KR20200068638A - 미숙아 뇌실내 출혈 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별법 - Google Patents

미숙아 뇌실내 출혈 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미숙아 뇌실내 출혈의 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor; VEGF)의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 뇌실내 출혈의 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법 및 상기 방법에 의해 선별된 고효능 줄기세포에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 뇌실내 출혈의 치료에서 VEGF가 중간엽 줄기세포의 신경세포 보호효과를 매개하는 중요한 인자이며 중간엽 줄기세포의 VEGF 발현수준과 신경세포 보호능 간의 상관관계를 확인하였는바, 중간엽 줄기세포의 선별에 있어서 VEGF의 수준을 측정하여 농도를 평가함으로써 우수한 신경세포 보호능을 갖는 고효능 줄기세포를 효율적으로 선별할 수 있으며, 상기 방법 및 이에 의해 선별된 고효능 줄기세포는 신생아 뇌실내 출혈을 포함하는 다양한 뇌혈관 질환의 치료에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

미숙아 뇌실내 출혈 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별법{Methods for Selecting Improved Stem Cell for Treating Intraventricular Hemorrhage of Premature Infants}
본 발명은 미숙아 뇌실내 출혈의 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 혈관내피성장인자(VEGF)의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 뇌실내 출혈의 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법, 상기 방법에 의해 선별된 고효능 줄기세포, 및 이의 용도에 관한 것이다.
뇌실내 출혈(intraventricular hemorrhage; IVH)은 주로 동정맥기형, 뇌동맥류의 파열, 시상부출혈, 또는 대뇌기정막출혈에 의해 발생하며, 깊은 의식장애, 사지마비, 호흡이상, 발열, 극소동공, 발한, 그밖의 자율신경증상 등이 나타나는 질환이다. 이러한 뇌실내 출혈은 CT로 관찰이 가능하여 조기에 적절한 처치를 할 수 있게 되었으나, 신생아 특히 미숙아들에서는 아직까지 사망 및 신경학적 장애를 야기하는 주요 질환이며, 효과적인 치료법이 거의 없는 실정이다. 따라서 뇌실내 출혈에 대한 새로운 치료법의 개발은 이러한 심각한 예후를 개선시킬 수 있는 매우 시급하고도 중요한 과제이다.
이와 관련하여, 최근 본 발명자들은 갓 출생한 백서에서 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 뇌실내 이식이 심각한 뇌실내 출혈에 의한 출혈 후 뇌수종(posthemorrhagic hydrocephalus) 및 뇌손상을 현저히 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 중간엽 줄기세포의 이식이 재생에 의한 기작 보다는 근거리분비(paracrine)에 의한 항염증 및 세포사멸 억제효과를 통해 기관지폐이형성증(bronchopulmonary dysplasia), 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome), 및 신생아 뇌졸중(neonatal stroke)과 같은 다양한 질환에도 현저한 치료효과가 있음을 보고한바 있다.
한편, 다양한 성장인자들 예컨대, 뇌 유래 신경 성장인자(brainderived neurotrophic factor; BDNF), 신경 성장인자(nerve growth factor; NGF), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor; IGF), 및 인터류킨(interleukins) 등은 저산소증(hypoxia) 및/또는 허혈(ischemia) 후의 뇌 손상 복구 능력을 향상시킨다고 보고되어 있다(Zheng, et al. Brain Research, 2010). 그러나 심각한 뇌실내 출혈 시 중간엽 줄기세포 이식에 의한 신경보호 효과를 나타내는 특정 근거리분비 인자(paracrine factor), 특히 VEGF가 미치는 영향 및 이의 작용기전은 아직까지 규명되지 않았다.
본 발명자들은 중간엽 줄기세포를 이용한 뇌혈관 질환의 치료에서 VEGF의 영향 및 이의 작용기전을 규명하기 위해 연구한 결과, VEGF의 발현이 저해되는 경우 중간엽 줄기세포 이식에 의한 뇌실내 출혈의 치료효과가 나타나지 않았으며, 뇌실 주변 조직에서의 반응성 아교화와 세포사멸의 증가, 수초화 감소, 및 뇌 염증 증가 등의 증상이 개선되지 않는 것을 확인함으로써 중간엽 줄기세포의 뇌실내 출혈의 치료에 있어서 VEGF가 중요한 인자임을 확인하였으며, 상기 중간엽 줄기세포의 VEGF의 발현수준과 신경세포 보호능 간의 상관관계를 실험적으로 규명하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명은 VEGF(vascular endothelial growth factor) 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 뇌혈관 질환의 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별 방법 및 상기 방법에 의해 선별된 고효능 줄기세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 고효능 줄기세포를 포함하는, 뇌혈관 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor; VEGF)의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 고효능 줄기세포의 선별방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 방법은 (a) 줄기세포를 배양하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 줄기세포 배양액에서 VEGF의 농도를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 측정된 농도에 근거하여 신경세포 보호능력을 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 신경세포 보호능력의 평가는, 상기 측정된 VEGF의 농도가 50 pg/ml 이상일 경우 고효능인 것으로 판정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 신경세포 보호능력의 평가는, 상기 측정된 VEGF의 농도가 100 pg/ml 이상일 경우 고효능인 것으로 판정할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 선별방법에 의해 선별된, 뇌혈관 질환의 치료를 위한 고효능 줄기세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고효능 줄기세포를 포함하는, 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 뇌혈관 질환은 신생아 뇌실내 출혈(intraventricular hemorrhage; IVH)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 고효능은 신경세포 보호능인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반에서 유래된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌혈관 질환의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 뇌혈관 질환 치료용도를 제공한다.
본 발명자들은 뇌실내 출혈이 유발된 백서에서 VEGF의 발현을 특이적으로 저해시킨 중간엽 줄기세포를 이식하는 경우 일반 중간엽 줄기세포를 이식한 경우와는 달리, 뇌실내 출혈의 치료효과가 나타나지 않고 반응성 아교화, 세포사멸 및 염증반응의 증가, 및 수초화 감소 현상이 개선되지 않는 것을 확인함에 따라 뇌실내 출혈의 치료에서 VEGF가 중간엽 줄기세포의 신경세포 보호효과를 매개하는 중요한 인자임을 확인하였으며, 중간엽 줄기세포의 VEGF 발현수준과 신경세포 보호능 간의 상관관계를 규명하였다. 이에, 중간엽 줄기세포의 선별에 있어서 VEGF의 수준을 측정하여 농도를 평가함으로써 우수한 신경세포 보호능을 갖는 고효능 줄기세포를 효율적으로 선별할 수 있으며, 상기 방법 및 이에 의해 선별된 고효능 줄기세포는 신생아 뇌실내 출혈을 포함하는 다양한 뇌혈관 질환의 치료에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은, VEGF siRNA의 기능을 검증한 것으로, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에 상기 VEGF siRNA를 트랜스펙션한 후 상기 중간엽 줄기세포의 배양액에서 시간 경과에 따른 VEGF 수준을 측정한 결과이다.
도 2는, 뇌실내 출혈이 유발된 대조군(IVH+Saline), 일반 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+MSC), scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+Scrambled siRNA MSC), 및 VEGF의 발현이 저해된 중간엽 줄기세포가 이식된 그룹(IVH+VEGF KD MSC)에 대하여, 뇌실 확장 정도를 뇌 MRI로 비교분석한 결과이다.
도 3은, 감각운동 기능을 평가한 결과로서, 뇌실내 출혈이 유발된 대조군(IVH+Saline), 일반 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+MSC), scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+Scrambled siRNA MSC), 및 VEGF의 발현이 저해된 중간엽 줄기세포가 이식된 그룹(IVH+VEGF KD MSC)에 대하여, 음성 주지성(negative geotaxis) 평가(도 3a) 및 로타로드(rotarod) 평가(도 3b)를 실시한 결과이다.
도 4는, 뇌실내 출혈이 유발된 대조군(IVH+Saline), 일반 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+MSC), scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+Scrambled siRNA MSC), 및 VEGF의 발현이 저해된 중간엽 줄기세포가 이식된 그룹(IVH+VEGF KD MSC)에 대하여, 각각 반응성 아교화(GFAP), 세포사멸(TUNEL), 및 수초화(MBP) 분석을 실시한 결과이다.
도 5는, 뇌실내 출혈이 유발된 대조군(IVH+Saline), 일반 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+MSC), scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+Scrambled siRNA MSC), 및 VEGF의 발현이 저해된 중간엽 줄기세포가 이식된 그룹(IVH+VEGF KD MSC)에 대하여, 뇌실 주변 조직의 염증화를 분석하기 위한 ED-1(도 5a) 및 염증성 사이토카인(IL-1a, IL-1b, IL-6, TNF-α)(도 5b)의 발현수준 분석 결과이다.
도 6은 고효능 줄기세포 예측/선별을 위한 VEGF level과 신경세포 생존율의 상관관계를 분석한 결과이다.
본 발명자들은, VEGF의 발현이 저해되는 경우 중간엽 줄기세포 이식에 의한 뇌실내 출혈의 치료효과가 나타나지 않았으며, 뇌실 주변 조직에서의 반응성 아교화와 세포사멸의 증가 및 수초화 감소, 및 뇌 염증 증가 등이 개선되지 않음을 확인하였는바, 중간엽 줄기세포의 뇌실내 출혈의 치료에 있어서 VEGF가 중요 인자임을 실험적으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명은 VEGF(Vascular endothelial growth factor)의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 고효능 줄기세포의 선별방법 및 상기 방법에 의해 선별된 고효능 줄기세포를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 (a) 줄기세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 줄기세포 배양액에서 VEGF의 농도를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 측정된 농도에 근거하여 신경세포 보호능력을 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명자들은 실시예에서 갓 출생한 백서에 대하여 5개 그룹 즉, 정상 대조군(NC), 뇌실내 출혈이 유발된 대조군(IVH+Saline), 일반 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+MSC), scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH-scrambled siRNA MSC), 및 VEGF의 발현이 저해된 중간엽 줄기세포가 이식된 그룹(IVH+VEGF KD MSC)으로 분류하고, 상기 그룹들에 대하여 다양한 실험을 통해 VEGF의 수준을 측정함으로써 고효능 줄기세포를 선별할 수 있음을 실험적으로 입증하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 상기 5개 그룹에 대하여 뇌 MRI를 실시하여 전체 뇌실의 volume / 전체 뇌 volume 비율을 계산해 뇌실 확장 정도를 측정한 결과, 상기 일반 중간엽 줄기세포 및 scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포를 이식한 그룹과 달리 VEGF의 발현이 저해된 중간엽 줄기세포를 이식한 경우에는 뇌실의 확장 정도가 현저히 증가한 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 5개 그룹에 대하여 감각 운동 행동평가로써 음성 주지성(negative geotaxis) 평가 및 로타로드(rotarod) 평가를 각각 실시한 결과, 역시 일반 중간엽 줄기세포 및 scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포를 이식한 그룹과 달리 VEGF의 발현이 저해된 중간엽 줄기세포를 이식한 경우에는 손상된 운동능력이 개선되지 않는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 5개 그룹에 대하여 면역조직화학염색 및 TUNEL 어세이를 통해 반응성 아교화 분석, 세포사멸 분석, 및 수초화 분석을 실시한 결과, 일반 중간엽 줄기세포 및 scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포를 이식한 그룹과 달리 VEGF의 발현이 저해된 중간엽 줄기세포를 이식한 경우에는 반응성 아교화 및 세포사멸의 증가와 수초화 감소가 개선되지 않는 것을 확인하였다(실시예 4-1 내지 4-3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 뇌실 주변 조직의 염증 개선여부를 분석하기 위해 상기 5개 그룹에 대하여 뇌 관상부분의 ED-1-positive 세포 및 뇌실 주변 조직의 현탁액을 이용해 염증성 사이토카인 수준을 측정한 결과, 역시 VEGF의 발현이 저해된 중간엽 줄기세포를 이식한 경우에는 ED-1-positive 세포 및 염증성 사이토카인 수준의 감소가 나타나지 않았다(실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 뇌실내 출혈의 in vitro model을 제조하여 세포 사멸이 유도된 신경세포에 각기 다른 VEGF level의 발현을 보이는 중간엽 줄기세포들을 lot별로 처리한 후 VEGF level에 따른 상기 신경세포의 생존율을 분석하였다. 그 결과, VEGF의 발현수준이 높을수록 신경세포의 생존율이 높게 나타난 것을 확인하였다.
상기 실시예 결과들을 통해 VEGF가 뇌실내 출혈의 치료에 있어서 중간엽 줄기세포가 신경세포 보호효과를 나타내는데 주요한 매개인자임을 알 수 있으며, 따라서 VEGF 농도에 근거하여 줄기세포의 신경세포 보호능력을 평가할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서 보다 바람직하게 줄기세포의 신경세포 보호능력의 평가는 측정된 VEGF의 농도가 50 pg/ml 이상일 경우, 더욱 바람직하게는 100 pg/ml 이상일 경우 고효능인 것으로 판정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 뇌혈관 질환은 본 발명에 따른 고효능 중간엽 줄기세포에 의해 치료가 가능한 질환을 모두 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 신생아 뇌실내 출혈(intraventricular hemorrhage; IVH)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 고효능은 신경세포 보호능을 의미하며, 이는 신경세포의 사멸 및 반응성 아교화 억제, 및 수초화 증가를 포함하며, 나아가 뇌실 확장 감소 및 운동능력 회복 등과 같은 뇌 기능 회복을 모두 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, '줄기세포'란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있고, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반에서 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 고효능 줄기세포를 포함하는, 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 고효능 줄기세포와 함께 뇌혈관 질환의 치료 효과를 갖는 공지의 보조성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 뇌혈관 질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 개체의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서 투여는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 고효능 줄기세포를 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌혈관 질환 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 뇌혈관 질환 치료용도를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험방법
1-1. 세포 준비 및 VEGF siRNA 트랜스펙션(Transfection)
본 발명에서 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 메디포스트(Medipost Co., Ltd., Seoul, Korea)에서 제공받아 이용하였다.
한편, VEGF siRNA 및 scrambled siRNA는 각각 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였으며, 제조사의 프로토콜에 준하여 상기 각각의 siRNA를 Oligofectamine(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용해 상기 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후 VEGF siRNA에 의해 VEGF의 발현이 저해되었는지 확인하기 위하여, 시간 경과에 따라 상기 중간엽 줄기세포의 배양배지를 회수하여 VEGF의 발현 수준 변화를 측정하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 VEGF의 발현수준이 트랜스펙션 하지 않은 중간엽 줄기세포(Non-transfected MSC) 및 VEGF 유전자를 표적하지 않는 스크램블 siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포(Scrambled siRNA MSC)에 비하여 현저히 감소된 것을 확인하였다.
1-2. 트롬빈 처리 및 세포 배양(Thrombin exposure in vitro cell culture)
E18.5의 미발달 마우스로부터 분리한 뇌 신경세포를 일차배양하고, 96웰 플레이트에 5×103 cells/well의 신경세포를 씨딩한 후 각 웰 당 B-27 보충제(GIBCO, Gaithersburg, MD, USA)가 포함된 100 μl의 Nerurobasal medium을 이용해 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 in vitro에서 출혈로 인한 신경손상을 유도하기 위하여, 상기 신경세포에 40 U의 트롬빈(Reyon pharm. Co. Ltd, Seoul, South Korea)을 처리하였으며, 트롬빈이 처리된 신경세포를 완전배지(complete medium)에서 단독으로 배양하거나, 또는 트랜스펙션 하지 않은 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(1x103), scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포, 또는 VEGF siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포를 24시간 동안 위쪽 챔버에 씨딩하여 공동 배양하였다.
1-3. 동물모델
모든 실험 프로토콜은 삼성생명과학연구소의 동물실험윤리위원회에 승인을 받은 후 진행하였다. 실험동물로는 갓 출생한 SD 백서(Sprague-Dawley rats)를 이용하였으며, 출생 후 4일째(P4)부터 32일(P32)까지 실험을 진행하였다.
P4의 백서에서 뇌실내 출혈을 유도하기 위하여, 할로탄(halothane)과 2:1 비율의 아산화질소(nitrous oxide):산소를 혼합한 마취제로 백서를 마취시킨 후 어미 백서로부터 혈액 200 μl를 채취하여 100 μl씩 양측 뇌실에 주입하였다. 뇌실내 출혈을 유도하고 1일 후인 P5 백서에서 뇌실내 출혈 정도를 확인하기 위해 뇌 MRI(magnetic resonance imaging)를 실시하였으며, 뇌실내 출혈이 거의 유도되지 않거나 육안으로 관찰되지 않는 백서는 분석에서 제외하였다. 이후 P6에 뇌실내 출혈이 유발된 백서를 무작위로 선정하여 다음과 같은 5개 그룹으로 분류하였다: 정상 대조군(NC), 뇌실내 출혈이 유발된 대조군(IVH+Saline), 일반 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+MSC), scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+Scrambled siRNA), 및 VEGF siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+VEGF KD MSC). 실험을 진행하는 동안, 뇌실내 출혈을 유도하지 않은 정상 대조군 그룹(NC)의 백서들은 실험 마지막 날인 P32까지 모두 생존한 반면, 뇌실내 출혈을 유발시킨 각 그룹에서는 일부 백서들이 사망하여 이들을 제외시키고 실험을 진행하였다. 중간엽 줄기세포 이식을 위해 IVH+MSC, IVH+Scrambled siRNA, 및 IVH+VEGF KD MSC 그룹의 백서에게 각각 일반 중간엽 줄기세포, scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포, 또는 VEGF siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포를 10 μl의 일반 식염수와 함께 1×105개씩 오른쪽 뇌실 내로 투여하였다. 중간엽 줄기세포를 이식하지 않는 IC 그룹의 백서에게는 동일한 부피의 식염수를 투여하였다. 이후 P11 및 P32일 째에 각 그룹에 대한 뇌 MRI 이미지 결과를 얻었으며, P32일에 모든 그룹의 백서들을 안락사 시킨 후 뇌 조직샘플을 회수하였다.
한편, 백서의 감각운동 신경을 평가하기 위한 행동평가로서, 음성주지성(negative geotaxis) 평가, 및 로타로드(rotarod) 평가를 실시하였다.
1-4. 통계분석(Statistical analyses)
샘플 크기 측정은 이전 연구 결과인 power 0.8 및 Type I error probability 0.05에 따라 P32에 뇌실 부피차이를 기반으로 하였다. 실험데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 연속적인 가변성을 위해, 각 그룹들 사이의 통계적 비교는 one-way ANOVA 및 Tukey’s post hoc 분석을 사용하여 수행하였다. 시간에 따른 변화 분석을 위해서는 반복적 측정을 위해 univariate general linear model을 이용해 Tukey’s post hoc 비교를 수행하였다. 모든 데이터는 SPSS version 18.0(IBM, Chicago, IL, USA)을 이용해 분석하였고, P < 0.05의 경우 통계적으로 유의한 차이가 존재하는 것으로 판단하였다.
실시예 2. 뇌 MRI 분석
본 발명자들은 종래 허혈성 저산소뇌병증이 유발된 신생 백서에서 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor; VEGF) 유전자 도입에 의한 신경의 기능적 회복이 향상된다는 연구 결과 등을 바탕으로 뇌실내 출혈에 대한 중간엽 줄기세포의 신경세포 보호효과에 있어서 VEGF가 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 이를 위해, 상기 실시예 1-1에 기재한 바와 같이 VEGF에 특이적인 siRNA를 이용하여 중간엽 줄기세포 내 VEGF의 발현을 저해하는 방법을 이용하였으며, 먼저 VEGF 발현 저해에 따른 영향을 분석하기 위해 실시예 1-3의 방법에 따라 백서에 뇌실내 출혈을 유발시킨 후 1, 7, 및 28일(P5, P11, 및 P32) 째에 각 그룹에 대한 뇌 MRI를 실시하였다.
P5, P11, 및 P32에 각각 전체 뇌실의 volume/전체 뇌 volume 비율을 계산하여 뇌실 확장 정도를 측정한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 P5에는 모든 그룹에서 별다른 차이가 나타나지 않은 반면, P11 및 P32에는 뇌실내 출혈이 유발된 대조군(IVH+Saline) 및 VEGF의 발현이 저해된 중간엽 줄기세포가 이식된 그룹(IVH+VEGF KD MSC)의 경우 뇌실 확장 정도가 현저히 증가하였다. 이에 반하여, 일반 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+MSC) 또는 scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH-scrambled siRNA MSC)의 경우에는 뇌실 확장 정도가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 3. 감각 운동 행동평가 분석
상기 실시예 2의 결과에 더하여, 감각운동 기능을 평가하기 위해, 음성 주지성(negative geotaxis) 평가 및 로타로드(rotarod) 평가를 실시하였다. 먼저, P11, P18, P25 및 P32에 음성 주지성 평가를 수행하였으며, 구체적으로 종래 공지된 방법에 따라 경사판 위에 백서의 머리가 하방을 향하도록 놓아두고, 상기 머리가 경사면 뒤쪽을 향하게 되는데 소요되는 시간을 기록함으로써 분석되었다.
평가 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 뇌실내 출혈이 유발된 대조군(IVH+Saline)의 경우, 정상 대조군에 비해 심각한 운동 기능 손상이 관찰되었다. 그러나 일반 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+MSC) 또는 scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH-scrambled siRNA MSC)의 경우에는 손상된 운동능력이 현저히 개선된 것을 확인하였다. 반면, VEGF의 발현을 저해시킨 중간엽 줄기세포를 이식한 그룹(IVH+VEGF KD MSC)에서는 운동능력의 개선 효과가 나타나지 않는 것을 확인하였다.
다음으로, P30, P31, 및 P32에 각각 로타로드 평가를 수행하였다. 그 결과, P30에 처음 로타로드 평가를 수행하였을 때는 각 그룹 간의 현저한 차이가 나타나지 않았으나, 정상 대조군(Normal)의 경우 P31 및 P32에는 학습 효과로 인해 떨어지는데 걸리는 시간이 현저히 증가한 반면, 뇌실내 출혈이 유발된 대조군(IVH+Saline)의 경우에는 P31 및 P32에 막대에서 떨어지는데 걸리는 시간이 정상 대조군에 비해 현저히 짧게 측정되었다. 이에 반해, 일반 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+MSC) 또는 scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH-scrambled siRNA MSC)의 경우에는 손상된 운동 기능이 현저히 개선된 것을 확인하였으나, VEGF의 발현을 저해시킨 중간엽 줄기세포를 이식한 그룹(IVH+VEGF KD MSC)에서는 상기와 같은 개선 효과가 나타나지 않는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통해 중간엽 줄기세포에 의한 뇌실내 출혈의 치료효과에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포 내 VEGF의 발현이 중요한 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.
실시예 4: VEGF 발현 저해에 따른 반응성 아교화, 세포사멸, 및 수초화 분석
4-1. 반응성 아교화 분석
중간엽 줄기세포 내 VEGF의 발현 저해에 따른 뇌실 주변 조직에서의 반응성 아교화를 분석하기 위해 면역조직화학염색법을 통해 GFAP가 염색된 세포들을 관찰하고, 정량적인 수준에서 비교하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 뇌실내 출혈이 유발된 대조군(IVH+S)의 경우 붉은 색으로 보이는 GFAP의 염색 정도가 증가하였으나, 일반 중간엽 줄기세포 이식 그룹(IVH+MSC) 및 scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포를 이식(IVH+scMSC)한 경우 GFAP의 염색 정도가 감소한 것을 확인하였다. 이에 반해 VEGF의 발현이 저해된 중간엽 줄기세포를 이식(IVH+siVEGF MSC)한 경우에는 상기와 같은 감소효과가 나타나지 않는 것을 확인하였다.
4-2. 세포사멸 분석
뇌실내 출혈 후 중간엽 줄기세포 내 VEGF의 발현 저해에 따른 세포사멸 정도를 확인하기 위하여, P32에 뇌실 주변 조직을 이용해 TUNEL 분석을 실시하여 TUNEL 시약에 의해 염색된 TUNEL positive 세포를 관찰하고 이를 정량적으로 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 뇌실내 출혈이 유발된 대조군(IVH+S)의 경우 정상대조군(NC)에 비해 TUNEL-positive 세포 수가 현저히 증가한 반면, 일반 중간엽 줄기세포를 이식한 그룹(IVH+MSC) 및 scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포를 이식(IVH+scMSC)한 경우에는 TUNEL positive 세포 수가 현저히 감소된 것을 확인하였다. 이에 반하여 VEGF의 발현이 저해된 중간엽 줄기세포를 이식(IVH+siVEGF MSC)한 경우에는 상기와 같은 세포사멸 억제효과가 나타나지 않는 것을 확인하였다.
4-3. 수초화 분석
마지막으로 뇌실 주변 조직에서 수초화 정도를 평가하기 위하여, MBP 항체를 이용한 면역염색을 실시하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 뇌실내 출혈이 유발된 대조군(IVH+S)의 경우 정상대조군(NC)에 비해 MBP 단백질의 발현이 현저히 감소한 것으로 나타났다. 그러나 일반 중간엽 줄기세포를 이식(IVH+MSC)한 경우 및 scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포를 이식(IVH+scMSC)한 경우에는 MBP 발현수준이 증가한 것을 통해 신경세포의 수초화가 개선된 것을 확인하였다. 이에 반하여 VEGF의 발현이 저해된 중간엽 줄기세포를 이식(IVH+siVEGF MSC)한 경우에는 상기와 같은 수초화 개선 효과가 나타나지 않는 것을 확인하였다.
실시예 5: 뇌실 주변 조직의 염증 분석
이식된 중간엽 줄기세포가 뇌실내 출혈에 의해 유발되는 뇌 염증을 개선시키는지 검증하고 이때 VEGF가 미치는 영향을 알아보기 위하여, P32에 뇌실 주변 조직의 균질 현탁액으로부터 염증성 사이토카인인 IL-1α, IL-1ß, IL-6, 및 TNF-α의 수준을 측정하였으며, 뇌 관상부분(coronal sections)에서 ED-1-positive 세포 수를 측정하여 분석하였다.
그 결과, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이 뇌실내 출혈이 유발된 대조군(IVH+S)의 경우 정상 대조군(NC)에 비하여 뇌실 주변 뇌 조직에서 ED-1-positive 세포 및 염증성 사이토카인 수준이 모두 현저히 증가한 것으로 나타났다. 그러나, 일반 중간엽 줄기세포를 이식(IVH+MSC)한 경우 및 scrambled siRNA를 트랜스펙션한 중간엽 줄기세포를 이식(IVH+scMSC)한 경우에는 ED-1-positive 세포 및 염증성 사이토카인 수준이 감소하였으며, 이에 반해 VEGF의 발현이 저해된 중간엽 줄기세포를 이식(IVH+siVEGF MSC)한 경우에는 이러한 감소효과가 나타나지 않은 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통해 뇌실내 출혈에서 중간엽 줄기세포의 신경세포 보호효과를 확인하였고, 이러한 효과에 있어서 상기 중간엽 줄기세포 내 VEGF의 발현이 중요한 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 따라서 상기 결과는 미숙아 뇌실내 출혈의 치료를 위한 고효능의 중간엽 줄기세포를 선별하는데 있어서 VEGF의 발현수준을 평가하는 것이 중요한 의미가 있음을 입증하는 것이다.
실시예 6: VEGF level 분석에 의한 고효능 줄기세포 예측/선별
VEGF의 농도 수준에 따라 중간엽줄기세포의 신경세포 보호 효능이 다르게 나타나는지 검증하기 위해, 마우스 배아의 뇌(embryo brain)로부터 1차 neuronal culture를 시행한 후 얻어진 신경세포에 트롬빈을 처리하여, 뇌실내 출혈의 in vitro model을 제조하였다. 상기 세포 사멸이 유도된 신경세포에 각기 다른 VEGF level의 발현을 보이는 중간엽줄기세포들을 lot별로 처리한 후 각 lot별로 분비하는 VEGF level에 따라서 세포 생존율을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 VEGF를 50 pg/ml 농도 이상으로 발현하는 경우, 보다 바람직하게는 100 pg/ml 이상을 발현하는 중간엽줄기세포를 처리한 경우에서 세포 생존율(cell survival)이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (18)

  1. 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor; VEGF)의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 뇌혈관 질환의 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 선별방법:
    (a) 줄기세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 줄기세포 배양액에서 VEGF의 농도를 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 측정된 농도에 근거하여 신경세포 보호능력을 평가하는 단계.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 신경세포 보호능력의 평가는, 상기 측정된 VEGF의 농도가 50 pg/ml 이상일 경우 고효능인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 신경세포 보호능력의 평가는, 상기 측정된 VEGF의 농도가 100 pg/ml 이상일 경우 고효능인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 뇌혈관 질환은 신생아 뇌실내 출혈(intraventricular hemorrhage; IVH)인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 고효능은 신경세포 보호능인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반에서 유래된 것임을 특징으로 하는, 선별방법.
  9. 제1항의 방법에 의해 선별된, 뇌혈관 질환의 치료를 위한 고효능 줄기세포.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 뇌혈관 질환은 신생아 뇌실내 출혈(intraventricular hemorrhage; IVH)인 것을 특징으로 하는, 고효능 줄기세포.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 고효능은 신경세포 보호능인 것을 특징으로 하는, 고효능 줄기세포.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 고효능 줄기세포.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반에서 유래된 것임을 특징으로 하는, 고효능 줄기세포.
  14. 제9항의 고효능 줄기세포를 포함하는, 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 뇌혈관 질환은 신생아 뇌실내 출혈(intraventricular hemorrhage; IVH)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 고효능은 신경세포 보호능인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반에서 유래된 것임을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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