KR20200131301A - 세포 노화의 역전을 위한 일시적 세포 재프로그래밍 - Google Patents

세포 노화의 역전을 위한 일시적 세포 재프로그래밍 Download PDF

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KR20200131301A
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비토리오 세바스티아노
타파쉬 제이 사르카르
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

본원에서는 세포 재생, 조직 공학, 및 재생 의학에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 기능성을 회복시키기 위해 노화 세포 및 조직을 회춘시키기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 특히, 세포는 세포를 분화된 상태로 유지하면서 세포를 회춘시키는 재프로그래밍 인자를 코딩하는 비통합 mRNA에의 일시적 노출에 의해 회춘된다.

Description

세포 노화의 역전을 위한 일시적 세포 재프로그래밍
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 3월 13일에 출원된 미국 가출원 제62/642538호에 우선권을 주장하며, 이는 이로써 전체적으로 모든 목적을 위해 참고로 포함된다.
연방 지원 연구 및 개발 하에 작성된 개시 내용에 대한 권리에 관한 진술
본 개시 내용은 허가 번호 R01 AR070865 및 R01 AR070864(미국 국립 보건원(National Institutes of Health)(NIH/NIAMS)), 허가 번호 P01 AG036695, R01 AG23806(R37 공로상), R01 AG057433, 및 R01 AG047820(미국 국립 보건원(NIH)), 보훈부(Department of Veterans Affairs)(BLR&D 및 RR&D 업적 평가) 및 CalPoly 기금상 # TB1-01175 하에 정부 지원으로 작성되었다. 정부는 개시 내용에 대해 특정 권리를 갖는다.
노화는 분자, 세포, 조직 및 유기체 수준에서 발생하는 기능의 점진적인 상실을 특징으로 한다. 염색질 수준에서, 노화는 결국 비정상적인 유전자 조절, 줄기 세포 고갈, 노화, 및 조절 해제된 세포/조직 항상성으로 이어지는 후성 유전학적 오류의 점진적인 축적과 관련된다. 소수의 전사 인자의 과발현을 통해 만능성으로의 핵 재프로그래밍 기술은 후성 유전적 재프로그래밍을 유도하여 임의의 세포의 연령과 정체성 둘 다를 배아 세포의 것으로 역전시킬 수 있다. 세포 정체성의 바람직하지 않은 소거는 조직과 기관의 구조, 기능 및 세포 유형 분포의 결과적인 파괴로 인해 회춘 요법의 개발에 문제가 된다.
전술한 관점에서, 세포 정체성의 탈분화 및 상실을 방지하는 개선된 세포 회춘 방법이 필요하다. 본 개시 내용은 이러한 요구를 해결하고 또한 추가적인 이점을 제공한다.
본 개시 내용은 일반적으로 세포 회춘, 조직 공학, 및 재생 의학에 관한 것이다. 특히, 본 개시 내용은 세포를 분화된 상태로 유지하면서 세포를 회춘시키는 재프로그래밍 인자를 코딩하는 비통합 mRNA에의 일시적 노출에 의해 기능성을 회복시키기 위해 노화 세포 및 조직을 회춘시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 개시 내용은 회춘한 세포를 이용하는 세포 기반 요법에 관한 것이다. 특히, 본 개시 내용은 세포를 분화된 상태로 유지하면서 세포를 회춘시키는 재프로그래밍 인자를 코딩하는 비통합 mRNA에의 일시적 노출에 의해 기능성을 회복시키기 위해 노화 세포 및 조직을 회춘시키는 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본원에서 세포의 회춘 방법으로서, 연속 5일 이하 동안 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 세포를 형질감염시켜, 회춘한 세포를 생성하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 본원에서 노화 관련 질환 또는 병태, 연골 변성 장애, 신경 변성 장애, 및/또는 근골격계 기능장애에 대해 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA를 포함하는 치료 유효량의 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본원에서 노화 관련 질환 또는 병태, 연골 변성 장애, 및/또는 근골격계 기능장애에 대해 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 치료 유효량의 하나 이상의 비통합 메신저 RNA를 투여하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본원에서 조작된 조직을 생체 외에서 회춘시키는 방법이 제공된다. 방법은 연속 5일 이하 동안 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 조직을 형질감염시켜, 회춘한 조작된 조직을 생성하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본원에서 연속 5일 이하 동안 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 세포를 형질감염시킴으로써 수득한 회춘한 세포를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시 내용은 세포의 회춘 방법으로서, a) 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 세포를 형질감염시키는 단계로, 상기 형질감염은 2일 이상 4일 이하 동안 매일 1회 수행되는 것인 단계; 및 b) 세포에서 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 생성하는 하나 이상의 비통합 메신저 mRNA를 번역시켜 세포의 일시적 재프로그래밍을 초래하는 단계로, 세포는 줄기 세포로의 탈분화 없이 회춘되는 것인 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 방법은 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내에서 세포에 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 형질감염은 2일, 3일, 또는 4일 동안 매일 1회 수행된다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 포함한다.
방법은 임의의 유형의 세포에 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포(예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 설치류, 고양이, 개, 소, 말, 돼지, 염소 등)이다. 예를 들어, 방법은 섬유아세포, 내피 세포, 연골 세포, 또는 골격근 줄기 세포에 수행될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 노령 대상체로부터 유래된다.
특정 실시양태에서, 일시적 재프로그래밍은 HP1γ, H3K9me3, 라미나 지지 단백질 LAP2α, 및 SIRT1 단백질의 발현 증가, GMSCF, IL18, 및 TNFα의 발현 감소, 핵 접힘 감소, 블레빙(blebbing) 감소, 세포 자가소화포(autophagosome) 형성 증가, 키모트립신 유사 프로테아좀 활성 증가, 미토콘드리아 막 전위 증가, 또는 활성 산소 종(ROS: reactive oxygen species) 감소를 초래한다.
특정 실시양태에서, 세포는 조직 또는 기관 내에 있다. 본원에 기술된 방법에 따른 일시적 재프로그래밍은 조직 또는 기관에서 세포의 기능을 회복시키거나, 조직 또는 기관에서 세포의 효능을 증가시키거나, 조직 또는 기관 내의 노화 세포 수를 감소시키거나, 조직 또는 기관 내의 세포의 복제능을 향상시키거나, 조직 또는 기관 내의 세포의 수명을 연장시킬 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 노화 관련 질환 또는 병태에 대한 대상체를 치료하는 방법으로서, a) 대상체의 세포를 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 형질감염시키는 단계로, 상기 형질감염은 2일 이상 4일 이하 동안 매일 1회 수행되는 것인 단계; 및 b) 대상체의 세포에서 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 발현시켜 세포의 일시적 재프로그래밍을 초래하는 단계로, 세포는 줄기 세포로의 탈분화 없이 회춘되는 것인 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 세포는 생체 외 또는 생체 내에서 형질감염될 수 있다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 포함한다.
특정 실시양태에서, 노화 관련 질환 또는 병태는 변성 질환, 신경 변성 질환, 심혈관 질환, 말초 혈관 질환, 피부 질환, 안 질환, 자가 면역 질환, 내분비 장애, 대사성 장애, 근골격계 장애, 소화계 질환, 또는 호흡기 질환이다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시 내용은 연골 변성을 수반하는 질환 또는 장애에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서, a) 대상체의 연골 세포를 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 형질감염시키는 단계로, 상기 형질감염은 2일 이상 4일 이하 동안 매일 1회 수행되는 것인 단계; 및 b) 연골 세포에서 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 발현시켜 연골 세포의 일시적 재프로그래밍을 초래하는 단계로, 연골 세포는 줄기 세포로의 탈분화 없이 회춘되는 것인 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 회춘한 연골 세포는 예를 들어 대상체의 관절염 관절에 이식될 수 있다.
방법은 생체 외, 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 연골 세포는 대상체로부터 수득한 연골 샘플로부터 단리되고 생체 외에서 형질감염된 후, 대상체에 이식된다.
특정 실시양태에서, 연골 변성을 수반하는 질환 또는 장애는 관절염(예를 들어, 골관절염 또는 류마티스성 관절염)이다.
특정 실시양태에서, 치료는 대상체에서 염증을 감소시킨다.
특정 실시양태에서, 치료는 RANKL, iNOS, IL6, IL8, BDNF, IFNα, IFNγ, 및 LIF의 발현을 감소시키고 연골 세포에 의한 COL2A1의 발현을 증가시킨다.
또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 대상체에서 근육 변성을 수반하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, a) 대상체의 골격근 줄기 세포를 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 형질감염시키는 단계로, 상기 형질감염은 2일 이상 4일 이하 동안 매일 1회 수행되는 것인 단계; 및 b) 골격근 줄기 세포에서 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 발현시켜 골격근 줄기 세포의 일시적 재프로그래밍을 초래하는 단계로, 골격근 줄기 세포는 근육 세포로 분화하는 능력의 상실 없이 회춘되는 것인 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
방법은 생체 외, 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 골격근 줄기 세포는 대상체로부터 수득한 근육 조직 샘플로부터 단리되고 생체 외에서 형질감염된 후, 대상체에서 복구 또는 재생을 필요로 하는 근육에 이식된다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 포함한다.
특정 실시양태에서, 치료는 골격근 줄기 세포의 효능을 회복시킨다. 특정 실시양태에서, 치료는 근섬유의 재생을 초래한다.
본 개시 내용의 방법은 임의의 대상체에 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간, 비인간 영장류, 설치류, 고양이, 개, 소, 말, 돼지, 또는 염소이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 노령이다.
당 업자는 본원의 개시 내용을 고려하여 본 개시 내용의 이들 및 다른 실시양태를 쉽게 생각해 낼 것이다.
[도 1a-1l]은 일시적 재프로그래밍이 섬유아세포에서 노화된 생리학을 더 젊은 상태로 역전시키다는 것을 보여준다. [도 1a]는 처리 기간 - 2일 vs 4일의 일시적 재프로그래밍, 및 둘 다 2일의 후속 휴식-에 따른 효과의 변동(ROS)을 나타내는 대표적인 플롯을 보여준다. 모든 상자 및 막대 플롯은 쉽게 볼 수 있도록 모든 개별 세포, 생물학적 및 기술적 복제물에 대한 데이터를 결합한 후 생성한다. 표시된 유의 수준이 환자 간 가변성을 위한 쌍별 비교를 적절하게 허용한다. [도 1b]는 면역 세포 화학을 사용하여 이질염색질 마커 H3K9me3 및 HP1γ의 단일 세포 수준의 정량화를 보여준다. [도 1c]는 면역 세포 화학을 사용하여 단일 세포에서 핵 라미나 지지 폴리펩티드 LAP2α의 존재의 정량화 및 각 집단에서 비정상 핵(접힘 또는 블레빙)의 백분율을 보여준다. [도 1d]는 단일 세포에서 자가소화포 형성 및 전체 집단에서 키모트립신 유사 20S 단백질 분해 활성 동안 절단된 형광 태그가 부착된 기질에 의한 생존 세포 영상화의 결과를 보여준다. [도 1e]는 미토콘드리아 특이적 염료로 정량화된 개별 세포 미토콘드리아 막 전위 및 ROS 수준을 보여준다. [도 1f]는 SIRT1에 대한 면역 염색의 단일 세포 정량화를 보여준다. [도 1g]는 단일 세포에 대한 텔로미어 정량 형광 제자리 혼성화(QFISH: quantitative fluorescent in situ hybridization)의 결과를 보여준다. [도 1h]는 노화 집단에 대한 SAβGal 염색의 결과를 보여준다. [도 1i]는 다중 세포 측정을 위한 분석물 항체 접합된 비드 패널을 사용한 염증성 사이토카인 프로파일링의 정량화를 보여준다. [도 1j]는 4일의 일시적 재프로그래밍 후 4일 및 6일의 더 긴 휴식 기간 동안 젊은 변화의 유지를 보여주는 대표적인 플롯을 보여준다. 이어서 각 코호트의 세포는 각 그룹(젊은 세포, 노화 세포 및 처리 세포 - R4X2)에 대한 트랜스크립톰 프로파일을 산출하기 위해 80개의 염기쌍의 페어드 엔드 리드(paired end read) RNA 시퀀싱을 거쳤다. [도 1k]는 노화 시그니처에 의해 정의된 부분 공간에서 주성분 분석을 보여준다. [도 1l]은 젊은 세포와 노화 세포(x 축)와 처리 세포와 노화 세포(y 축) 사이의 로그 변화 배수의 비교를 보여준다. 짙은 회색 점은 노화 시그니처의 모든 유전자이며, 밝은 회색 점은 처리 시그니처와 겹치는 유전자이며 처리 세포와 노화 세포 사이에서 유의하게 상이하다. 유전자의 대부분은 y = x 선을 따라 놓여 있으며, 이는 처리에 의한 변화의 크기가 젊은 세포와 노화 세포 사이에서 차이의 크기와 밀접하게 일치함을 의미한다. 유의성은 스튜던트 t 검정으로, 처리 세포와 노화 세포 사이에서 쌍별로, 젊은 환자와 비교할 때 그룹별로 계산된다. P 값: *<0.05, **<0.01, ***<0.001, 별표의 색상은 비교되고 있는 집단과 일치한다.
[도 2a-2k]은 일시적 재프로그래밍이 내피 세포에서 노화된 생리학을 더 젊은 상태로 역전시킨다는 것을 보여준다. [도 2a]는 처리 기간 - 2일 vs 4일의 일시적 재프로그래밍, 및 둘 다 2일의 후속 휴식-에 따른 효과의 변동(ROS)을 나타내는 대표적인 플롯을 보여준다. 모든 상자 및 막대 플롯은 쉽게 볼 수 있도록 모든 개별 세포, 생물학적 및 기술적 복제물에 대한 데이터를 결합한 후 생성한다. 표시된 유의 수준이 환자 간 가변성을 위한 쌍별 비교를 적절하게 허용한다. [도 2b]는 면역 세포 화학을 사용하여 이질염색체 마커 H3K9me3 및 HP1γ의 단일 세포 수준의 정량화를 보여준다. [도 2c]는 면역 세포 화학을 사용하여 단일 세포에서 핵 라미나 지지 폴리펩티드 LAP2α의 존재의 정량화 및 각 집단에서 비정상 핵(접힘 또는 블레빙)의 백분율을 보여준다. [도 2d]는 단일 세포에서 자가소화포 형성 및 전체 집단에서 키모트립신 유사 20S 단백질 분해 활성 동안 절단된 형광 태그가 부착된 기질에 의한 생존 세포 영상화의 결과를 보여준다. [도 2e]는 미토콘드리아 특이적 염료로 정량화된 개별 세포 미토콘드리아 막 전위 및 ROS 수준을 보여준다. [도 2f]는 SIRT1에 대한 면역 염색의 단일 세포 정량화를 보여준다. [도 2g]는 단일 세포에 대한 텔로미어 정량 형광 제자리 혼성화(QFISH)의 결과를 보여준다. [도 2h]는 노화 집단에 대한 SAβGal 염색의 결과를 보여준다. [도 2i]는 4일의 일시적 재프로그래밍 후 4일 및 6일의 더 긴 휴식 기간 동안 젊은 변화의 유지를 보여주는 대표적인 플롯을 보여준다. 이어서 각 코호트의 세포는 각 그룹(젊은 세포, 노화 세포 및 처리 세포 - R4X2)에 대한 트랜스크립톰 프로파일을 산출하기 위해 80개의 염기쌍의 페어드 엔드 리드 RNA 시퀀싱을 거쳤다. [도 2j]는 노화 시그니처에 의해 정의된 부분 공간에서 주성분 분석을 보여준다. [도 2k]은 젊은 세포와 노화 세포(x 축)와 처리 세포와 노화 세포(y 축) 사이의 로그 변화 배수의 비교를 보여준다. 짙은 회색 점은 노화 시그니처의 모든 유전자이며, 밝은 회색 점은 처리 시그니처와 겹치는 유전자이며 처리 세포와 노화 세포 사이에서 유의하게 상이하다. 유전자의 대부분은 y = x 선을 따라 놓여 있으며, 이는 처리에 의한 변화의 크기가 젊은 세포와 노화 세포 사이에서 차이의 크기와 밀접하게 일치함을 의미한다. 유의성은 스튜던트 t 검정으로, 처리 세포와 노화 세포 사이에서 쌍별로, 젊은 환자와 비교할 때 그룹별로 계산된다. P 값: *<0.05, **<0.01, ***<0.001, 별표의 색상은 비교되고 있는 집단과 일치한다.
[도 3a-3i]는 일시적 재프로그래밍이 질환 연골 세포에서 골관절염 표현형을 완화한다는 것을 보여준다: 모든 상자 및 막대 플롯은 쉽게 볼 수 있도록 생물학적 및 기술적 복제물에 대해 결합한다. 표시된 유의 수준이 환자 간 가변성을 위한 쌍별 비교를 적절하게 허용한다. 처리는 최적화된 3일의 재프로그래밍과 2일의 휴식을 의미한다. [도 3a]는 세포 생존능 염색으로부터의 집단 결과를 보여준다. [도 3b]는 동화 인자 COL2A1의 RNA 수준의 qRT-PCR 평가를 보여준다. [도 3c]는 각 코호트에서 ATP 농도의 정량화를 보여준다. [도 3d]는 항산화제 SOD2의 RNA 수준에 대한 qRT-PCR 평가를 보여주며, SOD2 상승이 ROS가 존재할 때, 즉 OA 상태일 때만 유익하기 때문에(도 3e) 젊은 수준은 OA 아래임에 주목한다. [도 3f 및 3g]는 이화 인자 MMP13(도 f) 및 MMP3(도 3g)의 RNA 수준의 qRT-PCR 평가를 보여준다. [도 3h 및 3i]는 다중 세포 측정 분석을 위한 분석물 항체 접합된 비드 패널을 사용한 염증 유발성 인자 RANKL(도 3h) 및 iNOS(도 3i) 프로파일링의 RNA 수준의 RT-PCR 평가를 보여준다. 유의성은 스튜던트 t 검정으로, 처리 세포와 노화 세포 사이에서 쌍별로, 젊은 환자와 비교할 때 그룹별로 계산된다. P 값: *<0.05, **<0.01, ***<0.001
[도 4a-4g]는 일시적 재프로그래밍이 노화된 근육 줄기 세포 효능을 회복시킴 보여준다. [도 4a]는 정지로부터 MuSC 활성화의 측정값을 보여준다. 새로 단리된 노화 MuSC는 2일의 처리와 1 또는 2일의 휴식 후 고정된 EdU와 함께 인큐베이션하였다. 모든 상자 및 막대 플롯은 쉽게 볼 수 있도록 생물학적 및 기술적 복제물에 대해 결합한다. 표시된 유의 수준이 환자 간 가변성을 위한 쌍별 비교를 적절하게 허용한다. [도 4b]는 이식 및 손상 후 상이한 시점에서 처리/미처리 + 루시페라제 마우스 MuSC의 TA 근육에서 이식 11일 후 마우스로부터 측정된 생물 발광의 정량화된 결과를 보여준다. [도 4c]는 [도 4b]에서 영상화되고 정량화된 마우스의 TA 근육 단면에서 GFP 발현의 면역 형광 염색의 정량화를 보여준다. [도 4d]는 이식된 MuSC의 수여자인 TA 근육에서 공여자 유래 GFP+ 섬유의 단면적의 정량화를 보여준다. [도 4e]는 이식 60일 후 재손상된(2차 손상) TA 근육의 생물 발광 영상화 결과를 보여준다. 초기에 이식되고 기저판 아래에 생착된 루시페라제+/GFP+ MuSC를 활성화하고 확장한 결과로서 생물 발광 신호가 증가했는지 테스트하기 위해 2차 손상을 수행하였다. [도 4f]는 처리된 루시페라제 + 인간 MuSC의 TA 근육에 이식 11일 후 마우스로부터 측정된 생물 발광의 정량화된 결과를 보여준다. [도 4g]는 다양한 연령 그룹의 건강한 공여자로부터 수득한 처리 MuSC와 미처리 MuSC 사이에서 생물 발광 비의 변화를 보여준다. 유의성은 스튜던트 t 검정으로, 처리 세포와 노화 세포 사이에서 쌍별로, 젊은 환자와 비교할 때 그룹별로 계산된다. P 값: *<0.05, **<0.01, ***<0.001 별표의 색상은 비교되고 있는 집단과 일치한다.
[도 5a-5j]는 일시적 재프로그래밍이 인간 섬유아세포(F) 및 내피 세포(E)에서 노화된 생리학을 더 젊은 상태로 역전시킨다는 것을 보여준다. 섬유아세포와 내피 세포는 다른 점에서는 건강한 젊은 개체 및 노화 개체로부터 얻었다. [도 5a]는 H3K9me3에 대한 후성 유전적 핵 마커의 분포를 보여준다. [도 5b]는 HP1γ에 대한 후성 유전적 핵 마커의 분포를 보여준다. [도 5c]는 LAP2α에 대한 후성 유전적 핵 마커의 분포를 보여준다. [도 5d]는 SIRT1에 대한 영양분 분포 및 에너지 조절을 보여준다. [도 5e]는 미토콘드리아 막 전위에 대한 영양분 분포 및 에너지 조절을 보여준다. [도 5f]는 미토콘드리아 ROS에 대한 영양분 분포 및 에너지 조절을 보여준다. [도 5g]는 자가소화포에서의 분포 및 벌크 폐기물 제거 및 노화를 보여준다. [도 5h]는 젊은 세포, 노화 세포, 및 처리 세포에 대한 프로테아좀 활성을 보여준다. [도 5i]는 젊은 세포, 노화 세포, 및 처리 세포에 대한 노화 활성을 보여준다. [도 5j]는 젊은 세포, 노화 세포, 및 처리 세포에서 분비된 사이토카인을 보여준다.
[도 6a-6i]는 노화된 섬유아세포 및 내피 세포에 대한 트랜스크립톰 및 메틸로믹 분석을 보여준다. [도 6a]는 섬유아세포에 대한 젊은 세포 vs 노화 세포 트랜스크립톰 프로파일을 보여준다. 데이터는 섬유아세포에서 961개 유전자(5.85%)(상향 조절된 678개, 하향 조절된 289개)가 유의 기준 p<0.05 및 로그 배수 변화 컷오프 +/- 0.5로 젊은 세포와 노화 세포 사이에서 상이하였음을 보여준다. [도 6b]는 섬유아세포에 대한 PCA 분석을 보여준다. [도 6c]는 섬유아세포에 대한 발현 분석을 보여준다. [도 6d]는 내피 세포에 대한 젊은 세포 vs 노화 세포 프로파일을 보여준다. 데이터는 내피 세포에서 748개 유전자(4.80%)(상향 조절된 389개, 하향 조절된 377개)가 유의 기준 p<0.05 및 로그 배수 변화 컷오프 +/- 0.5로 젊은 세포와 노화 세포 사이에서 상이하였음을 보여준다. [도 6e]는 내피 세포에 대한 PCA 분석을 보여준다. [도 6f]는 내피 세포에 대한 발현 분석을 보여준다. [도 6g]는 처리 전후에 호바스(Horvath) 시계에 의해 평가된 섬유아세포에 대한 메틸화 연령의 그래프이며, 데이터는 전반적인 감소 경향을 보여준다. [도 6h]는 처리 전후에 호바스 시계에 의해 평가된 내피 세포에 대한 메틸화 연령의 그래프이며, 데이터는 전반적인 감소 경향을 보여준다. [도 6i]는 처리 상태별, 성별별, 환자별 및 세포 유형별로 분리되는 메틸화 패턴에서 비지도 클러스터링(unsupervised clustering)을 보여주는 계통도이다. 클러스터링은 적어도 섬유아세포와 내피 세포를 비교할 때 세포 정체성의 집단적 보유를 입증한다.
[도 7a-7m]은 골관절염 연골 세포 및 중간엽 줄기 세포에서 일시적 재프로그래밍을 보여준다. [도 7a-i]는 일시적 재프로그래밍이 질환 연골 세포에서 염증성 표현형을 완화한다는 것을 보여주는 데이터이다. 연골 세포는 연골 생검으로부터 후기 골관절염(OA: Osteoarthritis)으로 진단받은 노인 환자로부터 수득하였다. 노화 OA 세포 및 일시적으로 재프로그래밍된 OA 세포를 OA 특정 표현형에 대해 평가하였다. 모든 상자 및 막대 플롯은 쉽게 볼 수 있도록 생물학적 및 기술적 복제물에 대해 결합한다. 전체 유의성 순위는 두 번째로 가장 엄격한 p 값으로 설정하였다. 유의성은 스튜던트 t 검정으로 계산되었다. P 값: *<0.05, **<0.01, ***<0.001. 오차 막대는 RMSE(평균 제곱근 오차)를 나타낸다. [도 7a]는 글리세롤계 형광단을 사용하여 ATP 농도를 측정함으로써 연골 세포에서 처리에 의한 ATP 수준의 상승을 보여준다. [도 7b]는 수퍼옥시드 유발 형광 염료를 흡수한 세포의 생존 단일 세포 이미지를 추적하여 ROS 활성이 처리 후 감소된 신호를 나타냄을 보여준다. [도 7c]는 처리에 의해 상승된 항산화제 SOD2의 RNA 수준에 대한 qRT-PCR 평가 결과를 보여준다. [도 7d]는 노화 처리 세포가 젊은 세포에 가까운 수준으로 이동하는, 젊은, 노화 및 노화 처리 연골 세포에서 세포 증식을 보여준다. [도 7e]는 노화 처리 세포가 젊은 세포에 가까운 수준으로 이동하는, 젊은, 노화 및 노화 처리 연골 세포에서 세포 외 기질 단백질 성분 COL2A1에 대한 RNA 수준의 상승을 반영하는 qRT-PCR의 데이터를 보여준다. [도 7f]는 연골 발생 정체성 및 기능 전사 인자 SOX9의 qRT-PCR 수준이 처리 후 유지됨을 보여주는 데이터이다. [도 7g]는 처리에 의해 NF-κB 리간드 RANKL의 세포 내 RNA 수준이 감소한다는 것을 보여주는 RT-PCR 평가를 요약한다. [도 7h]는 처리에 의해 반응으로서 산화질소를 생성하기 위한 그리고 염증 자극을 전파하기 위한 iNOS의 수준이 젊은 연골 세포에 더 가깝게 이동하면서 감소한다는 것을 보여주는 RT-PCR 평가를 요약한다. [도 7i]는 연골 세포 분비물의 사이토카인 프로파일링이 처리에 의해 감소하는 염증 유발성 사이토카인을 보여준다는 것을 반영하는 데이터이다. [도 7j]는 중간엽 줄기 세포에서 처리에 의해 p16의 감소된 수준으로의 환자별 분포 이동을 보여주는 그래프이다. [도 7k]는 중간엽 줄기 세포에서 처리에 의해 p21의 감소된 수준으로의 환자별 분포 이동을 보여주는 그래프이다. [도 7l]은 노화 및 처리된 중간엽 줄기 세포에서 세포 증식의 증가에 상응하는 변화 배수를 보여준다. [도 7m]은 세포 노화의 감소에 상응하는 노화 및 처리된 중간엽 줄기 세포의 노화 백분율을 보여준다.
[도 8a-8j]는 조작된 피부 조직의 일시적 재프로그래밍의 효과를 보여준다. [도 8a-8c]는 섬유아세포 및 각질 세포에 대한 피부 노화 파라미터를 보여준다. [도 8a]는 형태, 구조 및 조직화에 대한 메트릭스(metrics)를 통합한 조직학 점수를 보여주며, mRNA 처리에 의해 개선을 보이지만 일반적으로 판매되는 피부 치료제인 레티노산에 의해 개선을 보이지 않는다. mRNA 처리에 의한 노화 파라미터의 감소는 [도 8b](SaβGal) 및 [도 8c] 왼쪽 패널(p16)에서 보여주고 염증 파라미터의 감소는 [도 8c] 중앙 패널(IL-8) 및 [도 8c] 오른쪽 패널(MMP-1)에서 보여주고, 추가로 레티노산의 효과와의 비교를 보여준다. [도 8d-8j]는 위성 세포에서 근육 재생을 보여준다. [도 8d]는 처리된 루시페라제+ 인간 MuSC의 TA 근육에 이식 11일 후 마우스로부터 측정된 생물 발광의 정량화된 결과를 보여준다. [도 8e]는 10-30세, 30-55세, 60-80세 코호트의 생물 발광을 보여준다. 다양한 연령 그룹의 건강한 공여자로부터 수득한 처리 MuSC와 미처리 MuSC 사이에서 생물 발광 비의 변화. 유의성은 스튜던트 t 검정으로, 처리 세포와 노화 세포 사이에서 쌍별로, 젊은 환자와 비교할 때 그룹별로 계산된다(연령 그룹. 10-30: n=5; 30-55: n=7; 60-80: n=5). P 값: *<0.05, **<0.01, ***<0.001 별표의 색상은 비교되고 있는 집단과 일치한다. [도 8f]는 노화 MuSC로 손상 및 이식된 노화된 근육의 강축력 측정을 보여준다. TA 근육을 절제하고 강축 측정을 위한 생체 외 전기 생리학을 수행하였다. 이식되지 않은 근육의 힘 생성 기준선은 젊은 마우스(4개월, 청색 점선) 및 노화 마우스(27개월, 적색 점선)에서 측정하였다. 처리 노화 MuSC를 노화 마우스의 TA 근육에 이식하고 30일 후 힘 생성을 측정하였다(n=5). [도 8g]는 이식 및 손상 후 상이한 시점에서 처리 세포, 노화 세포, 및 젊은 세포의 생물 발광의 정량화된 결과를 보여준다(n=10). [도 8h]는 노화 처리 및 노화 미처리 세포로 이식된 마우스의 TA 근육 단면에서 면역 형광 염색의 정량화를 보여준다(n=5). [도 8i]는 이식된 MuSC의 수여자인 TA 근육에서 공여자 유래 GFP+ 섬유의 단면적의 정량화를 보여주는 그래프이다(n=5). [도 8j]는 MuSC 이식 60일 후 재손상된(2차 손상) TA 근육의 생물 발광 영상화의 결과를 보여준다(n=6). 초기에 이식되고 기저판 아래에 생착된 루시페라제+/GFP+ MuSC를 활성화하고 확장한 결과로서 생물 발광 신호가 증가했는지 테스트하기 위해 2차 손상을 수행하였다.
[도 9a-9d]는 일시적으로 재프로그래밍된 세포로 각막 상피 세포의 형질감염을 보여준다. [도 9a]는 노화 세포 vs 처리 세포에서 p16의 발현에 의해 측정된 노화의 감소를 보여준다. [도 9b]는 노화 세포 vs 처리 세포에서 p21의 발현에 의해 측정된 노화의 감소를 보여준다. [도 9c]는 노화 세포 vs 처리 세포에서 염증 인자 IL8의 감소를 보여준다. [도 9d]는 PGC1α 발현에 의해 측정된 미토콘드리아 생합성의 증가를 보여준다.
[도 10]은 RNAseq 분석을 사용하여 처리 세포와 노화 세포 사이에서 세포 특이적 마커의 변화의 P 값을 보여주는 차트이다. 8개의 섬유아세포 및 50개의 내피 세포 마커 중 어느 것도 각각의 세포 유형에서 처리에 의한 유의한 변화를 보이지 않았으며, 이는 보유 세포 정체성을 시사한다.
[도 11]은 11개의 확립된 분석 패널을 사용하여 분석된 노화의 특징을 보여준다.
본원에 기술된 기술의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당 업계의 기술 내에서 의학, 세포 생물학, 약리학, 화학, 생화학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술, 및 면역학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[G. Vunjak-Novakovic and R. I. Freshney Culture of Cells for Tissue Engineering (Wiley-Liss, 1st edition, 2006); Arthritis Research: Methods and Protocols, Vols. 1 and 2: (Methods in Molecular Medicine, Cope ed., Humana Press, 2007); Cartilage and Osteoarthritis (Methods in Molecular Medicine, M. Sabatini P. Pastoureau, and F. De Ceuninck eds., Humana Press; 2004); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); 및 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001)]을 참조한다.
상기 또는 하기의 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 이로써 그 전체가 참고로 포함된다.
I. 정의
본 개시 내용을 설명함에 있어, 하기 용어를 사용할 것이며, 하기에 명시된 바와 같이 정의하고자 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an"및 "the"는 내용이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함함에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "세포"에 대한 언급은 둘 이상의 세포의 혼합물 등을 포함한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 예를 들어, "일 실시양태", "한 실시양태", "다른 실시양태", "구체적인 실시양태", "관련 실시양태", "특정 실시양태", "추가의 실시양태", 또는 "추가 실시양태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 실시양태와 관련하여 설명된 구체적인 특징, 구조, 또는 특성이 본 개시 내용의 적어도 하나의 실시양태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 여러 곳에서 상기 문구의 출현은 반드시 모두 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니다. 더욱이, 구체적인 특징, 구조, 또는 특성은 하나 이상의 실시양태에서 임의의 적절한 방식으로 결합될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 명시된 값을 포함하는 값의 범위를 의미하며, 당업자라면 명시된 값과 합리적으로 유사하다고 간주할 것이다. 실시양태에서, 용어 "약"은 당 업계에서 일반적으로 허용되는 측정값을 사용하는 표준 편차 이내를 의미한다. 실시양태에서, 약은 명시된 값의 +/- 10%로 확장되는 범위를 의미한다. 실시양태에서, 약은 명시된 값을 의미한다.
본 명세서 전체에서 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "포함하다", "포함하고" 및 "포함하는"이라는 단어는 언급된 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 군의 포함을 의미하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 군의 배제를 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다. "~로 이루어진"은 "~로 이루어진" 문구 뒤에 오는 모든 것을 포함하고 이에 제한되는 것을 의미한다. 따라서 "~로 이루어진"이라는 문구는 나열된 요소가 필요하거나 필수적이며, 다른 요소가 존재할 수 없음을 나타낸다. "~로 본질적으로 이루어진"은 문구 뒤에 나열된 임의의 요소를 포함하고, 나열된 요소에 대한 개시 내용에 명시된 활동 또는 행위를 방해하거나 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한됨을 의미한다. 따라서, "~로 본질적으로 이루어진"이라는 문구는 나열된 요소가 필요하거나 필수적인 요소이지만, 다른 요소는 선택 사항이 아니며 나열된 요소의 활동 또는 행위에 영향을 미치는 지의 여부에 따라 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "생체 적합성"은 수여자에게 일반적으로 무독성이고 대상체에게 어떠한 심각한 부작용도 일으키지 않는 물질 및 이의 임의의 대사 산물 또는 분해 산물을 일반적으로 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포"는 자연적으로 발생하거나 변형된 온전한 생존 세포를 지칭한다. 배양물에서, 또는 조직(부분적 또는 온전한), 또는 유기체 내에서 다른 세포와 혼합된 세포는 다른 세포로부터 단리될 수 있다. 본원에 기술된 방법은 예를 들어 단일 세포, 세포 집단, 또는 세포를 포함하는 조직 또는 기관을 포함하는 샘플에 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 메신저 RNA(mRNA)와 관련하여 용어 "비통합"은 염색체 내로 또는 염색체 외로 숙주 게놈으로 통합되거나 벡터로 통합되지 않는 mRNA 분자를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "형질감염"은 세포에 의한 외인성 DNA 또는 RNA의 흡수를 지칭한다. 세포는 외인성 DNA 또는 RNA가 세포막 내부에 도입되었을 때 "형질감염"된다. 다수의 형질감염 기술이 일반적으로 당 업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning, a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1995) Basic Methods in Molecular Biology, 2nd edition, McGraw-Hill, 및 Chu et al. (1981) Gene 13:197]을 참조한다. 이러한 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 또는 RNA 분자를 세포에 도입하는 데 사용될 수 있다. 이 용어는 DNA 또는 RNA 분자의 안정적 및 일시적 흡수를 모두 지칭한다. 예를 들어, 형질감염은 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 mRNA를 회춘이 필요한 세포로 일시적 흡수에 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "일시적 재프로그래밍"은 세포를 회춘시키기(즉, 노화의 모든 또는 일부 특징을 제거하기)에 충분하지만 줄기 세포로의 탈분화를 유발할 만큼 충분히 길지 않은 기간 동안 세포 재프로그래밍 인자에 세포의 노출을 지칭한다. 이러한 일시적 재프로그래밍은 그 정체성(즉, 분화된 세포 유형)을 유지하는 회춘한 세포를 생성한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "회춘한 세포(들)"는 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자로 처리되거나 일시적으로 재프로그래밍된 노화 세포를 지칭하며, 따라서 세포는 하나 이상의 세포 정체성 마커를 여전히 보유하면서, 더 젊은 세포의 트랜스크립톰 프로파일을 갖는다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "포유동물 세포"는 동일하거나 상이한 대상체에 이식하기에 적합한 포유동물 대상체로부터 유래한 임의의 세포를 지칭한다. 세포는 이종 발생성, 자가 유래, 또는 동종 이계일 수 있다. 세포는 포유동물 대상체로부터 직접 수득한 1차 세포일 수 있다. 세포는 또한 대상체로부터 수득한 세포의 배양 및 증식으로부터 유래한 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 재조합 단백질 및/또는 핵산을 발현하도록 유전적으로 조작되었다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "줄기 세포"는 유사분열 세포 분열을 통해 스스로 재생하는 능력을 보유하고 다양한 범위의 특화된 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포를 지칭한다. 포유동물 줄기 세포는 3가지 넓은 범주, 배반포에서 유래하는 배아 줄기 세포, 성체 조직에서 발견되는 성체 줄기 세포, 탯줄에서 발견되는 제대혈 줄기 세포로 나눌 수 있다. 발생 중인 배아에서, 줄기 세포는 모든 특화된 배아 조직으로 분화할 수 있다. 성인 유기체에서 줄기 세포와 전구 세포는 특화된 세포를 보충하여 신체의 복구 시스템 역할을 한다. 전능성 줄기 세포는 난자와 정자 세포의 융합으로 생산된다. 수정란의 처음 몇몇 분열에 의해 생성된 세포도 전능성이 있다. 이러한 세포는 배아 및 배외 세포 유형으로 분화할 수 있다. 만능 줄기 세포는 전능 세포의 후손이며 세 가지 배엽 중 하나로부터 유도된 세포로 분화할 수 있다. 다분화능 줄기 세포는 밀접하게 관련된 세포 계열의 세포만을 생산할 수 있다(예를 들어, 조혈 줄기 세포는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등으로 분화됨). 단일 분화능 세포는 하나의 세포 유형만을 생산할 수 있지만, 자가 재생 특성을 가지고 있어 비-줄기 세포와 구별된다. 유도 만능 줄기 세포는 배아와 같은 만능 상태로 재프로그래밍된 성인 세포에서 유래한 일종의 만능 줄기 세포이다. 유도 만능 줄기 세포는 예를 들어 피부 또는 혈액 세포와 같은 성체 체세포로부터 유도될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "트랜스크립톰 프로파일"은 하나의 세포 또는 세포 집단의 모든 RNA 분자 세트를 지칭한다. 이는 때로는 특정 실험에 따라 모든 RNA, 또는 단지 mRNA만을 지칭하는 데 사용된다. 이는 지정된 세포 집단에서 발견되는 RNA 분자만을 포함하고 일반적으로 분자 정체성 외에도 각 RNA 분자의 양 또는 농도를 포함한다는 점에서 엑솜과 다르다. 트랩스크립톰 프로파일을 얻는 방법에는 DNA 마이크로 어레이 및 RNA-Seq와 같은 차세대 시퀀싱 기술이 포함된다. 전사는 또한 단일 세포 전사체학에 의해 개별 세포 수준에서 연구될 수 있다. 트랜스크립톰 서열을 추론하는 두 가지 일반적인 방법이 있다. 한 가지 접근법은 서열 리드(read)를 유기체 자체(트랜스크립톰이 연구 중인) 또는 밀접하게 연관된 종의 참조 게놈에 맵핑한다. 다른 접근법인 드 노보 트랜스크립톰 어셈블리(de novo transcriptome assembly)는 소프트웨어를 사용하여 짧은 서열 리드로부터 직접 전사체를 추론한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "평균 제곱근 오차" 또는 "RMSE(Root Mean Square Error)"는 잔차(예측 오차)의 표준 편차를 지칭한다. 잔차는 회귀선 데이터 포인트에서 얼마나 멀리 떨어져 있는지의 척도이다. RMSE는 이러한 잔차가 얼마나 퍼져 있는지의 척도이다. 즉, 데이터가 최적 적합 선 주위에 얼마나 집중되어 있는지 알려준다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포 생존능"은 전체 세포 샘플을 기준으로 생존 또는 죽은 세포 수의 척도를 지칭한다. 본원에 정의된 바와 같이 높은 세포 생존능은 모든 세포의 85% 초과, 바람직하게는 90 내지 95% 초과가 생존하는 세포 집단, 더욱 바람직하게는 99% 초과의 생존 세포를 포함하는 높은 세포 생존능을 특징으로 하는 집단을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "자가소화포"는 이중층 막을 갖는 구형 구조를 지칭한다. 이는 세포질 내용물(예를 들어, 비정상적인 세포 내 단백질, 과잉 또는 손상된 세포 기관)과 또한 침입 미생물에 대한 세포 내 분해 시스템인 거대 자가 포식에 있어 핵심 구조이다. 형성 후, 자가소화포는 세포질 성분을 리소좀에 전달한다. 자가소화포의 외막은 리소좀과 융합되어 자가 리소좀을 형성한다. 리소좀의 가수 분해 효소는 자가소화포 전달 내용물과 그 내부 막을 분해한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "프로테아좀 활성"은 펩티드 결합을 파괴하는 화학 반응인 단백질 분해를 통해 단백질 복합체인 프로테아좀에 의한 불필요하거나 손상된 단백질의 분해를 지칭한다. 용어 "키모트립신 유사 프로테아좀 활성"은 프로테아좀의 특징적인 촉매 활성을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "미토콘드리아 막 전위"는 크렙스 회로의 활성과 관련된 산화 환원 변환으로부터 발생하는 전위 및 양성자 구배를 지칭하며 ATP를 만들기 위한 중간 형태의 에너지 저장 역할을 한다. 이는 양성자 펌프에 의해 생성되며 산화적 인산화 동안 에너지 저장의 필수 과정이다. 이는 기능장애 미토콘드리아의 선택적인 제거를 통해 미토콘드리아 항상성에 중요한 역할을 한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체"는 경우에 따라 본 개시 내용의 조성물에 포함될 수 있고 환자에게 심각한 유해 독성 효과를 유발하지 않는 부형제를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "반응성 산소 종" 또는 "ROS"는 산소를 함유하는 화학적 반응성 화학 종이다. 예는 과산화물, 초산화물, 히드록실 라디칼, 일중항 산소, 및 알파-산소를 포함한다. 생물학적 맥락에서, ROS는 정상적인 산소 대사의 자연적인 부산물로 형성되며 세포 신호전달 및 항상성에 중요한 역할을 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "노화 관련 분비 표현형" 또는 "SASP(senescence-associated secretory phenotype)"는 노화 세포의 특징적인 특징인 다수의 다양한 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 및 프로테아제를 지칭한다. 노화 세포는 여전히 대사 활성을 가지며 염증성 사이토카인, 케모카인, 세포 외 기질 리모델링 인자, 및 성장 인자와 같은 분비 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하여 광범위한 유전자의 상향 조절을 나타내는 안정적이고 분열하지 않는 세포이다. 이 분비된 단백질은 조직 미세 환경에서 생리학적으로 기능을 하여 스트레스 반응을 전파하고 이웃 세포와 소통할 수 있다. 노화 관련 분비 표현형(SASP)이라고 하는 이 표현형은 노화 세포의 주변 분비 기능을 밝혀내며, 정지 세포 및 최종적으로 분화된 세포와 같은 비노화 세포주기 정지 세포와 노화 세포를 구별하는 중요한 특징이다. "SASP 사이토카인"은 특히 노화 관련 분비 표현형을 생성하는, 노화 세포에 의해 생성된 사이토카인을 지칭한다. 사이토카인은 IL18, IL1A, GROA, IL22, 및 IL9를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "메틸화 랜드스케이프(methylation landscape)"는 세포 또는 세포 집단의 DNA 메틸화 패턴을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "후성 유전학적 시계(epigenetic clock)"는 연령을 측정하는 데 사용될 수 있는 생화학적 테스트를 지칭한다. 이 테스트는 DNA 메틸화 수준을 기반으로 한다. 최초의 다중 조직 후성 유전학적 시계, 호바스의 후성 유전학적 시계 또는 "호바스 시계"는 스티브 호바스(Steve Horvath)(Horvath 2013)에 의해 개발되었다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "세포 재프로그래밍 인자"는 성체 또는 분화된 세포를 만능 줄기 세포로 전환할 수 있는 일련의 전사 인자를 지칭한다. 본원의 실시양태에서, 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 포함한다.
"약학적으로 허용 가능한 염"은 아미노산 염, 무기산으로 제조된 염, 예컨대 염화물, 황산염, 인산염, 이인산염, 브롬화물, 및 질산염, 또는 상기의 임의의 상응하는 무기산 형태로부터 제조된 염, 예를 들어 염산염 등, 또는 유기산으로부터 제조된 염, 예컨대 말레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 숙시네이트, 에틸숙시네이트, 시트레이트, 아세테이트, 락테이트, 메탄설포네이트, 벤조에이트, 아스코르베이트, 파라-톨루엔설포네이트, 팔모에이트, 살리실레이트 및 스테아레이트, 뿐만 아니라 에스톨레이트, 글루셉테이트 및 락토비오네이트 염을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 유사하게, 약학적으로 허용 가능한 양이온을 함유하는 염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 리튬, 및 암모늄(치환된 암모늄 포함)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "이식"은 세포, 조직, 또는 기관을 다른 공급원으로부터 대상체에게 전달하는 것을 지칭한다. 이 용어는 특정 전달 방식에 제한되지는 않는다. 세포는 주사 또는 외과적 이식과 같은 임의의 적절한 방법으로 이식될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "관절염"은 골관절염, 류마티스성 관절염, 루푸스 관련 관절염, 청소년 특발성 관절염, 반응성 관절염, 장병성 관절염 및 건선성 관절염을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "노화 관련 질환 또는 병태"는 신경 변성 질환(예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증, 치매, 및 뇌졸중), 심혈관 및 말초 혈관 질환(예를 들어, 죽상 경화증, 말초 동맥 질환(PAD: peripheral arterial disease), 혈종, 석회화, 혈전증, 색전증, 및 동맥류), 안 질환(예를 들어, 노화 관련 황반 변성, 녹내장, 백내장, 안구 건조증, 당뇨병성 망막 병증, 시력 상실), 피부 질환(피부 위축 및 얇아짐, 탄력 섬유 용해 및 피부 주름, 피지선 과형성 또는 저형성, 노인성 흑점 및 기타 색소 침착 이상, 백발, 탈모 또는 가늘어짐, 및 만성 피부 궤양), 자가 면역 질환(예를 들어, 류마티스성 다발 근통(PMR: polymyalgia rheumatica), 거대 세포 동맥염(GCA: giant cell arteritis), 류마티스성 관절염(RA: rheumatoid arthritis), 결정 관절 병증, 및 척추 관절병증(SPA: spondyloarthropathy)),내분비 및 대사 기능장애(예를 들어, 성인 뇌하수체 기능 저하증, 갑상선 기능 저하증, 무감각 갑상선 중독증, 골다공증, 당뇨병, 부신 기능 부전, 다양한 형태의 성선 기능 저하증, 및 내분비 악성 종양), 근골격계 장애(예를 들어, 관절염, 골다공증, 골수종, 통풍, 파제트병, 골절, 골수 부전 증후군, 강직증, 미만성 특발성 골격 과골증, 혈행성 골수염, 근육 위축, 말초 신경 병증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증(ALS: amyotrophic lateral sclerosis), 뒤시엔 근이영양증, 원발성 측삭 경화증, 및 중증 근무력증), 소화기 질환(예를 들어, 간경변증, 간섬유증, 바렛 식도), 호흡기 질환(예를 들어, 폐 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환, 천식, 만성 기관지염, 폐색전증(PE: pulmonary embolism), 폐암, 및 감염), 및 노화와 관련된 임의의 기타 질환 또는 장애와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 노화와 관련된 임의의 병태, 질환, 또는 장애를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "연골 변성을 수반하는 질환 또는 장애"는 연골 및/또는 관절 변성을 수반하는 임의의 질환 또는 장애이다. 용어 "연골 변성을 수반하는 질환 또는 장애"는 인간을 포함한 동물의 척추 디스크 또는 관절(예를 들어, 관절(articular joint))에 영향을 미치는 병태, 장애, 증후군, 질환, 및 손상을 포함하고, 관절염, 연골병증, 척추관절증, 강직성 척추염, 홍반성 루푸스, 재발성 다발연골염, 및 쇼그렌 증후군을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. .
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "근육 변성 질환 또는 장애"는 근육 변성을 수반하는 임의의 질환 또는 장애이다. 이 용어는 근육 위축, 근육 사용 불능, 근육 파열, 화상, 수술, 말초 신경 병증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 뒤시엔 근이영양증, 원발성 측삭 경화증, 중증 근무력증, 암, AIDS, 울혈성 심부전, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD: chronic obstructive pulmonary disease), 간 질환, 신부전, 섭식 장애, 영양실조, 기아, 감염, 또는 글루코코르티코이드 치료와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 근육 조직에 영향을 미치는 병태, 장애, 증후군, 질환, 및 손상을 포함한다.
"치료 유효 용량 또는 양"은 조직 복구 또는 재생을 필요로 하는 대상체에서 양성 치료 반응을 야기하는 회춘한 세포 또는 비통합 메신저 RNA의 양, 예컨대 치료 부위에서 기능을 회복시키고/거나 새로운 조직의 생성을 초래하는 양으로 의도된다. 회춘한 세포는 본원에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내에서 형질감염에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 예를 들어, "양성 치료 반응"은 치료법과 관련된 노화 관련 질환 또는 병태의 개선, 및/또는 치료법과 관련된 노화 관련 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상 개선, 예컨대 조직 기능성 회복, 통증 감소, 체력 개선, 강도 증가, 운동성 증가, 및/또는 인지 기능 개선일 것이다. 정확한 필요량(세포 또는 mRNA의)은 대상체의 종, 연령, 및 일반적인 상태, 치료되는 병태의 중증도, 투여 방식 등에 따라 대상체마다 다를 것이다. 임의의 개별 사례에서 적절한 "유효" 양은 본원에 제공된 정보에 기초하여 일상적인 실험을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
예를 들어, 회춘한 연골 세포의 치료 유효 용량 또는 양은 본원에 기재된 바와 같이 투여될 때, 연골이 손상 또는 손실된 대상체에서 양성 치료 반응을 야기하는 양, 예컨대 치료 부위(예를 들어, 손상된 관절)에서 새로운 연골 생성을 초래하는 양으로 의도된다. 예를 들어, 치료 유효 용량 또는 양은 외상성 손상 또는 변성 질환, 예컨대 관절염 또는 연골 변성을 수반하는 기타 질환으로 인한 연골 손상 또는 손실을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 치료 유효량은 기능을 회복시키고/거나 연골 손상 또는 손실과 관련된 통증 및 염증을 완화시킨다.
또 다른 예에서, 회춘한 골격근 줄기 세포의 치료 유효 용량 또는 양은 본원에 기재된 바와 같이 투여될 때, 근육이 손상 또는 손실된 대상체에서 양성 치료 반응을 야기하는 양, 예컨대 치료 부위(예를 들어, 손상된 근육)에서 새로운 근섬유의 생성을 초래하는 양으로 의도된다. 예를 들어, 치료 유효 용량 또는 양은 외상성 손상 또는 근육 변성을 수반하는 질환 또는 장애로 인한 근육 손상 또는 손실을 치료하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 치료 유효량은 근력 및 근육 기능을 개선한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체", "개체", 및 "환자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 인간, 및 침팬지와 다른 유인원 및 원숭이 종과 같은 비인간 영장류를 포함하는 기타 영장류; 소, 양, 돼지, 염소 및 말과 같은 농장 동물; 개 및 고양이와 같은 애완 포유동물; 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터, 및 기니피그와 같은 설치류; 닭, 칠면조 및 기타 가금류 조류, 오리, 거위 등과 같은 가축, 야생 및 사냥감 조류를 포함하는 조류를 제한 없이 포함하는 임의의 척추동물 대상체를 지칭한다. 일부 경우에, 본 개시 내용의 방법은 실험동물, 수의학적 적용, 및 질환에 대한 동물 모델의 개발에서 용도를 모색한다. 이 용어는 특정 연령을 나타내지 않는다. 따라서 성인 및 신생아 개체 모두가 포함되는 것으로 의도된다.
I. 방법
본 개시 내용을 상세하게 설명하기 전에, 본 개시 내용이 특정 제제 또는 공정 파라미터에 제한되지 않고, 그에 따라 당연히 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 본 발명의 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 다수의 방법 및 재료가 본 개시 내용의 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에 기술된다.
본 개시 내용은 예를 들어, 미토콘드리아 기능, 단백질 분해 활성, 이질염색질 수준, 히스톤 메틸화, 핵 라미나 폴리펩티드, 사이토카인 분비, 또는 노화에 영향을 미치는 mRNA의 일시적 과발현에 의해 기능성을 회복시키기 위한 노화 세포 및 조직의 회춘 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명자들은 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 코딩하는 mRNA가 세포를 분화된 세포 상태로 유지하면서 섬유아세포, 내피 세포, 연골 세포, 및 골격근 줄기 세포를 포함하는 다양한 세포 유형을 회춘시키는 데 사용될 수 있음을 보였다.
본 개시 내용의 추가 이해를 위해, 이러한 회춘한 세포를 사용하는 mRNA 및 세포 기반 요법으로 일시적 재프로그래밍에 의한 세포의 회춘 방법에 관하여 아래에 더 상세한 논의가 제공된다.
a. 세포의 회춘
한 측면에서, 본원에서 세포의 회춘 방법으로서, 연속 5일 이하 동안 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 세포를 형질감염시켜, 회춘한 세포를 생성하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
실시양태에서, 회춘한 세포는 젊은 세포와 유사한 표현형 또는 활성 프로파일을 갖는다. 표현형 또는 활성 프로파일은 트랜스크립톰 프로파일, 하나 이상의 핵 및/또는 후성 유전학적 마커의 유전자 발현, 단백질 분해 활성, 미토콘드리아 건강 및 기능, SASP 사이토카인 발현, 및 메틸화 랜드스케이프 중 하나 이상을 포함한다.
실시양태에서, 회춘한 세포는 젊은 세포의 트랜스크립톰 프로파일과 더 유사한 트랜스크립톰 프로파일을 갖는다. 실시양태에서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 RPL37, RHOA, SRSF3, EPHB4, ARHGAP18, RPL31, FKBP2, MAP1LC3B2, Elf1, Phf8, Pol2s2, Taf1 및 Sin3a로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현의 증가를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 RPL37의 유전자 발현의 증가를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 RHOA의 유전자 발현의 증가를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 SRSF3의 유전자 발현의 증가를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 EPHB4의 유전자 발현의 증가를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 ARHGAP18의 유전자 발현의 증가를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 RPL31의 유전자 발현의 증가를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 FKBP2의 유전자 발현의 증가를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 MAP1LC3B2의 유전자 발현의 증가를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 Elf1의 유전자 발현의 증가를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 Phf8의 유전자 발현의 증가를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 Pol2s2의 유전자 발현의 증가를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 Taf1의 유전자 발현의 증가를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 Sin3a의 유전자 발현의 증가를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 RPL37, RHOA, SRSF3, EPHB4, ARHGAP18, RPL31, FKBP2, MAP1LC3B2, Elf1, Phf8, Pol2s2, Taf1 및 Sin3a의 유전자 발현의 증가를 포함한다.
실시양태에서, 회춘한 세포는 참조 값과 비교하여 하나 이상의 핵 및/또는 후성 유전학적 마커의 증가된 유전자 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 하나 이상의 핵 및/또는 후성 유전학적 마커는 HP1 감마, H3K9me3, 라미나 지지 단백질 LAP2알파, 및 SIRT1 단백질로부터 선택된다. 실시양태에서, 회춘한 세포는 HP1 감마의 증가된 유전자 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 세포는 H3K9me3의 증가된 유전자 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 세포는 라미나 지지 단백질 LAP2알파의 증가된 유전자 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 세포는 SIRT1 단백질의 증가된 유전자 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 세포는 HP1 감마, H3K9me3, 라미나 지지 단백질 LAP2알파, 및 SIRT1 단백질의 증가된 유전자 발현을 나타낸다.
실시양태에서, 회춘한 세포는 젊은 세포의 단백질 분해 활성과 더 유사한 단백질 분해 활성을 갖는다. 실시양태에서, 단백질 분해 활성은 증가된 세포 자가소화포 형성, 증가된 키모트립신 유사 프로테아좀 활성, 또는 이들의 조합으로 측정된다. 실시양태에서, 단백질 분해 활성은 증가된 세포 자가소화포 형성으로 측정된다. 실시양태에서, 단백질 분해 활성은 증가된 키모트립신 유사 프로테아좀 활성으로 측정된다. 실시양태에서, 단백질 분해 활성은 증가된 세포 자가소화포 형성 및 증가된 키모트립신 유사 프로테아좀 활성으로 측정된다.
실시양태에서, 회춘한 세포는 참조 값과 비교하여 개선된 미토콘드리아 건강 및 기능을 나타낸다. 실시양태에서, 개선된 미토콘드리아 건강 및 기능은 증가된 미토콘드리아 막 전위, 감소된 활성 산소 종(ROS), 또는 이들의 조합으로 측정된다. 실시양태에서, 개선된 미토콘드리아 건강 및 기능은 증가된 미토콘드리아 막 전위로서 측정된다. 실시양태에서, 개선된 미토콘드리아 건강 및 기능은 감소된 활성 산소 종(ROS)으로 측정된다. 실시양태에서, 개선된 미토콘드리아 건강 및 기능은 증가된 미토콘드리아 막 전위 및 감소된 활성 산소 종(ROS)으로 측정된다.
실시양태에서, 회춘한 세포는 참조 값과 비교하여 하나 이상의 SASP 사이토카인의 감소된 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 하나 이상의 SASP 사이토카인은 IL18, IL1A, GROA, IL22, 및 IL9를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 세포는 IL18의 감소된 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 세포는 IL1A의 감소된 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 세포는 GROA의 감소된 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 세포는 IL22의 감소된 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 세포는 IL9의 감소된 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 세포는 IL18, IL1A, GROA, IL22, 및 IL9의 감소된 발현을 나타낸다.
실시양태에서, 회춘한 세포는 메틸화 랜드스케이프의 역전을 나타낸다. 실시양태에서, 메틸화 랜드스케이프의 역전은 호바스 시계 추정에 의해 측정된다.
실시양태에서, 참조 값은 노화 세포로부터 얻는다.
실시양태에서, 세포는 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 mRNA로 일시적 재프로그래밍에 의해 회춘된다. 일시적 재프로그래밍은 2일 이상 5일 이하 동안 비통합 mRNA로 매일 1회 세포를 형질감염시킴으로써 수행된다. "비통합"이란 mRNA 분자가 염색체 내 또는 염색체 외로 숙주 게놈에 통합되지 않거나 벡터에 통합되지 않아 재프로그래밍이 일시적이고 회춘한 세포의 정체성을 파괴하지 않음(즉, 세포는 그의 성체 세포 유형으로 분화하는 능력을 유지함)을 의미한다. 실시양태에서, 세포의 일시적 재프로그래밍은 세포의 줄기 세포로의 완전한 탈분화를 방지하면서 노화의 다양한 특징을 제거한다.
실시양태에서, 메신저 RNA로 세포를 형질감염시키는 것은 리포펙타민 및 LT-1 매개 형질감염, 덱스트란 매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 일렉트로포레이션, mRNA의 리포솜 내 캡슐화, 및 직접 마이크로인젝션으로부터 선택되는 형질감염 방법에 의해 달성될 수 있다. 실시양태에서, 메신저 RNA로 세포를 형질감염시키는 단계는 리포펙타민 및 LT-1 매개 형질감염에 의해 달성될 수 있다. 실시양태에서, 메신저 RNA로 세포를 형질감염시키는 것은 덱스트란 매개 형질감염에 의해 달성될 수 있다. 실시양태에서, 메신저 RNA로 세포를 형질감염시키는 것은 인산칼슘 침전에 의해 달성될 수 있다. 실시양태에서, 메신저 RNA로 세포를 형질감염시키는 것은 폴리브렌 매개 형질감염에 의해 달성될 수 있다. 실시양태에서, 메신저 RNA로 세포를 형질감염시키는 것은 일렉트로포레이션에 의해 달성될 수 있다. 실시양태에서, 메신저 RNA로 세포를 형질감염시키는 것은 mRNA의 리포솜 내 캡슐화에 의해 달성될 수 있다. 실시양태에서, 메신저 RNA로 세포를 형질감염시키는 것은 직접 마이크로인젝션에 의해 달성될 수 있다.
세포 노화 역전, 또는 회춘은 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 mRNA의 일시적 과발현에 의해 달성된다. 이러한 세포 재프로그래밍 인자는 전사 인자, 후성 유전적 리모델러, 또는 미토콘드리아 기능, 단백질 분해 활성, 이질염색질 수준, 히스톤 메틸화, 핵 라미나 폴리펩티드, 사이토카인 분비, 또는 노화에 영향을 미치는 소분자를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG 중 하나 이상을 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로 이루어진된다.
실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 회춘이 필요한 임의의 유형의 세포에 적용될 수 있다. 배양물에서, 또는 조직(부분적 또는 온전한), 또는 살아있는 유기체 내 다른 세포와 혼합된 세포는 다른 세포로부터 단리될 수 있다. 본원에 기술된 방법은 예를 들어 단일 세포, 세포 집단, 또는 세포를 포함하는 조직 또는 기관을 포함하는 샘플에 수행될 수 있다. 회춘을 위해 선택되는 세포는 노화 관련 질환 또는 병태를 치료하기 위해 원하는 치료 효과에 따라 결정될 것이다.
실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 실시양태에서, 세포는 노령 대상체로부터 유래한다.
실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 신경계, 근육계, 호흡계, 심혈관계, 골격계, 생식계, 외피계, 림프계, 배설계, 내분비계(예를 들어, 내분비 및 외분비) 또는 소화계의 세포, 조직, 또는 기관에 수행될 수 있다. 상피 세포(예를 들어, 편평, 입방체, 원주상, 및 다열 상피 세포), 내피 세포(예를 들어, 정맥, 동맥, 및 림프관 내피 세포), 및 결합 조직, 근육 및 신경계의 세포를 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 임의의 유형의 세포가 본원에 기술된 바와 같이 잠재적으로 회춘될 수 있다. 이러한 세포는 표피 세포, 섬유아세포, 연골 세포, 골격근 세포, 위성 세포, 심장 근육 세포, 평활근 세포, 각질 세포, 기저 세포, 애나멜 아세포, 외분비 분비 세포, 근상피 세포, 골아 세포, 파골 세포, 뉴런(예를 들어, 감각 뉴런, 운동 뉴런, 및 인터뉴런), 신경교 세포(예를 들어, 희돌기 교세포, 성상 세포, 상의 세포, 미세 아교 세포, 슈반 세포, 및 위성 세포), 주상 세포, 지방 세포, 주변 세포, 별세포, 폐포세포, 혈액 및 면역계 세포(예를 들어, 적혈구, 단핵구, 수지상 세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 비만 세포, T 세포, B 세포, 자연 살해 세포), 호르몬 분비 세포, 생식 세포, 간질 세포, 수정체 세포, 광 수용체 세포, 미각 수용체 세포, 및 후각 세포; 뿐만 아니라 신장, 간, 췌장, 위, 비장, 담낭, 장, 방광, 폐, 전립선, 유방, 비뇨 생식기, 뇌하수체 세포, 구강, 식도, 피부, 모발, 손발톱, 갑상선, 부갑상선, 부신, 눈, 코, 또는 뇌의 세포 및/또는 조직을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 세포는 섬유아세포, 내피 세포, 연골 세포, 골격근 줄기 세포, 각질 세포, 중간엽 줄기 세포 및 각막 상피 세포로부터 선택된다. 실시양태에서, 세포는 섬유아세포이다. 실시양태에서, 세포는 내피 세포이다. 실시양태에서, 세포는 연골 세포이다. 실시양태에서, 세포는 골격근 줄기 세포이다. 실시양태에서, 세포는 각질 세포이다. 실시양태에서, 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 실시양태에서, 세포는 각막 상피 세포이다.
실시양태에서, 회춘한 섬유아세포는 젊은 섬유아세포의 트랜스크립톰 프로파일과 유사한 트랜스크립톰 프로파일을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 섬유아세포는 전술한 바와 같이 참조 값과 비교하여 하나 이상의 핵 및/또는 후성 유전학적 마커의 증가된 유전자 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 섬유아세포는 전술한 바와 같이 젊은 세포의 단백질 분해 활성과 더 유사한 단백질 분해 활성을 갖는다. 실시양태에서, 회춘한 섬유아세포는 전술한 바와 같이 참조 값과 비교하여 개선된 미토콘드리아 건강 및 기능을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 섬유아세포는 메틸화 랜드스케이프의 역전을 나타낸다.
실시양태에서, 회춘한 내피 세포는 젊은 내피 세포의 트랜스크립톰 프로파일과 유사한 트랜스크립톰 프로파일을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 내피 세포는 전술한 바와 같이 참조 값과 비교하여 하나 이상의 핵 및/또는 후성 유전학적 마커의 증가된 유전자 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 내피 세포는 전술한 바와 같이 젊은 세포의 단백질 분해 활성과 더 유사한 단백질 분해 활성을 갖는다. 실시양태에서, 회춘한 내피 세포는 전술한 바와 같이 참조 값과 비교하여 개선된 미토콘드리아 건강 및 기능을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 내피 세포는 메틸화 랜드스케이프의 역전을 나타낸다.
실시양태에서, 회춘한 연골 세포는 염증 인자의 감소된 발현 및/또는 증가된 ATP 및 콜라겐 대사를 나타낸다. 실시양태에서, 염증 인자는 RANKL, iNOS2, IL6, IFNα, MCP3 및 MIP1A를 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 연골 세포는 RANKL의 감소된 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 연골 세포는 iNOS2의 감소된 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 연골 세포는 IL6의 감소된 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 연골 세포는 IFNα의 감소된 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 연골 세포는 MCP3의 감소된 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 연골 세포는 MIP1A의 감소된 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 연골 세포는 RANKL, iNOS2, IL6, IFNα, MCP3 및 MIP1A의 감소된 발현을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 연골 세포는 증가된 ATP 및 콜라겐 대사를 나타낸다. 실시양태에서, ATP 및 콜라겐 대사는 증가된 ATP 수준, 감소된 ROS 및 증가된 SOD2 발현, 증가된 COL2A1 발현 및 연골 세포에 의한 전반적 증식 중 하나 이상에 의해 측정된다. 실시양태에서, ATP 및 콜라겐 대사는 증가된 ATP 수준에 의해 측정된다. 실시양태에서, ATP 및 콜라겐 대사는 감소된 ROS 및 증가된 SOD2 발현에 의해 측정된다. 실시양태에서, ATP 및 콜라겐 대사는 증가된 COL2A1 발현 및 연골 세포에 의한 전반적 증식에 의해 측정된다.
실시양태에서, 회춘한 골격근 줄기 세포는 더 높은 증식 능력, 근아세포 및 근육 섬유로 분화하는 향상된 능력, 정지로부터 활성화의 회복된 더 낮은 동역학, 근육 마이크로니치를 회춘시키는 능력, 근육의 젊은 힘 회복, 또는 이들의 조합을 나타낸다.
실시양태에서, 회춘한 각질 세포는 더 높은 증식 능력, 감소된 염증 표현형, 더 낮은 RNAKL 및 INOS2 발현, 감소된 사이토카인 MIP1A, IL6, IFNa, MCP3 발현, 증가된 ATP, 증가된 수준의 SOD2 및 COL2A1 발현을 나타낸다.
실시양태에서, 회춘한 중간엽 줄기 세포는 노화 파라미터의 감소, 증가된 세포 증식. 및/또는 ROS 수준의 감소를 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 중간엽 줄기 세포는 노화 파라미터의 감소를 나타낸다. 실시양태에서, 노화 파라미터는 p16 발현, p21 발현 및 양성 SAβGal 염색을 포함한다. 실시양태에서, 회춘한 중간엽 줄기 세포는 증가된 세포 증식을 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 중간엽 줄기 세포는 ROS 수준의 감소를 나타낸다. 실시양태에서, 회춘한 중간엽 줄기 세포는 노화 파라미터의 감소, 증가된 세포 증식, 및 ROS 수준의 감소를 나타낸다.
실시양태에서, 회춘한 각막 상피 세포는 노화 파라미터의 감소를 나타낸다. 실시양태에서, 노화 파라미터는 p21의 발현, p16의 발현, 미토콘드리아 생합성 PGC1α, 및 염증 인자 IL8의 발현 중 하나 이상을 포함한다. 실시양태에서, 노화 파라미터는 p21을 포함한다. 실시양태에서, 노화 파라미터는 p16의 발현을 포함한다. 실시양태에서, 노화 파라미터는 미토콘드리아 생합성 PGC1α를 포함한다. 실시양태에서, 노화 파라미터는 염증 인자 IL8의 발현을 포함한다. 실시양태에서, 노화 파라미터는 p21의 발현, p16의 발현, 미토콘드리아 생합성 PGC1α, 및 염증 인자 IL8의 발현 중 하나를 포함한다.
본 개시 내용의 방법은 세포 요법에 사용하기 위한 기능 및 효능을 개선하기 위해 배양물(예를 들어, 생체 외 또는 시험관 내)에서 세포를 회춘시키는 데 사용될 수 있다. 환자 치료에 사용되는 세포는 자가 유래 또는 동종 이계일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 환자 또는 일치된 공여자로부터 유래한다. 예를 들어, 생체 외 요법에서, 세포는 치료될 환자로부터 직접 수득되고, 본원에 기재된 바와 같이 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 mRNA로 형질감염되고 환자에게 재이식된다. 이러한 세포는 예를 들어 환자에 대해 수행된 생검 또는 수술 절차에서 얻을 수 있다. 대안적으로, 회춘이 필요한 세포는 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 mRNA로 생체 내에서 직접 형질감염될 수 있다.
형질감염은 회춘을 필요로 하는 세포 내로 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 mRNA의 일시적 흡수(즉, 일시적 재프로그래밍)를 제공하는 당 업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 실시양태에서, 대상체의 세포 내로 mRNA의 생체 외, 시험관 내, 또는 생체 내 전달 방법은 리포펙타민 및 LT-1 매개 형질감염, 덱스트란 매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 일렉트로포레이션, mRNA의 리포솜 내 캡슐화, mRNA의 세포로의 직접적인 마이크로인젝션, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 방법을 포함할 수 있다.
b. 조성물
한 측면에서, 본원에서 연속 5일 이하 동안 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 세포를 형질감염시킴으로써 수득한 회춘한 세포를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
실시양태에서, 회춘한 세포는 자가 유래이다. 실시양태에서, 회춘한 세포는 동종 이계이다.
실시양태에서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로부터 선택된다. 실시양태에서, 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG이다.
실시양태에서, 회춘한 세포는 HP1 감마, H3K9me3, LAP2알파, SIRT1의 증가된 발현, 증가된 미토콘드리아 막 전위 및 감소된 반응성 산소 종, 및 SASP 사이토카인의 감소된 발현 중 하나 이상을 나타낸다. 실시양태에서, SASP 사이토카인은 IL18, IL1A, GROA, IL22, 및 IL9 중 하나 이상을 포함한다.
특정 실시양태에서, 세포 요법에 사용하기 위한 회춘한 세포를 포함하는 조성물은 세포 기능 또는 생존능을 개선하기 위해서 하나 이상의 추가 인자, 예컨대 영양분, 사이토카인, 성장 인자, 세포 외 기질(ECM: extracelluar matrix) 성분, 항생제, 항산화제, 또는 면역 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
성장 인자의 예는 섬유아세포 성장 인자(FGF: fibroblast growth factor), 인슐린 유사 성장 인자(IGF: insulin-like growth factor), 형질 전환 성장 인자 베타(TGF-β: transforming growth factor beta), 에피레귤린, 표피 성장 인자("EGF(epidermal growth factor)"), 내피 세포 성장 인자("ECGF(endothelial cell growth factor)"), 신경 성장 인자("NGF(nerve growth factor)"), 백혈병 억제 인자("LIF(leukemia inhibitory factor)"), 골 형태 형성 단백질-4("BMP-4(bone morphogenetic protein-4)"), 간세포 성장 인자("HGF(hepatocyte growth factor)"), 혈관 내피 성장 인자-A("VEGF-A(vascular endothelial growth factor-A)"), 및 콜레시스토키닌 옥타펩티드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
ECM 성분의 예는 프로테오글리칸(예를 들어, 콘드로이틴 설페이트, 헤파란 설페이트, 및 케라탄 설페이트), 비-프로테오글리칸 다당류(예를 들어, 히알루론산), 섬유(예를 들어, 콜라겐 및 엘라스틴), 및 기타 ECM 성분(예를 들어, 피브로넥틴 및 라미닌)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
면역 억제제의 예는 스테로이드성(예를 들어, 프레드니손) 또는 비스테로이드성(예를 들어, 시롤리무스(Rapamune, Wyeth-Ayerst 캐나다 소재), 타크롤리무스(Prograf, Fujisawa 캐나다 소재), 및 항-IL2R 다클리주맙(Zenapax, Roche 캐나다 소재)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 기타 면역 억제제는 15-데옥시스페르구알린, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 라파마이신, 라파문(시롤리무스/라파마이신), FK506, 또는 리소필린(LSF)을 포함한다.
하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제가 또한 포함될 수 있다. 예는 탄수화물, 무기염, 항균제, 항산화제, 계면 활성제, 완충제, 산, 염기, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 미생물 성장을 방지 또는 억제하기 위한 항균제가 포함될 수 있다. 본 개시 내용에 적합한 항균제의 비제한적인 예는 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 질산 페닐수은, 티머솔, 및 이들의 조합을 포함한다. 항균제는 또한 박테리아 감염을 예방하는 데 사용할 수 있는 항생제를 포함한다. 항생제의 예로는 아목시실린, 페니실린, 설파 약물, 세팔로스포린, 에리트로마이신, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 테트라사이클린, 클라리트로마이신, 시프로플로자신, 아지트로마이신 등이 포함된다. 또한 마이코나졸 및 테르코나졸과 같은 항진균제도 포함된다.
다양한 항산화제, 예컨대 환원된 글루타티온(GSH) 또는 이의 전구체, 글루타티온 또는 글루타티온 유사체, 글루타티온 모노에스테르, 및 N-아세틸시스테인과 같이 티올기를 갖는 분자가 또한 포함될 수 있다. 다른 적합한 항산화제는 수퍼옥시드 디스뮤타제, 카탈라제, 비타민 E, 트롤록스, 리포산, 라자로이드, 부틸화 히드록시아니솔(BHA), 비타민 K 등을 포함한다.
주사 가능한 조성물에 적합한 부형제는 물, 알코올, 폴리올, 글리세린, 식물성 오일, 인지질, 및 계면 활성제를 포함한다. 당과 같은 탄수화물, 알디톨과 같은 유도체화된 당, 알돈산, 에스테르화 당, 및/또는 당 중합체가 부형제로서 존재할 수 있다. 구체적인 탄수화물 부형제는 예를 들어 다음을 포함한다: 단당류, 예컨대 프룩토오스, 말토오스, 갈락토오스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 이당류, 예컨대 락토스, 수크로오스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 다당류, 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 소르비톨(글루시톨), 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨 등. 부형제는 또한 무기염 또는 완충제, 예컨대 시트르산, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 질산칼륨, 제일인산나트륨, 제이인산나트륨, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
산 또는 염기도 부형제로서 존재할 수 있다. 사용될 수 있는 산의 비제한적인 예는 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산을 포함한다. 적합한 염기의 예에는 수산화나트륨, 아세트산나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 아세트산암모늄, 아세트산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨, 포름산나트륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 푸마르산칼륨, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기가 제한 없이 포함된다.
전형적으로, 임의의 개별 부형제의 최적 양은 일상적인 실험을 통해, 즉 다양한 양의 부형제(저에서 고까지의 범위)를 함유하는 조성물을 제조하고, 안정성 및 기타 파라미터를 조사한 다음, 심각한 부작용 없이 최적의 성능을 얻는 범위를 결정함으로써 결정된다. 그러나 일반적으로 부형제(들)는 약 1 중량% 내지 약 99 중량%, 바람직하게는 약 5 중량% 내지 약 98 중량%, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 약 95 중량%의 부형제의 양으로 조성물에 존재할 것이며, 30 중량% 미만의 농도가 가장 바람직하다. 다른 부형제와 함께 전술한 약학 부형제는 문헌["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), 및 Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000]에 기술되어 있다.
c. 투여
본 개시 내용의 방법은 노화 관련 질환 또는 병태에 대한 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 재프로그래밍 인자를 코딩하는 비통합 mRNA로 형질감염(예를 들어, 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내)에 의한 세포의 일시적 재프로그래밍을 포함하는 세포 요법은 신경 변성 질환(예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증, 치매, 및 뇌졸중), 심혈관 및 말초 혈관 질환(예를 들어, 죽상 경화증, 말초 동맥 질환(PAD), 혈종, 석회화, 혈전증, 색전증, 및 동맥류), 안 질환(예를 들어, 노화 관련 황반 변성, 녹내장, 백내장, 안구 건조증, 당뇨병성 망막 병증, 시력 상실), 피부 질환(피부 위축 및 얇아짐, 탄력 섬유 용해 및 피부 주름, 피지선 과형성 또는 저형성, 노인성 흑점 및 기타 색소 침착 이상, 백발, 탈모 또는 가늘어짐, 및 만성 피부 궤양), 자가 면역 질환(예를 들어, 류마티스성 다발 근통(PMR), 거대 세포 동맥염(GCA), 류마티스성 관절염(RA), 결정 관절 병증, 및 척추 관절병증(SPA)), 내분비 및 대사 기능장애(예를 들어, 성인 뇌하수체 기능 저하증, 갑상선 기능 저하증, 무감각 갑상선 중독증, 골다공증, 당뇨병, 부신 기능 부전, 다양한 형태의 성선 기능 저하증, 및 내분비 악성 종양), 근골격계 장애(예를 들어, 관절염, 골다공증, 골수종, 통풍, 파제트병, 골절, 골수 부전 증후군, 강직증, 미만성 특발성 골격 과골증, 혈행성 골수염, 근육 위축, 말초 신경 병증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 뒤시엔 근이영양증, 원발성 측삭 경화증 및 중증 근무력증), 소화기 질환(예를 들어, 간경변증, 간섬유증, 바렛 식도), 호흡기 질환(예를 들어, 폐 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환, 천식, 만성 기관지염, 폐색전증(PE), 폐암, 및 감염), 및 노화와 관련된 임의의 기타 질환 또는 장애와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 다양한 노화 관련 질환 및 병태에 대한 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본원에서 노화 관련 질환 또는 병태, 연골 변성 장애, 신경 변성 장애, 및/또는 근골격계 기능장애에 대해 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA를 포함하는 치료 유효량의 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 형질감염에 의한 하나 이상의 치료적 유효 주기의 치료가 노화 관련 질환 또는 병태의 치료를 위해 대상체에게 투여될 수 있다.
실시양태에서, 노화 관련 질환 또는 병태는 눈, 피부, 또는 근골격계 기능장애로부터 선택된다.
실시양태에서, 대상체는 연골 변성 장애를 갖는다. 실시양태에서, 장애는 관절염, 연골병증, 척추관절증, 강직성 척추염, 홍반성 루푸스, 재발성 다발연골염, 및 쇼그렌 증후군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 장애는 관절염이다. 실시양태에서, 장애는 연골병증이다. 실시양태에서, 장애는 척추관절증이다. 실시양태에서, 장애는 강직성 척추염이다. 실시양태에서, 장애는 홍반성 루푸스이다. 실시양태에서, 장애는 재발성 다발연골염이다. 실시양태에서, 장애는 쇼그렌 증후군이다.
실시양태에서, 치료는 하나 이상의 염증 인자의 발현을 감소시키고/거나 ATP 및 콜라겐 대사를 증가시킨다. 실시양태에서, 염증 인자는 RANKL, iNOS2, IL6, IFNα, MCP3 및 MIP1A로부터 선택된다. 실시양태에서, ATP 및 콜라겐 대사는 증가된 ATP 수준, 감소된 ROS 및 증가된 SOD2, 증가된 COL2A1 및 연골 세포에 의한 전반적 증식 중 하나 이상에 의해 측정된다.
실시양태에서, 세포 배양물에서 생체 외 또는 시험관 내 형질감염에 의해 회춘한 세포, 회춘한 세포를 이식하기 위한 조성물로 대상체를 치료는 반드시는 아니지만, 전형적으로, 조직 재생 또는 복구가 필요한 영역에 주사 또는 외과적 이식에 의해 투여된다.
실시양태에서, 치료 유효량의 회춘한 세포는 섬유아세포, 내피 세포, 연골 세포, 골격근 줄기 세포, 각질 세포, 중간엽 줄기 세포 및 각막 상피 세포로부터 선택된다. 실시양태에서, 치료 유효량의 회춘한 세포는 섬유아세포이다. 실시양태에서, 치료 유효량의 회춘한 세포는 내피 세포이다. 실시양태에서, 치료 유효량의 회춘한 세포는 연골 세포이다. 실시양태에서, 치료 유효량의 회춘한 세포는 골격근 줄기 세포이다. 실시양태에서, 치료 유효량의 회춘한 세포는 각질 세포이다. 실시양태에서, 치료 유효량의 회춘한 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 실시양태에서, 치료 유효량의 회춘한 세포는 각막 상피 세포이다.
실시양태에서, 회춘한 각막 상피는 노화 파라미터의 감소를 나타낸다. 실시양태에서, 노화 파라미터는 p21 및 p16의 발현, 미토콘드리아 생합성 PGC1α, 및 염증 인자 IL8의 발현 중 하나 이상을 포함한다.
일 실시양태에서, 연골 손상 또는 손실 영역의 연골 세포는 치료 부위에서 연골 세포의 회춘 및 새로운 연골의 생성을 초래하기에 충분한 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 유효량의 비통합 메신저 RNA로 생체 내에서 형질감염된다. 대안적으로, 생체 외 또는 시험관 내 형질감염에 의해 생성된 회춘한 연골 세포는 대상체의 손상된 관절 또는 다른 적합한 치료 부위와 같은 연골 손상 또는 손실 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 회춘한 연골 세포의 치료 유효 용량 또는 양은 연골이 손상 또는 손실된 대상체에서 양성 치료 반응을 유발하는 양, 예컨대 치료 부위(예를 들어, 손상된 관절)에서 새로운 연골 생성을 초래하는 양으로 의도된다. 예를 들어, 치료 유효 용량 또는 양은 외상성 손상 또는 변성 질환, 예컨대 관절염 또는 연골 변성을 수반하는 기타 질환으로 인한 연골 손상 또는 손실을 치료하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 치료 유효량은 기능을 회복시키고/거나 연골 손상 또는 손실과 관련된 통증 및 염증을 완화시킨다.
또 다른 실시양태에서, 골격근 줄기 세포는 치료 부위(예를 들어, 손상된 근육)에서 골격근 줄기 세포의 회춘(즉, 효능 회복) 및 새로운 근섬유 생성을 초래하기에 충분한 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 유효량의 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 생체 내에서 형질감염된다. 대안적으로, 생체 외 또는 시험관 내 형질감염에 의해 생성된 회춘한 골격근 줄기 세포는 복구 또는 재생이 필요한 손상된 근육에 국소적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료 유효 용량 또는 양은 외상성 손상, 근육 위축, 또는 근육 변성을 수반하는 질환 또는 장애로 인한 근육 손상 또는 손실을 치료하는 데 사용될 수 있다. 회춘한 골격근 줄기 세포의 치료 유효 용량 또는 양은 근육이 손상되거나 손실된 대상체에서 양성 치료 반응을 일으키는 양, 예컨대 치료 부위(예를 들어, 손상된 근육)에서 새로운 근섬유의 생성을 초래하는 양으로 의도된다. 바람직하게는, 치료 유효량은 근력 및 근육 기능을 개선하고/거나, 통증을 완화하고/거나, 체력을 개선하고/거나 운동성을 증가시킨다.
한 측면에서, 상기 본원에 기재된 바와 같이 노화 관련 질환 또는 병태, 연골 변성 장애, 및/또는 근골격계 기능장애에 대해 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 본원에 상기 기재된 바와 같이 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 치료 유효량의 하나 이상의 비통합 메신저 RNA를 투여하는 단계를 포함한다.
실시양태에서, 대상체의 세포는 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 유효량의 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 생체 내에서 형질감염에 의해 회춘될 수 있다.
한 측면에서, 조작된 조직을 생체 외에서 회춘시키는 방법이 본원에 제공된다. 방법은 연속 5일 이하 동안 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 조직을 형질감염시켜, 회춘한 조작된 조직을 생성하는 단계를 포함한다.
실시양태에서, 조작된 조직은 노화 파라미터, 염증 유발성 인자의 감소, 조직학적 점수의 개선, 또는 이들의 조합을 나타낸다. 실시양태에서, 조작된 조직은 하나 이상의 노화 파라미터의 감소를 나타낸다. 실시양태에서, 노화 파라미터는 p16 발현, 양성 SaβGal 염색, 및 염증 유발성 인자 IL8 및 MMP1 발현으로부터 선택된다. 실시양태에서, 조작된 조직은 p16 발현의 감소를 나타낸다. 실시양태에서, 조작된 조직은 양성 SaβGal 염색의 감소를 나타낸다. 실시양태에서, 조작된 조직은 염증 유발성 인자 IL8 및 MMP1 발현의 감소를 나타낸다. 실시양태에서, 조작된 조직은 조직학적 점수의 개선을 나타낸다. 실시양태에서, 조직학적 점수는 모폴로지, 조직, 및/또는 퀄리티를 포함한다.
실시양태에서, 조작된 조직은 조작된 피부 조직 및 오가노이드다.
d. 키트
본 개시 내용은 또한 세포의 일시적 재프로그래밍을 위한 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA를 포함하는 조성물을 보유하는 하나 이상의 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 형질감염제, 세포 배양용 배지, 및 경우에 따라 성장 인자, ECM 성분, 항생제 등과 같은 하나 이상의 다른 인자를 추가로 포함할 수 있다. 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 mRNA 및/또는 다른 조성물은 액체 형태이거나 동결 건조될 수 있다. 이러한 키트는 또한 mRNA 분해로부터 보호하는, mRNA를 보존하거나 유지하는 구성 요소를 포함할 수 있다. 이러한 구성 요소는 RNAse가 없거나 RNAse로부터 보호할 수 있다. 조성물에 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱을 포함한 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥 내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있은 마개가 있는 바이알일 수 있음).
키트는 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 또는 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로 허용 가능한 완충액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 완충액과 같은 다른 약학적으로 허용 가능한 제제화 용액, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기 또는 기타 전달 장치를 포함하여 최종 사용자에게 유용한 기타 재료를 포함할 수 있다. 전달 장치는 조성물로 미리 채워질 수 있다.
키트는 또한 노화 관련 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 대한 서면 지침을 포함하는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 패키지 삽입물은 승인되지 않은 초안 패키지 삽입물이거나 미국 식품 의약국(FDA: Food and Drug Administration) 또는 기타 규제 기관에서 승인받은 패키지 삽입물일 수 있다.
특정 실시양태에서, 키트는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 mRNA를 포함한다. 일 실시양태에서, 키트는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 mRNA를 포함한다.
II. 실험
다음은 본 개시 내용을 수행하기 위한 특정 실시양태의 실시예이다. 실시예는 예시 목적으로만 제공되며, 어떤 방식으로든 본 개시 내용의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만, 물론 약간의 실험적 오류 및 편차가 허용되어야 한다.
본원에 기술된 실시예 및 실시양태는 단지 예시를 위한 것이며, 그에 비추어 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며 본 출원의 취지 및 범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되어야 함을 이해해야 한다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허,및 특허 출원은 이로써 그 전체가 모든 목적을 위해 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1: 일시적이고 비통합적인 세포 재프로그래밍은 노화의 다면적 역전을 촉진한다
본원에 기술된 실험은 세포 정체성이 비가역적으로 상실되기 전에 중지되는 일시적 재프로그래밍 프로토콜에 의해 달성될 수 있는 노화 역전 효과의 정도를 설명한다. 최근 증거는 또한 부분적인 트랜스제닉 재프로그래밍이 노화 관련 특징을 개선하고 조로증 마우스의 수명을 연장할 수 있다는 것을 보였다. 그러나 이러한 형태의 '후성 유전적 회춘'이 어떻게 자연 노화에 광범위하게 적용될지와 중요하게는 어떻게 인간 세포로 안전하게 변환될 수 있는지는 알려지지 않았다. 본원의 데이터는 mRNA 기술을 기반으로 한 일시적 재프로그래밍이 생리학적 노화의 특징을 역전시키고, 노화 관련 질환 표현형을 감소시키며, 인간 임상 샘플에서 수득한 체세포 및 줄기 세포에서 노화에 따라 감소된 재생 반응을 회복시킨다는 것을 보여준다. 본원에 기술된 일시적 세포 재프로그래밍의 비통합적 방법은 재생 의학을 목표로 하는 생체 외 세포 회춘 치료, 및 자연 노화의 생리학적 붕괴 및 노화 관련 질환의 병인을 지연 또는 역전시키기 위한 생체 내 조직 회춘 요법을 위한 새롭고, 보다 변형 가능한 전략의 길을 열어 준다.
세포 연령의 실질적이고 측정 가능한 재프로그래밍이 돌아올 수 없는 시점 이전에 달성될 수 있는 지와, 이것이 세포 기능 및 생리학의 어떤 개선을 초래할 수 있는지를 테스트하기 위해, 일시적 재프로그래밍이 그 외 건강한 인간 대상체로부터의 2가지 특징적인 세포 유형인 섬유아세포 및 내피 세포의 노화된 생리학에 미치는 영향을 평가하였고, 젊은 공여자로부터 채취한 동일한 세포 유형과 비교하였다. 섬유아세포는 다진 팔과 복부 피부 생검(젊은 대조군의 경우 25-35세, n=3, 노화 그룹의 경우 60-70세, n=3)으로부터 유래하였던 반면, 내피 세포는 장골 정맥 및 동맥(젊은 대조군의 경우 15-25세, n=3, 노화 그룹의 경우 45-50세, n=3)의 콜라게나제 분해물로부터 추출하였다.
비통합 재프로그래밍 프로토콜을 사용하였다. 프로토콜은 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG(OSKMLN)를 발현하는 mRNA의 칵테일을 기반으로 최적화하였다. 다중 재프로그래밍 기간을 조사하였고, 두 세포 유형 모두 R2X2(2회의 재프로그래밍 형질감염과 2일의 휴식으로 기저 상태로 돌아감) 만큼 일찍이 많은 노화 파라미터에서 급격한 변화를 보였지만, 가장 두드러진 효과는 R4X2에서 발생하였다(도 1a 및 2a). 프로토콜은 12 내지 15회의 매일 형질감염 후, 공여자의 연령에 관계없이 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 콜로니를 지속적으로 생성한다; 본 발명자들은 내인성 만능성 관련 lncRNA의 첫 번째 검출 가능한 발현이 제5일에 발생한다는 관찰에 근거하여 본 발명의 플랫폼의 PNR이 재프로그래밍의 대략 제5일에 발생한다고 추론하였다. 따라서 OSKMLN이 매일 연속 4일 동안 매일 형질감염되는 일시적 재프로그래밍 프로토콜을 채택하고, 중단 2일 후 유전자 발현 분석을 수행하였다.
젊은(Y), 미처리 노화(UA) 및 처리 노화(TA)의 동일한 세 코호트에 대해 두 세포 유형 모두에 페어드-엔드 벌크 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 먼저, 각 세포 유형에 대한 젊은 세포와 미처리 노화 세포("Y vs UA")의 분위수 정규화된 트랜스크립톰을 비교하였다. 데이터는 섬유아세포에서 961개 유전자(5.85%)(상향 조절된 678개, 하향 조절된 289개) 및 내피 세포에서 748개 유전자(4.80%)(상향 조절된 389개, 하향 조절된 377개)가 p < 0.05의 유의 기준 및 로그 변화 배수 컷오프 +/-0.5로 젊은 세포와 노화 세포 사이에서 상이하였음을 보여준다(도 6). 이러한 유전자 세트는 Molecular Signatures 데이터베이스의 특징 유전자 세트 컬렉션에서 확인된, 공지된 많은 노화 경로에 풍부하였다. 각 유전자의 평균보다 높거나 낮은 발현의 방향성을 맵핑했을 때, 섬유아세포와 내피 세포 모두에 대해 노화 세포와 대조적으로 처리 세포와 젊은 세포 사이에서 명확한 유사성이 관찰되었다. 이 유전자 세트 공간에서 주성분 분석(PCA: Principal component analysis)을 수행하였으며, 첫 번째 주성분(PC1)을 따라 젊은 집단과 노화 집단이 분리 가능한 것으로 확인되었으며, 이로써 섬유아세포에서 64.8%의 변동과 내피 세포에서 60.9%의 변동이 설명되었다. 흥미롭게도, 처리 세포는 또한 PC1을 따라 젊은 집단에 더 가깝게 클러스터링되었다(도 1k 및 2j).
상기 정의된 동일한 유의 기준을 사용하여, 미처리 및 처리 노화 집단("UA vs TA")을 비교하여 섬유아세포에서 1042개 유전자(상향 조절된 734개, 하향 조절된 308개) 및 내피 세포에서 992개 유전자(상향 조절된 461개, 하향 조절된 531개)은 차등적으로 발현되었음을 확인하였다. 흥미롭게도, 이러한 유전자 세트 내에서도 Molecular Signatures 데이터베이스 내에서 노화 경로에 풍부하였음을 발견하였다. 각 세포 유형에서 젊은 세포 vs 미처리 노화 세포("Y vs UA") 및 미처리 노화 세포 vs 처리 노화 세포("UA vs TA") 프로파일을 비교하였을 때, 섬유아세포에 대해 24.7% 중복(승산 비 4.53, p<0.05)과 내피 세포에 대해 16.7% 중복(승산 비 3.84, p <0.05)이 젊은 집단의 것과 일치하는 유전자 발현의 변화 방향성(즉, 젊은 세포에서 더 높으면 처리 노화 세포에서 더 높음)으로 관찰되었다. 0.5% 미만은 두 세포 유형에서 반대로 이동하였다.
다음으로, 이러한 트랜스크립톰 프로파일을 사용하여 일시적 재프로그래밍 후 세포 정체성의 유지를 확인하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 확립된 세포 정체성 마커를 사용하여, 처리시 유의한 변화가 없음을 확인하였다(도 10). 또한, 본 발명자들은 만능성 관련 마커(형질감염된 OSKMLN mRNA 제외)의 발현을 전혀 검출할 수 없었다(도 10). 전체적으로, 트랜스크립톰 시그니처의 분석은 일시적 재프로그래밍이 세포 정체성을 유지하면서 더 젊은 유전자 발현 프로파일을 유발한다는 것을 밝혔다.
DNA 메틸화 수준에 기초한 후성 유전적 시계는 조직 및 세포 유형에 걸쳐 연령의 가장 정확한 분자 바이오마커이며 수명을 포함하는 노화 관련 병태의 숙주를 예측한다. 표준 재프로그래밍 인자(OSKLM)의 외인성 발현은 1차 세포의 후성 유전적 연령을 태아기 상태로 역전시키는 것으로 알려져 있다. OSKMLN의 일시적 발현이 후성 유전적 시계를 역전시킬 수 있는지를 테스트하기 위해, 인간 섬유아세포와 내피 세포에 적용되는 두 가지 후성 유전적 시계를 사용하였다: 호바스의 고유한 범 조직 후성 유전적 시계(353개의 시토신-인산-구아닌 쌍 기반), 및 피부 및 혈액 시계(391개 CpG 기반).
범 조직 후성 유전적 시계에 따르면, 일시적 OSKMLN은 유의하게(양측 혼합 효과 모델 P 값 = 0.023) DNA 메틸화 연령을 역전시켰다(평균 연령 차이 = -3.40세, 표준 오차 1.17). 회춘 효과는 섬유아세포(평균 연령 차이 = -1.84, SE = 1.46, 도 6g)에서보다 내피 세포(평균 연령 차이 = -4.94세, SE=1.63, 도 6h)에서 더 두드러졌다. 피부 및 혈액 후성 유전적 시계로 정성적으로 유사하지만 유의성이 감소한 결과를 얻을 수 있었다(전체 회춘 효과 -1.35세, SE = 0.67, 단측 혼합 효과 모델 P 값 = 0.042, 내피 세포 및 섬유아세포의 평균 회춘은 각각 -1.62세 및 -1.07세).
이러한 결과에 의해 힘입어, 세포 생리학적 노화의 다양한 특징에 미치는 일시적 재프로그래밍의 효과를 분석하였다. 노화의 특징을 포괄하는 11개의 확립된 분석 패널을 사용하였고(도 11), 대부분의 분석은 단일 세포에서 정량적 변화와 전체 세포 집단에서 분포 이동을 포착하기 위해 단일 세포 고처리량 영상화를 사용하여 수행하였다. 모든 분석은 각 개별 세포주에서 개별적으로 수행하였다(총 19개의 섬유아 세포주: 3개 젊은 세포주, 8개 노화 세포주 및 8개 처리 노화 세포주; 총 17개의 내피 세포주: 3개 젊은 세포주, 7개 노화 세포주 및 7개 처리 노화 세포주). 각 쌍의 샘플 세트에서 통계 분석을 수행하였다. 이후 데이터는 표현의 용이성을 위해 연령 범주별로 풀링하였다(사용된 통계 방법에 대한 자세한 설명은 재료 및 방법을 참조). 대조군 실험은 GFP를 코딩하는 mRNA를 사용하여 동일한 형질감염 방식을 채택하여 수행하였다.
후성 유전학에 대한 연구 결과를 확장하기 위해, 면역 형광(IF: immunofluorescence)에 의해 후성 유전적 억제 마크 H3K9me3, 이질염색질 관련 단백질 HP1γ, 및 핵 라미나 지지 단백질 LAP2α를 정성적으로 측정하는 실험을 수행하였다(도 1b, 1c, 2b, 2c, 5a-c). 노화된 섬유아세포 및 내피 세포는 젊은 세포에 비해 세 가지 모든 마커에 대한 핵 신호의 감소를 나타냈다. 노화 세포를 처리한 결과 두 세포 유형 모두에서 이들 마커가 증가하였다. 다음으로, 세포의 단백질 분해 활성에 관여하는 두 경로 모두를 노화에 따라 감소하는 자가소화포의 형성과 키모트립신 유사 프로테아좀 활성을 측정하여 조사하였다. 처리는 두 경로 모두를 젊은 세포와 비슷하거나 훨씬 더 높은 수준으로 증가시켰으며, 이는 재프로그래밍의 초기 단계가 분해된 생체 분자의 활성적인 제거를 촉진함을 시사한다(도 1d, 2d, 5g-h).
에너지 대사 측면에서, 노화 세포는 감소된 미토콘드리아 활성, 반응성 산소 종(ROS)의 축적, 및 조절 해제된 영양분 감지를 나타낸다. 따라서 세포에서 미토콘드리아 막 전위, 미토콘드리아 ROS, 및 시르투인1 단백질(SIRT1) 수준을 측정하여 노화 세포에 미치는 처리 효과를 테스트하였다. 일시적 재프로그래밍은 젊은 세포와 유사하게, 두 세포 유형 모두에서 미토콘드리아 막 전위를 증가시키는 반면(도 1e 왼쪽 패널, 2e 왼쪽 패널, 5e), ROS를 감소시키고(도 1e 오른쪽 패널, 2e 오른쪽 패널, 5f) 섬유아세포에서 SIRT1 단백질 수준을 증가시켰다(도 1f, 2f, 및 5d). 노화 관련 베타-갈락토시다제 염색은 노화 내피 세포에서 노화 세포의 수에서 유의한 감소를 보였다(도 1h, 2h, 및 5i). 이러한 감소는 내피 세포에서 또한 염증 유발성의 노화와 관련 분비 표현형(SASP) 사이토카인의 감소를 수반하였다(5j). 마지막으로, 정량적 형광 제자리 혼성화에 의해 측정하여, 어떤 세포 유형에서도 텔로미어 길이는 처리에 의해 유의한 연장을 나타내지 않았으며(도 1g 및 2g), 이는 세포가 텔로머라제 활성이 재활성화될 줄기 유사 상태로 탈분화하지 않았음을 시사한다.
다음으로, 이러한 효과의 지속성을 평가하였으며 대부분이 재프로그래밍 중단 후 4일 및 6일 후에 유의하게 유지되는 것을 확인하였다. 이러한 생리학적 회춘 변화가 얼마나 신속하게 나타나는 지를 단지 연속 2일 동안 형질감염된 섬유아세포와 내피 세포에서 동일한 세트의 실험을 반복하여 조사하였다. 놀랍게도, 데이터는 대부분의 회춘 효과는 처리 2일 후에 이미 나타날 수 있었지만 대부분은 더 중간 정도였음을 보여주었다.
종합적으로, 이 데이터는 OSKMLN의 일시적 발현이 트랜스크립톰, 후성 유전 및 세포 수준에서 인간 세포에서 세포 연령의 신속하고 지속적인 역전을 유도할 수 있음을 입증한다. 중요하게도, 이러한 데이터는 "세포 회춘" 과정(본원에서는 노화의 후성 유전적 재프로그래밍 또는 "ERA(Epigenetic Reprogramming of Aging)"라고 명명됨)이 iPSC 재프로그래밍 과정에서 매우 초기에 빠르게 관여됨을 입증한다. 이러한 후성 유전적 및 전사적 변화는 세포 정체성의 임의의 후성 유전적 재프로그래밍이 일어나기 전에 발생한다.
ERA가 세포 노화에 미치는 유익한 효과의 이러한 징후와 함께 ERA가 또한 노화와 관련된 염증 표현형을 역전시킬 수 있는지를 조사하기 위한 실험을 수행하였다. 내피 세포에서 이러한 역전의 예비 증거를 얻은 후(도 5j), 노화와 강하게 연관되고 관절 내 연골 세포에 영향을 미치는 뚜렷한 염증 스펙트럼을 특징으로 하는 질환인 골관절염으로 분석을 확장하였다. 진행된 단계 OA로 인해 전체 관절 치환술을 받은 60-70세 환자의 연골로부터 연골 세포를 단리하고 처리 결과를 젊은 개체로부터 단리한 연골 세포와 비교하였다. 일시적 재프로그래밍을 2 또는 3일 동안 수행하였고, 재프로그래밍 중단으로부터 2일 후에 분석을 수행하였지만, 장기 처리에 의해 환자에 걸친 효과가 더 일관되었다. 처리는 염증 유발성 사이토카인(도 7i) RANKL 및 iNOS2의 세포 내 mRNA 수준뿐만 아니라 세포에 의해 분비되는 염증 인자 수준에서도 유의한 감소를 나타냈다(도 3h-i 및 7i). 또한, ERA는 세포 증식을 촉진하였고(도 3a 및 7d), ATP 생산을 증가시켰으며(도 3c 및 7a), 미토콘드리아 ROS 감소 및 OA에서 하향 조절되는 것으로 밝혀진 유전자인 항산화제 SOD2의 RNA 수준 증가에 의해 밝혀진 바와 같이 산화 스트레스를 감소시켰다(도 3d, 3e, 7b 및 7d). ERA는 SOX9(연골 세포 정체성 및 기능에 중요한 전사 인자)의 발현 수준에 영향을 미치지 않았으며 COL2A1(관절 연골의 1차 콜라겐)의 발현 수준을 유의하게 증가시켰으며(도 3b, 7e. 및 7f에서 qRT-PCR), 이는 연골형성 세포 정체성의 유지를 시사한다. 종합적으로, 이러한 결과는 OSKMLN의 일시적 발현이 노화된 OA 연골 세포에서 더 건강한 상태로 유전자 발현 및 세포 생리학의 부분적인 역전을 촉진할 수 있음을 보여준다.
줄기 세포의 기능 및 재생 능력의 상실은 노화의 또 다른 중요한 특징을 나타낸다. 재생을 약화시키는 체세포 줄기 세포의 노화 관련 변화에 미치는 일시적 재프로그래밍의 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 먼저, 마우스 유래 골격근 줄기 세포(MuSC: mouse-derived skeletal muscle stem cell)에 미치는 일시적 재프로그래밍의 효과를 테스트하였다. MuSC를 인공 니치를 사용하여 정지 상태로 유지시키면서 2일 동안 처리하였다. 초기 실험은 FACS에 의해 단리된 젊은(3개월) 및 노화(20-24개월) 마우스 MuSC로 수행하였다. 노화 MuSC의 처리는 첫 번째 분열 시간을 단축하여, 정지된 젊은 MuSC와 미토콘드리아 질량의 더 빠른 활성화 역학에 접근하였다. 더욱이, 처리는 단일 MuSC가 콜로니를 형성하는 감소된 능력을 부분적으로 구제하였다. 이 세포를 추가로 배양하였고 데이터는 처리가 근원성 마커 MyoD의 발현을 변경하지 않지만 대신에 근관으로 분화하는 능력을 개선하였음을 보였으며, 이는 일시적 재프로그래밍이 근원성 운명을 방해하지 않지만 근원성 잠재력을 향상시킬 수 있음을 시사한다.
다음으로, 생체 내에서 새로운 조직을 재생하는 MuSC 기능 및 효능을 테스트하였다. 이를 위해, 젊은, 노화, 또는 일시적으로 재프로그래밍된 노화 MuSC를 루시페라제 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 렌티 바이러스로 형질 도입한 후 세포를 면역 손상 마우스의 손상된 전경골(TA: tibialis anterior) 근육에 이식하였다. 종방향 생물 발광 영상화(BLI)는 처음에 처리 노화 MuSC로 이식된 근육이 가장 높은 신호를 보였지만(제4일, 도 4b), 이식 후 제11일까지 젊은 MuSC가 있는 근육과 비슷해졌으며, 반대로 미처리 노화 MuSC가 있는 근육은 이식 후 모든 시점에서 더 낮은 신호를 나타냈음(도 4b)을 보였다. 면역 형광 분석은 미처리 노화 MuSC에 비해 처리 노화 MuSC로 이식된 TA에서 더 많은 수의 공여자 유래(GFP+) 근섬유를 추가로 보였다(도 4c). 더욱이, 처리 노화 세포로부터의 GFP+ 근섬유는 미처리 대응물과 비교할 때 증가된 단면적을 보였으며, 실제로는 젊은 대조군보다 훨씬 더 큰 단면적을 보였다(도 4d). 종합하여, 이러한 결과는 일시적으로 재프로그래밍된 노화 MuSC의 개선된 조직 재생 잠재력을 시사한다. 3개월 후, 모든 마우스는 생검을 거쳤으며 신생물성 병변 또는 기형종은 발견되지 않았다.
처리의 잠재적인 장기적 이점을 테스트하기 위해, 세포 이식 60일 후 2차 손상을 유도하였고, 다시 데이터는 일시적으로 재프로그래밍된 노화 MuSC로 이식된 TA 근육이 더 높은 BLI 신호를 생성했음을 보여주었다(도 4e).
근육 감소증은 근육 질량 및 근력 생성의 감소를 특징으로 하는 노화 관련 병태이다. 유사하게, 마우스에서 근육 기능은 노화에 따라 점진적인 변성을 보여준다. 노화 MuSC의 일시적 재프로그래밍이 노화 마우스의 근육의 생리학적 기능을 회복시키는 세포 기반 치료를 개선하는지를 테스트하기 위해, 젊은(4개월) 또는 노화(27개월) 면역 손상된 마우스로부터 단리된 TA 근육의 강축력 생성을 측정하기 위한 전기 생리학을 수행하였다. 데이터는 노화 마우스의 TA 근육이 젊은 마우스에 비해 강축력이 낮다는 것을 보였으며, 이는 노화 관련 힘 생산 손실을 시사한다(도 8f). 다음으로, 노화 마우스(20-24개월)에서 MuSC를 단리하였다. 노화 MuSC를 처리한 후, 세포를 노화(27개월) 면역 손상된 마우스의 심독소 손상 TA 근육에 이식하였다. 이식된 근육이 완전히 재생하기에 충분한 시간을 주기 위해 30일을 제공하였다. 강축력 생성을 측정하기 위한 전기 생리학을 수행하였다. 미처리 노화 MuSC로 이식된 근육은 노화 대조군 마우스의 이식되지 않은 근육과 비슷한 힘을 나타냈다(도 4h). 반대로, 처리 노화 MuSC를 이식받은 근육은 젊은 대조군 마우스의 이식되지 않은 근육과 비슷한 강축력을 나타냈다. 이러한 결과는 MuSC 기반 요법과 병용하여 일시적 재프로그래밍이 노화된 근육의 생리학적 기능을 젊은 근육의 생리학적 기능으로 회복시킬 수 있다는 것을 지지한다.
마지막으로, 이러한 결과를 인간 MuSC로 변환시켰다. 다른 연령대(10 내지 80세)의 환자로부터 수득한 수술 샘플을 사용하여 GFP 및 루시페라제 발현 렌티바이러스 벡터로 형질 도입하여 연구를 반복하였다. 마우스에서와 같이, 이식되고 일시적으로 재프로그래밍된 노화 인간 MuSC는 동일한 개체의 미처리 MuSC와 비교하여 증가된 BLI 신호를 생성하였으며 젊은 MuSC에서 관찰된 것과 비슷하였다(도 8d). 흥미롭게도, MuSC를 처리한 것과 처리하지 않은 대측성 근육 사이의 BLI 신호 비는 젊은 연령 그룹(10-30 또는 30-55세)보다 노년 그룹(60-80세)에서 더 높았으며, 이는 ERA가 노화 세포에서 더 젊은 수준으로 상실한 기능을 회복시킴을 시사한다(도 8e). 종합해보면, 이러한 결과는 일시적 재프로그래밍이 운명을 손상시키지 않으면서, 노화 MuSC의 효능을 젊은 MuSC와 유사한 정도로 부분적으로 회복시키고, 따라서 재생 의학에서 세포 요법으로서의 잠재력을 가짐을 시사한다.
> 65세의 노인 환자의 섬유아세포와 각질 세포를 결합하여 3차원(3D) 시험관 내 조작된 피부를 재구성하였으며, 배양 배지에 재프로그래밍 인자 칵테일을 첨가하여 형질감염시켰다. 퀄리티를 평가하기 위해 조직학적 분석을 수행하고 숫자 점수를 할당하였다(도 8a). 미처리 대조군 및 레티노산 처리 샘플에 비해 증가된 수치 점수에 의해 측정된 바와 같이 재프로그래밍 인자에 의해 회춘이 관찰되었다.
망막 상피 세포를 생체 외에서 배양하고 2일 또는 3일 동안 OSKMN으로 일시적으로 재프로그래밍하였다. 결과는 p16(도 9a), p21(도 9b), IL8(도 9c) 및 PGC1a(도 9d)의 발현의 현저한 감소를 보였다.
유도 만능 줄기 세포(iPSC)로의 핵 재프로그래밍은 개시, 성숙 및 안정화를 포함하는 다단계 과정이다. 이러한 역동적이고 복잡한 "후성 유전적 재프로그래밍"이 완료되면, iPSC는 만능일뿐만 아니라 젊다. 본원의 데이터는 일시적 세포 재프로그래밍의 비통합적 mRNA 기반 플랫폼이 세포 정체성의 후성 유전적 소거가 아직 발생하지 않은 초기 단계에서 노화의 특징을 매우 빠르게 역전시킬 수 있음을 입증하였다. 데이터는 세포의 정체성을 보존하면서 질환 세포와 노화된 줄기 세포의 상실된 기능성을 회복시키면서 노화된 인간 세포에서 회춘 과정이 발생함을 보여준다.
실시예 2: 방법
mRNA 형질감염: 세포를 세포 독성을 줄이기 위해 섬유아세포 및 연골 세포의 경우 mRNA-In(mTI Global Stem), 형질감염시키기 더 어려운 내피 세포 및 MuSC의 경우 Lipofectamine MessengerMax(Thermo Fisher)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 형질감염 4시간 후 섬유아세포 및 내피 세포에 대해 배양 배지를 변경했지만 연골 세포 또는 MuSC의 경우 mRNA의 상당한 흡수를 생성하기 위해 밤새 인큐베이션이 필요했기 때문에 그러지 않았다. 전달 효율은 OSKMNL 칵테일 내 개별 인자에 대해 GFP mRNA 및 면역 염색 두 가지 모두로 확인하였다. Sebastiano Lab의 일원이기도 한 Jens Durruthy-Durruthy와 그가 컨설턴트로 근무한 ESI BIO의 시설과 함께 mRNA 합성 및 형질감염 최적화를 수행하였다.
섬유아세포 단리 및 배양: 60-70대(노인) 및 30-40대(젊은이) 남성 및 여성 환자의 혼합으로부터 2mm 펀치 생검을 사용하여 중간 상완 또는 복부의 근심 측면에서 생검된 건강한 환자에서 단리를 수행했다. 이러한 외식 편으로부터 세포를 배양하고 비필수 아미노산, 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 얼스(Earl's) 염 포함 이글(Eagle) 최소 필수 배지에서 유지시켰다.
내피 세포 단리 및 배양: Coriell Institute에서 45-50대(노인) 및 10대(젊은이)에 갑작스런 두부 외상으로 사망했지만 그 외 건강했던 공여자로부터 사망 직전 제거된 장골 동맥 및 정맥에서 단리를 수행하였다. 조직을 콜라게나제로 분해하고 루멘에서 방출된 세포를 사용하여 배양을 시작하였다. 2mM L-글루타민, 15 소 태아 혈청, 0.02 mg/ml 내피 성장 보충제, 0.05 mg/ml 헤파린 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 배지 199에서 세포를 유지시켰다.
핵 면역 세포 화학: 세포를 HBSS로 세척한 후 PBS 중 15% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정하였다. 그런 후 세포를 PBS 중 1% BSA 및 0.3% 트리톤 X-100의 블로킹 용액으로 30분 동안 블로킹하였다. 그런 후 1차 항체를 PBS 중 1% BSA 및 0.3% 트리톤 X-100에 적용하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하도록 하였다. 다음날 세포를 HBSS로 세척한 후 해당 Alexa Flour 표지된 2차 항체로 전환하고 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 후 세포를 다시 세척한 후 DAPI로 30분 동안 염색하였다. 마지막으로, 영상화를 위해 세포를 HBSS로 전환하였다.
자가소화포 형성 염색: 세포를 HBSS로 세척하고 LC3 기반 형광 자가소화포 마커(Sigma)를 함유하는 염색 용액으로 전환하였다. 그런 후 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 그런 후 HBSS/Ca/Mg를 사용하여 세포를 2 회 세척하였다. 그런 후 세포 표지 염료인 CellTracker Deep Red를 사용하여 15분 동안 세포를 염색하였다. 그런 후 세포를 Operetta로 단일 세포 영상화를 위해 HBSS/Ca/Mg로 전환하였다.
프로테아좀 활성 측정: 웰을 먼저 세포 생존능 염료인 PrestoBlue(Thermo)로 10분 동안 염색하였다. TECAN 형광 플레이트 판독기를 사용하여 웰 신호를 판독하였다. 그런 후 세포를 HBSS/Ca/Mg로 세척한 후 키모트립신 유사 20S 프로테아좀 활성에 의해 절단되는 LLVY-R110 형광 발생성 기질(Sigma)을 함유하는 원래 배지로 전환하였다. 그런 후 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, TECAN 형광 플레이트 판독기에서 다시 판독하였다.
미토콘드리아 막 전위 염색: 테트라메틸로다민, 메틸 에스테르, 과염소산염(Thermo)을 세포 배양 배지에 첨가하였고, 이 염료는 막 전위에 기초하여 미토콘드리아에 의해 격리된다. 그런 후 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 후 세포를 HBSS/Ca/Mg로 2회 세척한 후 CellTracker Deep Red를 사용하여 15분 동안 염색하였다. 마지막으로, 세포를 신선한 HBSS/Ca/Mg에서 Operetta로 영상화하였다.
미토콘드리아 ROS 측정: 세포를 HBSS/Ca/Mg로 세척한 후 미토콘드리아에서 수퍼옥시드에 의해 산화되는 형광 발생성 염료인 MitoSOX를 함유하는 HBSS/Ca/Mg로 전환하였다. 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그런 후 세포를 HBSS/Ca/Mg로 2회 세척한 후 CellTracker Deep Red를 사용하여 15분 동안 염색하였다. 마지막으로, 세포를 신선한 HBSS/Ca/Mg에서 Operetta로 영상화하였다.
SaβGal 조직 화학: 세포를 HBSS/Ca/Mg로 2회 세척한 후 PBS 중 15% 파라포름알데히드로 6분 동안 고정하였다. 그런 후 세포를 HBSS/Ca/Mg로 3회 헹군 후 내인성 B 갈락토시다제에 의해 절단되는 X-gal 발색성 기질로 염색하였다. 세포를 염색 용액에 보관하고 주위 CO2와 함께 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 세포를 다시 HBSS/Ca/Mg로 세척한 후 Leica 명시야 현미경으로 영상화하기 위해 70% 글리세롤 용액으로 전환하였다.
사이토카인 프로파일링: 이 작업은 스탠포드 대학의 인간 면역 모니터링 센터와 함께 수행하였다. 세포 배지를 수거하고 실온에서 400 rcf에서 10분 동안 회전시켰다. 그런 후 상등액을 분석할 때까지 액체 질소로 빠르게 동결시켰다. 인간 63-plex 키트(eBiosciences/Affymetrix)를 사용하여 분석을 수행하였다. 비드를 96 웰 플레이트에 첨가하고 Biotek ELx405 세척기로 세척하였다. 혼합된 항체 결합 비드를 함유하는 플레이트에 샘플을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 4℃에서 진탕하면서 밤새 인큐베이션하였다. 저온 및 실온 인큐베이션 단계는 궤도 진탕기에서 500 내지 600 rpm에서 수행하였다. 밤새 인큐베이션한 후 플레이트를 Biotek ELx405 세척기에서 세척한 후 실온에서 진탕하면서 75분 동안 비오틴화된 검출 항체를 첨가하였다. 상기와 같이 플레이트를 세척하고 스트렙타비딘-PE를 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후 상기와 같이 세척을 수행하고 웰에 판독 완충액을 첨가하였다. 각 샘플은 중복 측정하였다. 플레이트는 사이토카인마다 샘플당 50개의 비드의 하한으로 Luminex 200 기기를 사용하여 판독하였다. 모든 웰에 Radix Biosolutions의 맞춤형 분석 대조군 비드를 첨가한다.
항체: 5가지 1차 항체를 핵 측정에 사용하였다: 토끼 항-히스톤 H3K9me3 히스톤 메틸화(1:4000), 마우스 항-HP1γ 이질염색질 마커(1:200), 토끼 항-LAP2α(1:500) 핵 조직화 단백질, 마우스 항-라미닌 A/C 핵 엔벨로프 마커 및 토끼 항-SIRT1(1:200).
RNA 시퀀싱 및 데이터 분석
세포를 TRIzol(Thermo)로 세척하고 분해하였다. Total RNA 정제 키트(Norgen Biotek Corp)를 사용하여 총 RNA를 단리하고 RNA 분석 스크린테이프(R6K screentape, Agilent)로 RNA 퀄리티를 평가하고 RIN > 9인 RNA를 cDNA로 역전사하였다. cDNA 라이브러리는 TruSeq RNA 샘플 준비 키트 v2(Illumina)를 사용하여 1 μg의 총 RNA를 사용하여 준비하였다. RNA 품질은 Agilent Bioanalyzer 2100에 의해 평가하였으며, RIN > 9인 RNA를 cDNA로 역전사하였다. cDNA 라이브러리는 분자 인덱싱의 이점이 추가된 TruSeq RNA 샘플 준비 키트 v2(Illumina)를 사용하여 500 ng의 총 RNA를 사용하여 준비하였다. 임의의 PCR 증폭 단계 전에, 모든 cDNA 단편 말단을 8 bp 고유 분자 인덱스를 함유하는 어댑터 쌍에 무작위로 결찰시켰다. 그런 후 분자 인덱스 cDNA 라이브러리는 PCR 증폭(15 주기)한 후 Bioanalzyer 및 Qubit를 사용하여 QC하였다. QC가 성공적으로 이루어지면, 이들을 Illumina Nextseq 플랫폼에서 시퀀싱하여 80 bp 단일 말단 리드를 얻었다. 품질이 낮은 부분을 제거하고 게놈에 대한 맵핑을 개선하기 위해 리드를 각 끝에서 2개의 뉴클레오티드를 트리밍하였다. 중복체를 제거하지만 데이터베이스에서 각 서열이 각 샘플에서 몇 번 발생했는지 추적하여 생성된 78개의 뉴클레오티드 리드를 압축하였다. 그런 후 정확한 일치를 사용하여 고유한 리드를 인간 게놈에 맵핑하였다. 이것은 엑손-엑손 경계를 넘는 오독과 오류 및 SNP/돌연변이가 있는 리드이지만, 이는 각 유전자의 발현 수준을 추정하는 데 큰 영향을 미치지는 않는다. 그런 후 맵핑된 각 리드에 기본 게놈의 주석을 할당하였다. 여러 주석(예를 들어, 유전자의 인트론에서 발생하는 miRNA)의 경우, 휴리스틱 기반 계층 구조를 사용하여 각 리드에 고유한 정체성을 부여하였다. 그런 후 이것을 사용하여 각 전사체에 속하는 리드를 확인하였고 전사체 대한 각 위치에 대한 커버리지를 확립하였다. 이 커버리지는 불균일하고 뾰족하므로 유전자 발현 값의 추정치로서 이 커버리지의 중앙값을 사용하였다. 다른 샘플에서 발현을 비교하기 위해, 분위수 정규화를 사용하였다. 추가 데이터 분석은 MATLAB에서 수행하였다. 그런 후 발현 수준의 비를 계산하여 배수 변화의 로그(밑이 2)를 추정하였다. 스튜던트 t 검정을 사용하여 p < 0.05 컷오프로 유의성을 결정하였다. ENCODE 유전자 분석을 전사 인자 식별에 사용하였으며, 이는 스탠포드 의료 정보학 연구 센터(Stanford Center for Biomedical Informatics Research)의 Butte Lab에서 개발하고 공개적으로 이용 가능하게 하였다.
마우스: C57BL/6 수컷 마우스 및 NSG 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입하였다. NOD/MrkBomTac-Prkdcscid 암컷 마우스는 Taconic Biosciences에서 구입하였다. 마우스는 재향 군인회 팔로 알토 건강 관리 시스템(Veterans Affairs Palo Alto Health Care Systems)의 수의학 부서에서 보관 및 유지하였다. 동물 프로토콜은 스탠포드 대학의 실험 동물 관리에 관한 행정 패널에 의해 승인받았다.
인간 골격근 표본: 대상체의 연령은 10세 내지 78세 범위였다. 인간 근육 생검 표본은 스탠포드 대학 기관 감사 위원회(Stanford University Institutional Review Board)에서 승인한 인간 연구 리서치 프로토콜의 일부로서 환자가 사전 동의를 제공한 후 채취하였다. 모든 실험은 임상 절차의 가용성에 따라 신선한 근육 표본을 사용하여 수행하였다. 세포 분석을 위한 샘플 처리는 표본 단리 후 1 내지 12시간 이내에 시작하였다. 모든 연구에서, 표준 편차는 실제 생물학적 복제물(즉, 고유한 공여자)을 사용한 연구에서 유도된 데이터의 변동성을 반영한다. 데이터는 공여자 정체성과 관련이 없었다.
MuSC 단리 및 정제: 근육을 뒷다리에서 수거하고 기계적으로 분리하여 단편화된 근육 현탁액을 생성하였다. 그 후 콜라게나제 II-Ham의 F10 용액(ml 당 500 unit, Invitrogen)에서 45 내지 50분 동안 분해하였다. 세척 후, 콜라게나제 II(ml당 100 unit) 및 디스파제(ml당 2 unit; ThermoFisher)로 30분 동안 2차 분해를 수행하였다. 생성된 세포 현탁액을 세척, 여과하고 1:100로 희석된 VCAM-비오틴(클론 429; BD Bioscience), CD31-FITC(클론 MEC 13.3; BD Bioscience), CD45-APC(클론 30-F11; BD Bioscience) 및 Sca-1-Pacific-Blue(클론 D7; Biolegend) 항체로 염색하였다. 인간 MuSC는 신선한 수술 샘플 50, 51로부터 정제하였다. 수술 샘플은 지방 및 섬유 조직으로부터 조심스럽게 절개하고 분리된 근육 현탁액을 마우스 조직에 대해 설명된 바와 같이 제조하였다. 그런 후 생성된 세포 현탁액을 세척, 여과하고 항-CD31-Alexa Fluor 488(클론 WM59; BioLegend; #303110, 1:75), 항-CD45-Alexa Fluor 488(클론 HI30; Invitrogen; #MHCD4520, 1:75), 항-CD34-FITC(클론 581; BioLegend; #343503, 1:75), 항-CD29-APC(클론 TS2/16; BioLegend; #303008, 1:75) 및 항-NCAM-비오틴(클론 HCD56; BioLegend; #318319, 1:75)으로 염색하였다. 이어서 결합되지 않은 1차 항체를 세척하고 세포를 스트렙타비딘-PE/Cy7(BioLegend)에서 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 NCAM-비오틴을 검출하였다. MuSC 집단을 수득하기 위해 488 nm, 633 nm 및 405 nm 레이저가 장착된 보정된 BD-FACS Aria II 또는 BD FACSAria III 유세포 분석기에서 세포 분류를 수행하였다. 분류된 세포의 작은 부분을 플레이팅하고 Pax7 및 MyoD에 대해 염색하여 분류된 집단의 순도를 평가하였다. FACS 게이팅 전략에 대해서는 보충 정보를 참조한다.
생물 발광 영상화: 생물 발광 영상화는 Xenogen IVIS-Spectrum System(Caliper Life Sciences)을 사용하여 수행하였다. 2.5 ℓ/min의 유속의 2% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시켰다(n=4). 멸균 PBS에 용해된 D-루시페린(50mg/ml, Biosynth International Inc.)의 복강 내 주사를 투여하였다. 주사 직후, 마우스를 최고 해상도(작은 비닝)에서 최대 감도(f-stop 1)로 30초 동안 영상화하였다. 생물 발광 신호의 피크 강도가 감소하기 시작할 때까지 매분 30초 노출이 이루어졌다. 후속 분석을 위해 각 이미지를 저장하였다. 영상화는 블라인드로 수행하였다. 영상화를 수행하는 조사자는 이식된 세포에 대한 실험 조건의 정체를 알지 못했다.
생물 발광 이미지 분석: 각 이미지의 분석은 Living Image Software, 버전 4.0(Caliper Life Sciences)을 사용하여 수행하였다. 수동으로 생성된 원을 관심 영역 위에 배치하고 수여 마우스의 사지 또는 지정된 영역을 완전히 둘러싸도록 크기를 재조정하였다. 유사하게, 관심의 배경 영역은 이식된 다리 외부의 마우스 영역에 배치하였다.
조직 수거: TA 근육을 뼈에서 조심스럽게 절제하고 무게를 재고 고정을 위해 0.5% PFA 용액에 넣어 밤새 두었다. 그런 후 근육을 20% 수크로오스 용액으로 옮기고 3시간 동안 또는 근육이 포화점에 도달하여 가라앉기 시작할 때까지 두었다. 그런 후 조직을 최적 절삭 온도(OCT: Optimal Cutting Temperature) 매질에 매립하고 냉동하고 절편화할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 10 μm 절편을 생성하도록 설정된 Leica CM3050S 저온 유지 장치에서 절편화를 수행했다. 절편은 Fisherbrand Colorfrost 슬라이드에 봉입하였다. 이 슬라이드는 면역 조직 화학을 수행할 때까지 -20℃에 보관하였다.
조직학: 0.5% 전자 현미경 등급 파라포름알데히드를 사용하여 TA 근육을 5시간 동안 고정한 다음 20% 수크로오스로 옮겨 밤새 두었다. 그런 후 근육을 OCT에서 동결시키고 10 μm 두께로 동결 절편화하고 염색하였다. 헤마톡실린 및 에오신(Sigma) 또는 Gomorri Trichrome(Richard-Allan Scientific)을 사용한 비색 염색을 위해 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 샘플을 처리하였다.
MuSC 면역 염색: PBS 중 20% 당나귀 혈청/0.3% 트리톤을 사용한 1시간 차단 단계를 이용하여 모든 샘플에 대해 원치 않는 1차 항체 결합을 방지하였다. 1차 항체를 적용하고 PBS 중 20% 당나귀 혈청/0.3% 트리톤에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하도록 하였다. 0.3% PBST로 4회 세척한 후, 형광 접합된 2차 항체를 첨가하고 0.3% PBST에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 3회의 추가 헹굼 후 Fluoview 봉입제를 사용하여 각 슬라이드를 봉입하였다.
항체: 본 연구에서는 다음 항체를 사용하였다. 각 항체의 출처를 나타낸다. 마우스: GFP(Invitrogen, #A11122, 1:250); 루시페라제(Sigma-Aldrich, #L0159, 1:200); 콜라겐 I(Cedarlane Labs, #CL50151AP, 1:200); HSP47(Abcam, #ab77609, 1:200).
영상화: 표준 형광 현미경 및 10x 또는 20x 공기 대물렌즈를 사용하여 샘플을 영상화하였다. Volocity 영상화 소프트웨어를 사용하여 여기 및 방출 필터를 조정하였으며 가능할 때마다 사용되는 사전 프로그래밍된 AlexaFluor 필터 설정을 함께 제공하였다. 모든 노출 시간은 첫 번째 영상화 라운드 동안 최적화한 후 모든 후속 영상화를 통해 일정하게 유지시켰다.
이미지 분석: 색상 임계값 플러그인을 사용하여 콜라겐에 대해 양성인 영역만의 마스크를 생성하여 콜라겐으로 구성된 영역의 백분율을 Image J를 사용하여 계산하였다. 그런 후 그 영역을 자유 그리기 도구를 사용하여 확인된 샘플의 전체 영역으로 나누었다. 다른 모든 분석은 Volocity 소프트웨어를 사용하고 자유 그리기 도구를 사용하여 수동으로 섬유를 계수하고 핵, eMHC+ 섬유, 신경근 접합부 및 혈관의 수를 수동으로 계수하였다.
렌티 바이러스 형질 도입: 루시페라제 및 GFP 단백질 리포터를 3세대 HIV-1 렌티 바이러스 벡터(CD51X DPS, SystemBio)에 서브클로닝하였다. 형질 도입하기 위해 새로 단리된 MuSC 세포를 폴리-D-리신(Millipore Sigma, A-003-E) 및 ECM 코팅된 8웰 챔버 슬라이드(Millipore Sigma, PEZGS0896)에 웰당 30,000 내지 40,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고 웰당 5 μl의 농축된 바이러스 및 8 μg/mL 폴리브렌(Santa Cruz Biotechnology, sc-134220)과 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 3200g에서 5분 동안, 25℃에서 2500g에서 1시간 동안 회전시켰다. 그런 후 세포를 새로운 배지로 2회 세척하고, 플레이트에서 긁어 낸 다음, 실험 조건에 따라 최종 부피에 재현탁시켰다.
MitoTracker 염색 및 유세포 측정 분석: 재프로그래밍 중인 MuSC 및 대조군을 순수한 HamsF10(혈청 또는 페니실린/스트렙토마이신 없음)으로 2회 세척하였다. 그 후, MuSC를 0.5 μM MitoTracker Green FM(ThermoFisher, M7514) 및 DAPI로 37℃에서 30분 동안 염색하고 순수한 HamsF10으로 3회 세척한 다음 BD FACSAria III 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다.
통계 분석: 달리 언급되지 않는 한, 모든 통계 분석은 MATLAB R2017a(MathWorks Software) 또는 GraphPad Prism 5(GraphPad Software)를 사용하여 수행하였다. 통계 분석을 위해 t 검정을 사용하였다. 모든 오차 막대는 s.e.m.을 나타낸다. * p<0.05; ** p<0.001; *** p<0.0001.
본 개시 내용의 바람직한 실시양태가 예시되고 설명되었지만, 본 개시 내용의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 그 안에서 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
참고 문헌
Figure pct00001
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P 실시양태
실시양태 P1. 세포의 회춘 방법으로서, a) 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 세포를 형질감염시키는 단계로, 형질감염은 2일 이상 4일 이하 동안 매일 1회 수행되는 것인 단계; 및 b) 세포에서 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 생성하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA를 번역시켜 일시적 재프로그래밍을 초래하는 단계로, 세포는 줄기 세포로의 탈분화 없이 회춘되는 것인 단계를 포함하는 방법.
실시양태 P2. 실시양태 P1에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 P3. 실시양태 P2에 있어서, 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 포함하는 것인 방법.
실시양태 P4. 실시양태 P1에 있어서, 세포는 포유동물 세포인 방법.
실시양태 P5. 실시양태 P4에 있어서, 세포는 인간 세포인 방법.
실시양태 P6. 실시양태 P1에 있어서, 세포는 노령 대상체로부터 유래된 것인 방법.
실시양태 P7. 실시양태 P1에 있어서, 세포는 섬유아세포, 내피 세포, 연골 세포, 또는 골격근 줄기 세포인 방법.
실시양태 P8. 실시양태 P1의 방법에 있어서, 일시적 재프로그래밍은 HP1 감마, H3K9me3, 라미나 지지 단백질 LAP2알파, 및 SIRT1 단백질의 발현 증가, 핵 접힘 감소, 블레빙 감소, 세포 자가소화포 형성 증가, 키모트립신 유사 프로테아좀 활성 증가, 미토콘드리아 막 전위 증가, 또는 활성 산소 종(ROS) 감소를 초래하는 것인 방법.
실시양태 P9. 실시양태 P1에 있어서, 세포는 조직 또는 기관 내에 있는 것인 방법.
실시양태 P10. 실시양태 P9에 있어서, 일시적 재프로그래밍은 조직 또는 기관 내의 노화 세포의 수를 감소시키는 것인 방법.
실시양태 P11. 실시양태 P9에 있어서, 일시적 재프로그래밍은 GMSCF, IL18, 및 TNFα의 발현을 감소시키는 것인 방법.
실시양태 P12. 실시양태 P9의 방법에 있어서, 치료는 기능을 회복시키거나, 효능을 증가시키거나, 생존능을 향상시키거나, 조직 또는 기관 내의 세포의 복제능 또는 수명을 증가시키는 것인 방법.
실시양태 P13. 실시양태 P1에 있어서, 방법은 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내에서 수행되는 것인 방법.
실시양태 P14. 실시양태 P1에 있어서, 형질감염은 3일 또는 4일 동안 매일 1회 수행되는 것인 방법.
실시양태 P15. 노화 관련 질환 또는 병태에 대한 대상체를 치료하는 방법으로서, a) 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 회춘을 필요로 하는 세포를 생체 내 또는 생체 외에서 형질감염시키는 단계로, 형질감염은 2일 이상 4일 이하 동안 매일 1회 수행되는 것인 단계; 및 b) 세포에서 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 발현시켜 세포의 일시적 재프로그래밍을 초래하는 단계로, 세포는 줄기 세포로의 탈분화 없이 회춘되는 것인 단계를 포함하는 방법.
실시양태 P16. 실시양태 P15에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 P17. 실시양태 P16의 방법에 있어서, 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 포함하는 것인 방법.
실시양태 P18. 실시양태 P15에 있어서, 회춘한 세포를 대상체에 이식하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 P19. 실시양태 P15에 있어서, 노화 관련 질환 또는 병태는 변성 질환인 방법.
실시양태 P20. 실시양태 P15에 있어서, 노화 관련 질환 또는 병태는 신경 변성 질환 또는 근골격계 장애인 방법.
실시양태 P21. 연골 변성을 수반하는 질환 또는 병태에 대한 대상체를 치료하는 방법으로서, a) 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 회춘을 필요로 하는 연골 세포를 생체 내 또는 생체 외에서 형질감염시키는 단계로, 형질감염은 2일 이상 4일 이하 동안 매일 1회 수행되는 것인 단계; 및 b) 연골 세포에서 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 발현시켜 연골 세포의 일시적 재프로그래밍을 초래하는 단계로, 연골 세포는 줄기 세포로의 탈분화 없이 회춘되는 것인 단계를 포함하는 방법.
실시양태 P22. 실시양태 P21에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 P23. 실시양태 P22에 있어서, 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 포함하는 것인 방법.
실시양태 P24. 실시양태 P21에 있어서, 연골 변성을 수반하는 질환 또는 장애는 관절염인 방법.
실시양태 P25. 실시양태 P24에 있어서, 관절염은 골관절염 또는 류마티스성 관절염인 방법.
실시양태 P26. 실시양태 P21에 있어서, 치료는 대상체에서 염증을 감소시키는 것인 방법.
실시양태 P27. 실시양태 P21에 있어서, 형질감염은 생체 외에서 수행되고 회춘한 연골 세포는 대상체의 관절염 관절에 이식되는 것인 방법.
실시양태 P28. 실시양태 P27에 있어서, 연골 세포는 대상체로부터 수득한 연골 샘플로부터 단리되는 것인 방법.
실시양태 P29. 실시양태 P21에 있어서, 치료는 RANKL, iNOS, IL6, IL8, BDNF, IFNα, IFNγ, 및 LIF의 발현을 감소시키고 연골 세포에 의한 SOX9 및 COL2A1의 발현을 증가시키는 것인 방법.
실시양태 P30. 실시양태 P21에 있어서, 대상체는 노령 대상체인 방법.
실시양태 P31. 실시양태 P21에 있어서, 대상체는 포유동물 대상체인 방법.
실시양태 P32. 실시양태 P31에 있어서, 포유동물 대상체는 인간 대상체인 방법.
실시양태 P33. 대상체에서 근육 변성을 수반하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, a) 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 골격근 줄기 세포를 생체 내 또는 생체 외에서 형질감염시키는 단계로, 형질감염은 2일 이상 4일 이하 동안 매일 1회 수행되는 것인 단계; 및 b) 골격근 줄기 세포에서 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 발현시켜 골격근 줄기 세포의 일시적 재프로그래밍을 초래하는 단계로, 골격근 줄기 세포는 근육 세포로 분화하는 능력의 상실 없이 회춘되는 것인 단계를 포함하는 방법
실시양태 P34. 실시양태 P33에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 P35. 실시양태 P34에 있어서, 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 포함하는 것인 방법.
실시양태 P36. 실시양태 P33에 있어서, 형질감염은 생체 외에서 수행되고 회춘한 골격근 줄기 세포는 대상체에서 복구 또는 재생이 필요한 근육에 이식되는 것인 방법.
실시양태 P37. 실시양태 P33에 있어서, 골격근 줄기 세포는 대상체로부터 수득한 근육 샘플로부터 단리되는 것인 방법.
실시양태 P38. 실시양태 P33에 있어서, 치료는 근섬유의 재생을 초래하는 것인 방법.
실시양태 P39. 실시양태 P33에 있어서, 치료는 골격근 줄기 세포의 효능을 회복시키는 것인 방법.
실시양태 P40. 실시양태 P33에 있어서, 대상체는 노령 대상체인 방법.
실시양태 P41. 실시양태 P33에 있어서, 대상체는 포유동물 대상체인 방법.
실시양태 P42. 실시양태 P41에 있어서, 포유동물 대상체는 인간 대상체인 방법.
실시양태
실시양태 1. 세포의 회춘 방법으로서, 연속 5일 이하 동안 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 세포를 형질감염시켜, 회춘한 세포를 생성하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 젊은 세포의 트랜스크립톰 프로파일과 더 유사해지는 것인 방법.
실시양태 3. 실시양태 2에 있어서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일은 RPL37, RHOA, SRSF3, EPHB4, ARHGAP18, RPL31, FKBP2, MAP1LC3B2, Elf1, Phf8, Pol2s2, Taf1 및 Sin3a로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 유전자 발현의 증가를 포함하는 것인 방법.
실시양태 4. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 회춘한 세포는 참조 값과 비교하여 하나 이상의 핵 및/또는 후성 유전학적 마커의 증가된 유전자 발현을 나타내는 것인 방법.
실시양태 5. 실시양태 4에 있어서, 마커는 HP1 감마, H3K9me3, 라미나 지지 단백질 LAP2알파, 및 SIRT1 단백질로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 6. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 회춘한 세포는 참조 값과 비교하여 증가된 단백질 분해 활성을 나타내는 것인 방법.
실시양태 7. 실시양태 6에 있어서, 증가된 단백질 분해 활성은 증가된 세포 자가소화포 형성, 증가된 키모트립신 유사 프로테아좀 활성, 또는 이들의 조합으로서 측정되는 것인 방법.
실시양태 8. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 회춘한 세포는 참조 값과 비교하여 개선된 미토콘드리아 건강 및 기능을 나타내는 것인 방법.
실시양태 9. 실시양태 8에 있어서, 개선된 미토콘드리아 건강 및 기능은 증가된 미토콘드리아 막 전위, 감소된 활성 산소 종(ROS), 또는 이들의 조합으로서 측정되는 것인 방법.
실시양태 10. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 회춘한 세포는 참조 값과 비교하여 하나 이상의 SASP 사이토카인의 감소된 발현을 나타내는 것인 방법.
실시양태 11. 실시양태 10에 있어서, SASP 사이토카인은 IL18, IL1A, GROA, IL22, 및 IL9 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
실시양태 12. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 회춘한 세포는 메틸화 랜드스케이프의 역전을 나타내는 것인 방법.
실시양태 13. 실시양태 12에 있어서, 메틸화 랜드스케이프의 역전은 호바스 시계 추정에 의해 측정되는 것인 방법.
실시양태 14. 실시양태 4 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 참조 값은 노화 세포로부터 얻는 것인 방법.
실시양태 15. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 메신저 RNA로 세포를 형질감염시키는 것은 리포펙타민 및 LT-1 매개 형질감염, 덱스트란 매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 일렉트로포레이션, mRNA의 리포솜 내 캡슐화, 및 직접 마이크로인젝션으로부터 선택되는 방법을 포함하는 것인 방법.
실시양태 16. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 17. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 포함하는 것인 방법.
실시양태 18. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 세포는 포유동물 세포인 방법.
실시양태 19. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 세포는 인간 세포인 방법.
실시양태 20. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 세포는 노령 대상체로부터 유래된 것인 방법.
실시양태 21. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 세포는 섬유아세포, 내피 세포, 연골 세포, 골격근 줄기 세포, 각질 세포, 중간엽 줄기 세포 및 각막 상피 세포로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 22. 실시양태 21에 있어서, 세포는 중간엽 줄기 세포인 방법.
실시양태 23. 실시양태 22에 있어서, 회춘한 중간엽 줄기 세포는 노화 파라미터(p16, p21 및 양성 SAβGal 염색)의 감소, 증가된 세포 증식, 및/또는 ROS 수준의 감소를 나타내는 것인 방법.
실시양태 24. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내에서 수행되는 방법.
실시양태 25. 실시양태 24에 있어서, 생체 내에서 수행되는 방법.
실시양태 26. 실시양태 25에 있어서, 세포는 조직 또는 기관 내에 있는 것인 방법.
실시양태 27. 실시양태 25 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 조직 또는 기관 내의 노화 세포의 수를 감소시키는 방법.
실시양태 28. 실시양태 25 내지 27 중 어느 하나에 있어서, IL18, IL1A, GROA, IL22, 및 IL9 중 하나 이상의 발현을 감소시키는 방법.
실시양태 29. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 기능을 회복시키거나, 효능을 증가시키거나, 생존능을 향상시키거나, 세포의 복제능 또는 수명을 증가시키거나, 이들의 조합을 유도하는 방법.
실시양태 30. 실시양태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 형질감염은 5일 동안 매일 1회 수행되는 것인 방법.
실시양태 31. 실시양태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 형질감염은 4일 동안 매일 1회 수행되는 것인 방법.
실시양태 32. 실시양태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 형질감염은 3일 동안 매일 1회 수행되는 것인 방법.
실시양태 33. 실시양태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 형질감염은 2일 동안 매일 1회 수행되는 것인 방법.
실시양태 34. 노화 관련 질환 또는 병태, 연골 변성 장애, 신경 변성 장애, 및/또는 근골격계 기능장애에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA를 포함하는 치료 유효량의 세포를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 35. 실시양태 34에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 36. 실시양태 34 또는 35에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 포함하는 것인 방법.
실시양태 37. 실시양태 34 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 노화 관련 질환 또는 병태를 갖는 것인 방법.
실시양태 38. 실시양태 34의 방법에 있어서, 노화 관련 질환 또는 병태는 눈, 피부, 또는 근골격계 기능장애로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 39. 실시양태 34 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 연골 변성 장애를 갖는 것인 방법.
실시양태 40. 실시양태 39에 있어서, 장애는 관절염, 연골병증, 척추관절증, 강직성 척추염, 홍반성 루푸스, 재발성 다발연골염, 및 쇼그렌 증후군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 41. 실시양태 39 또는 40에 있어서, 치료는 염증 인자의 발현을 감소시키고/거나 ATP 및 콜라겐 대사를 증가시키는 것인 방법.
실시양태 42. 실시양태 41에 있어서, 염증 인자는 RANKL, iNOS2, IL6, IFNα, MCP3 및 MIP1A로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 43. 실시양태 42에 있어서, ATP 및 콜라겐 대사는 증가된 ATP 수준, 감소된 ROS 및 증가된 SOD2, 증가된 COL2A1 및 연골 세포에 의한 전반적 증식 중 하나 이상에 의해 측정되는 것인 방법.
실시양태 44. 실시양태 34 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 근골격계 기능장애를 갖는 것인 방법.
실시양태 45. 실시양태 34 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 치료 유효량의 세포를 투여하는 단계는 주사 또는 외과적 이식을 포함하는 것인 방법.
실시양태 46. 실시양태 34 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 치료 유효량의 회춘한 세포는 섬유아세포, 내피 세포, 연골 세포, 골격근 줄기 세포, 각질 세포, 중간엽 줄기 세포 및 각막 상피 세포로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 47. 실시양태 46에 있어서, 치료 유효량의 회춘한 세포는 각막 상피 세포인 방법.
실시양태 48. 실시양태 47에 있어서, 회춘한 각막 상피는 노화 파라미터의 감소를 나타내는 것인 방법.
실시양태 49. 실시양태 48에 있어서, 노화 파라미터는 p21 및 p16의 발현, 미토콘드리아 생합성 PGC1α, 및 염증 인자 IL8의 발현 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
실시양태 50. 노화 관련 질환 또는 병태, 연골 변성 장애, 및/근골격계 기능장애에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 치료 유효량의 하나 이상의 비통합 메신저 RNA를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 51. 실시양태 50에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 52. 실시양태 50, 51 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 포함하는 것인 방법.
실시양태 53. 실시양태 50 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 노화 관련 질환 또는 병태를 갖는 것인 방법.
실시양태 54. 실시양태 53에 있어서, 노화 관련 질환 또는 병태는 눈, 피부, 또는 근골격계 기능장애로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 55. 실시양태 50 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 연골 변성 장애를 갖는 것인 방법.
실시양태 56. 실시양태 55에 있어서, 장애는 관절염, 연골병증, 척추관절증, 강직성 척추염, 홍반성 루푸스, 재발성 다발연골염, 및 쇼그렌 증후군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 57. 실시양태 50 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 근골격계 기능장애를 갖는 것인 방법.
실시양태 58. 실시양태 50 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 치료 유효량의 하나 이상의 비통합 메신저 RNA를 투여하는 단계는 표적 세포로의 직접 주입을 포함하는 것인 방법.
실시양태 59. 실시양태 58에 있어서, 표적 세포는 상피 세포, 내피 세포, 결합 조직 세포, 근육 세포, 및 신경계 세포로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 60. 조작된 조직을 생체 외에서 회춘시키는 방법으로서, 연속 5일 이하 동안 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 조직을 형질감염시켜, 회춘한 조작된 조직을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 61. 실시양태 60에 있어서, 조작된 조직은 노화 파라미터, 염증 유발성 인자의 감소, 조직학적 점수의 개선, 또는 이들의 조합을 나타내는 것인 방법.
실시양태 62. 실시양태 60 또는 61에 있어서, 조작된 조직은 조작된 피부 조직인 방법.
실시양태 63. 실시양태 60 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 노화 파라미터는 p16 및 양성 SaβGal 염색 및 염증 유발성 인자 IL8 및 MMP1로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 64. 실시양태 60 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 조직학적 점수는 모폴로지, 조직화 및/또는 퀄리티를 포함하는 것인 방법.
실시양태 65. 회춘한 세포를 포함하는 약학 조성물로서, 회춘한 세포는 연속 5일 이하 동안 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 세포를 형질감염시킴으로써 수득되는 것인 조성물.
실시양태 66. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로부터 선택되는 것인 조성물.
실시양태 67. 실시양태 65 또는 66에 있어서, 세포는 HP1 감마, H3K9me3, LAP2알파, SIRT1의 증가된 발현, 증가된 미토콘드리아 막 전위 및 감소된 활성 산소 종, 및 SASP 사이토카인의 감소된 발현 중 하나 이상을 나타내는 것인 조성물.
실시양태 68. 실시양태 67에 있어서, SASP 사이토카인은 IL18, IL1A, GROA, IL22, 및 IL9 중 하나 이상을 포함하는 것인 조성물.
실시양태 69. 실시양태 65 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 영양분, 사이토카인, 성장 인자, 세포 외 기질(ECM) 성분, 항생제, 항산화제, 및 면역 억제제로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 70. 실시양태 65 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 71. 실시양태 65 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 세포는 자가 유래 또는 동종 이계인 조성물.

Claims (71)

  1. 세포의 회춘 방법으로서, 연속 5일 이하 동안 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 세포를 형질감염시켜, 회춘한 세포를 생성하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일이 젊은 세포의 트랜스크립톰 프로파일과 더 유사해지는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 회춘한 세포의 트랜스크립톰 프로파일이 RPL37, RHOA, SRSF3, EPHB4, ARHGAP18, RPL31, FKBP2, MAP1LC3B2, Elf1, Phf8, Pol2s2, Taf1 및 Sin3a로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 유전자 발현의 증가를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 회춘한 세포는 참조 값과 비교하여 하나 이상의 핵 및/또는 후성 유전학적 마커의 증가된 유전자 발현을 나타내는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 마커가 HP1 감마, H3K9me3, 라미나 지지 단백질 LAP2알파, 및 SIRT1 단백질로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 회춘한 세포는 참조 값과 비교하여 증가된 단백질 분해 활성을 나타내는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 증가된 단백질 분해 활성은 증가된 세포 자가소화포 형성, 증가된 키모트립신 유사 프로테아좀 활성, 또는 이들의 조합으로서 측정되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 회춘한 세포는 참조 값과 비교하여 개선된 미토콘드리아 건강 및 기능을 나타내는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 개선된 미토콘드리아 건강 및 기능은 증가된 미토콘드리아 막 전위, 감소된 활성 산소 종(ROS: reactive oxygen species), 또는 이들의 조합으로서 측정되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 회춘한 세포는 참조 값과 비교하여 하나 이상의 SASP 사이토카인의 감소된 발현을 나타내는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, SASP 사이토카인은 IL18, IL1A, GROA, IL22, 및 IL9 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 회춘한 세포는 메틸화 랜드스케이프(methylation landscape)의 역전을 나타내는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 메틸화 랜드스케이프의 역전은 호바스(Horvath) 시계 추정에 의해 측정되는 것인 방법.
  14. 제4항에 있어서, 참조 값은 노화 세포로부터 얻는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 메신저 RNA로 세포를 형질감염시키는 것은 리포펙타민 및 LT-1 매개 형질감염, 덱스트란 매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 일렉트로포레이션, mRNA의 리포솜 내 캡슐화, 및 직접 마이크로인젝션으로부터 선택되는 방법을 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자가 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자가 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 세포가 인간 세포인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 세포가 노령 대상체로부터 유래된 것인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 세포가 섬유아세포, 내피 세포, 연골 세포, 골격근 줄기 세포, 각질 세포, 중간엽 줄기 세포 및 각막 상피 세포로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 세포가 중간엽 줄기 세포인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 회춘한 중간엽 줄기 세포는 노화 파라미터(p16, p21 및 양성 SAβGal 염색)의 감소, 증가된 세포 증식, 및/또는 ROS 수준의 감소를 나타내는 것인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내에서 수행되는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 생체 내에서 수행되는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 세포가 조직 또는 기관 내에 있는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 조직 또는 기관 내의 노화 세포의 수를 감소시키는 방법.
  28. 제27항에 있어서, IL18, IL1A, GROA, IL22, 및 IL9 중 하나 이상의 발현을 감소시키는 방법.
  29. 제1항에 있어서, 기능을 회복시키거나, 효능을 증가시키거나, 생존능을 향상시키거나, 세포의 복제능 또는 수명을 증가시키거나, 이들의 조합을 유도하는 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 형질감염이 5일 동안 매일 1회 수행되는 것인 방법.
  31. 제1항에 있어서, 상기 형질감염이 4일 동안 매일 1회 수행되는 것인 방법.
  32. 제1항에 있어서, 상기 형질감염이 3일 동안 매일 1회 수행되는 것인 방법.
  33. 제1항에 있어서, 상기 형질감염이 2일 동안 매일 1회 수행되는 것인 방법.
  34. 노화 관련 질환 또는 병태, 연골 변성 장애, 신경 변성 장애, 및/또는 근골격계 기능장애에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA를 포함하는 치료 유효량의 세포를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자가 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로부터 선택되는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자가 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 포함하는 것인 방법.
  37. 제34항에 있어서, 대상체가 노화 관련 질환 또는 병태를 갖는 것인 방법.
  38. 제34항에 있어서, 노화 관련 질환 또는 병태가 눈, 피부, 또는 근골격계 기능장애로부터 선택되는 것인 방법.
  39. 제34항에 있어서, 대상체가 연골 변성 장애를 갖는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 장애가 관절염, 연골병증, 척추관절증, 강직성 척추염, 홍반성 루푸스, 재발성 다발연골염, 및 쇼그렌 증후군으로부터 선택되는 것인 방법.
  41. 제34항에 있어서, 치료가 염증 인자의 발현을 감소시키고/거나 ATP 및 콜라겐 대사를 증가시키는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 염증 인자가 RANKL, iNOS2, IL6, IFNα, MCP3 및 MIP1A로부터 선택되는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, ATP 및 콜라겐 대사가 증가된 ATP 수준, 감소된 ROS 및 증가된 SOD2, 증가된 COL2A1 및 연골 세포에 의한 전반적 증식 중 하나 이상에 의해 측정되는 것인 방법.
  44. 제34항에 있어서, 대상체가 근골격계 기능장애를 갖는 것인 방법.
  45. 제34항에 있어서, 치료 유효량의 세포를 투여하는 단계가 주사 또는 외과적 이식을 포함하는 것인 방법.
  46. 제34항에 있어서, 치료 유효량의 회춘한 세포가 섬유아세포, 내피 세포, 연골 세포, 골격근 줄기 세포, 각질 세포, 중간엽 줄기 세포 및 각막 상피 세포로부터 선택되는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 치료 유효량의 회춘한 세포가 각막 상피 세포인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 회춘한 각막 상피가 노화 파라미터의 감소를 나타내는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 노화 파라미터가 p21 및 p16의 발현, 미토콘드리아 생합성 PGC1α, 및 염증 인자 IL8의 발현 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  50. 노화 관련 질환 또는 병태, 연골 변성 장애, 및/근골격계 기능장애에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 치료 유효량의 하나 이상의 비통합 메신저 RNA를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자가 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로부터 선택되는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자가 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG를 포함하는 것인 방법.
  53. 제50항에 있어서, 대상체가 노화 관련 질환 또는 병태를 갖는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 노화 관련 질환 또는 병태가 눈, 피부, 또는 근골격계 기능장애로부터 선택되는 것인 방법.
  55. 제50항에 있어서, 대상체가 연골 변성 장애를 갖는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 장애가 관절염, 연골병증, 척추관절증, 강직성 척추염, 홍반성 루푸스, 재발성 다발연골염, 및 쇼그렌 증후군으로부터 선택되는 것인 방법.
  57. 제50항에 있어서, 대상체가 근골격계 기능장애를 갖는 것인 방법.
  58. 제50항에 있어서, 치료 유효량의 하나 이상의 비통합 메신저 RNA를 투여하는 단계가 표적 세포로의 직접 주입을 포함하는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 표적 세포가 상피 세포, 내피 세포, 결합 조직 세포, 근육 세포, 및 신경계 세포로부터 선택되는 것인 방법.
  60. 조작된 조직을 생체 외에서 회춘시키는 방법으로서, 연속 5일 이하 동안 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 조직을 형질감염시켜, 회춘한 조작된 조직을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 조작된 조직이 노화 파라미터, 염증 유발성 인자의 감소, 조직학적 점수의 개선, 또는 이들의 조합을 나타내는 것인 방법.
  62. 제60항에 있어서, 조작된 조직이 조작된 피부 조직인 방법.
  63. 제61항에 있어서, 노화 파라미터가 p16 및 양성 SaβGal 염색 및 염증 유발성 인자 IL8 및 MMP1로부터 선택되는 것인 방법.
  64. 제61항에 있어서, 조직학적 점수가 모폴로지, 조직화, 및/또는 퀄리티를 포함하는 것인 방법.
  65. 회춘한 세포를 포함하는 약학 조성물로서, 회춘한 세포는 연속 5일 이하 동안 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자를 코딩하는 하나 이상의 비통합 메신저 RNA로 세포를 형질감염시킴으로써 얻어지는 것인 약학 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 하나 이상의 세포 재프로그래밍 인자가 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 및 NANOG로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
  67. 제65항에 있어서, 세포가 HP1 감마, H3K9me3, LAP2알파, SIRT1의 증가된 발현, 증가된 미토콘드리아 막 전위 및 감소된 활성 산소 종, 및 SASP 사이토카인의 감소된 발현 중 하나 이상을 나타내는 것인 약학 조성물.
  68. 제67항에 있어서, SASP 사이토카인이 IL18, IL1A, GROA, IL22, 및 IL9 중 하나 이상을 포함하는 것인 약학 조성물.
  69. 제65항에 있어서, 영양분, 사이토카인, 성장 인자, 세포 외 기질(ECM: extracelluar matrix) 성분, 항생제, 항산화제, 및 면역 억제제로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함하는 약학 조성물.
  70. 제65항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  71. 제65항에 있어서, 세포가 자가 유래 또는 동종 이계인 약학 조성물.
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