では、治療有効量の若返った細胞は、軟骨細胞である。実施形態では、治療有効量の若返った細胞は、骨格筋幹細胞である。実施形態では、治療有効量の若返った細胞は、ケラチノサイトである。実施形態では、治療有効量の若返った細胞は、間葉系幹細胞である。実施形態では、治療有効量の若返った細胞は、角膜上皮細胞である。
実施形態では、若返った角膜上皮は、老化パラメータの低下を示す。実施形態では、老化パラメータは、ｐ２１及びｐ１６の発現、ミトコンドリア新生ＰＧＣ１α、並びに炎症性因子ＩＬ８の発現のうち１種以上を含む。
一実施形態では、軟骨損傷又は喪失の領域における軟骨細胞は、処置部位における軟骨細胞の若返り及び新たな軟骨の生成をもたらすのに十分な、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡの有効量をインビボでトランスフェクトされる。その代わりに、エクスビボ又はインビトロでのトランスフェクションによって産生された若返った軟骨細胞は、対象の損傷した関節又は他の適した処置部位などの軟骨損傷又は喪失の領域へと局所的に投与され得る。若返った軟骨細胞の治療有効用量又は量とは、処置部位（例えば、損傷した関節）における新たな軟骨の生成をもたらす量など、軟骨損傷又は喪失を有する対象に肯定的な治療応答をもたらす量を意図する。例えば、治療有効用量又は量は、外傷性傷害に起因する軟骨損傷若しくは喪失、又は関節炎若しくは軟骨変性が関与する他の疾患などの変性疾患の治療に使用され得る。好ましくは、治療有効量は、機能を回復させる、及び／又は軟骨損傷若しくは喪失に伴う疼痛及び炎症を軽減する。
別の実施形態では、骨格筋幹細胞は、処置部位（例えば、損傷した筋肉）における骨格筋幹細胞の若返り（すなわち、分化能を回復する）及び新たな筋線維の生成をもたらすのに十分な、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡの有効量をインビボでトランスフェクトされる。その代わりに、エクスビボ又はインビトロでのトランスフェクションによって産生された若返った骨格筋幹細胞は、修復又は再生を必要とする損傷した筋肉へと局所的に投与され得る。例えば、治療有効用量又は量は、外傷性傷害に起因する筋肉損傷若しくは喪失、筋萎縮、又は筋肉変性が関与する疾患若しくは障害の治療に使用され得る。若返った骨格筋幹細胞の治療有効用量又は量とは、処置部位（例えば、損傷した筋肉）における新たな筋線維の生成をもたらす量など、筋肉損傷又は喪失を有する対象に肯定的な治療応答をもたらす量を意図する。好ましくは、治療有効量は、筋力及び筋機能を改善する、疼痛を軽減する、スタミナを改善する、及び／又は移動性を増加させる。
ある態様では、本明細書に上述されている通り、対象の加齢性疾患若しくは状態、軟骨変性障害を治療する、及び／又は筋骨格機能不全を有する対象を治療するための方法が本明細書に提供される。本方法は、本明細書に上述されている通り、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、治療有効量の１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを投与するステップを含む。
実施形態では、対象における細胞は、本明細書に記載されている通り、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡの有効量によるインビボでのトランスフェクションによって若返らせることができる。
ある態様では、操作された組織をエクスビボで若返らせる方法が本明細書に提供される。本方法は、組織に、連続した５日以下の間、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡをトランスフェクトし、これにより、若返った操作された組織を産生するステップを含む。
実施形態では、操作された組織は、老化パラメータ、炎症促進性因子の低下、組織学的スコアの改善、又はこれらの組合せを示す。実施形態では、操作された組織は、１種以上の老化パラメータの低下を示す。実施形態では、老化パラメータは、ｐ１６発現、陽性ＳＡβＧａｌ染色、並びに炎症促進性因子ＩＬ８及びＭＭＰ１発現から選択される。実施形態では、操作された組織は、ｐ１６発現の低下を示す。実施形態では、操作された組織は、陽性ＳＡβＧａｌ染色の低下を示す。実施形態では、操作された組織は、炎症促進性因子ＩＬ８及びＭＭＰ１発現の低下を示す。実施形態では、操作された組織は、組織学的スコアの改善を示す。実施形態では、組織学的スコアは、形態、組織化及び／又は品質を含む。
実施形態では、操作された組織は、操作された皮膚組織及びオルガノイドである。
ｄ．キット
本開示は、また、細胞の一過性リプログラミングのための１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを含む組成物を保持する、１個以上の容器を含むキットを提供する。キットは、トランスフェクション剤、細胞を培養するための培地、及び任意選択的に、成長因子、ＥＣＭ成分、抗生物質その他などの１種以上の他の因子をさらに含むことができる。細胞リプログラミング因子をコードするｍＲＮＡ及び／又は他の組成物は、液体形態又は凍結乾燥状態であってもよい。斯かるキットは、それを分解から保護する、ｍＲＮＡを保存又は維持する成分を含むこともできる。斯かる成分は、ＲＮＡｓｅフリーであってもよい、又はＲＮＡｓｅｓから保護することができる。組成物に適した容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックを含む種々の材料でできていてよい。容器は、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、皮下注射針で貫通できるストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい。）。
本キットは、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液又はデキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第２の容器をさらに含むことができる。これは、バッファー、希釈剤などの他の薬学的に許容される製剤化溶液、フィルター、針及びシリンジ又は他の送達デバイスを含む、エンドユーザーに有用な他の材料を含有することもできる。送達デバイスは、組成物を予め充填されていてよい。
本キットは、加齢性疾患又は状態を治療する方法のための書面による説明書を含有する添付文書を含むこともできる。添付文書は、未承認の下書き添付文書であってもよい、又は食品医薬局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）若しくは他の規制機関によって承認された添付文書であってもよい。
ある特定の実施形態では、本キットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される１種以上の細胞リプログラミング因子をコードするｍＲＮＡを含む。一実施形態では、本キットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧ細胞リプログラミング因子をコードするｍＲＮＡを含む。
ＩＩＩ．実験
下に、本開示を実行するための特異的な実施形態の実施例を示す。実施例は、単なる説明目的のために提供されており、決して本開示の範囲の限定を意図するものではない。
使用されている数（例えば、量、温度など）に関して精度を確実にする試みが為されたが、当然ながら、ある程度の実験誤差及び偏差が、許容されるべきである。
本明細書に記載されている実施例及び実施形態が、単なる説明を目的としており、それを考慮した様々な修正又は変更が、当業者に示唆され、本願及び添付の特許請求の範囲の本旨及び範疇内に含まれるべきであることが理解される。本明細書に引用されているあらゆる刊行物、特許及び特許出願は、あらゆる目的のため、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
［実施例１］：一過性及び非組込み細胞リプログラミングは、加齢の多面的な反転を促進する
本明細書に記載されている実験は、細胞独自性が不可逆的に失われる前に停止する、一過性リプログラミングプロトコールによって達成され得る加齢反転効果の程度を描写する。近年の証拠も、部分的トランスジェニックリプログラミングが、早老性マウスにおいて加齢に伴う特徴を寛解し、寿命を延長し得ることを示した。しかし、この形態の「エピジェネティック若返り」がどのように、天然の加齢に広く適用されるか、また、重要なことに、これがどのように、ヒト細胞に安全に橋渡しできるかは不明である。本明細書におけるデータは、ｍＲＮＡ技術に基づく一過性リプログラミングが、ヒト臨床試料から得られた体細胞及び幹細胞において、生理学的加齢の特徴を反転し、加齢性疾患表現型を低下させ、加齢に伴い縮小された再生応答を回復することを示す。本明細書に記載されている一過性細胞リプログラミングの非組込み方法は、再生医学を目標とするエクスビボ細胞若返り治療のための、並びに天然の加齢の生理学的減衰及び加齢性疾患の病理発生を遅延又は反転するインビボ組織若返り療法のための、新規のより橋渡し可能な戦略への道を開く。
後戻りできない限界点の前に細胞年齢のいずれかの実質的及び測定可能なリプログラミングが達成され得るか、また、これが、細胞機能及び生理機能のいずれかの寛解をもたらし得るかを検査するために、他の面では健康なヒト対象に由来する２種の別個の細胞型である線維芽細胞及び内皮細胞の加齢した生理機能における一過性リプログラミングの効果を評価し、若齢ドナーから採取した同じ細胞型と比較した。線維芽細胞は、刻んだ腕及び腹部皮膚生検に由来した（若齢対照は２５〜３５歳、ｎ＝３、及び加齢群は６０〜７０歳、ｎ＝３）一方、内皮細胞は、腸骨静脈及び動脈のコラゲナーゼ消化から抽出した（若齢対照は１５〜２５歳、ｎ＝３、及び加齢群は４５〜５０歳、ｎ＝３）。
非組込みリプログラミングプロトコールを利用した。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧ（ＯＳＫＭＬＮ）を発現するｍＲＮＡのカクテルに基づきプロトコールを最適化した。複数のリプログラミング持続時間を探索したところ、両方の細胞型が、早くもＲ２Ｘ２（２回のリプログラミングトランスフェクションと、２日間の基底状態に戻るリラクゼーション）に多くの加齢パラメータの急速な変化を呈したが、最も顕著な効果はＲ４Ｘ２に見られた（図１Ａ及び図２Ａ）。プロトコールは、１２〜１５回の毎日のトランスフェクション後に、ドナーの年齢に関係なく、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）コロニーを一貫して産生する；本出願人らは、内在性多能性関連ｌｎｃＲＮＡの最初の検出可能な発現が、５日目に生じることの観察に基づき、本出願人らのプラットフォームにおけるＰＮＲが、リプログラミング約５日目に生じると結論を下した。したがって、連続した４日間、ＯＳＫＭＬＮが毎日トランスフェクトされる、一過性リプログラミングプロトコールを採用し、中断２日後に遺伝子発現解析を行った。
ペアードエンドバルクＲＮＡ配列決定を、同じ３種のコホート：若齢（Ｙ）、無処置・加齢（ＵＡ）及び処置・加齢（ＴＡ）に関して両方の細胞型において行った。先ず、細胞型毎の若齢及び無処置・加齢細胞の分位正規化されたトランスクリプトーム（「Ｙ対ＵＡ」）を比較した。データは、線維芽細胞における９６１種の遺伝子（５．８５％）（６７８種が上方調節、２８９種が下方調節。）及び内皮細胞における７４８種の遺伝子（４．８０％）（３８９種が上方調節、３７７種が下方調節。）が、有意性基準ｐ＜０．０５及び対数倍数変化カットオフ＋／−０．５で、若齢及び加齢細胞の間で異なったことを示す（図６）。これらの遺伝子セットは、分子シグネチャーデータベースの特徴遺伝子セットコレクションにおいて同定された、既知の加齢経路の多くで濃縮されていた。各遺伝子の平均を上回る又は下回る発現の方向性がマッピングされると、線維芽細胞及び内皮細胞の両方に関して、加齢した細胞とは対照的に、処置及び若齢細胞の間の明らかな類似性が観察された。この遺伝子セット空間における主成分分析（ＰＣＡ）を行ったところ、若齢及び加齢集団が、第１の主成分（ＰＣ１）に沿って分離可能であることが決定され、このことは、線維芽細胞における分散の６４．８％及び内皮細胞における分散の６０．９％を説明した。興味をそそることに、処置細胞も、ＰＣ１に沿って、より若齢の集団のより近くにクラスター形成した（図１Ｋ及び図２Ｊ）。
上に定義されている同じ有意性基準を使用して、無処置及び処置・加齢集団（「ＵＡ対ＴＡ」）を比較したところ、線維芽細胞における１０４２種の遺伝子（７３４種が上方調節、３０８種が下方調節。）及び内皮細胞における９９２種（４６１種が上方調節、５３１種が下方調節）が差次的に発現されたことを見出した。興味深いことに、これらの遺伝子セット内でも、本出願人らは、分子シグネチャーデータベース内に加齢経路の濃縮を見出した。各細胞型におけるプロファイル若齢対無処置・加齢（「Ｙ対ＵＡ」）及び無処置・加齢対処置・加齢（「ＵＡ対ＴＡ」）を比較した場合、線維芽細胞の２４．７％重複（オッズ比４．５３、ｐ＜０．０５）及び内皮細胞の１６．７％重複（オッズ比３．８４、ｐ＜０．０５）が観察され、遺伝子発現の変化の方向性は、若年者のそれにマッチした（すなわち、若齢においてより高ければ、処置・加齢においてより高い）；いずれかの細胞型において０．５％未満が逆に移動した。
次に、これらのトランスクリプトームプロファイルを使用して、一過性リプログラミング後の細胞独自性の保持を検証した。この目的に向けて、確立された細胞独自性マーカーを使用して、本出願人らは、処置により有意に変化したものがなかったことを検証した（図１０）。加えて、本出願人らは、いずれの多能性関連マーカー（トランスフェクトされたＯＳＫＭＬＮ ｍＲＮＡ以外の）の発現を検出することもできなかった（図１０）。要するに、トランスクリプトームシグネチャーの解析は、一過性リプログラミングが、細胞独自性を保持しつつ、より若々しい遺伝子発現プロファイルを誘発することを明らかにした。
ＤＮＡメチル化レベルに基づくエピジェネティック時計は、組織及び細胞型にわたる年齢の最も正確な分子バイオマーカーであり、寿命を含む多くの加齢性状態を予測する。正準リプログラミング因子（ＯＳＫＭ）の外因性発現は、初代細胞のエピジェネティック年齢を出生前状態まで復帰させることが知られている。ＯＳＫＭＬＮの一過性発現が、エピジェネティック時計を反転することができるかを検査するために、ヒト線維芽細胞及び内皮細胞に適用される２種のエピジェネティック時計を使用した：Ｈｏｒｖａｔｈのオリジナル汎組織エピジェネティック時計（３５３種のシトシン−リン酸−グアニンペアに基づく。）及び皮膚＆血液時計（３９１種のＣｐＧに基づく。）。
汎組織エピジェネティック時計によると、一過性ＯＳＫＭＬＮは、ＤＮＡメチル化年齢を有意に（両側混合効果モデルＰ値＝０．０２３）復帰させた（平均年齢差＝−３．４０歳、標準誤差１．１７）。若返り効果は、内皮細胞（平均年齢差＝−４．９４歳、ＳＥ＝１．６３、図６Ｈ）において、線維芽細胞（平均年齢差＝−１．８４、ＳＥ＝１．４６、図６Ｇ）におけるよりも顕著であった。皮膚及び血液エピジェネティック時計を用いて、定性的に同様であるが、有意性がより低い結果を得ることができた（全体的な若返り効果−１．３５歳、ＳＥ＝０．６７、片側混合効果モデルＰ値＝０．０４２、内皮細胞及び線維芽細胞における平均若返りは、それぞれ−１．６２歳及び−１．０７である。）。
これらの結果によって促され、細胞生理学的加齢の様々な特徴における一過性リプログラミングの効果を解析した。加齢の特徴に及ぶ、１１種の確立されたアッセイのパネルを用い（図１１）、単細胞ハイスループットイメージングを使用して解析の大部分を行って、細胞集団全体における単細胞の定量的変化及び分布シフトを捕捉した。個々の細胞株のそれぞれにおいて全解析を別々に行った（総計１９種の線維芽細胞株：３種の若齢、８種の加齢及び８種の処置・加齢；総計１７種の内皮細胞株：３種の若齢、７種の加齢及び７種の処置・加齢）。対になった試料セットのそれぞれにおいて統計解析を行った；表示し易くするために、年齢カテゴリーによってデータをその後にプールした（使用された統計方法の詳細な説明については材料と方法を参照。）。ＧＦＰをコードするｍＲＮＡを使用して、同じトランスフェクションスキームを採用することにより対照実験を行った。
エピジェネティックに関する知見を拡張するために、免疫蛍光（ＩＦ）によって、エピジェネティック抑圧マークＨ３Ｋ９ｍｅ３、ヘテロクロマチン関連タンパク質ＨＰ１γ及び核ラミナ支持タンパク質ＬＡＰ２αを定量的に測定するための実験を行った（図１Ｂ、図１Ｃ、図２Ｂ、図２Ｃ、図５Ａ〜図５Ｃ）。加齢した線維芽細胞及び内皮細胞は、若齢細胞と比較して、全３種のマーカーに関して核シグナルの減少を示した。加齢した細胞の処置は、両方の細胞型においてこれらのマーカーの増加をもたらした。次に、オートファゴソームの形成及びキモトリプシン様プロテアソーム活性を測定することにより、細胞のタンパク質分解活性に関与する両方の経路を試験したところ、これは、加齢に伴い減少する。処置は、両方の経路を、若齢細胞と同様の又はこれよりもさらにはより高いレベルまで増加させ、リプログラミングにおける初期ステップが、分解された生体分子の活発なクリアランスを促進することを示唆する（図１Ｄ、図２Ｄ、図５Ｇ〜図５Ｈ）。
エネルギー代謝の観点から、加齢した細胞は、減少したミトコンドリア活性、活性酸素種（ＲＯＳ）の蓄積、及び調節解除された栄養素感知を呈する。したがって、細胞におけるミトコンドリア膜電位、ミトコンドリアＲＯＳ、及びサーチュイン１タンパク質（ＳＩＲＴ１）のレベルを測定することにより、加齢した細胞における処置の効果を検査した。一過性リプログラミングは、両方の細胞型においてミトコンドリア膜電位を増加させた（図１Ｅ左パネル、図２Ｅ左パネル、図５Ｅ）が、これは、若齢細胞（図１Ｆ、図２Ｆ及び図５Ｄ）と同様に、線維芽細胞においてＲＯＳを減少させ（図１Ｅ右パネル、図２Ｅ右パネル、図５Ｆ）、ＳＩＲＴ１タンパク質レベルを増加させた。老化関連ベータ−ガラクトシダーゼ染色は、加齢した内皮細胞における老化した細胞の数の有意な低下を示した（図１Ｈ、図２Ｈ及び図５Ｉ）。この減少は、やはり内皮細胞において、炎症促進性細胞老化関連分泌現象（ＳＡＳＰ）サイトカインの減少を伴った（図５Ｊ）。最後に、どちらの細胞型においても、定量的蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによって測定されたテロメア長は、処置により有意な伸長を示さず（図１Ｇ及び図２Ｇ）、細胞が、テロメラーゼ活性が再活性化される幹細胞様状態へと脱分化しなかったことを示唆する。
次に、これらの効果の永続性を評価したところ、リプログラミングの中断から４及び６日後に、大部分が有意に保持されていたことを見出した。連続した２日間のみトランスフェクトされた線維芽細胞及び内皮細胞において同じ実験セットを反復することにより、これらの生理学的若返り変化が、どの程度急速に顕在化するかを調査した。注目すべきことに、データは、若返り効果の大部分が、大部分はより控えめであったが、２日間の処置の後に既に見ることができたことを示した。
まとめると、このデータは、ＯＳＫＭＬＮの一過性発現が、トランスクリプトーム、エピジェネティック及び細胞レベルで、ヒト細胞において細胞年齢の急速な持続性反転を誘導することができることを実証する。重要なことに、これらのデータは、本明細書で加齢のエピジェネティックリプログラミング又は「ＥＲＡ」と命名された、「細胞の若返り」のプロセスが、非常に初期及び急速に、ｉＰＳＣリプログラミングプロセスに関与することを実証する。これらのエピジェネティック及び転写変化は、細胞独自性のいずれかのエピジェネティックリプログラミングが行われる前に生じる。
細胞加齢におけるＥＲＡの有益な効果のこれらの徴候により、ＥＲＡが、加齢に関連する炎症性表現型を反転することもできるかを調査するための実験を行った。内皮細胞におけるこの反転の予備的証拠を得た後に（図５Ｊ）、加齢に強く関連し、関節内の軟骨細胞に罹患する顕著な炎症性スペクトルによって特徴付けられた疾患である変形性関節症へと解析を拡張した。その進行期ＯＡのために全人工関節置換外科手術を受けている６０〜７０歳患者の軟骨から軟骨細胞を単離し、若齢個体から単離された軟骨細胞と処置結果を比較した。一過性リプログラミングを２又は３日間行い、リプログラミング中断から２日後に解析を行ったが、患者にわたるより一貫した効果は、より長い処置によりもたらされた。処置は、炎症促進性サイトカイン（図７Ｉ）、ＲＡＮＫＬ及びｉＮＯＳ２の細胞内ｍＲＮＡレベル、並びに細胞によって分泌される炎症性因子のレベル（図３Ｈ〜図３Ｉ及び図７Ｉ）の有意な低下を示した。加えて、ＥＲＡは、細胞増殖を促進し（図３Ａ及び図７Ｄ）、ＡＴＰ産生を増加させ（図３Ｃ及び図７Ａ）、低下したミトコンドリアＲＯＳ、及びＯＡにおいて下方調節されることが示された遺伝子である抗酸化剤ＳＯＤ２の上昇したＲＮＡレベルによって明らかになる通り、酸化的ストレスを減少させた（図３Ｄ、図３Ｅ、図７Ｂ及び図７Ｄ）。ＥＲＡは、ＳＯＸ９（軟骨細胞固有性及び機能に中心的な転写因子）の発現レベルに影響を与えず、ＣＯＬ２Ａ１（関節軟骨における主要コラーゲン）の発現のレベルを有意に増加させ（図３Ｂ、図７Ｅ及び図７ＦにおけるｑＲＴ−ＰＣＲ）、軟骨形成（ｃｈｒｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ）細胞独自性の保持を示唆する。総合すると、これらの結果は、ＯＳＫＭＬＮの一過性発現が、遺伝子発現の部分的反転、及びより健康な状態に向かう加齢したＯＡ軟骨細胞における細胞生理機能を促進することができることを示す。
機能及び再生能力の幹細胞喪失は、加齢の別の重要な特徴を表す。再生を損なう体細胞性幹細胞の加齢性変化における一過性リプログラミングの効果を評価するための実験を行った。先ず、一過性リプログラミングの効果を、マウス由来骨格筋幹細胞（ＭｕＳＣ）において検査した。人工ニッチを使用して、静止状態に維持しつつ、ＭｕＳＣを２日間処置した。ＦＡＣＳによって単離された若齢（３カ月）及び加齢（２０〜２４カ月）マウスＭｕＳＣを用いて初期実験を行った。加齢ＭｕＳＣの処置は、静止状態若齢ＭｕＳＣのより速い活性化動態に近い最初の分裂の時間、及びミトコンドリア質量の両方を低下させた。さらに、処置は、コロニーを形成する単一ＭｕＳＣの低下した能力を部分的にレスキューした。このような細胞をさらに培養したところ、データは、処置が、筋原性マーカーＭｙｏＤの発現を変化させなかったが、その代わりに、筋管へと分化するその能力を改善したことを示し、一過性リプログラミングが、筋原性運命を破壊しないが、筋原性潜在力を増強し得ることを示唆する。
次に、インビボで新たな組織を再生するＭｕＳＣ機能及び分化能を検査した。これを行うために、若齢、加齢又は一過性にリプログラミングされた加齢ＭｕＳＣに、ルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するレンチウイルスを形質導入し、次いで、免疫低下マウスの傷害された前脛骨（ＴＡ）筋にこの細胞を移植した。長軸方向バイオルミネセンスイメージング（ＢＬＩ）は、初期に、処置・加齢ＭｕＳＣを移植された筋肉が、最高シグナルを示した（４日目、図４Ｂ）が、移植後１１日目までに若齢ＭｕＳＣによる筋肉に匹敵するようになったことを示した；逆に、無処置・加齢ＭｕＳＣによる筋肉は、移植後の全時点で、より低いシグナルを示した（図４Ｂ）。免疫蛍光解析は、無処置・加齢ＭｕＳＣと比較して、処置ＭｕＳＣを移植したＴＡにおけるより多い数のドナー由来の（ＧＦＰ＋）筋線維をさらに明らかにした（図４Ｃ）。さらに、処置・加齢した細胞由来のＧＦＰ＋筋線維は、その無処置対応物と比較して、増加した横断面の面積を示し、実際に、若齢対照よりも大きくさえあった（図４Ｄ）。総合すると、これらの結果は、一過性にリプログラミングされた加齢ＭｕＳＣの改善された組織再生能を示唆する。３カ月後に、全マウスを剖検に付したところ、新生物病変もテラトーマも発見されなかった。
処置の潜在的な長期利益を検査するために、細胞移植６０日後に第２の傷害を誘導し、再度、データは、一過性にリプログラミングされた加齢ＭｕＳＣを移植されたＴＡ筋肉が、より高いＢＬＩシグナルを生じたことを示した（図４Ｅ）。
サルコペニアは、筋量及び力の産生の喪失によって特徴付けられる加齢性状態である。同様に、マウスにおいて、筋肉機能は、加齢に伴い進行性の変性を示す。加齢ＭｕＳＣの一過性リプログラミングが、より老齢のマウスの筋肉の生理学的機能の回復において細胞に基づく処置を改善するかを検査するために、若齢（４カ月）又は加齢（２７カ月）免疫低下マウスから単離されたＴＡ筋肉において強縮力の産生を測定するための電気生理学検査を行った。データは、加齢マウス由来のＴＡ筋肉が、若齢マウスと比較して、より低い強縮力を有することを示し、力の産生の加齢性喪失を示唆する（図８Ｆ）。次に、加齢マウス（２０〜２４カ月）からＭｕＳＣを単離した。加齢ＭｕＳＣを処置した後に、加齢（２７カ月）免疫低下マウスの心臓毒傷害のあるＴＡ筋肉へと細胞を移植した。移植された筋肉が十分に再生するのに十分な時間を与えるために、三十（３０）日間を置いた。強縮力の産生を測定するための電気生理学検査を行った。無処置・加齢ＭｕＳＣを移植された筋肉は、加齢対照マウス由来の移植されていない筋肉に匹敵する力を示した（図４ｈ）。逆に、処置・加齢ＭｕＳＣを受けた筋肉は、若齢対照マウス由来の移植されていない筋肉に匹敵する強縮力を示した。これらの結果は、ＭｕＳＣに基づく治療法と組み合わせた一過性リプログラミングが、加齢筋肉の生理学的機能を、若々しい筋肉のそれへと回復し得ることを支持する。
最後に、これらの結果をヒトＭｕＳＣに橋渡しした。異なる年齢範囲（１０〜８０歳）の患者から得た手術試料を用い、これらにＧＦＰ及びルシフェラーゼ発現レンチウイルスベクターを形質導入して、試験を反復した。マウスと同様に、移植された一過性にリプログラミングされた加齢ヒトＭｕＳＣは、同じ個体由来の無処置ＭｕＳＣと比較して、増加したＢＬＩシグナルをもたらし、若齢ＭｕＳＣに観察されるものに匹敵した（図８Ｄ）。興味深いことに、処置及び無処置ＭｕＳＣによる対側性筋肉の間のＢＬＩシグナル比は、より老齢の年齢群（６０〜８０歳）において、より若齢の年齢群（１０〜３０又は３０〜５５歳）におけるよりも高く、ＥＲＡが、加齢した細胞において失われた機能をより若齢のレベルまで回復させることを示唆する（図８Ｅ）。総合すると、これらの結果は、一過性リプログラミングが、その運命を損なうことなく、加齢ＭｕＳＣの分化能を、若齢ＭｕＳＣのものと同様の程度まで部分的に回復させ、よって、再生医学における細胞療法としての潜在力を有することを示唆する。
６５歳超の患者由来の線維芽細胞及びケラチノサイトを組み合わせて、三次元（３Ｄ）インビトロ操作された皮膚を再構成し、リプログラミング因子のカクテルを培養培地に添加することによりトランスフェクトした。品質を評価するための組織学的解析を行い、数値的スコアを割り当てた（図８Ａ）。対照無処置及びレチノイン酸処置試料と比較して増加した数値的スコアによって測定される通り、リプログラミング因子により若返りが観察された。
網膜上皮細胞をエクスビボで培養し、２又は３日間ＯＳＫＭＮにより一過性にリプログラミングした。結果は、ｐ１６（図９Ａ）、ｐ２１（図９Ｂ）、ＩＬ８（図９Ｃ）及びＰＧＣ１ａ（図９Ｄ）の発現の有意な減少を示した。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）への核リプログラミングは、惹起、成熟及び安定化を含む多相性プロセスである。斯かる動的で複雑な「エピジェネティックリプログラミング」の完了後に、ｉＰＳＣは、多能性であるのみならず、若々しくもある。本明細書におけるデータは、一過性細胞リプログラミングの非組込み、ｍＲＮＡに基づくプラットフォームが、細胞独自性のエピジェネティック抹消が未だ生じていない惹起相において、加齢の特徴を非常に急速に反転することができることを実証した。データは、細胞独自性を保存しつつ、罹患した細胞及び加齢した幹細胞における失われた機能性を回復することにより、若返りのプロセスが加齢したヒト細胞において生じることを示す。
［実施例２］：方法
ｍＲＮＡトランスフェクション：製造業者のプロトコールを使用して、細胞毒性を低下させる線維芽細胞及び軟骨細胞のためのｍＲＮＡ−Ｉｎ（ｍＴＩ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｔｅｍ）、並びにトランスフェクトがより困難な内皮細胞及びＭｕＳＣのためのリポフェクタミンＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）のいずれかを使用して、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション４時間後に線維芽細胞及び内皮細胞のために培養培地を交換したが、ｍＲＮＡの有意な取込みの産生に一晩インキュベーションが必要とされるため、軟骨細胞又はＭｕＳＣのためには交換しなかった。ＧＦＰ ｍＲＮＡ及びＯＳＫＭＮＬカクテルにおける個々の因子の免疫染色の両方によって、送達の効率が確認された。Ｓｅｂａｓｔｉａｎｏ ＬａｂのメンバーでもあるＪｅｎｓ Ｄｕｒｒｕｔｈｙ−Ｄｕｒｒｕｔｈｙと共に、彼が顧問を務めるＥＳＩ ＢＩＯにおける施設により、ｍＲＮＡ合成及びトランスフェクション最適化を行った。
線維芽細胞単離及び培養：健康な患者において単離を行い、６０〜７０代（加齢）及び３０〜４０代（若齢）の男性及び女性患者の混合から２ｍｍパンチ生検を使用して、上腕中央（ｍｉｄ−ｕｐｐｅｒ ａｒｍ）の近心面又は腹部から生検された。これらの外植片から細胞を培養し、非必須アミノ酸、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、アールの塩を含有するイーグルの最小必須培地中に維持した。
内皮細胞単離及び培養：Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて、４５〜５０代（加齢）及び１０代（若齢）の、突然の頭部外傷で死亡したが、他の面では健康であったドナーから死前に除去された腸骨動脈及び静脈から単離を行った。コラゲナーゼで組織を消化し、管腔から放出された細胞を使用して、培養を開始した。２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１５ ウシ胎仔血清、０．０２ｍｇ／ｍｌ内皮成長サプリメント、０．０５ｍｇ／ｍｌヘパリン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した培地１９９中に細胞を維持した。
核免疫細胞化学：細胞をＨＢＳＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の１５％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。次に、細胞を、１％ＢＳＡ及び０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００のＰＢＳ中ブロッキング溶液で３０分間ブロッキングした。次に、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ及び０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００において一次抗体をアプライし、４Ｃで一晩インキュベートした。翌日、対応するＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ標識二次抗体に切り替える前に、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、２時間インキュベートした。次に、再度細胞を洗浄し、次いでＤＡＰＩで３０分間染色した。最後に、イメージングのために細胞をＨＢＳＳに切り替えた。
オートファゴソーム形成染色：細胞をＨＢＳＳで洗浄し、ＬＣ３に基づく蛍光オートファゴソームマーカー（Ｓｉｇｍａ）を含有する染色溶液に切り替えた。次に、細胞を３７℃で５％ＣＯ２により２０分間インキュベートした。次に、ＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇを使用して、細胞を２回洗浄した。次に、細胞標識色素であるＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄを使用して、細胞を１５分間染色した。次に、Ｏｐｅｒｅｔｔａによる単細胞イメージングのため、細胞をＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇに切り替えた。
プロテアソーム活性測定：ウェルを先ず、細胞生存率色素であるＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）で１０分間染色した。ＴＥＣＡＮ蛍光プレートリーダーを使用して、ウェルシグナルを読み取った。次に、キモトリプシン様２０Ｓプロテアソーム活性によって切断されるＬＬＶＹ−Ｒ１１０蛍光発生基質（Ｓｉｇｍａ）を含有する本来の培地に切り替える前に、細胞をＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇで洗浄した。次に、ＴＥＣＡＮ蛍光プレートリーダーにおいて再度読み取る前に、細胞を３７℃で５％ＣＯ２により２時間インキュベートした。
ミトコンドリア膜電位染色：テトラメチルローダミン、メチルエステル、過塩素酸塩（Ｔｈｅｒｍｏ）を細胞培養培地に添加した。この色素は、その膜電位に基づきミトコンドリアによって隔離される。次に、細胞を３０分間３７℃で５％ＣＯ２によりインキュベートした。次に、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄを使用した１５分間の染色前に、細胞をＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇで２回洗浄した。最後に、新鮮ＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇにおいて細胞をＯｐｅｒｅｔｔａで撮像した。
ミトコンドリアＲＯＳ測定：細胞をＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇで洗浄し、次いでミトコンドリアにおけるスーパーオキシドによって酸化される蛍光発生色素であるＭｉｔｏＳＯＸを含有するＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇに切り替えた。細胞を１０分間３７Ｃで５％ＣＯ２によりインキュベートした。次に、細胞をＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇで２回洗浄し、次いで、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄを使用して１５分間染色した。最後に、新鮮ＨＢＳＳ／Ｃａ／ＭｇにおいてＯｐｅｒｅｔｔａで細胞を撮像した。
ＳａβＧａｌ組織化学：細胞をＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇで２回洗浄し、次いでＰＢＳ中の１５％パラホルムアルデヒドで６分間固定した。次に、内在性Ｂガラクトシダーゼによって切断されるＸ−ｇａｌ発色基質による染色前に、細胞をＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇで３回リンスした。細胞を染色溶液中に維持し、一晩３７℃で外界ＣＯ２によりインキュベートした。翌日、Ｌｅｉｃａ明視野顕微鏡下でのイメージングのための７０％グリセロール溶液に切り替える前に、細胞をＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇで再度洗浄した。
サイトカインプロファイリング：この作業は、スタンフォード大学（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＨｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒと共に行った。細胞培地を収集し、４００ｒｃｆで１０分間ＲＴにてスピンした。次に、解析まで液体窒素で上清を瞬間（ｓｎａｐ）凍結した。ヒト６３−ｐｌｅｘキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して解析を行った。９６ウェルプレートにビーズを添加し、Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬｘ４０５洗浄機において洗浄した。混合抗体連結ビーズを含有するプレートに試料を添加し、室温で１時間インキュベートし、続いて４℃で振盪しつつ一晩インキュベーションを行った。５００〜６００ｒｐｍの軌道回転振盪機において低温及び室温インキュベーションステップを行った。一晩インキュベーション後に、Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬｘ４０５洗浄機においてプレートを洗浄し、次いで７５分間室温で振盪しつつビオチン化検出抗体を添加した。上述の通りにプレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＰＥを添加した。３０分間室温におけるインキュベーション後に、上述の通りに洗浄を行い、ウェルに読み取りバッファーを添加した。各試料を２回複製して測定した。サイトカイン当たり試料当たりより低い結合の５０種のビーズにより、Ｌｕｍｉｎｅｘ ２００機器を使用して、プレートを読み取った。Ｒａｄｉｘ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓによる特別注文のアッセイ対照ビーズが全ウェルに添加される。
抗体：核測定のために５種の一次抗体を使用した：ウサギ抗ヒストンＨ３Ｋ９ｍｅ３ヒストンメチル化（１：４０００）、マウス抗ＨＰ１γヘテロクロマチンマーカー（１：２００）、ウサギ抗ＬＡＰ２α（１：５００）核組織化タンパク質、マウス抗ラミニンＡ／Ｃ核膜マーカー及びウサギ抗ＳＩＲＴ１（１：２００）。
ＲＮＡ配列決定及びデータ解析
細胞を洗浄し、ＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ）によって消化した。全ＲＮＡ精製キット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ）を使用して全ＲＮＡを単離し、ＲＮＡ解析ｓｃｒｅｅｎｔａｐｅ（Ｒ６Ｋ ｓｃｒｅｅｎｔａｐｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ）によってＲＮＡ品質を評価し、ＲＩＮ＞９を有するＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにした。ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ試料調製キットｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、１μｇの全ＲＮＡを使用してｃＤＮＡライブラリーを調製した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００によってＲＮＡ品質を評価し、ＲＩＮ＞９を有するＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにした。分子インデックス付けの付加利益を有するＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ試料調製キットｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、５００ｎｇの全ＲＮＡを使用してｃＤＮＡライブラリーを調製した。いずれかのＰＣＲ増幅ステップに先立ち、全ｃＤＮＡ断片末端を、８ｂｐの特有の分子インデックスを含有するアダプターペアへとランダムにライゲーションした。次に、分子インデックス付けされたｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲ増幅し（１５サイクル）、次いでＢｉｏａｎａｌｚｙｅｒ及びＱｕｂｉｔを使用してＱＣを行った。ＱＣ成功後に、これをＩｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｓｅｑプラットフォームにおいて配列決定して、８０−ｂｐシングルエンド読み取りデータを得た。読み取りデータを、各末端２ヌクレオチドトリミングして、低品質部分を除去し、ゲノムへのマッピングを改善した。生じた７８ヌクレオチド読み取りデータを、重複を除去することにより圧縮したが、データベースにおける各試料において各配列が何回生じたかについて追跡した。次に、正確なマッチを使用して、特有の読み取りデータをヒトゲノムにマッピングした。これは、エクソン−エクソン境界交差、並びに誤差及びＳＮＰ／突然変異を有する読み取りデータを誤読するが、各遺伝子の発現のレベルの推定に実質的な影響はない。次に、マッピングされた読み取りデータのそれぞれに、根底にあるゲノム由来のアノテーションを割り当てた。複数アノテーション（例えば、遺伝子のイントロンに生じるｍｉＲＮＡ）の場合、ヒューリスティクスに基づく階層を使用して、各読み取りデータに特有の同一性を与えた。次に、これを使用して、各転写物に属する読み取りデータを同定し、転写物の各位置にわたる被覆度を確立した。この被覆度は、不均一で尖っているため、本出願人らは、遺伝子の発現値の推定としてこの被覆度の中央値を使用した。異なる試料における発現を比較するために、分位正規化を使用した。さらなるデータ解析をＭＡＴＬＡＢ（登録商標）において行った。次に、発現レベルの比を計算して、倍数変化の対数（２を底とする）を推定した。スチューデントｔ検定を使用して、ｐ＜０．０５カットオフによる有意性を決定した。Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＲｅｓｅａｒｃｈのＢｕｔｔｅ Ｌａｂによって開発され公開利用が可能となった、ＥＮＣＯＤＥ遺伝子解析を転写因子同定に使用した。
マウス：Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス及びＮＳＧマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。ＮＯＤ／ＭｒｋＢｏｍＴａｃ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ雌マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。Ｖｅｔｅｒａｎｓ Ａｆｆａｉｒｓ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ ＳｙｓｔｅｍｓのＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｔにおいてマウスを収容及び維持した。動物プロトコールは、スタンフォード大学のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ＣａｒｅのＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｐａｎｅｌによって承認された。
ヒト骨格筋標本：対象は、１０〜７８歳の年齢範囲に及んだ。スタンフォード大学施設内審査委員会によって承認されたヒト試験研究プロトコールの一部として、患者のインフォームドコンセントを得た後に、ヒト筋肉生検標本を採取した。臨床手技の利用可能性に従って、新鮮筋肉標本を使用して全実験を行った。標本単離１〜１２時間以内に細胞解析のための試料加工を始めた。全試験において、標準偏差は、真の生物学的複製（すなわち、特有のドナー）を使用して、試験に由来するデータにおける可変性を反映する。データは、ドナー同一性と相関しなかった。
ＭｕＳＣ単離及び精製：後肢から筋肉を収集し、機械的に解離して、断片化筋肉懸濁液を得た。これに続いて、コラゲナーゼＩＩ−ＨａｍのＦ１０溶液（１ｍｌ当たり５００ユニット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における４５〜５０分間消化を行った。洗浄後に、コラゲナーゼＩＩ（１ｍｌ当たり１００ユニット）及びディスパーゼ（１ｍｌ当たり２ユニット；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により第２の消化を３０分間行った。その結果得られた細胞懸濁液を洗浄し、濾過し、１：１００希釈のＶＣＡＭ−ビオチン（クローン４２９；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３１−ＦＩＴＣ（クローンＭＥＣ１３．３；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４５−ＡＰＣ（クローン３０−Ｆ１１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＳｃａ−１−Ｐａｃｉｆｉｃ−Ｂｌｕｅ（クローンＤ７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）抗体で染色した。新鮮な手術試料５０，５１からヒトＭｕＳＣを精製した。脂肪及び線維性組織から手術試料を慎重に解剖し、マウス組織について記載されている通りに解離（ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）筋肉懸濁液を調製した。次に、その結果得られた細胞懸濁液を洗浄し、濾過し、抗ＣＤ３１−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（クローンＷＭ５９；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；＃３０３１１０、１：７５）、抗ＣＤ４５−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（クローンＨＩ３０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃ＭＨＣＤ４５２０、１：７５）、抗ＣＤ３４−ＦＩＴＣ（クローン５８１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；＃３４３５０３、１：７５）、抗ＣＤ２９−ＡＰＣ（クローンＴＳ２／１６；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；＃３０３００８、１：７５）及び抗ＮＣＡＭ−ビオチン（クローンＨＣＤ５６；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；＃３１８３１９、１：７５）で染色した。次に、結合していない一次抗体を洗浄し、ストレプトアビジン−ＰＥ／Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）において細胞を１５分間４℃でインキュベートして、ＮＣＡＭ−ビオチンを検出した。４８８−ｎｍ、６３３−ｎｍ及び４０５−ｎｍレーザーを備える較正ＢＤ−ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（登録商標）又はＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩフローサイトメーターにおいて細胞選別を行って、ＭｕＳＣ集団を得た。選別された細胞のごく一部を蒔き、Ｐａｘ７及びＭｙｏＤを染色して、選別された集団の純度を評価した。ＦＡＣＳゲーティング戦略については、補足情報を参照されたい。
バイオルミネセンスイメージング：Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ−Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してバイオルミネセントイメージングを行った。流量２．５ｌ／分の２％イソフルランを使用してマウスを麻酔した（ｎ＝４）。滅菌ＰＢＳに溶解したＤ−ルシフェリン（５０ｍｇ／ｍｌ、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）の腹腔内注射を投与した。注射の直後に、最大感度（ｆ−ストップ１）、最高分解能（小ビニング）でマウスを３０秒間撮像した。バイオルミネセントシグナルのピーク強度が縮小し始めるまで、毎分３０秒間露光を用いた。その後の解析のために各画像を保存した。盲検法でイメージングを行った：イメージングを行う研究者は、移植された細胞の実験条件の同一性を知らなかった。
バイオルミネセンス画像解析：Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア、バージョン４．０（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して各画像の解析を行った。手作業で生成した円を、目的の領域の上に置き、レシピエントマウスの肢又は指定領域を完全に囲むようにサイズ変更した。同様に、目的のバックグラウンド領域を、移植された脚の外側のマウスの領域に置いた。
組織収集：ＴＡ筋肉を骨から離して慎重に解剖し、秤量し、固定のため０．５％ＰＦＡ溶液に一晩置いた。次に、３時間、又は筋肉がその飽和点に達し、沈み始めるまで、筋肉を２０％スクロース溶液に移動した。次に、組織を最適切削温度（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（ＯＣＴ）培地に包埋し、凍結し、切片作製まで−８０℃で貯蔵した。１０μｍ切片を生成するように設定されたＬｅｉｃａ ＣＭ３０５０Ｓクリオスタットにおいて切片作製を行った。Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ Ｃｏｌｏｒｆｒｏｓｔスライド上に切片をマウントした。免疫組織化学的検査を行うことができるまで、これらのスライドを−２０℃で貯蔵した。
組織学：０．５％電子顕微鏡グレードのパラホルムアルデヒドを使用して、ＴＡ筋肉を５時間固定し、その後、２０％スクロースに一晩移した。次に、筋肉をＯＣＴ中で凍結し、１０μｍの厚さで凍結切片作製し、染色した。ヘマトキシリン・エオシン（Ｓｉｇｍａ）又はゴモリ（Ｇｏｍｏｒｒｉ）トリクローム（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による比色染色のため、製造業者の推奨プロトコールに従って試料を加工した。
ＭｕＳＣ免疫染色：ＰＢＳ中の２０％ロバ血清／０．３％Ｔｒｉｔｏｎによる１時間ブロッキングステップを使用して、全試料について望まれない一次抗体結合を防止した。一次抗体をアプライし、ＰＢＳ中の２０％ロバ血清／０．３％Ｔｒｉｔｏｎにおいて一晩４℃でインキュベートした。０．３％ＰＢＳＴによる４回洗浄後に、蛍光コンジュゲートされた二次抗体を添加し、０．３％ＰＢＳＴにおいて室温で１時間インキュベートした。３回の追加的なリンスの後に、Ｆｌｕｏｖｉｅｗマウント培地を使用して各スライドをマウントした。
抗体：本試験において次の抗体を使用した。各抗体の供給源を示す。マウス：ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ａ１１１２２、１：２５０）；ルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｌ０１５９、１：２００）；コラーゲンＩ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｓ、＃ＣＬ５０１５１ＡＰ、１：２００）；ＨＳＰ４７（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ７７６０９、１：２００）。
イメージング：標準蛍光顕微鏡及び１０×又は２０×ａｉｒ対物レンズのどちらかを使用して試料を撮像した。Ｖｏｌｏｃｉｔｙイメージングソフトウェアを使用して、励起及び発光フィルターを調整し、予めプログラムされたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒフィルター設定が付属し、これを可能な限り常に使用した。イメージングの第１ラウンドにおいて全露光時間を最適化し、次いでその後の全イメージングを通して一定に維持した。
画像解析：Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して、色閾値プラグインを使用することにより、コラーゲンで構成された面積のパーセンテージを計算して、コラーゲンが陽性の面積のみのマスクを創出した。次に、当該面積を、フリー描画ツールを使用して見出された試料の総面積で割った。Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェアを使用して他の解析の全てを行い、フリー描画ツールを使用して線維を手作業で計数し、また、手動で核、ｅＭＨＣ＋線維、神経筋接合部及び血管の数を計数した。
レンチウイルス形質導入：ルシフェラーゼ及びＧＦＰタンパク質レポーターを、第三世代ＨＩＶ−１レンチウイルスベクター（ＣＤ５１Ｘ ＤＰＳ、ＳｙｓｔｅｍＢｉｏ）にサブクローニングした。新鮮に単離されたＭｕＳＣを形質導入するために、ポリ−Ｄ−リジン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ａ−００３−Ｅ）及びＥＣＭコーティングされた８ウェルチャンバースライド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、ＰＥＺＧＳ０８９６）上に、ウェル当たり３０，０００〜４０，０００個の細胞の密度で細胞を蒔き、ウェル当たり５μｌの濃縮ウイルス及び８μｇ／ｍＬポリブレン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−１３４２２０）と共にインキュベートした。５分間３２００ｇで、また、１時間２５００ｇで２５℃にてプレートをスピンした。次に、細胞を新鮮培地で２回洗浄し、プレートから擦過し、実験条件に応じた最終容量に再懸濁した。
ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色及びフローサイトメトリー解析：リプログラミングを受けているＭｕＳＣ及び対照を純粋ＨａｍｓＦ１０（血清又はｐｅｎ／ｓｔｒｅｐなし）で２回洗浄した。その後、ＭｕＳＣを０．５μＭ ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｍ７５１４）及びＤＡＰＩで３０分間３７℃にて染色し、純粋ＨａｍｓＦ１０で３回洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩフローサイトメーターを使用して解析した。
統計解析：他に記述がない限り、ＭＡＴＬＡＢ Ｒ２０１７ａ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓソフトウェア）又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を使用して全統計解析を行った。統計解析のため、ｔ検定を使用した。全エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１。
本開示の好まれる実施形態について説明及び記載してきたが、本開示の本旨及び範囲から逸脱することなく、その中で様々な変更を為すことができることが認められる。
Figure 2021518331
Figure 2021518331
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Ｐ実施形態
実施形態Ｐ１．細胞を若返らせる方法であって、
ａ）１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、細胞にトランスフェクトするステップであって、トランスフェクトするステップが、少なくとも２日かつ４日以下の間、１日１回行われる、ステップ；及びｂ）１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを翻訳し、細胞において１種以上の細胞リプログラミング因子を産生し、細胞の一過性リプログラミングをもたらすステップであって、細胞が、幹細胞へと脱分化することなく若返る、ステップを含む方法。
実施形態Ｐ２．１種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される、実施形態Ｐ１に記載の方法。
実施形態Ｐ３．細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを含む、実施形態Ｐ２に記載の方法。
実施形態Ｐ４．細胞が、哺乳類細胞である、実施形態Ｐ１に記載の方法。
実施形態Ｐ５．細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ｐ４に記載の方法。
実施形態Ｐ６．細胞が、高齢対象に由来する、実施形態Ｐ１に記載の方法。
実施形態Ｐ７．細胞が、線維芽細胞、内皮細胞、軟骨細胞又は骨格筋幹細胞である、実施形態Ｐ１に記載の方法。
実施形態Ｐ８．一過性リプログラミングが、ＨＰ１ガンマ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、ラミナ支持タンパク質ＬＡＰ２アルファ及びＳＩＲＴ１タンパク質の増加した発現、減少した核の折畳み、減少した小疱形成、増加した細胞オートファゴソーム形成、増加したキモトリプシン様プロテアソーム活性、増加したミトコンドリア膜電位、又は減少した活性酸素種（ＲＯＳ）をもたらす、実施形態Ｐ１に記載の方法。
実施形態Ｐ９．細胞が、組織又は臓器内にある、実施形態Ｐ１に記載の方法。
実施形態Ｐ１０．一過性リプログラミングが、組織又は臓器内の老化した細胞の数を低下させる、実施形態Ｐ９に記載の方法。
実施形態Ｐ１１．一過性リプログラミングが、ＧＭＳＣＦ、ＩＬ１８及びＴＮＦαの発現を減少させる、実施形態Ｐ９に記載の方法。
実施形態Ｐ１２．処置が、組織又は臓器内の細胞の機能を回復させる、分化能を増加させる、生存率を増強する、又は複製能若しくは寿命を増加させる、実施形態Ｐ９に記載の方法。
実施形態Ｐ１３．インビトロ、エクスビボ又はインビボで行われる、実施形態Ｐ１に記載の方法。
実施形態Ｐ１４．トランスフェクトするステップが、３日間又は４日間、１日１回行われる、実施形態Ｐ１に記載の方法。
実施形態Ｐ１５．対象の加齢性疾患又は状態を治療するための方法であって、ａ）１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、若返りを必要とする細胞にインビボ又はエクスビボでトランスフェクトするステップであって、トランスフェクトするステップが、少なくとも２日かつ４日以下の間、１日１回行われる、ステップ；及びｂ）細胞において１種以上の細胞リプログラミング因子を発現させ、細胞の一過性リプログラミングをもたらすステップであって、細胞が、幹細胞へと脱分化することなく若返る、ステップを含む方法。
実施形態Ｐ１６．１種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される、実施形態Ｐ１５に記載の方法。
実施形態Ｐ１７．細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを含む、実施形態Ｐ１６に記載の方法。
実施形態Ｐ１８．若返った細胞を対象に移植するステップをさらに含む、実施形態Ｐ１５に記載の方法。
実施形態Ｐ１９．加齢性疾患又は状態が、変性疾患である、実施形態Ｐ１５に記載の方法。
実施形態Ｐ２０．加齢性疾患又は状態が、神経変性疾患又は筋骨格障害である、実施形態Ｐ１５に記載の方法。
実施形態Ｐ２１．対象の軟骨変性が関与する疾患又は障害を治療するための方法であって、ａ）１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、若返りを必要とする軟骨細胞にインビボ又はエクスビボでトランスフェクトするステップであって、トランスフェクトするステップが、少なくとも２日かつ４日以下の間、１日１回行われる、ステップ；及びｂ）軟骨細胞において１種以上の細胞リプログラミング因子を発現させ、軟骨細胞の一過性リプログラミングをもたらすステップであって、軟骨細胞が、幹細胞へと脱分化することなく若返る、ステップを含む方法。
実施形態Ｐ２２．１種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される、実施形態Ｐ２１に記載の方法。
実施形態Ｐ２３．細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを含む、実施形態Ｐ２２に記載の方法。
実施形態Ｐ２４．軟骨変性が関与する疾患又は障害が、関節炎である、実施形態Ｐ２１に記載の方法。
実施形態Ｐ２５．関節炎が、変形性関節症又は関節リウマチである、実施形態Ｐ２４に記載の方法。
実施形態Ｐ２６．処置が、対象における炎症を低下させる、実施形態Ｐ２１に記載の方法。
実施形態Ｐ２７．トランスフェクトするステップが、エクスビボで行われ、若返った軟骨細胞が、対象の関節炎の関節に移植される、実施形態Ｐ２１に記載の方法。
実施形態Ｐ２８．軟骨細胞が、対象から得られる軟骨試料から単離される、実施形態Ｐ２７に記載の方法。
実施形態Ｐ２９．処置が、軟骨細胞によるＲＡＮＫＬ、ｉＮＯＳ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＢＤＮＦ、ＩＦＮα、ＩＦＮγ及びＬＩＦの発現を低下させ、ＳＯＸ９及びＣＯＬ２Ａ１の発現を増加させる、実施形態Ｐ２１に記載の方法。
実施形態Ｐ３０．対象が、高齢対象である、実施形態Ｐ２１に記載の方法。
実施形態Ｐ３１．対象が、哺乳類対象である、実施形態Ｐ２１に記載の方法。
実施形態Ｐ３２．哺乳類対象が、ヒト対象である、実施形態Ｐ３１に記載の方法。
実施形態Ｐ３３．対象における筋肉変性が関与する疾患又は障害を治療するための方法であって、ａ）１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、骨格筋幹細胞にインビボ又はエクスビボでトランスフェクトするステップであって、トランスフェクトするステップが、少なくとも２日かつ４日以下の間、１日１回行われる、ステップ；及びｂ）骨格筋幹細胞において１種以上の細胞リプログラミング因子を発現させ、骨格筋幹細胞の一過性リプログラミングをもたらすステップであって、骨格筋幹細胞が、筋肉細胞へと分化するその能力を喪失することなく若返る、ステップを含む方法。
実施形態Ｐ３４．１種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される、実施形態Ｐ３３に記載の方法。
実施形態Ｐ３５．細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを含む、実施形態Ｐ３４に記載の方法。
実施形態Ｐ３６．トランスフェクトするステップが、エクスビボで行われ、若返った骨格筋幹細胞が、対象における修復又は再生を必要とする筋肉に移植される、実施形態Ｐ３３に記載の方法。
実施形態Ｐ３７．骨格筋幹細胞が、対象から得られる筋肉試料から単離される、実施形態Ｐ３３に記載の方法。
実施形態Ｐ３８．処置が、筋線維の再生をもたらす、実施形態Ｐ３３に記載の方法。
実施形態Ｐ３９．処置が、骨格筋幹細胞の分化能を回復させる、実施形態Ｐ３３に記載の方法。
実施形態Ｐ４０．対象が、高齢対象である、実施形態Ｐ３３に記載の方法。
実施形態Ｐ４１．対象が、哺乳類対象である、実施形態Ｐ３３に記載の方法。
実施形態Ｐ４２．哺乳類対象が、ヒト対象である、実施形態Ｐ４１に記載の方法。
実施形態
実施形態１．細胞を若返らせる方法であって、連続した５日以下の間、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、細胞にトランスフェクトし、これにより、若返った細胞を産生するステップを含む方法。
実施形態２．若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルが、若齢細胞のトランスクリプトームプロファイルに類似するようになる、実施形態１に記載の方法。
実施形態３．若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルが、ＲＰＬ３７、ＲＨＯＡ、ＳＲＳＦ３、ＥＰＨＢ４、ＡＲＨＧＡＰ１８、ＲＰＬ３１、ＦＫＢＰ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ２、Ｅｌｆ１、Ｐｈｆ８、Ｐｏｌ２ｓ２、Ｔａｆ１及びＳｉｎ３ａから選択される１種以上の遺伝子の遺伝子発現の増加を含む、実施形態２に記載の方法。
実施形態４．若返った細胞が、参照値と比較して、１種以上の核及び／又はエピジェネティックマーカーの増加した遺伝子発現を示す、先行する実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態５．マーカーが、ＨＰ１ガンマ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、ラミナ支持タンパク質ＬＡＰ２アルファ及びＳＩＲＴ１タンパク質から選択される、実施形態４に記載の方法。
実施形態６．若返った細胞が、参照値と比較して、増加したタンパク質分解活性を示す、先行する実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態７．増加したタンパク質分解活性が、増加した細胞オートファゴソーム形成、増加したキモトリプシン様プロテアソーム活性、又はこれらの組合せとして測定される、実施形態６に記載の方法。
実施形態８．若返った細胞が、参照値と比較して、改善されたミトコンドリアの健康及び機能を示す、先行する実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態９．改善されたミトコンドリアの健康及び機能が、増加したミトコンドリア膜電位、減少した活性酸素種（ＲＯＳ）、又はこれらの組合せとして測定される、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０．若返った細胞が、参照値と比較して、１種以上のＳＡＳＰサイトカインの減少した発現を示す、先行する実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態１１．ＳＡＳＰサイトカインが、ＩＬ１８、ＩＬ１Ａ、ＧＲＯＡ、ＩＬ２２及びＩＬ９のうち１種以上を含む、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２．若返った細胞が、メチル化ランドスケープの反転を示す、先行する実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態１３．メチル化ランドスケープの反転が、Ｈｏｒｖａｔｈ時計による推定によって測定される、実施形態１２に記載の方法。
実施形態１４．参照値が、加齢した細胞から得られる、実施形態４〜１３のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態１５．細胞にメッセンジャーＲＮＡをトランスフェクトするステップが、リポフェクタミン及びＬＴ−１媒介トランスフェクション、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームにおけるｍＲＮＡの封入、並びに直接的マイクロインジェクションから選択される方法を含む、先行する実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態１６．１種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧから選択される、先行する実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態１７．１種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを含む、先行する実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態１８．細胞が、哺乳類細胞である、先行する実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態１９．細胞が、ヒト細胞である、先行する実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態２０．細胞が、高齢対象に由来する、先行する実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態２１．細胞が、線維芽細胞、内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋幹細胞、ケラチノサイト、間葉系幹細胞及び角膜上皮細胞から選択される、先行する実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態２２．細胞が、間葉系幹細胞である、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３．若返った間葉系幹細胞が、老化パラメータ（ｐ１６、ｐ２１及び陽性ＳＡβＧａｌ染色）の低下、増加した細胞増殖、及び／又はＲＯＳレベルの減少を示す、実施形態２２に記載の方法。
実施形態２４．インビトロ、エクスビボ又はインビボで行われる、先行する実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態２５．インビボで行われる、実施形態２４に記載の方法。
実施形態２６．細胞が、組織又は臓器内にある、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２７．組織又は臓器内の老化した細胞の数を低下させる、実施形態２５〜２７のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態２８．ＩＬ１８、ＩＬ１Ａ、ＧＲＯＡ、ＩＬ２２及びＩＬ９のうち１種以上の発現を減少させる、実施形態２５〜２７のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態２９．細胞の機能を回復させる、分化能を増加させる、生存率を増強する、複製能若しくは寿命を増加させる、又はこれらの組合せである、先行する実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態３０．トランスフェクトするステップが、５日間、１日１回行われる、実施形態１〜２４のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態３１．トランスフェクトするステップが、４日間、１日１回行われる、実施形態１〜２４のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態３２．トランスフェクトするステップが、３日間、１日１回行われる、実施形態１〜２４のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態３３．トランスフェクトするステップが、２日間、１日１回行われる、実施形態１〜２４のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態３４．対象の加齢性疾患若しくは状態、軟骨変性障害、神経変性障害及び／又は筋骨格機能不全を治療するための方法であって、治療有効量の細胞を投与するステップを含み、細胞が、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを含む、方法。
実施形態３５．１種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧから選択される、実施形態３４に記載の方法。
実施形態３６．１種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを含む、実施形態３４〜３５のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態３７．対象が、加齢性疾患又は状態を有する、実施形態３４〜３６のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態３８．加齢性疾患又は状態が、眼、皮膚又は筋骨格機能不全から選択される、実施形態３４に記載の方法。
実施形態３９．対象が、軟骨変性障害を有する、実施形態３４〜３６のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態４０．障害が、関節炎、軟骨無形成症（ｃｈｏｎｄｒｏｐｈａｓｉａ）、脊椎関節症、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、再発性多発軟骨炎及びシェーグレン症候群から選択される、実施形態３９に記載の方法。
実施形態４１．処置が、炎症性因子の発現を低下させる、及び／又はＡＴＰ及びコラーゲン代謝を増加させる、実施形態３９又は４０のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態４２．炎症性因子が、ＲＡＮＫＬ、ｉＮＯＳ２、ＩＬ６、ＩＦＮα、ＭＣＰ３及びＭＩＰ１Ａから選択される、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３．ＡＴＰ及びコラーゲン代謝が、増加したＡＴＰレベル、減少したＲＯＳ及び増加したＳＯＤ２、増加したＣＯＬ２Ａ１、及び軟骨細胞による全体的な増殖のうち１種以上によって測定される、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４４．対象が、筋骨格機能不全を有する、実施形態３４〜３６のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態４５．治療有効量の細胞を投与するステップが、注射又は外科的埋植を含む、実施形態３４〜４４のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態４６．治療有効量の若返った細胞が、線維芽細胞、内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋幹細胞、ケラチノサイト、間葉系幹細胞及び角膜上皮細胞から選択される、実施形態３４〜４５のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態４７．治療有効量の若返った細胞が、角膜上皮細胞である、実施形態４６に記載の方法。
実施形態４８．若返った角膜上皮が、老化パラメータの低下を示す、実施形態４７に記載の方法。
実施形態４９．老化パラメータが、ｐ２１及びｐ１６の発現、ミトコンドリア新生ＰＧＣ１α、並びに炎症性因子ＩＬ８の発現のうち１種以上を含む、実施形態４８に記載の方法。
実施形態５０．対象の加齢性疾患若しくは状態、軟骨変性障害を治療する、及び／又は筋骨格機能不全を有する対象を治療するための方法であって、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、治療有効量の１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを投与するステップを含む方法。
実施形態５１．１種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧから選択される、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５２．１種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを含む、実施形態５０〜５１〜４８のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態５３．対象が、加齢性疾患又は状態を有する、実施形態５０〜５２のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態５４．加齢性疾患又は状態が、眼、皮膚又は筋骨格機能不全から選択される、実施形態５３に記載の方法。
実施形態５５．対象が、軟骨変性障害を有する、実施形態５０〜５２のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態５６．障害が、関節炎、軟骨無形成症（ｃｈｏｎｄｒｏｐｈａｓｉａ）、脊椎関節症、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、再発性多発軟骨炎及びシェーグレン症候群から選択される、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７．対象が、筋骨格機能不全を有する、実施形態５０〜５２のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態５８．治療有効量の１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを投与するステップが、標的細胞への直接的注射を含む、実施形態５０〜５７のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態５９．標的細胞が、上皮細胞、内皮細胞、結合組織細胞、筋肉細胞及び神経系細胞から選択される、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６０．操作された組織をエクスビボで若返らせる方法であって、連続した５日以下の間、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、組織にトランスフェクトし、これにより、若返った操作された組織を産生するステップを含む方法。
実施形態６１．操作された組織が、老化パラメータ、炎症促進性因子の低下、組織学的スコアの改善、又はこれらの組合せを示す、実施形態６０に記載の方法。
実施形態６２．操作された組織が、操作された皮膚組織である、実施形態６０又は６１のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態６３．老化パラメータが、ｐ１６並びに陽性ＳＡβＧａｌ染色並びに炎症促進性因子ＩＬ８及びＭＭＰ１から選択される、実施形態６０〜６２のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態６４．組織学的スコアが、形態、組織化及び／又は品質を含む、実施形態６０〜６３のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態６５．若返った細胞を含む医薬組成物であって、若返った細胞が、連続した５日以下の間、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、細胞にトランスフェクトするステップによって得られる、医薬組成物。
実施形態６６．１種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧから選択される、先行する実施形態のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態６７．細胞が、ＨＰ１ガンマ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、ＬＡＰ２アルファ、ＳＩＲＴ１の増加した発現、増加したミトコンドリア膜電位、及び減少した活性酸素種、及びＳＡＳＰサイトカインの減少した発現のうち１種以上を呈する、実施形態６５又は６６に記載の組成物。
実施形態６８．ＳＡＳＰサイトカインが、ＩＬ１８、ＩＬ１Ａ、ＧＲＯＡ、ＩＬ２２及びＩＬ９のうち１種以上を含む、実施形態６７に記載の組成物。
実施形態６９．栄養素、サイトカイン、成長因子、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、抗生物質、抗酸化剤及び免疫抑制剤から選択される１種以上の追加的な成分をさらに含む、実施形態６５〜６８のいずれか一実施形態に記載の組成物。
実施形態７０．薬学的に許容される担体をさらに含む、実施形態６５〜６９のいずれか一実施形態に記載の組成物。
実施形態７１．細胞が、自家又は同種異系である、実施形態６５〜７０のいずれか一実施形態に記載の組成物。

Claims (71)

  1. 細胞を若返らせる方法であって、連続した５日以下の間、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、細胞にトランスフェクトし、これにより、若返った細胞を産生するステップを含む方法。
  2. 若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルが、若齢細胞のトランスクリプトームプロファイルに類似するようになる、請求項１に記載の方法。
  3. 若返った細胞のトランスクリプトームプロファイルが、ＲＰＬ３７、ＲＨＯＡ、ＳＲＳＦ３、ＥＰＨＢ４、ＡＲＨＧＡＰ１８、ＲＰＬ３１、ＦＫＢＰ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ２、Ｅｌｆ１、Ｐｈｆ８、Ｐｏｌ２ｓ２、Ｔａｆ１及びＳｉｎ３ａから選択される１種以上の遺伝子の遺伝子発現の増加を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 若返った細胞が、参照値と比較して、１種以上の核及び／又はエピジェネティックマーカーの増加した遺伝子発現を示す、請求項１に記載の方法。
  5. マーカーが、ＨＰ１ガンマ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、ラミナ支持タンパク質ＬＡＰ２アルファ及びＳＩＲＴ１タンパク質から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 若返った細胞が、参照値と比較して、増加したタンパク質分解活性を示す、請求項１に記載の方法。
  7. 増加したタンパク質分解活性が、増加した細胞オートファゴソーム形成、増加したキモトリプシン様プロテアソーム活性、又はこれらの組合せとして測定される、請求項６に記載の方法。
  8. 若返った細胞が、参照値と比較して、改善されたミトコンドリアの健康及び機能を示す、請求項１に記載の方法。
  9. 改善されたミトコンドリアの健康及び機能が、増加したミトコンドリア膜電位、減少した活性酸素種（ＲＯＳ）又はこれらの組合せとして測定される、請求項８に記載の方法。
  10. 若返った細胞が、参照値と比較して、１種以上のＳＡＳＰサイトカインの減少した発現を示す、請求項１に記載の方法。
  11. ＳＡＳＰサイトカインが、ＩＬ１８、ＩＬ１Ａ、ＧＲＯＡ、ＩＬ２２及びＩＬ９のうち１種以上を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 若返った細胞が、メチル化ランドスケープの逆行を示す、請求項１に記載の方法。
  13. メチル化ランドスケープの反転が、Ｈｏｒｖａｔｈ時計による推定によって測定される、請求項１２に記載の方法。
  14. 参照値が、加齢した細胞から得られる、請求項４に記載の方法。
  15. 細胞にメッセンジャーＲＮＡをトランスフェクトするステップが、リポフェクタミン及びＬＴ−１媒介トランスフェクション、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームにおけるｍＲＮＡの封入、並びに直接的マイクロインジェクションから選択される方法を含む、請求項１に記載の方法。
  16. １種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧから選択される、請求項１に記載の方法。
  17. １種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを含む、請求項１に記載の方法。
  18. 細胞が、哺乳類細胞である、請求項１に記載の方法。
  19. 細胞が、ヒト細胞である、請求項１８に記載の方法。
  20. 細胞が、高齢対象に由来する、請求項１９に記載の方法。
  21. 細胞が、線維芽細胞、内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋幹細胞、ケラチノサイト、間葉系幹細胞及び角膜上皮細胞から選択される、請求項１８に記載の方法。
  22. 細胞が、間葉系幹細胞である、請求項２１に記載の方法。
  23. 若返った間葉系幹細胞が、老化パラメータ（ｐ１６、ｐ２１及び陽性ＳＡβＧａｌ染色）の低下、増加した細胞増殖、及び／又はＲＯＳレベルの減少を示す、請求項２２に記載の方法。
  24. インビトロ、エクスビボ又はインビボで行われる、請求項１に記載の方法。
  25. インビボで行われる、請求項２４に記載の方法。
  26. 細胞が、組織又は臓器内にある、請求項２５に記載の方法。
  27. 組織又は臓器内の老化した細胞の数を低下させる、請求項２６に記載の方法。
  28. ＩＬ１８、ＩＬ１Ａ、ＧＲＯＡ、ＩＬ２２及びＩＬ９のうち１種以上の発現を減少させる、請求項２７に記載の方法。
  29. 細胞の機能を回復させる、分化能を増加させる、生存率を増強する、複製能若しくは寿命を増加させる、又はこれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
  30. トランスフェクトするステップが、５日間、１日１回行われる、請求項１に記載の方法。
  31. トランスフェクトするステップが、４日間、１日１回行われる、請求項１に記載の方法。
  32. トランスフェクトするステップが、３日間、１日１回行われる、請求項１に記載の方法。
  33. トランスフェクトするステップが、２日間、１日１回行われる、請求項１に記載の方法。
  34. 対象の加齢性疾患若しくは状態、軟骨変性障害、神経変性障害及び／又は筋骨格機能不全を治療するための方法であって、治療有効量の細胞を投与するステップを含み、細胞が、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを含む、方法。
  35. １種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧから選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. １種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 対象が、加齢性疾患又は状態を有する、請求項３４に記載の方法。
  38. 加齢性疾患又は状態が、眼、皮膚又は筋骨格機能不全から選択される、請求項３４に記載の方法。
  39. 対象が、軟骨変性障害を有する、請求項３４に記載の方法。
  40. 障害が、関節炎、軟骨無形成症（ｃｈｏｎｄｒｏｐｈａｓｉａ）、脊椎関節症、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、再発性多発軟骨炎及びシェーグレン症候群から選択される、請求項３９に記載の方法。
  41. 治療が、炎症性因子の発現を低下させる、及び／又はＡＴＰ及びコラーゲン代謝を増加させる、請求項３４に記載の方法。
  42. 炎症性因子が、ＲＡＮＫＬ、ｉＮＯＳ２、ＩＬ６、ＩＦＮα、ＭＣＰ３及びＭＩＰ１Ａから選択される、請求項４１に記載の方法。
  43. ＡＴＰ及びコラーゲン代謝が、増加したＡＴＰレベル、減少したＲＯＳ及び増加したＳＯＤ２、増加したＣＯＬ２Ａ１、及び軟骨細胞による全体的な増殖のうち１種以上によって測定される、請求項４２に記載の方法。
  44. 対象が、筋骨格機能不全を有する、請求項３４に記載の方法。
  45. 治療有効量の細胞を投与するステップが、注射又は外科的埋植を含む、請求項３４に記載の方法。
  46. 治療有効量の若返った細胞が、線維芽細胞、内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋幹細胞、ケラチノサイト、間葉系幹細胞及び角膜上皮細胞から選択される、請求項３４に記載の方法。
  47. 治療有効量の若返った細胞が、角膜上皮細胞である、請求項４６に記載の方法。
  48. 若返った角膜上皮が、老化パラメータの低下を示す、請求項４７に記載の方法。
  49. 老化パラメータが、ｐ２１及びｐ１６の発現、ミトコンドリア新生ＰＧＣ１α、並びに炎症性因子ＩＬ８の発現のうち１種以上を含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 対象の加齢性疾患若しくは状態、軟骨変性障害を治療する、及び／又は筋骨格機能不全を有する対象を治療するための方法であって、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする治療有効量の１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを投与するステップを含む方法。
  51. １種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧから選択される、請求項５０に記載の方法。
  52. １種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 対象が、加齢性疾患又は状態を有する、請求項５０に記載の方法。
  54. 加齢性疾患又は状態が、眼、皮膚又は筋骨格機能不全から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. 対象が、軟骨変性障害を有する、請求項５０に記載の方法。
  56. 障害が、関節炎、軟骨無形成症（ｃｈｏｎｄｒｏｐｈａｓｉａ）、脊椎関節症、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、再発性多発軟骨炎及びシェーグレン症候群から選択される、請求項５５に記載の方法。
  57. 対象が、筋骨格機能不全を有する、請求項５０に記載の方法。
  58. 治療有効量の１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを投与するステップが、標的細胞への直接的注射を含む、請求項５０に記載の方法。
  59. 標的細胞が、上皮細胞、内皮細胞、結合組織細胞、筋肉細胞及び神経系細胞から選択される、請求項５８に記載の方法。
  60. 操作された組織をエクスビボで若返らせる方法であって、連続した５日以下の間、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、組織にトランスフェクトし、これにより、若返った操作された組織を産生するステップを含む方法。
  61. 操作された組織が、老化パラメータ、炎症促進性因子の低下、組織学的スコアの改善、又はこれらの組合せを示す、請求項６０に記載の方法。
  62. 操作された組織が、操作された皮膚組織である、請求項６０に記載の方法。
  63. 老化パラメータが、ｐ１６並びに陽性ＳＡβＧａｌ染色並びに炎症促進性因子ＩＬ８及びＭＭＰ１から選択される、請求項６１に記載の方法。
  64. 組織学的スコアが、形態、組織化及び／又は品質を含む、請求項６１に記載の方法。
  65. 若返った細胞を含む医薬組成物であって、若返った細胞が、連続した５日以下の間、１種以上の細胞リプログラミング因子をコードする、１種以上の非組込みメッセンジャーＲＮＡを、細胞にトランスフェクトするステップによって得られる、医薬組成物。
  66. １種以上の細胞リプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧから選択される、請求項６５に記載の組成物。
  67. 細胞が、ＨＰ１ガンマ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、ＬＡＰ２アルファ、ＳＩＲＴ１の増加した発現、増加したミトコンドリア膜電位、及び減少した活性酸素種、及びＳＡＳＰサイトカインの減少した発現のうち１種以上を呈する、請求項６５に記載の組成物。
  68. ＳＡＳＰサイトカインが、ＩＬ１８、ＩＬ１Ａ、ＧＲＯＡ、ＩＬ２２及びＩＬ９のうち１種以上を含む、請求項６７に記載の組成物。
  69. 栄養素、サイトカイン、成長因子、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、抗生物質、抗酸化剤及び免疫抑制剤から選択される１種以上の追加的な成分をさらに含む、請求項６５に記載の組成物。
  70. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項６５に記載の組成物。
  71. 細胞が、自家又は同種異系である、請求項６５に記載の組成物。
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