KR20120109671A

KR20120109671A - 줄기 세포 및 줄기 세포 인자의 조성물과 그 사용 및 제조 방법

Info

Publication number: KR20120109671A
Application number: KR1020117021829A
Authority: KR
Inventors: 니콜라이 탄코비치; 알렉산더 카라지; 치민 린
Original assignee: 스테메디카 셀 테크놀로지스, 인크.
Priority date: 2009-10-05
Filing date: 2010-04-26
Publication date: 2012-10-08
Also published as: US8790638B2; WO2011043844A1; US20100209398A1

Abstract

본 발명은 줄기 세포 및 이 줄기 세포의 사용 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 줄기 세포는 줄기 세포 증식 및 줄기 세포 분화 유연성을 조정하기 위해 환경 요인 및 세포 영양 조건을 조작함으로써 배양한다.

Description

줄기 세포 및 줄기 세포 인자의 조성물과 그 사용 및 제조 방법{COMPOSITIONS OF STEM CELLS AND STEM CELL FACTORS AND METHODS FOR THEIR USE AND MANUFACTURE}

본 출원은 2009년 10월 5일에 출원된 미국 특허 출원 제12/573,159호를 기초로 우선권을 주장하며, 상기 미국 특허 출원은 그 전체 내용을 본원에서 참고로 인용한다.

줄기 세포는 다양한 의학적 질병의 치료에 있어서 큰 전망을 제시하였다. 그러나, 줄기 세포 치료는 대개 조직 외식편의 시험관내 증식에 의해 제조되는 매우 많은 수의 줄기 세포의 투여를 필요로 한다. 줄기 세포는 비교적 적은 수의 조직에만 존재하기 때문에, 치료 용도를 위해 다수의 줄기 세포를 생성하는 것은 어렵다. 이러한 문제는 시험관내 줄기 세포 배양의 특징인 분화 잠재력의 상실에 의해 복잡해진다. 줄기 세포가 더 긴 시간의 배양을 거치고 여러 차례의 세포 분열을 겪음에 따라, 줄기 세포의 분화 잠재력은 감소한다[BMC Cell Biol. 2008 Oct 28; 9:60; J Cell Physiol. 2005 Nov; 205(2): 194-201]. 따라서, 원하는 수준의 분화 잠재력을 갖는 줄기 세포를 얻기 위해서는, 단지 제한된 횟수의 세포 분열 후에 줄기 세포를 회수해야 한다.

따라서, 당업계에는, 줄기 세포가 배양에 의해 유지될 수 있는 시간의 길이를 연장시키고, 줄기 세포가 많은 횟수의 분열을 겪을 수 있도록 하며, 줄기 세포가 원하는 수준의 줄기 세포 분화 및 치료적 잠재력을 유지할 수 있도록 하는 줄기 세포 제조 방법이 요구되고 있다.

본 발명은 줄기 세포 제조의 속도 및 수율을 현격히 개선하기 위해 환경 요인 및 세포 영양 조건을 이용한다. 본 발명은 세포 증식을 증가시키고 줄기 세포의 시험관내 증식의 특징인 줄기 세포 잠재력의 파괴를 억제함으로써 이를 달성한다. 분화 잠재력 상실을 억제하는 것은 줄기 세포가 원하는 수준의 잠재력을 유지하면서 다수의 계대를 겪을 수 있도록 함으로써 줄기 세포 수율을 증가시킨다. 본 발명은 특유의 특징을 갖는 줄기 세포 집단을 생산한다는 예기치 않은 결과를 제공하면서 이를 달성한다.

본 발명의 한 가지 목적은, 줄기 세포 집단을 제공하는 단계, 줄기 세포 집단을 증식시키기에 적합한 조건 하에 줄기 세포 집단을 배양하는 단계 및 상기 줄기 세포 집단을 하나 이상의 환경 요인에 노출시키는 단계로서, 상기 환경 요인은 상기 줄기 세포 집단의 분화 잠재력을 상기 환경 요인에 노출되지 않은 대조군 줄기 세포 집단에 비해 증대시키는 것인 단계를 포함하는, 시험관내 줄기 세포 집단의 분화 잠재력을 증대시키는 것이다.

본 발명의 추가적인 목적은, 줄기 세포를 제공하는 단계, 줄기 세포 집단을 증식시키기에 적합한 배양 조건 하에 줄기 세포를 배양하는 단계 및 상기 줄기 세포를 하나 이상의 환경 요인에 노출시키는 단계로서, 상기 환경 요인은 줄기 세포에 특유의 생물학적 활성을 부여하는 것인 단계를 포함하는, 특유의 생물학적 활성을 갖는 줄기 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 목적은, 줄기 세포 집단을 제공하는 단계, 줄기 세포 집단을 증식시키기에 적합한 조건 하에 줄기 세포 집단을 배양하는 단계 및 상기 줄기 세포를 하나 이상의 환경 요인에 노출시키는 단계로서, 상기 환경 요인은 상기 줄기 세포 집단의 증식 및/또는 분화 잠재력을 상기 환경 요인에 노출되지 않은 대조군 줄기 세포 집단에 비해 증대시키는 것인 단계를 포함하는, 줄기 세포 집단을 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 목적은, 줄기 세포 집단을 제공하는 단계, 줄기 세포 집단을 증식시키기에 적합한 조건 하에 줄기 세포 집단을 배양하는 단계 및 상기 줄기 세포 집단을 하나 이상의 환경 요인에 노출시키는 단계로서, 상기 줄기 세포는 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 이들의 조합으로부터 선택되고, 상기 환경 요인은 상기 줄기 세포 집단의 분화 잠재력을 대조군 신경 줄기 세포 집단에 비해 증대시키는 것인 단계를 포함하는, 줄기 세포 집단의 분화 잠재력을 증대시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은, 치료 유효량의 산소 조정 신경 줄기 세포 및 치료 유효량의 산소 조정 중간엽 줄기 세포를 포함하는, 의학적 질병의 치료를 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 목적은, 치료 유효량의 산소 조정 신경 줄기 세포 및 유효량의 산소 조정 중간엽 줄기 세포를 포함하는, 의학적 질병의 치료를 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 목적은, 유효량의 산소 조정 신경 줄기 세포 및 유효량의 산소 조정 중간엽 줄기 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 의학적 질병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 목적은, 산소 조정 신경 줄기 세포로부터 유래된 유효량의 줄기 세포 인자 및 산소 조정 중간엽 줄기 세포로부터 유래된 유효량의 줄기 세포 인자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 의학적 질병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 목적은, 신경 줄기 세포를 제공하는 단계, 상기 줄기 세포를 혈청 함유 배양 배지와 접촉시키는 단계 및 감소된 산소 분압을 포함하는 배양 조건 하에 상기 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 신경 줄기 세포를 배양하는 방법으로서, 상기 줄기 세포는 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 이들의 조합으로부터 선택되고, 상기 감소된 산소 분압은 상기 줄기 세포의 분화 잠재력을 증대시키는 것인 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 목적은, 줄기 세포 및 혈청 함유 배양 배지를 포함하는 시험관내 세포 배양물을 제공하는 것이며, 이때 상기 배양 배지는 약 5% 미만의 산소 분압을 가지고, 상기 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포, 외배엽 줄기 세포 및 내배엽 줄기 세포로 구성된 군에서 선택된다.

본 발명의 추가적인 목적은 줄기 세포 및 혈청 함유 배양 배지를 포함하는 시험관내 세포 배양물을 제공하는 것이며, 이때 상기 줄기 세포는 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 이들의 조합으로부터 선택되고, 상기 배양 배지는 대기 중 산소보다 낮은 산소 분압 수준을 갖는다.

본 발명의 추가적인 목적은, 줄기 세포를 제공하는 단계, 적절한 세포 배양 조건 하에 상기 줄기 세포를 배양하는 단계 및 상기 줄기 세포를 하나 이상의 환경 요인에 노출시키는 단계를 포함하는, 줄기 세포의 이동 및 생착 잠재력을 증가시키는 방법을 제공하며, 이때 상기 환경 요인에 줄기 세포를 노출시키는 것은 줄기 세포의 이동 및 생착 잠재력을 상기 환경 요인에 노출되지 않은 대조군 줄기 세포에 비해 증가시킨다.

본 발명의 추가적인 목적은, 신경 줄기 세포를 제공하는 단계, 신경 줄기 세포를 증식시키기에 적합한 조건 하에 상기 신경 줄기 세포를 배양하는 단계 및 상기 신경 줄기 세포를 환경 요인에 노출시키는 단계로서, 상기 환경 요인은 상기 줄기 세포의 생물학적 활성을 상기 환경 요인에 노출되지 않은 대조군 신경 줄기 세포에 비해 증대시키는 것인 단계를 포함하는, 재생성 세포 치료에 사용하기 위한 신경 줄기 세포를 제공하는 것이다.

도 1. 다양한 배양 조건 하에서의 신경 프로제니터의 세포 모폴로지. 신경 줄기 세포를 8주차 인간 배아의 동일한 인간 태아 뇌로부터 수집하였다. 신경 줄기 세포를 6개 그룹으로 나누었다. 신경 줄기 세포는 무혈청 조건에서 배양될 때 뉴로스피어를 형성한다. 그러나, 신경 프로제니터는 배지가 혈청을 함유할 경우 부착성이 되었다. A는 20% 산소 및 5% CO₂ 배양 조건 하에 무혈청 배양 배지에서의 세포 모폴로지를 도시하였다. B는 5% 산소 및 5% CO₂ 배양 조건 하에 무혈청 배양 배지에서의 세포 모폴로지를 도시하였다. C는 20% 산소 및 5% CO₂ 배양 조건 하에 0.1% 혈청 배양 배지에서의 세포 모폴로지를 도시하였다. D는 5% 산소 및 5% CO₂ 배양 조건 하에 0.1% 혈청 배양 배지에서의 세포 모폴로지를 도시하였다. E는 20% 산소 및 5% CO₂ 배양 조건 하에 0.2% 혈청 배양 배지에서의 세포 모폴로지를 도시하였다. F는 5% 산소 및 5% CO₂ 배양 조건 하에 0.2% 혈청 배양 배지에서의 세포 모폴로지를 도시하였다.
도 2. 다양한 배양 조건에서의 전구 세포 마커인 네스틴 발현. 4차 계대 시의 다양한 배양 조정 세포 모두에서 신경 전구 세포 마커인 네스틴이 발현되었다. A는 무혈청, 20% 산소 조정 세포에서의 네스틴 발현 패턴을 도시하였다. B는 무혈청, 5% 산소 조정 세포에서의 네스틴 발현 패턴을 도시하였다. C는 0.1% 혈청, 20% 산소 조정 세포에서의 네스틴 발현 패턴을 도시하였다. D는 무혈청, 5% 산소 조정 Adsf에서의 네스틴 발현 패턴을 도시하였다.
도 3. 시험관내 분화 후 다양한 배양 조정 세포에서의 튜불린-βIII(Tu-β III) 발현. 모든 조정 세포를 수거하여, 마이토젠 무함유, 10% 혈청 및 20% 산소 배양 조건 하에 2주 동안 라미닌 코팅 커버 슬립에 시딩하였다. 뉴런 마커인 Tu-βIII를 분화 후 뉴런을 검출하는 데 사용하였다. A는 무혈청 및 20% 산소 조건 하에서의 Tu-βIII 발현 패턴을 도시하였다. B는 무혈청 및 5% 산소 조건 하에서의 Tu-βIII 발현 패턴을 도시하였다. C는 0.1% 혈청 및 20% 산소 조건 하에서의 Tu-βIII 발현 패턴을 도시하였다. D는 0.1% 혈청 및 5% 산소 조건 하에서의 Tu-βIII 발현 패턴을 도시하였다. E는 0.2% 혈청 및 20% 산소 조건 하에서의 Tu-βIII 발현 패턴을 도시하였다. F는 0.2% 혈청 및 5% 산소 조건 하에서의 Tu-βIII 발현 패턴을 도시하였다. 20% 산소 하에서의 0.2% 혈청은 Tu-βIII 발현을 나타내지 않았다. 그러나, 5% 산소 하 0.2% 혈청에서는 Tu-βIII가 발현되었는데, 이는 산소 분압이 신경 계통을 따라 세포를 구제한다는 것을 시사한다.
도 4. 시험관내 분화 후 다양한 배양 조정 세포에서의 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP) 발현. 모든 조정 세포를 수거하여, 마이토젠 무함유, 10% 혈청 및 20% 산소 배양 조건 하에 2주 동안 라미닌 코팅 커버 슬립에 시딩하였다. 뉴런 마커인 GFAP를 분화 후 뉴런을 검출하는 데 사용하였다. A는 무혈청 및 20% 산소 조건 하에서의 GFAP 발현을 도시하였다. B는 무혈청 및 5% 산소 조건 하에서의 GFAP 발현을 도시하였다. C는 0.1% 혈청 및 20% 산소 조건 하에서의 GFAP 발현을 도시하였다. D는 0.1% 혈청 및 5% 산소 조건 하에서의 GFAP 발현을 도시하였다. E는 0.2% 혈청 및 20% 산소 조건 하에서의 GFAP 발현을 도시하였다. F는 0.2% 혈청 및 5% 산소 조건 하에서의 GFAP 발현을 도시하였다. 20% 산소 하에서의 0.2% 혈청은 GFAP 발현을 나타내지 않았다. 그러나, 5% 산소 하 0.2% 혈청에서는 GFAP가 발현되었는데, 이는 산소 분압이 신경 계통을 따라 세포를 구제한다는 것을 시사한다.
도 5. 생체내 잠재력 테스트: 닭 배아 뇌에서 확인된 다양한 세포 이동 활성. 모든 조정 세포를 잠재력 분석을 위한 닭 배아 뇌로의 이식을 위해 수거하였다. 2×10⁵개 세포를 전뇌실에 미세주입하였다. 면역조직학적 분석을 위해 이식 6일 후 뇌를 적출하였다. 숙주 뇌로의 주입 후 세포 이동을 추적하기 위해 인간 특이적 핵 및 네스틴 항체를 사용하였다. A 및 B는 무혈청 및 20% 산소 배양 세포가 숙주 뇌를 뇌실로부터 뇌실 영역을 통해 선조체로 이동하여 편입되는 것을 도시하였다. C 및 D는 무혈청 및 20% 산소 배양 세포가 숙주 뇌를 뇌실로부터 뇌실 영역을 통해 선조체로 이동하는 것을 도시하였다. E 및 F는 0.1% 혈청 및 20% 산소 배양 세포가 뇌실과 뇌실 영역 사이에서 응집되고 일부 세포는 숙주 뇌를 뇌실로부터 뇌실 영역을 통해 선조체로 이동하는 것을 도시하였다. G 및 H는 0.1% 혈청 및 5% 산소 배양 세포가 숙주 뇌로 이동하는 것을 도시하였다. I 및 J는 0.2% 혈청 및 20% 산소 배양 세포가 뇌실에서 응집되고 이동이 검출되지 않음을 도시하였다. K 및 L은 0.2% 혈청 및 5% 산소 배양 세포가 뇌실에서 응집되고 일부 세포가 뇌실 영역으로 이동하는 것을 도시하였다.
도 6. 0.1% 혈청 및 5% 산소 조정 세포에서의 신경 전구 세포 마커 발현. Sox 2, 네스틴 및 비멘틴을 4차 계대 시의 0.1% 혈청 및 5% 산소 조정 세포를 위한 전구 세포 마커로서 사용하였다.
도 7. 산소 분압 및 혈청 조정 배지는 세포 증식을 증가시킨다. NSC를 6 가지의 상이한 배양 조건 하에 배양하였다. 성장률은 혈청 조정 배지에서뿐만 아니라 5% 산소 분압이 세포 증식을 증가시킨다는 것을 보여주었다.
도 8. 실시예 2로부터 얻은 7 포인트 신경 점수 테스트 결과.

정의

용어 "줄기 세포"는 (유사분열성 세포 분열을 통한) 자기 재생 능력을 가질 뿐만 아니라 분화되어 더 특수화된 세포를 형성하는 능력을 갖는 미분화된 세포를 의미한다. 줄기 세포는 다양한 정도의 잠재력을 갖고 있다. 전구 세포가 줄기 세포의 일례이다.

용어 "전구 세포(precursor cell)", "조직 전구 세포", 또는 "프로제니터 세포(progenitor cell)"는 특수한 발달 경로를 겪게 되는 미분화된 세포를 의미한다. 전구 세포는 제한된 증식 능력을 갖는다. "신경 전구 세포"는 뉴런, 신경교 세포 또는 성상 세포로 발달되는 전구 세포의 일례이다. 프로제니터 세포의 또 다른 비한정적인 예로는 분화되어 뉴런 세포가 되는 능력을 갖는 뉴런 프로제니터 세포가 있다.

용어 "신경 줄기 세포"는 자기 재생 능력과 다수의 신경 세포 표현형을 형성하도록 분화되는 능력을 갖는 외배엽 줄기 세포를 의미한다. 본원에서 사용될 때, "신경 세포"는 뉴런 세포(즉, 단극, 양극 및 다극 뉴런) 및 신경교 세포(즉, 희돌기세포, 슈반 세포, 성상 세포 및 미세아교세포)를 비롯한 신경 세포 계통에 속하는 세포를 의미한다. "신경 잠재력을 갖는" 또는 "신경 잠재력"은 신경 세포 표현형을 나타낼 수 있는 줄기 세포의 능력을 의미한다.

"분화"는 덜 특수화된 세포가 더 특수화된 세포 유형으로 되는 생물학적 과정을 의미한다. 예를 들어, 배 발달 단계에서, 다능성 배아 줄기 세포는 "분화되어" 다능성 중간엽, 외배엽 및 내배엽 줄기 세포를 형성하며, 이들은 각각 특수한 발달 경로(즉, 조직의 범위)에 한정된다.

"분화 잠재력", "세포 잠재력", "분화 유연성" 및 "잠재력"은 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 줄기 세포가 더 특수화된 세포 유형으로 분화되는 능력을 의미한다.

"다능성의" 또는 "다능성"이란 줄기 세포가 중배엽, 내배엽 및 외배엽 조직 계통에 속하는 특수화된 세포를 형성할 수 있는 잠재력을 갖는 것을 의미한다.

"만능성의" 또는 "만능성"이란 줄기 세포가 단일 생식세포 계통(예를 들어, 내배엽 또는 외배엽 또는 중배엽)에 속하는 하나보다 많은 세포 유형을 형성할 수 있는 능력을 의미한다. 예를 들어, 연골 세포, 지방 세포 및 골세포를 형성할 수 있는 능력을 갖는 세포는 만능성 중간엽 세포이다.

"단능성의" 또는 "단능성"이란 프로제니터 세포가 특수한 최종적인 세포 유형을 형성할 수 있는 능력을 의미한다. 예를 들어, 뉴런 프로제니터 세포는 뉴런 형성에 대해 단능성이다.

"중간엽 세포"는 분화될 수도 있고 분화되지 않을 수도 있는 중배엽 생식세포 계통 세포이다. 본 발명의 중간엽 세포는 만능성 중간엽 줄기 세포에서부터 시작하여 완전 분화된 최종적인 세포로 분화되는 모든 분화 단계에 있는 세포를 포함한다.

"외배엽 세포"는 분화될 수도 있고 분화되지 않을 수도 있는 외배엽 생식세포 계통 세포이다. 본 발명의 외배엽 세포는 만능성 외배엽 줄기 세포에서부터 시작하여 완전 분화된 최종적인 세포로 분화되는 모든 분화 단계에 있는 세포를 포함한다.

"내배엽 세포"는 분화될 수도 있고 분화되지 않을 수도 있는 내배엽 생식세포 계통 세포이다. 본 발명의 내배엽 세포는 만능성 내배엽 줄기 세포에서부터 시작하여 완전 분화된 최종적인 세포로 분화되는 모든 분화 단계에 있는 세포를 포함한다.

본원에서 사용될 때, 용어 "환경 요인"은 줄기 세포에 노출될 경우 줄기 세포의 증식, 분화 잠재력, 생체내 생착 능력 및/또는 생체내 이동 능력을, 이러한 제제, 조건 또는 에너지 형태에 노출되지 않은 대조군 줄기 세포에 비해 증대시키는 제제, 조건 또는 에너지 형태를 의미한다. 환경 요인으로는 감소된 산소 분압, 전자기 에너지, 기계 에너지, 대사적 부족, 기압 편차, 화학 물질에의 노출 및 이들의 조합을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

"증식"은 유사분열성 세포 분열에 의한 집단 내 세포수의 증가를 의미한다. "증가된 증식" 또는 "증대된 증식"은 환경 요인에의 노출에 반응하여 이러한 환경 요인에 노출되지 않은 대조군 줄기 세포 증식에 비해 줄기 세포의 증식이 측정 가능하게 증가하는 것을 의미한다.

"줄기 세포 잠재력을 보유하는", "줄기 세포 잠재력을 유지하는", "분화 잠재력을 증대시키는", "줄기 세포 분화 잠재력 상실을 억제하는" 등은, 환경 요인에 노출되지 않은 대조군 줄기 세포에 비해, 복수의 세포 계대에 걸친 시험관내 세포 배양 과정에서의 줄기 세포의 분화 유연성 상실을 증가 또는 감소시킬 수 있는 환경 요인의 능력을 의미한다.

본원에서 사용될 때 "증대된 생존율"이란, 환경 요인에 노출됨으로 인해 이러한 환경 요인에 노출되지 않은 대조군 줄기 세포에 비해 세포사(아폽토시스 또는 비아폽토시스 세포사)가 지연 또는 감소되는 것을 의미할 수 있다. 줄기 세포 증식과 관련하여 사용될 때 "증대된"이란 줄기 세포의 유사분열성 세포 분열 속도가 측정 가능하게 증가하는 것을 의미한다. 줄기 세포의 분화 잠재력과 관련하여 사용될 때 "증대된"이란 줄기 세포가 배양에 의해 증식하고 계대됨에 따라 줄기 세포의 분화 잠재력을 유지하거나 그 상실을 억제하는 것을 의미한다.

본원에 개시된 바와 같은 저산소 조건 하에 배양된 줄기 세포는 "산소 조정 줄기 세포" 또는 "OM-SC"라 칭한다. 산소 조정 줄기 세포가 신경 줄기 세포인 경우, 그러한 줄기 세포를 "산소 조정 신경 줄기 세포" 또는 "OM-NSC"라 칭한다. 중간엽 줄기 세포인 산소 조정 줄기 세포는 "산소 조정 중간엽 줄기 세포" 또는 "OM-MSC"라 칭한다.

용어 "태아기" 및 "태아"는 이배체 접합체 형성에서부터 시작하여 태아 출생에 선행하는 기간을 의미한다. 따라서, 본 발명에 있어서, 자연 분만 또는 제왕절개술에 의한 분만 전의 태아로부터 얻은 조직 및 그 관련 세포는 태아(즉, 태아기) 조직이다. 포유동물의 분만(예를 들어, 정상 출산 또는 사산) 후의 포유동물 조직으로부터 얻은 조직은 성체 조직이며, 이로부터 유래된 세포는 "성체 세포"이다.

세포 집단(예를 들어, 세포의 조성물)과 관련하여 사용될 때의 용어 "정제된" 및 "단리된"은 집단 내의 세포가 상이한 유형의 세포를 실질적으로 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 세포의 조성물은 이것이 원하는 유형을 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상 또는 약 100% 이상 포함할 경우 "정제된" 또는 "실질적으로 정제된" 것으로 간주된다.

용어 "환자" 또는 "피험체"는 약학 조성물로 치료되거나 본원에 기재된 방법에 따라 처리되는 포유동물, 바람직하게는 인간을 비롯한 동물을 의미한다.

용어 "약학적으로 허용되는 담체"(또는 매질)는 용어 "생물학적으로 적합한 담체"(또는 매질)와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있으며, 세포 및 치료를 위해 투여될 수 있는 다른 제제와 함께 사용하기에 적합할 뿐만 아니라 합당한 의학적 판단 범위 내에 있고 지나친 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 합병증 없이 인간 및 동물의 조직에 접촉시키기에 적합하며, 합리적인 이익/위험 비에 알맞은 제제, 세포, 화합물, 물질, 조성물 및/또는 제형을 의미한다.

"중추 신경계 질환" 또는 "CNS 질환"은 포유동물 중추 신경계의 정상적인 기능을 손상시키는 병태 또는 손상, 예를 들어 신경퇴행성 질환, (뇌 또는 척수의) 외상성 손상 및 CNS 기능장애를 의미한다. 신경퇴행성 CNS 질환은 일반적으로 CNS 신경 조직의 장기간에 걸친 퇴화와 관련되어 있으며, 그 예로 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증(MS), 헌팅턴병, 근위축성 측삭경화증, 뇌성 마비, 고셔병, 테이색스병, 니만피크병, 스핑고마이엘린 유지증 및 뇌종양을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. CNS 질환은 외상성 손상, 예를 들어, 출혈성 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중, 및 뇌 및 척수에의 기계적 손상을 추가로 포함한다. 어구 "CNS 질환"은, 예를 들어 우울증, 간질 및 정신분열증과 같은 기능장애를 추가로 포함한다.

용어 "척수 손상"은 외상성 사건이 척수 내의 세포를 손상시키거나 척수 위아래로 신호를 중계하는 신경로가 절단되거나 다른 방식으로 손상될 경우 발생하는 병태를 의미한다. 척수 손상의 가장 흔한 유형의 몇 가지 예로 타박상과 압박이 있다. 다른 외상 유형으로는 열상 및 중심척수 증후군을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

용어 "허혈"은 혈액 공급의 기계적 차단으로 인한 국소 빈혈을 의미한다. "허혈성"은 허혈에 의해 손상된 조직을 말한다.

용어 "뇌졸중"은 뇌로 가는 혈류가 중단되거나 신경계 기능의 손상을 유발하는 지점에 한정되는 상태를 의미한다. 용어 "뇌졸중"은 뇌의 혈관 또는 동맥을 차단하는 폐색에 의해 유발될 수 있는 허혈성 뇌졸중 및 뇌의 혈관이 파열되어 주변 조직으로 혈액을 방출할 경우 발생될 수 있는 출혈성 뇌졸중을 포함한다.

본원에서 사용될 때 용어 "CNS 허혈"은 뇌 또는 척수의 하나 이상의 부위로의 혈류의 부분적 또는 완전한 감소를 의미하는 것으로 사용된다. 허혈은 전신적, 예를 들어 전신 저혈압으로 인한 혈류의 전신적 감소일 수도 있고, 국소적, 예를 들어 하나 이상의 뇌동맥에서의 질환 또는 국부적 외상에 기인한 것일 수도 있다. 허혈은 혈류의 협착 또는 폐색의 결과, 예를 들어, 혈전증, 색전증 또는 입자에 기인한 것일 수 있다.

본원에서 사용될 때 용어 "뉴런 손상" 또는 "뉴런 외상"은 CNS 장애 또는 외상으로 인해 CNS에 임의의 세포 유형(예를 들어, 뉴런, 성상 세포, 신경교 세포)에 발생하는 손상을 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, 혈류 부족은 괴사 및/또는 아폽토시스에 의한 세포사를 초래한다.

본원에서 사용될 때, "치료량"은 치료 대상 질환에 치료 효과를 제공하는 데 필요한 이식된 세포의 수를 의미한다. 예를 들어, 파킨슨 증상을 치료할 경우, 치료 유효량의 세포의 이식은 일반적으로 그 질환과 관련된 증상, 예를 들어, 경직, 운동 불능 및 보행 장애의 정도 및/또는 심각성을 감소시킨다.

본원에서 사용될 때, "숙주를 치료하는" 또는 "치료"는 질병 과정의 예방적 개입, 고식적 개입 및 치유적 개입을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용될 때 용어 "치료"는 일반적으로 치료하고자 하는 특정 질환의 증상을 경감하거나 제거하는 치료적 방법을 의미한다. 본원에서 사용될 때 용어 "숙주"는 일반적으로 특정 치료를 받는 인간, 비인간 영장류, 설치류 등과 같은 임의의 온혈 포유동물을 의미한다. 용어 "숙주", "환자" 및 "피험체"는 상호 교환 가능하게 사용된다.

[상세한 설명]

일부 양태에서, 본 발명은 증대된 증식 및 분화 특성을 갖는 줄기 세포를 생산하기 위해 환경 요인과 배양 조건의 조합을 이용하는 것에 관한 것이다. 가장 일반적으로, 이러한 실시형태는 줄기 세포 집단을 제공하는 단계, 줄기 세포 집단을 시험관내에서 배양하는 단계 및 줄기 세포 집단을 하나 이상의 환경 요인에 노출시켜 적어도 증대된 분화, 증식 및 치료적 특성을 갖는 줄기 세포 집단을 생산하는 단계에 의해 실시될 수 있다. 본원에 개시된 줄기 세포의 사용 방법 또한 본 발명의 실시형태로서 고려된다.

환경 요인

본 발명의 양태들은 줄기 세포를 하나 이상의 환경 요인에 노출시키는 것에 관한 것이다.

본 발명에 사용되는 환경 요인으로는 감소된 산소 분압, 전자기적 에너지, 기계적 에너지, 대사적 부족, 기압 편차, 화학 물질에의 노출 및 이들의 조합을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 줄기 세포를 환경 요인에 노출시키는 것은 줄기 세포를 감소된 산소 분압에 노출시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 이것은 줄기 세포 조성물을 주위 산소압이 낮은 환경에 접촉시킴으로써 수행한다. 어구 "저 주위 산소 조건", "저산소" 및 "감소된 산소 분압"은 대기 중 산소보다 낮은 산소 농도를 의미한다. 저 주위 산소 조건은 일반적으로 해수면에서 약 20% 이하, 바람직하게는 약 15% 이하, 더 바람직하게는 약 5~10% 이하의 산소 농도를 의미한다. 저산소 조건은 특정 줄기 세포가 생체내에 존재하는 정상적인 생리학적 산소 조건에 가능한 한 가깝게 유지될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 세포에 이용되는 조건은 특정 세포의 국부적 기원에 따라 달라지며, 이러한 조건은 당업자에게 알려져 있다. "생리학적" 산소 수준은 건강한 조직 및 기관에서 정상적으로 존재하는 산소 수준의 범위이다.

일 실시형태에서, 저 주위 산소 조건은 약 0.25%~약 18% 산소의 주위 산소 조건을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 저 주위 산소 조건은 약 0.5%~약 15% 산소의 주위 산소 조건을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 저 주위 산소 조건은 약 1%~약 10% 산소의 주위 산소 조건을 포함한다. 추가적인 실시형태에서, 저 주위 산소 조건은 약 1.5%~약 6% 산소의 주위 산소 조건을 포함한다. 물론, 이것은 배양에 사용될 수 있는 예시적인 주위 산소 조건 범위이며, 당업자가 일반적으로 이러한 범위에 속하는 산소 조건을 이용하거나 이러한 범위 중 특정 세포에 대한 생리학적 산소 조건을 모방하는 임의의 범위 사이의 산소 조건을 이용할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 당업자라면 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 10.5%, 11%, 11.5%, 12%, 12.5%, 13%, 13.5%, 14%, 14.5%, 15%, 15.5%, 16%, 16.5%, 17%, 17.5%, 18%, 18.5% 또는 이들 값의 임의의 값 사이의 임의의 다른 산소 조건으로 산소 배양 조건을 설정할 수 있다.

본 발명의 일 양태는 줄기 세포가 저산소(즉, 감소된 산소 분압) 조건에 노출되는 타이밍(예를 들어, 세포 배양 단계)에 관한 것이다. 당업자라면 줄기 세포를 감소된 산소 분압에 노출시키는 타이밍은 원하는 줄기 세포 특성에 따라 달라진다는 것을 이해할 것이다. 줄기 세포는 줄기 세포의 시험관내 배양 동안의 임의의 시점에 감소된 산소 분압에 노출시킬 수 있다. 줄기 세포는, 조직 샘플로서 줄기 세포를 수집한 후, 이러한 조직 샘플을 분해시키는 동안, 줄기 세포의 1차 배양 중, 줄기 세포의 시험관내 증식 중(예를 들어, 복수의 세포 계대에 걸쳐), 프라이밍 중(예를 들어, 피험체에 주사하기 전에 줄기 세포가 원하는 생물학적 활성을 나타내도록 유도할 때)을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 시점에 감소된 산소 분압에 노출시킬 수 있다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 줄기 세포를 줄기 세포의 시험관내 배양 중에 감소된 산소 분압에 노출시킨다. 당업자는 저 주위 산소 조건(즉, 감소된 산소 분압) 하에 줄기 세포를 배양하는 다양한 방법이 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 본 발명의 실시를 위한 적절한 공정, 반응물 및 장치는 본원에서 참고로 인용하는 하기 참고 문헌에 개시되어 있다: 미국 특허 제6,759 242호; 미국 특허 제6,846,641호; 미국 특허 제6,610,540호; J. Cereb. Blood Flow Metab. 2008 Sep. 28(9): 1530-42: Stem Cells. 2008 May 26(5): 1325-36; Exp Neurol. 2008 Apr 210(2): 656-70; Mol. Cell. Neurosci. (2007), doi: 10.1016/j.mcn.2007.04.003; Experimental Neurology 170, 317-325 (2001); 및 Neurosignals 2006-07, 15: 259-265. 이들 참고 문헌이 특정 절차 및 반응물을 개시하고 있지만, 본 발명에 따라 줄기 세포를 증식시킬 수 있는 임의의 저 산소 배양 조건이 이용될 수 있다.

줄기 세포가 본원에 개시된 것과 같은 증대된 분화 잠재력, 증식 속도, 생착 능력 및/또는 생체내 이동 능력을 달성할 수 있도록 하는 임의의 방법을 이용하여 줄기 세포를 저 산소 조건에 노출시킬 수 있다. 전문화된 실험 시설은 전용 격리실 전체에 걸쳐 산소 농도가 제어되는 완전 밀폐 환경을 구비할 수 있다. 이러한 전문화된 구역에서는, 저 산소 농도가 세포의 단리, 생육 및 분화 전반에 걸쳐 끊임없이 유지될 수 있다. 생리학적 또는 저 산소 배양 조건은 또한 소정의 기체 혼합물로 플러싱되는 상업적으로 이용 가능한 챔버(예를 들어, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Billups-Rothenberg로부터 입수한 것)를 이용하여 유지할 수 있다. 보조적으로, 세포 영양 공급 전에 동일한 기체 혼합물로 배지를 플러싱할 수 있다. 일반적으로, 세포 영양 공급 및 계대를 실시하는 동안 생리학적 산소 조건 또는 저산소 조건을 유지하는 것이 불가능한데, 따라서, 이러한 조작을 위한 시간을 가능한 한 최소로 해야 한다. 적절한 가습, 온도 및 이산화탄소가 제공된다면, 생리학적 산소 또는 저산소 농도 배양에 임의의 밀폐된 유닛을 사용할 수 있다.

산소 이외에 배양에 사용되는 다른 기체는 일반적으로 약 5% 이산화탄소이고, 나머지는 질소이나, 경우에 따라, 다양한 양의 산화질소(3 ppm의 낮은 농도에서 시작), 일산화탄소 및 다른 기체(비활성이면서 생물학적 활성임)를 포함할 수 있다. 이산화탄소 농도는 일반적으로 상기에 언급한 것과 같은 약 5%이나, 2~10%에서 다양할 수 있다. 산화질소와 일산화탄소 둘 다 일반적으로 소량으로(즉, ppm 범위로), 실험적으로 결정된 양으로, 또는 문헌에 기재된 양으로 투여된다.

본 발명의 일 양태는 줄기 세포를 감소된 산소 분압에 노출시키는 시간의 길이에 관한 것이다. 본 발명에서는, 줄기 세포를 본원에 개시된 것과 같은 줄기 세포의 증식 및 분화를 증대시키는 임의의 시간 동안 감소된 산소 분압에 노출시킬 수 있다. 이 시간은 1시간 이상, 3시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상일 수 있거나, 이 시간은 연속적(예를 들어, 줄기 세포를 시험관내 배양하는 전체 시간 동안)일 수 있다. 배양 동안의 온도는 일반적으로 중심 체온, 또는 약 37℃를 반영하지만, 약 32℃~약 40℃에서 다양할 수 있다.

줄기 세포 및 배양 조건

본 발명은 본 발명의 방법을 통해 증대될 수 있거나 증대되는 임의의 줄기 세포(또는 줄기 세포의 조합)를 증식시키는 데 이용될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 적절한 줄기 세포는 다능성 배아 줄기 세포, 중간엽 세포, 내배엽 세포 및 이들의 조합을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 외배엽 세포를 사용하여 수행한다. 본 발명에 사용하기 위한 외배엽 세포로는 배아 외배엽으로부터 유래된 다능성 세포를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 이러한 배아 외배엽 세포를 얻기 위한 적절한 방법은 당업자가 용이하게 이용할 수 있다.

본 발명의 일부 양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 외배엽 세포는 신경 줄기 세포이다. 신경 줄기 세포는 다수의 상이한 신경 세포 표현형을 나타내도록 자기 재생 및 분화하는 능력을 갖는다. 본 발명에 사용하기 위한 신경 줄기 세포는 다양한 조직 구획으로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 신경 줄기 세포는 신경 조직으로부터 얻는다. 신경 줄기 세포를 제공하기 위한 적절한 신경 조직은 (i) 말초 신경계, 예를 들어, 비강 상피, 색소 상피, 비색소 상피 및 모양체, (ii) 척수, (iii) 전뇌, 전뇌 기저부(콜린성 뉴런), 소뇌, 종뇌, 중뇌, 해마, 후각신경구, 피질(예를 들어, 운동 또는 체감각 피질), 선조체, 복측 중뇌(흑질 세포) 및 청색 반점(중추신경계의 뉴로아드레날린 세포) 및 (iv) 이들의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

신경 조직으로부터 신경 줄기 세포를 얻는 것에 관한 설명 및 이러한 신경줄기 세포를 증식시키기 위한 배양 조건은 본원에서 참고로 인용하는 하기 문헌에 개시된 바와 같이 당업계에서 용이하게 이용될 수 있다: 미국 특허 제5,750,376호, 제6,497,872호 및 제6,777,233호; 미국 특허 제5,196,315호; 제5,766,948호; 제5,968,829호; 제6,468,794호; 제6,638,763호; 제6,680,198호; 제6,767,738호; 제6,852,532호; 제6,897,061호; 제7,037,719호; 미국 특허 공개 제2005-0112109호, 제2004-0048373호, 제2002-0039789호, 제2002-0039789호, 제2003-0095956호, 제2005-0118143호, 제2006-0148083호, 제2005-0074880호, 제2002-0086422호, 제2004-0253719호, 제2005-0003531호, 제2005-0125848호, 제2005-0142569호, 제2006-0099192호 및 제2006-0134280호.

또한, 본원에 개시된 방법에서 증식에 사용되는 신경 줄기 세포는 비신경(예를 들어, 비외배엽) 조직 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 신경 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 중간엽 세포의 이러한 공급원은 골수이다. 이러한 세포는 미분화된 상태에서 시험관내 조건 하에 또는 동물의 신경 조직에 투여될 경우 신경 표현형을 나타낸다. 양수는 신경 전구 세포로 분화될 수 있는 또 다른 세포 공급원이다. 본 발명에 사용하기 위한 신경 형성능 골수 줄기 세포를 얻는 것에 관한 설명은 본원에서 참고로 인용하는 하기 문헌으로부터 얻을 수 있다: 미국 특허 제6,673,606호 및 제7,015,037호; 미국 특허 공개 제2002-0164794호, 제2003-0003090호, 제2003-0039639호, 제2003-0059414호, 제2003-0203484호, 제2004-0151701호, 제2004-0208858호, 제2005-0282276호, 제2005-0249708호, 제2006-0105457호, 제2006-0177928호; 및 Mareschi et al. Exp Hematol. 2006 Nov; 34(11): 1563-72. 다른 실시형태에서, 신경 형성능 중간엽 세포는 제대혈로부터 유래된다. 적절한 탯줄 유래 세포 및 그 단리 방법은 미국 특허 공개 제2002-0028510호, 제2005-0249708호, 제2004-0115804호, 제2005-0142118호 및 제2005-0074435호에 개시되어 있으며, 상기 문헌들은 본원에서 참고로 인용한다. 신경 형성능 중간엽 세포는 두피(즉, 피부)(예를 들어, 미국 특허 공개 제2003-0003574호, 제2004-0253718호 및 제2004-0033597호; 및 Shih et al. Stem Cells 2005 Aug; 23(7) 1012-1020 참조), 말초혈(예를 들어, 미국 특허 공개 제2004-0136973호 및 제2005-0221483호 참조), 태반(예를 들어, 미국 특허 공개 제2005-0089513호 및 제2006-0030039호 참조) 및 양막(예를 들어, 미국 특허 공개 제2003-0044977호 참조)로부터 유래될 수도 있다.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 신경 줄기 세포는 정제된 세포 또는 미정제 세포뿐만 아니라 정제된 세포와 미정제 세포의 조합을 이용하여 제조할 수 있다. 신경 줄기 세포의 미정제 조성물은 다수의 방법으로 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 신경 줄기 세포 조성물은 개개의 정제된(즉, 단리된) 신경 줄기 세포 집단을 조합하여 제조한다. 다른 실시형태에서, 상기 신경 줄기 세포 조성물은 조직 외식편으로부터 얻은 1차 배양물 및 그로부터 얻은 증식된 세포 집단 등의 혼합 세포 집단을 배양함으로써 얻는다. 또 다른 실시형태에서, 신경 줄기 세포의 미정제 조성물은 1종 이상의 정제된 세포 조성물과 1차 세포 배양물 등의 혼합 세포 유형의 조성물을 조합하여 얻는다. 일반적으로, 동물로부터 수집된 후의 1차 세포 배양물은, 다양한 세포가 배양 증식할 수 있기 때문에, 세포 혼합물을 포함한다. 따라서, 1차 배양물은 일반적으로 생체내에서 증식할 수 있는 상이한 세포 유형의 조합을 포함한다. 이들 세포 유형은 다양한 표현형(예를 들어, 세포 마커) 및 다양한 분화도를 가질 수 있다.

본 방법이 신경 줄기 세포의 1차 배양물을 사용하여 실시될 경우, 이 방법은 일반적으로 동물로부터 얻은 신경 조직의 제거, 샘플 내 신경 세포의 분해 및 적절한 시험관내 조건 하 적절한 배지 중에서의 세포의 증식을 포함한다. 일반적으로, 뉴런, 성상 세포 또는 희돌기 세포가 농축된 3 가지 유형의 배양물을 제조할 수 있다. 신경 줄기 세포의 1차 배양물을 제조하기 위한 방법은 당업계에서 널리 이용 가능하다. 이러한 방법 중 하나는 미국 특허 제5,753,491호에 개시되어 있으며, 이 특허 문헌은 태아 신경 조직으로부터 신경 줄기 세포 조성물을 제조하는 방법을 기재한다. 일반적으로, 이 방법은 임신령 약 7~11주의 태아 유래의 태아 뇌 조직의 적출을 포함한다. 적출 후, 뇌 조직을 분해시켜 세포 현탁액을 얻고, 그 후 이 현탁액을 배양 디쉬에 플레이팅하고 적절한 조건 하에 증식시킨다. 여기에서는 특별히 인간 태아 신경 조직의 제조를 언급하지만, 당업자는 태아 신경 줄기 세포가 또한 인간 신생아 신경 조직으로부터도 비인간 신생아 신경 조직으로부터도 유래될 수 있음을 알 것이다. 미국 특허 제5,753,491호 및 이 문헌에 인용된 다른 모든 문헌의 교시는 그 전체가 본원에서 참고로 인용된다.

신경 세포의 1차 배양물을 제조하기 위한 적절한 다른 방법은 당업계에서 용이하게 이용 가능하다. 본원에서 참고로 인용되는 하기 문헌은 당업자가 본 발명에 사용하기 위한 신경 줄기 세포의 1차 배양물을 제조할 수 있도록 하는 데 필요한 설명을 제공한다: 미국 특허 제5,750,376호, 제6,497,872호 및 제6,777,233호; 미국 특허 공개 제2005-0112109호, 제2004-0048373호, 제2002-0039789호, 제2002-0039789호, 제2003-0095956호, 제2005-0118143호, 제2006-0148083호 및 제2005-0074880호; Isolation, Characterization and Use of Stem Cells from the CNS, 18 Ann. Rev. Neurosci. 159-92 (1995); M Marvin & R. McKay, Multipotential Stem Cell in the Vertebrate CNS, 3 Semin. Cell. Biol. 401-11 (1992); R. P. Skoff, The Lineages of Neuroglial Cells, 2 The Neuroscientist 335-44 (1996). A. A. Davis & S. Temple, A Self-Renewing Multipotential Stem Cells in Embryonic Rat Cerebral Cortex, 362 Nature 363-72 (1994); A. G. Gritti et al., Multipotential Stem Cells from the Adult Mouse Brain Proliferate and Self-Renew in Response to Basic Fibroblast Growth Factor, 16 J. Neurosci. 1091-1100 (1996); B. A. Reynolds et al., A Multipotent EGF-Responsive Striatal Embryonic Progenitor Cell Produces Neurons and Astrocytes, 12 J. Neurosci. 4565-74 (1992); B. A. Reynolds & S. Weiss, Clonal and Population Analyses Demonstrate that an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor is a Stem Cell, 175 Developmental Biol. 1-13 (1996); Cattaneo et al., Mol. Brain Res., 42, pp. 161-66 (1996); 및 B. P. Williams et al., The Generation of Neurons and Oligodendrocytes from a Common Precursor Cell, 7 Neuron 685-93 (1991).

상기에서 태아 신경 줄기 세포 조성물을 언급하였지만, 본 발명의 방법은 또한 성체 신경 조직 유래의 조성물을 사용하여 실시할 수 있다. 이러한 성체 신경 줄기 세포 및 이것을 얻는 방법은 하기 문헌에 개시되어 있으며, 이들의 개시 내용은 본원에서 참고로 인용한다: 미국 특허 제5,356,807호, 제5,851,832호, 제6,638,763호 및 제6,812,027호; 및 미국 특허 공개 제2003-0049234호, 제2003-0095956호, 제2003-0118566호, 제2004-0253719호, 제2005-0112109호 및 제2005-01 18143호.

본 발명의 방법은, 신경 줄기 세포의 1차 배양물을 사용하는 것 이외에도, 정제된 신경 줄기 세포의 조성물을 추가로 고려한다. 본 발명에 있어서, 세포 조성물은, 조성물 내의 세포가 상이한 유형의 세포를 실질적으로 포함하지 않을 경우, "정제된" 또는 "단리된" 것이다. 세포 조성물은, 이것이 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상 또는 약 100% 이상의 원하는 세포 유형을 포함할 경우 "정제된" 또는 "실질적으로 정제된" 것으로 간주된다. 본 발명에 사용하기 위한 신경 줄기 세포는, 예를 들어, FACS, 자성 분류, 연속 계대배양, 클로닝 및 친화성 크로마토그래피와 같은 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 정제할 수 있다. 이러한 신경 줄기 세포는 배양에 의해 증식시킨 혼합 세포 집단 또는 조직 외식편으로부터 정제할 수 있다. 본 발명을 실시하는 데 사용하기 위한 적절한 정제된 세포 및 이를 제조하는 방법은 하기 문헌에 개시되어 있으며, 그 개시 내용은 본원에서 참고로 인용한다: 미국 특허 제5,196,315호, 제5,766,948호, 제5,968,829호, 제6,468,794호, 제6,638,763호, 제6,680,198호, 제6,767,738호, 제6,852,532호, 제6,897,061호 및 제7,037,719호; 및 미국 특허 공개 제2002-0086422호, 제2004-0253719호, 제2005-0003531호, 제2005-0125848호, 제2005-0142569호 및 제2006-0099192호.

본 발명에 사용하기 위한 신경 줄기 세포는 또한 신경 형성능 골수 중간엽 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 이러한 세포는 미분화된 상태에서 적절한 시험관내 조건 하에 신경 표현형을 나타낸다. 양수는 본 발명에 사용하기 위한 신경 전구 세포로 교차분화될 수 있는 중간엽 줄기 세포의 또 다른 공급원이다. 본 발명에 사용하기 위한 신경 형성능 골수 줄기 세포를 얻는 것에 관한 설명은 본원에서 참고로 인용하는 하기 문헌에 기재되어 있다: 미국 특허 제6,673,606호 및 제7,015,037호; 미국 특허 공개 제2002-0164794호, 제2003-0003090호, 제2003-0039639호, 제2003-0059414호, 제2003-0203484호, 제2004-0151701호, 제2004-0208858호, 제2005-0282276호, 제2005-0249708호, 제2006-0105457호, 제2006-0177928호; 및 Mareschi et al. Exp Hematol. 2006 Nov; 34(11): 1563-72.

본 발명에 사용하기 위한 신경 형성능 중간엽 세포는 제대혈로부터 유래될 수 있다. 이러한 적절한 탯줄 유래 세포 및 그 단리 방법은 미국 특허 공개 제2002-0028510호, 제2005-0249708호, 제2004-0115804호, 제2005-0142118호 및 제2005-0074435호에 개시되어 있으며, 상기 문헌들의 개시 내용은 본원에서 참고로 인용한다. 신경 형성능 중간엽 세포는 피부(예를 들어, 미국 특허 공개 제2003-0003574호, 제2004-0253718호 및 제2004-0033597호; 및 Shih et al. Stem Cells 2005 Aug; 23(7) 1012-1020 참조), 말초혈(예를 들어, 미국 특허 공개 제2004-0136973호 및 제2005-0221483호 참조), 태반(예를 들어, 미국 특허 공개 제2005-0089513호 및 제2006-0030039호 참조) 및 양막(예를 들어, 미국 특허 공개 제2003-0044977호 참조)로부터 유래될 수도 있다. 이들 참고 문헌의 개시 내용은 본원에서 참고로 인용한다.

본 발명에 사용하기 위한 신경 줄기 세포는 선택 유산 후의 태아 조직을 비롯한 인간 이종성 공급원으로부터 또는 신생아, 소아 또는 성인 장기 공여자로부터 유래될 수 있다. 자가 신경 조직은 생검에 의해 얻거나, 신경 조직을 제거하는 신경 외과 수술, 예를 들어, 간질 수술, 측두엽 절제술, 해마 절제술을 받는 환자로부터 얻을 수 있다. 신경 줄기 세포를 전두엽, 척수원추, 흉부 척수, 뇌간 및 시상하부를 비롯한 다양한 성체 CNS 뇌실 영역으로부터 단리하여 본원에 상세히 설명하는 방법을 이용하여 시험관내에서 증식시켰다. 이러한 경우 각각에서, 신경 줄기 세포는 자기 유지능을 나타내며, 뉴런, 성상 세포 및 희돌기 세포를 포함하는 다수의 자손 세포를 생성한다.

또한, 본 발명은 신경 줄기 세포의 정제된 집단을 증식시키는 데 이용될 수 있다. 신경 줄기 세포의 정제된 집단을 제공하는 방법으로는 FACS, 자성 분류, 연속 계대배양, 클로닝 및 친화성 크로마토그래피를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 이들 방법은 배양에 의해 증식시킨 세포의 혼합 집단 또는 조직 외식편으로부터 세포를 정제하는 데 이용될 수 있다. 본 발명을 실시하는 데 이용되는 적절한 정제된 세포 및 그 제조 방법은 그 개시 내용을 본원에서 참고로 인용하는 하기 문헌에 개시되어 있다: 미국 특허 제5,196,315호, 제5,766,948호, 제5,968,829호, 제6,468,794호, 제6,638,763호, 제6,680,198호, 제6,767,738호, 제6,852,532호, 제6,897,061호 및 제7,037,719호; 및 미국 특허 공개 제 2002-0086422호, 제2004-0253719호, 제2005-0003531호, 제2005-0125848호, 제2005-0142569호 및 제2006-0099192호.

본 발명은 또한 중간엽 줄기 세포를 사용하여 실시할 수 있다. 즉, 본 발명의 환경 요인과 세포 배양 조건의 조합을, 증대된 증식력 및 증대된 분화 잠재력을 갖는 중간엽 줄기 세포 집단을 생산하는 데 이용할 수 있다. 상기한 바와 같이, 줄기 세포 증식과 관련하여 사용될 때의 "증대된"은 줄기 세포의 유사분열성 분열 속도가 측정 가능하게 증가하는 것을 의미한다. 줄기 세포 분화 잠재력과 관련하여 사용될 때, "증대된"은 줄기 세포가 배양에 의해 증식되고 계대됨에 따라 줄기 세포의 분화 잠재력을 유지하거나 그 상실을 억제하는 것을 의미한다.

본 발명에 사용하기 위한 중간엽 줄기 세포는 본원에 개시된 방법에 따라 증식될 수 있는 줄기 세포를 제공하는 임의의 인간 또는 비인간 조직으로부터 유래될 수 있다. 적절한 조직 공급원으로는 태아 공급원, 신생아 공급원 및 이들의 조합을 포함한다. 중간엽 줄기 세포의 적절한 공급원을 얻을 수 있는 조직으로는 골수, 혈액(말초혈), 진피, 골막, 활막, 말초혈, 피부, 모근, 근육, 자궁 내막, 지방조직, 태반, 월경 분비물, 융모막 융모, 양수 및 제대혈을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 중간엽 줄기 세포는 이들 공급원으로부터 개별적으로 얻을 수도 있고, 이들 공급원을 합하여(농축 전 또는 후) 상이한 조직 공급원 유래의 중간엽 줄기 세포의 혼합 집단을 생성할 수도 있다.

본 발명에 사용하기 위한 중간엽 줄기 세포 조성물은 정제된 또는 미정제 중간엽 줄기 세포를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 중간엽 줄기 세포는 본원에서 그 개시 내용을 참고로 인용하는 하기 문헌에 개시된 것들을 포함한다: 미국 특허 제5,215,927호; 미국 특허 제5,225,353호; 미국 특허 제5,262,334호; 미국 특허 제5,240,856호; 미국 특허 제5,486,359호; 미국 특허 제5,759,793호; 미국 특허 제5,827,735호; 미국 특허 제5,811,094호; 미국 특허 제5,736,396호; 미국 특허 제5,837,539호; 미국 특허 제5,837,670호; 미국 특허 제5,827,740호; 미국 특허 제6,087,113호; 미국 특허 제6,387,367호; 미국 특허 제7,060,494호; Jaiswal, N., et al., J. Cell Biochem. (1997) 64(2): 295-312; Cassiede P., et al., J. Bone Miner. Res. (1996) 11(9): 1264-1273; Johnstone, B., et al., (1998) 238(1): 265-272; Yoo, et al, J. Bone Joint Sure. Am. (1998) 80(12): 1745-1757; Gronthos, S., Blood (1994) 84(12): 4164-4173; Basch, et al,, J. Immunol. Methods (1983) 56: 269; Wysocki and Sato, Proc, Natl. Acad. Sci. (USA) (1978) 75: 2844; 및 Makino, S., et al., J. Clin. Invest. (1999) 103(5): 697-705.

본 발명은 본원에 개시된 줄기 세포 집단을 증식시키는 데 적합한 임의의 배양 조건을 이용하여 실시할 수 있다. 즉, 본 발명은, 본원에 개시된 환경 요인과 조합될 때 증대된 증식, 분화, 생착 및/또는 생체내 이동 특성을 갖는 줄기 세포 집단을 생산하는 임의의 세포 배양 조건을 이용하여 실시할 수 있다. 본원에서 사용될 때, "세포 배양 조건"이란 용어는 배지 조성, 세포 배양(예를 들어, 인큐베이터) 온도, 세포 시딩 밀도, 사용을 위해 줄기 세포를 수거하기 전에 허용되는 계대수, 최고 세포 밀도(즉, 세포를 계대하기 전에 허용되는 줄기 세포의 최고 밀도) 및 이들의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 당업자는 배양되는 줄기 세포의 종류 및 원하는 분화 잠재력의 수준에 따라 적절한 세포 배양 조건이 달라진다는 것을 알 것이다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 줄기 세포를 혈청 함유 배양 배지의 사용을 포함하는 조건 하에 배양한다. 본 발명은 인간, 소, 염소, 돼지, 말, 토끼, 래트 및 이들의 조합을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 임의의 포유동물 유래의 혈청을 사용하여 실시할 수 있다. 사용되는 혈청의 양은 배양되는 줄기 세포의 의도된 용도에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 줄기 세포를 약 5% 미만의 혈청을 포함하는 배지에서 배양한다. 본 발명의 일부 실시형태는 약 0.1%~0.2%의 혈청을 함유하는 배지에서 줄기 세포를 배양한다.

본 발명의 비한정적인 실시형태에서, 인간 골수를 산소 조정 중간엽 줄기 세포(OM-MSC)의 생산을 위해 사용한다. 적절한 공여자로부터 인간 골수 천자액을 흡인하여 1차 세포 배양물을 조제하는 데 사용한다. 1차 세포 배양물을 배양 배지에서 증식시킨다. 일부 양태에서, 상기 배양 배지는 혈청(예를 들어, 약 0.05~2%의 우태 혈청)을 포함할 수 있다. 1차 배양물을 산소 농도 약 0.5~2%의 저산소 조건 하에 배양에 의해 증식시킨다. 중간엽 줄기 세포는 골수 천자액 유래의 1차 배양물로부터 시작하여 저산소 조건 하에 증식시킬 수 있다. 다른 양태에서, 중간엽 줄기 세포를, 세포의 계대 후에, 예를 들어, 1차, 2차, 3차 또는 그 이상의 계대 후에, 그러한 저산소 조건 하에 증식시킨다.

줄기 세포 인자

본 발명은, 단독으로 또는 줄기 세포(예를 들어, OM-MSC 및/또는 OM-NSC)와 함께 사용되는, 의학적 질병의 치료를 위한 줄기 세포 인자의 생산 및 사용을 추가로 고려한다. 본원에서 사용될 때, 용어 "줄기 세포 인자"는 줄기 세포의 대사 활성을 통해 생산되는 임의의 생물학적 활성 물질을 의미한다. 이러한 물질로는 사이토카인, 케모카인, 펩티드, 단백질, 아미노산, 폴리뉴클레오티드(즉, RNA 또는 DNA) 및 이들의 조합을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 줄기 세포 인자는 본원에 개시된 본 발명의 방법에 따라 투여될 경우 치료 효과를 제공할 수 있는 능력을 가질 뿐만 아니라 시험관내 또는 생체내에서 줄기 세포의 증식, 분화, 생착 및 이동에 영향을 줄 수 있는 능력을 갖는다.

본 발명의 줄기 세포 인자는 (예를 들어, 줄기 세포로부터의) 배양된 배지, 줄기 세포 균질물, 또는 동결건조 줄기 세포 조제물을 비롯한 다수의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 이러한 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포 및 신경 줄기 세포를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 일부 양태에서, 이러한 줄기 세포 인자는 OM-MSC 및 OM-NSC를 비롯한 산소 조정 줄기 세포로부터 얻는다. OM-MSC로부터 유래된 인자를 산소 조정 중간엽 줄기 세포 인자, 또는 "OM-MSCF"라 칭한다. 유사하게, OM-NSC로부터 유래된 줄기 세포 인자를 산소 조정 신경 줄기 세포 인자 또는 "OM-NSCF"라 칭한다.

본 발명의 비한정적인 실시형태에서, 줄기 세포 인자는, 줄기 세포 집단을 얻고, 줄기 세포를 하나 이상의 환경 요인과 접촉시키는 것(예를 들어, 감소된 산소 분압 하에 줄기 세포를 배양하는 것)을 포함하는 시험관내 조건 하에 줄기 세포를 배양함으로써 제조한다. 그 후, 배양 중에 줄기 세포에 의해 생산된 줄기 세포 인자를 당업계에서 용이하게 이용되는 방법에 의해 수거할 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포 인자는, 줄기 세포로부터 생산된 조정 배양 배지로부터 얻거나, 줄기 세포를 사용하여 줄기 세포 용해물을 형성함으로써 얻을 수 있다. 본 발명은 OM-MSC뿐만 아니라 OM-NSC로부터 생산된 인자를 고려한다. 본 발명은 무혈청 배양 배지 또는 혈청 함유 배양 배지에서 줄기 세포 인자를 생산하기 위해 줄기 세포를 배양하는 것을 추가로 고려한다.

유용성

일부 양태에서, 본 발명은 줄기 세포의 제조를 촉진하는 데 이용된다. 따라서, 본 발명은 원하는 수의 줄기 세포를 얻는 데 필요한 시간의 길이를 감소시킨다. 본 발명은 또한 줄기 세포가 원하는 수준의 분화 잠재력을 유지한 채로 많은 회차의 세포 계대를 겪을 수 있도록 함으로써 줄기 세포 제조 수율을 향상시킨다.

일부 양태에서, 본 발명은 줄기 세포의 치료적 잠재력을 조정(즉, 증가 또는 증대)하는 데 이용된다. 이러한 실시형태에서, 제1 치료적 잠재력을 갖는 줄기 세포를 적절한 조건 하에 배양하고 하나 이상의 환경 요인에 노출시켜 제2 치료적 잠재력을 갖는 줄기 세포를 생산하며, 상기 제2 치료적 잠재력은 제1 치료적 잠재력보다 크다. 본원에서 사용될 때, 줄기 세포가 본 발명의 방법에 따라 증식시키지 않은 대조군 세포에 비해 증가된 증식률, 증가된 생체내 이동 능력, 증가된 분화 잠재력 및/또는 증가된 최종 세포 활성(즉, 기능)을 가질 경우, 이 줄기 세포는 더 큰 치료적 잠재력을 갖는 것으로 간주된다. 줄기 세포 활성의 증가는 줄기 세포의 생체내 이동, 증식 및/또는 생착 특성의 증가를 통해 관찰될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 줄기 세포의 생체내 이동 및/또는 생착 잠재력을 증대시키는 데 이용된다. "생체내 이동" 또는 "이동"과 관련하여 사용될 때, 용어 "증대시키는"은, 본 발명이, 본 발명의 방법에 따라 처리(예를 들어, 배양)되지 않은 대조군 줄기 세포에 비해, 식립(예를 들어, 이식)된 줄기 세포가 생체내에서 이동할 수 있는 속도 및/또는 거리를 측정 가능하게 증가시키는 것을 의미한다. "생체내 생착" 또는 "생착"과 관련하여 사용될 때, 용어 "증대시키는"은, 본 발명이, 줄기 세포가 피험체의 신체에 받아들여져 영양을 공급받고 식립된 줄기 세포와 접촉하는 세포의 기능을 나타낼 수 있는 능력을 측정 가능하게 증가시키는 것을 의미한다.

본 발명은 또한 치료 용도를 위한 줄기 세포 및 줄기 세포 인자를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 다양한 중추신경계 질환에 사용하기 위한 줄기 세포(예를 들어, 신경 줄기 세포)를 생산한다. 본원에서 사용될 때, 용어 "중추신경계 질환" 또는 "CNS 질환"은 포유동물의 중추신경계의 정상 기능을 해치는 상태 또는 손상, 예를 들어, 신경퇴행성 질환, (뇌 또는 척수에의) 외상성 손상 및 CNS 기능장애를 의미한다. 신경퇴행성 질환은 일반적으로 CNS 신경 조직의 장기간에 걸친 퇴화와 관련되어 있으며, 그 예로 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증(MS), 헌팅턴병, 근위축성 측삭경화증, 뇌성 마비, 고셔병, 테이색스병, 니만피크병, 스핑고마이엘린 유지증 및 뇌종양을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. CNS 질환은 외상성 손상, 예를 들어, 출혈성 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중, 및 뇌 및 척수에의 기계적 손상을 추가로 포함한다. 어구 "CNS 질환"은, 예를 들어 우울증, 간질 및 정신분열증과 같은 기능장애를 추가로 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명은의 줄기 세포 조성물은 적정량의 세포를 약학적으로 허용되는 담체에 현탁시킴으로써 제조한다. 본원에서 사용될 때, "약학적으로 허용되는"이란 어구는 포유동물에게 투여될 때 유해 반응을 유발하지 않는 담체 또는 비이클을 의미한다. 이러한 담체는 비독성이며, 체내에서 염증 반응 또는 아네르기 반응을 유발하지 않는다. 본 발명을 실시하는 데 사용되는 약학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어, 배양 배지 및 인산염 완충 염수와 같은, 면역화에 유용한 잘 알려진 임의의 화합물을 포함한다. 추가적인 생리학적으로 허용되는 담체 또는 그 조제물은 잘 알려져 있고, 일반적으로, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science (18^th Ed., ed. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990)] 및 문헌[the Handbook of Pharmaceutical Excipients (4^th ed., Ed. Rowe et al. Pharmaceutical Press, Washington, D.C.)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 각각 본원에서 참고로 인용한다.

본 발명의 일 양태는 피험체에 투여되는 세포의 농도에 관한 것이다. 이와 관련하여, 줄기 세포 및/또는 줄기 세포 인자는, 본원에 개시된 방법에 따라 투여될 경우 치료 효과를 제공하는 임의의 농도로 투여될 수 있다. 적절한 줄기 세포 농도는 약 10⁴개~약 10⁷개 세포/ml이다. 특정 치료에 사용되는 세포의 농도는 주사에 사용되는 바늘의 직경에 의해 부여되는 점도 제한 및 치료에 사용되는 조성물의 용량 등의 요인을 고려한다. 줄기 세포 및/또는 줄기 세포 인자는 단회 주사로 투여되거나, 다중 동시 주사로 투여되거나, 동일한 또는 상이한 주사 부위에의 다중 순차 주사로 투여될 수 있다.

본 발명을 산소 조정 신경 줄기 세포(OM-NSC) 및/또는 산소 조정 줄기 세포 인자(OM-NSCF)의 조성물을 사용하여 실시할 경우, 이러한 조성물은 신경 유조직 내의 임의의 부위(즉, 피험체의 혈뇌 장벽의 신경측에 위치하는 임의의 영역)에 투여(예를 들어, 주사)될 수 있다. 따라서, OM-NSC 및/또는 0M-NSCFC는 뇌에 또는 뇌 부근에, 또는 척수에 또는 척수 부근에, 또, 이들을 조합한 부위에 투여될 수 있다.

본 발명의 일부 실시형태에서, OM-NSC 및/또는 OM-NSCFC의 조성물은 피험체의 척추강내로 투여된다. 본원에서 사용될 때, 용어 "척추강내 투여" 또는 "척추강내로"는, 천두술 또는 대조 천자 또는 요추 천자 등을 통한 측뇌실 주사를 비롯한 기법에 의해 피험체의 뇌척수액으로 직접 신경 줄기 세포 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것으로 의도된다(문헌[Lazorthes et al. Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192], 문헌[Omaya et al., Cancer Drug Delivery, 1:169-179] 및 미국 특허 제7,011,827호의 기재 참조, 이들 문헌의 내용은 본원에서 참고로 인용됨). 용어 "요부"는 제3 요추와 제4 요추(등 아래 부분) 사이의 영역을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "대뇌조"는 두개골이 끝나고 뒷머리에서 척수가 시작되는 부위를 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "뇌실"은 척수 중심관과 연속되는 뇌강을 포함하는 것으로 의도된다. 상기에 언급된 어느 한 부위로의 OM-NSC 및/또는 OM-NSCFG 조성물의 투여는 신경 줄기 세포 조성물의 직접 주사 또는 침착(deposition)에 의해 수행할 수 있다. 주사 또는 침착은, 예를 들어, 볼러스 주사 또는 연속 주입의 형태일 수 있다.

허혈성 뇌졸중

일부 양태에서, 본 발명은 허혈성 뇌졸중을 치료하는 데 이용된다. 예를 들어, OM-MSC 및/또는 OM-MSCF는 단독으로 또는 OM-NSC 및 OM-NSCF와 조합하여 투여될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, OM-MSC 및/또는 OM-MSCF는 정맥내 투여되며, OM-NSC 및/또는 OM-NSCF는 혈뇌 장벽의 중추신경계측에 투여된다. 투여는 동맥내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 복막내 투여, 안내 투여, 안구후 투여 및 이들의 조합을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 다른 형태로 이루어질 수도 있다.

예시적이고 비한정적인 실시형태에서, 본 발명은 인간 골수 유래의 OM-MSC를 사용함으로써 허혈성 뇌졸중을 치료한다. 일반적으로, 이러한 실시형태는 인간 공여자로부터 취한 골수 천자액으로부터 세포 현탁액을 만들어 실시할 수 있다. 그 후, 이 세포 현탁액을, 예를 들어 혈청을 함유하는 배양 배지에 시딩하고, OM-MSC 집단이 생성될 수 있도록 원하는 횟수의 계대 기간 동안 감소된 산소 분압 하에 증식시킬 수 있다. 그 후, 유효량의 OM-MSC를 약학적 담체에 현탁시켜, 허혈성 뇌졸중이 발병한 피험체에 정맥내 투여할 수 있다. 유사한 실시형태에서, OM-MSCF를 OM-MSC 대신에 사용하거나 이와 함께 사용할 수 있다.

여기에서는 본 발명의 특정 용도만이 개시되었지만, 당업자라면 본 발명이 줄기 세포 증식 및/또는 분화의 증대로부터 이익을 얻는 임의의 용도에 유용하다는 것을 이해할 것이다.

실시예 1

조직 채취 및 세포 배양

8~10주령의 태아 뇌로부터 인간 신경 줄기 세포를 채취하였다. 뇌 조직을 새로 절개하여, Accutase(Sigma Aldrich)에서 37℃로 30분 동안 분리시켰다. 이 세포를, 상이한 산소 분압 하에, 100 mm 세포 배양 디쉬의, 20% 또는 5% 산소를 포함하는 배지, 무혈청 배지, 0.1% 혈청 조정 배지, 또는 0.2% 혈청 조정에 시딩하였다. NSC를 유지하기 위한 기본 배지로 Neurobasal 배지를 사용하였다. 성분들은 Neurobasal(96%; Gibco Invitrogen, Grand Island, NY); GlutaMAX(1%; Gibco/lnvitrogen); 헤파린(8 mg/ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)(26)을 포함하였다. 여기에, 하기 인자들을 첨가하였다: 0.1% 또는 0.2% FBS(Hyclone)가 보충된 염기성 섬유아세포 성장 인자 및 상피세포 성장 인자(bFGF; 20 ng/ml; EGF; 20 ng/ml; 인간, 재조합; Chemicon International, Temecula, CA). 통상적인 계대배양을 위해, 분리제(dissociating agent)로서 TrypLE를 사용하였다(Invitrogen).

닭 배아

SPEFAS(North franklin, CT)로부터 무균 닭 수정란을 입수하여 Hamburger 및 Hamilton(H&H)(1951)에 따라 단계적으로 발생시켰다.

닭 배아로의 신경 줄기 세포의 이식

이식 72시간 전에 NSC를 계대배양하였다. 미분화 NSC 및 분화 NSC를 수집하고, 미분화 NSC 및 분화 NSC 각각에 대해 2×10⁵개 세포의 세포 샘플을 조제하였다. 이 세포 샘플을 H&H 26기의 닭 배아의 종뇌 측뇌실로 주사(즉, 이식)하였다. 이식된 닭 배아를 37℃에서 6일 동안 부화시켰다. 닭 배아 뇌를 적출하여 동결절편 작성을 위해 OCT Cryo Tech로 포매하였다.

면역조직학적 분석

동결절편 슬라이드를 실온에 30분 동안 두었다. 슬라이드를 미리 냉각한 아세톤으로 실온에서 5~10분 동안 고정하고, 100% 메탄올 중 0.3% H₂O₂로 10분 동안 처리하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 켄칭하였다. 슬라이드를 매회 5분 동안 3회 PBS로 세척하였다. 닭 뇌를 항인간 네스틴(1:3,000, Chemicon international Inc.) 및 핵(1:500, Chemicon International Inc.)과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이트하였다. 슬라이드를 매회 5분씩 3회 PBS로 세척하고, 2차 항체 Alexa fluor 488 접합 염소 항마우스 IgG(1:400) 및 Alexa Fluro 647 접합 염소 항토끼 IgG(1:400)에 실온에서 30분 동안 노출시켰다. 슬라이드를 매회 5분씩 3회 PBS로 세척하고, DAPI로 실온에서 10분 동안 대비염색하였다. 슬라이드를 매회 5분씩 3회 PBS로 세척하고, Sigma-Aldrich로부터 입수한 면역형광 봉입제로 봉입하였다.

실험 2 - 포유동물 숙주로의 세포 이식

이 연구의 목적은, 1) 폐색 1일 후, 성인 골수 줄기 세포(human adult bone marrow stem cell: HBMSC)의 단독 정맥내 투여 또는 인간 태아 신경 줄기 세포(HFNSC)의 척추강내 투여와 병행된 정맥내 투여가, 60분 간의 중대뇌동맥 폐색(middle cerebral artery occlusion)(tMCAO)이 일어난 자연 발생 고혈압 래트(spontaneously hypertensive rat: SHR)의 감각 운동 기능 및 인지력을 회복시키고 경색 용적에 영향을 미치는지를 조사하고, 2) 정상 산소 조직 배양 조건과 저산소 조직 배양 조건(HBMSC-L0₂) 하에 증식시킨 HBMSC의 정맥내 주사 후 기능 회복을 비교하는 것이었다.

경색 후 1일, 3일, 7일, 14일, 21일, 28일, 35일 및 42일째 감각 운동 기능 장애 및 전반적인 상태를 조사하기 위해 7 포인트 및 28 포인트 신경 점수 테스트를 수행하였다. 허혈 후 7일, 21일 및 35일째 실린더 테스트를 수행하였다. 인지력 결함은 뇌졸중 후 28~29일째 모리스(Morris) 수중 미로 테스트로 평가하였다. 숙련된 발 사용은 허혈 후 35~39일째 몬토야 계단 테스트(Montoya's staircase test)(사료 잡기와 먹기)로 테스하였다. 경색 용적 및 출혈 발생률은 42일째 체외 MRI로 평가하였다. 체외 MRI 후, 뇌를 내동 처리하여 액체 질소로 냉동시켜 가능한 후속 분석을 위해 -80℃에 보존하였다.

동물들은 다음과 같이 그룹핑하였다:

ㆍ 그룹 1: 폐색 후 24시간째 비이클(PBS, 2 ml/kg, i.v.)로 처리된 래트 15마리,

ㆍ 그룹 2: 폐색 후 24시간째 비이클(PBS, 150 ㎕/kg, i.t.)로 처리된 래트 15마리,

ㆍ 그룹 3: 폐색 후 24시간째 비이클(PBS, kg당 2 ml/150 ㎕, i.v./i.t.)로 처리된 래트 15마리,

ㆍ 그룹 4: 폐색 후 24시간째 HBMSC(2.0 M 세포, 2 ml/kg, i.v.)로 처리된 래트 15마리,

ㆍ 그룹 5: 폐색 후 24시간째 MBMSC-LO₂(2.0 M 세포, 2 ml/kg, i.v.)로 처리된 래트 15마리,

ㆍ 그룹 6: 폐색 후 24시간째 HFNSC-LO₂(2.0 M 세포, 150 ㎕/kg, i.t.)로 처리된 래트 15마리,

ㆍ 그룹 7: 폐색 후 24시간째, 혈청 HFNSC-LO₂(2.0 M 세포, 150 ㎕/kg, i.t.)와 함께 HBMSC-LO₂(2.0 M 세포, 2 ml/kg, i.v.)로 처리된 래트 15마리,

ㆍ 그룹 8: 거동 테스트를 위한 대조군으로서의 미처리 래트 15마리.

일시적 MCAO

변경을 가한 Koizumi의 방법에 따라 수컷 SHR을 대상으로 MCA 폐색에 의해 일시적 국소 뇌허혈을 발생시켰다[Koizumi et al. Jpn. J. Stroke 8: 1-8, 1986]. 이 래트를 5% 이소플루란(70% N₂0 및 30% 0₂; 유량 300 ml/min)으로 마취시켰다. 수술하는 동안, 마취제의 농도를 1.0~1.5%로 줄였다. 직장 온도는 항온 블랭킷 시스템으로 37.0±1.5℃로 유지하였다. 중선 피부 절개 후, 우측 총경동맥(CCA)을 노출시키고, 경동맥 분기로부터 원위에서 외경동맥(ECA)을 결찰시켰다. 끝이 뭉툭한 직경 0.25 mm의 모노필라멘트 나일론실을 내경동맥(ICA)에 22~23 mm 삽입하여 MCA의 기시점에 이르게 하였다. 허혈 60분 후, 실을 제거하여 MCA 혈류를 회복시켰다. 상처를 닫고 소독하여, 동물들을 마취로부터 깨어나게 하였다. tMCAO 후 발생할 수 있는 수술 후 합병증 여부에 대해 래트를 주의를 기울여 모니터링하였다. tMCAO 후 0~7일째 수돗물에 현탁시킨 표준 실험실용 사료를 래트에게 공급하였다. 탈수를 방지하기 위해, 모든 래트에게 7일 동안 1일 1회 식염수(래트당 4 ml)를 복강내 주사하여 투여하였다.

0점 병변(검출 가능한 경색 없음)을 나타낸 동물은 데이터 및 분석으로부터 제외시켰다.

연구를 위한 HBMSC/HFNSC 보존 및 조제

HBMSC 및 HFNSC는, i.v./i.t. 주사를 위한 세포/용액 제조 방법 설명서와 함께, 후원자에 의해 냉동 보존 현탁액으로서 Cerebricon으로 전달되었다. 이 세포 현탁액은 매일 새로 제조하였고 사용하지 않을 때에는 실온(RT)에서 보존하였다. HFNSC와 HBMSC 둘 다에 대해, 적절한 줄기 세포 마커의 발현 및 다양한 성숙 세포 유형으로의 분화 능력을 테스트하였다.

중간엽 줄기 세포(HBMSC)

MSC는 24세의 건강한 여성의 골수로부터 얻었다. Histopague를 사용하여 신선한 검체로부터 단핵 세포를 단리하여, 페트리 디쉬에 시딩하였다. 이 세포를 FGF-2 및 10% 우태 혈청(FBS) 함유 DMEM/F12 배지에서 증식시켰다. 이 세포가 인간 병원체를 갖는지 검사하여 5차 계대까지 추가로 증식시켰다. 증식된 세포를 수거하여, 10% DMSO 및 10% FBS 함유 동결용 배지 중에 바이알당 15×10⁶개 세포로 넣고 속도 제어 냉동기를 사용하여 동결시켰다. 동결된 세포는 운송 시까지 액체 질소에 넣어 보존하였다. 이 세포를 드라이 아이스에 넣어 Cerebricon으로 운송하였다.

저산소 조건으로 배양한 MSC를 2차 계대부터 5% 산소 조건 하에 증식시켰다.

신경 줄기 세포(HFNSC)

신경 줄기 세포는 8주차 인간 태아의 전뇌로부터 얻었다. 기계적 분해로 세포를 단리하여 페트리 디쉬에 플레이팅하였다. 세포를 FGF-2, EGF 및 0.1% 태아 클론(Fetal Clone) II 혈청을 함유하는 신경 배양용 배지에서 5% 산소 조건 하에 증식시켰다. 인간 병원체를 갖는지를 검사하여 4차 계대까지 추가로 증식시켰다. 증식된 세포를 수거하여, 10% DMSO(Cryostor 10)를 함유하는 무혈청 동결용 배지 중에 바이알당 15×10⁶개 세포로 넣고 속도 제어 냉동기를 사용하여 동결시켰다. 동결된 세포는 운송 시까지 액체 질소에 넣어 보존하였다. 이 세포를 드라이 아이스에 넣어 Cerebricon으로 운송하였다.

주입을 위한 HBMSC(정상 산소 및 저산소) 프로세싱

멸균된 50 mL 원심분리용 튜브를 후드에 놓고 미리 열어 두었다. 동결 세포를 포함한 6개 바이알(각각 동결용 배지 1 mL 중에 15×10⁶개 세포를 포함함)을 37℃ 수조에서 해동시켰다. 작은 얼음 결정(약 2~3 mm)이 관찰될 때까지 바이알을 수조에 두었다. 바이알 내용물을 50 mL 원심분리용 튜브로 옮긴 후, 예열한(37℃) 새로운 Ca²⁺ 무함유 행크(Hank) 평형 염 용액(HBSS) 6 mL를 천천히 첨가하고 세포 현탁액을 약하게 혼합하였다. 첨가하는 동안 튜브를 가볍게 진탕하여 균질한 세포 현탁액이 형성되게 하였다. 새로운 HBSS 28 mL를 더 첨가하고, 튜브 내용물을 볼텍싱하지 않은 채 조심스럽게 혼합하였다. 혼합 후, HBMSC를 실온에서 450 g로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 펠릿을 새로운 HBSS 20 mL에 재현탁시켰다. 트립판 블루 및 혈구계수기로 세포 생존율을 측정하였다. 생존율 평가에 세포 현탁액의 1:2 및 1:4 희석액을 사용하였다. 세포를 챔버에 도입하기 전에, 현탁액을 조심스럽게 혼합하였다. 3개 시역(1×1 mm)을 카운팅하여 평균하였다. 최적 카운트는 20~40개 세포/mm²였다.

혼합물 중 생존 세포의 수는 다음과 같았다:

세포 생존율 분석 후, 세포 현탁액에 30 mL의 HBSS를 첨가하고, 그 후 HBMSC를 실온에서 450 g로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액 제거 후, 세포를 Ca²⁺ 무함유 0.01 M PBS에 재현탁시켜 원하는 2.0×10⁶개 세포/0.5 ml를 얻었다.

주입을 위한 HFNSC 프로세싱

멸균된 50 mL 원심분리용 튜브를 후드에 놓고 미리 열어 두었다. 동결 세포를 포함한 6개 바이알(각각 동결용 배지 1 mL 중에 15×10⁶개 세포를 포함함)을 37℃ 수조에서 해동시켰다. 작은 얼음 결정(약 2~3 mm)이 관찰될 때까지 바이알을 수조에 두었다. 바이알 내용물을 50 mL 원심분리용 튜브로 옮긴 후, 예열한(37℃) 새로운 Ca²⁺ 무함유 행크(Hank) 평형 염 용액(HBSS) 6 mL를 상기에 기재한 바와 같이 첨가하였다. 새로운 HBSS 28 mL를 더 첨가하고, 튜브 내용물을 볼텍싱하지 않은 채 조심스럽게 혼합하였다. HBMSC에 대해 기재한 바와 같이 세포 생존율을 측정하였다. HFNSC를 130 g로 실온에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 폐기하였다. 세포를 Ca²⁺ 무함유 0.01 M PBS에 재현탁시켜 2.0×10⁶개 세포/50 ㎕를 얻었다. 적당한 피펫팁을 갖는 1,000 ㎕ 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 20~25회 천천히 혼합하여 균질한 현탁액을 얻었다.

세포 투여

폐색 24시간 후 이소플루란으로 래트를 잠깐 마취시키고, HBMSC 및/또는 HFNSC 또는 비이클을 대퇴정맥 또는 척수강에 주입하였다.

HFNSC의 척수강 주입 후, 마취된 래트를 L-3번 척추에서 추궁절제술을 실시하고, 세포의 정위적 주입을 수행하였다. 요약하면, 래트를 마취시켜 정위 장치에 배치하고, 추궁절제술 전에 주입 지점 주변 피부 부위를 면도하고 소독하였다. 추궁절제술 후 경막을 노출시킨 뒤, HFNSC를 함유하는 50 ㎕ 기밀 주사기를 마이크로리터 주입 펌프(TSE Systems Germany)에 연결하였다. 정위 장치를 사용하여 바늘(26G)을 척수강 내로 유도하였다. 바늘이 척수강으로 침투되면, 세포 주입 시작 전에 CSF가 경막을 통해 누출되도록(약 20 ㎕) 하였다. 비이클 또는 HFNSC를 10분 동안 주입하였다(5 ㎕/min으로 10분 동안 총 50 ㎕, 20×10⁶개 HFNSC를 함유함). 10분 동안 안정화시킨 후, 척수강으로부터 바늘을 조심스럽게 빼내었다. 바늘 제거 직후, 열린 경막을 조직 봉합제(Tisseel^® Duo Quick, Baxter)로 봉하였다. 그 후, 근육과 결합 조직을 층층이 봉합한 후 상처를 닫았다. 수술 후, 래트를 청정 회복 케이지에 넣은 뒤 홈케이지로 돌려 보냈다.

체중

tMCAO 전과 1일, 3일, 7일, 21일, 28일, 35일 및 42일째 각 동물의 체중을 측정하였다.

거동 테스트

허혈 후 운동 및 거동 결합을 평가하기 위해 28 포인트 신경 점수 테스트를 이용하였다. 신경 테스트는 맹검 관찰자가 MCAO 전(기저선) 및 tMCAO 후 1일, 3일, 7일, 14일, 21일, 28일, 35일 및 42일째 수행하였다.

하기 파라미터를 분석하였다:

ㆍ 발 놓기(최고 4점)

ㆍ 정위 반사(최고 1점)

ㆍ 수평 바에서의 거동(최고 3점)

ㆍ 경사대에서의 거동(최고 3점)

ㆍ 대측 회전(최고 2점)

ㆍ 가시적 앞발 뻗기(최고 2점)

ㆍ 주원 운동(최고 4점)

ㆍ 반대쪽 반사(최고 1점)

ㆍ 악력(최고 2점)

ㆍ 운동성(최고 3점)

ㆍ 전반적인 상태(최고 3점)

정상 래트의 최고 점수는 28점이었다.

허혈 후 운동 및 거동 결함을 평가하기 위해 7 포인트 신경 점수 테스트를 이용하였다(문헌[Zausinger et al., 2000. Brain Res. 863:94-105]의 방법을 변경한 것). 신경 테스트는 맹검 관찰자가 MCAO 전(기저선) 및 tMCAO 후 1일, 3일, 7일, 14일, 21일, 28일, 35일 및 42일째 수행하였다.

ㆍ 6등급: 꼬리를 살짝 들어올릴 때 양 앞다리를 바닥쪽으로 정상적으로 뻗음

ㆍ 5등급: 손상된 뇌반구 반대쪽 앞다리의 계속되는 굴신, 경미한 발목 굴신 및 어깨 내전근 운동에서부터 발목, 다리 관절의 전체 굴신 및 어깨 내부 회전을 동반한 내전근 운동을 포함한 심각한 자세까지 다양함

ㆍ 4등급: 환측쪽으로 측면 밀기에 대한 저항성을 감소를 지속적으로 보이는 기능장애 래트

ㆍ 3등급: 꼬리를 당기고 들어 올릴 경우 환측쪽으로 주원 운동하는 래트

ㆍ 2등급: 꼬리를 당길 경우 환측쪽으로 주원 운동하는 래트

ㆍ 1등급: 환측쪽으로 자발적으로 주원 운동하는 래트

ㆍ 0등급: 자발 운동이 없는 래트

동물이 홈케이지 벽에 뒤를 기댄 상태에서의 앞다리 사용 대칭성을 정량하기 위해 실린더 테스트(문헌[Schallert and Tillerson in Innovative models of CNS disease: from molecule to therapy. Clifton, NJ, Humana, 1999]의 테스트를 변경한 것)를 이용하였다. 테스트는 tMCAO 후 7일, 21일 및 35일째 수행하였다. 래트가 홈케이지에서 자유롭게 움직일 때 래트를 모니터링하였다. 뒤를 기댄 채로 케이지 벽에 양 앞다리가 접촉한 것을 맹검 관찰자가 점수로 매겼다. 각 동물에 대해 총 15~20회 접촉을 기록하였고, 손상된(왼쪽) 앞다리 접촉과 비손상 앞다리 접촉의 수를 총 접촉수의 백분율로서 계산하였다.

인지력 테스트는 Morris 등[J Neurosci Methods. 1984; 11: 47-60]에 의해 처음 고안된 수중 미로 테스트를 이용하여 수행하였다. 뇌줄중 후 28일째, 래트에게, 25.0±1.5℃ 온도의 투명한 물을 채운 대형 암색 탱크(직경 200 cm)에서 1시간 간격으로 5회 연속 시험을 수행하게 하였다. 물속에 잠겨 있는 플랫폼(사각형 플랫폼: 10×10 cm; 수면으로부터 1.5 cm 아래)을 풀의 북서(NW) 분면에 배치하였다. 탈출 지점은 항상 풀의 남쪽 끝에 있었다. 래트를 벽을 보게 하여 풀에 집어 넣은 후 놓아주었다. 각 래트에게 물속에 잠긴 플랫폼을 찾는 데 최대 90초를 주었다. 래트가 그 시간 내에 플랫폼을 찾지 못할 경우, 래트를 물리적으로 그곳으로 이끌어 주었다. 플랫폼에서 20초 동안 머무르게 한 후, 래트를 풀에서 꺼내어 건조 케이지에 넣었다. 1시간 후, 각각의 래트에게 동일한 탈출 지점과 플랫폼 위치를 이용하여 2차 시험을 수행하게 하여, 플랫폼 위치를 기억하는지를 측정하였다. 매회 시험마다 1시간의 간격을 두어 래트마다 이 과정을 총 5회 반복하였다. 이러한 5회 시험을 행한 뒤 24시간 후 기억력 시험을 수행하였다.

래트의 수영 경로를 컴퓨터 인터페이스된 카메라 트랙킹 시스템을 이용하여 기록하고 HVS 이미지 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 1~5회의 시험과 6회의 기억력 시험을 위해 하기 파라미터를 분석하였다: 1) 감춰진 플랫폼을 찾는 데 걸리는 시간(잠시), 2) 감춰진 플랫폼에 이르는 경로의 길이(이들 두 파라미터는 플랫폼의 정확한 위치를 학습하고 기억하는 동물의 능력을 측정함), 3) 수영 속도(수영할 수 있는 래트의 신체적 능력을 평가함), 4) 외주에 한정된 수영 경로의 백분율로서 정의된 주촉성, "벽 잡기(wall hugging)"(감춰진 플랫폼을 찾는 게 아니라 풀의 최외곽 15 cm에서 수영함)

몬토야 계단 테스트는 독립적인 앞다리 뻗기와 악력(전신 근육 및 소근육 운동 및 동작)을 측정한다. 이 테스트는 tMCAO 후 35~39일째 5일 동안의 매일 15분의 시험으로 이루어진다. 래트를 계단 장치에 투입하였으며, 여기서 래트는 중앙 플랫폼에 놓여져 양측에 있는 계단의 사료에 닿으려고 한다. 계단은 설탕맛 사료(45 mg, Bioserv, UK)를 미끼로 달고 있는 6개 단으로 되어 있다. 성공적으로 취한 사료의 수(=먹음)뿐만 아니라 닿았으나 떨어뜨린(=도달) 사료의 수도 계산하였다. 테스트 2일 전 모든 래트에게 먹이를 주지 않았다(자유 체중의 85%까지). 5일 동안 1일 1회 래트를 테스트하였다.

뇌 프로세싱 및 T2 및 T2 ^* MRI에 의한 경색 용적 및 출혈 발생률의 체외 이미지화

종료 시점인 42일째, 래트를 펜토바비탈(60 mg/kg Mebunat, Orion Pharma, Finland)로 깊이 마취시키고, 헤파린 처리(2.5 IU/ml) 식염수 및 0.1 M PB(인산염 완충액) 중 4% 포름알데히드를 순차로 심장을 통해 관류시켰다. 그 후, 뇌를 0.1 M PB 중의 4% 포름알데히드에 24시간 동안 침지하였다가 PBS로 헹구었다. 이 뇌를 퍼플루오로폴리에테르(FOMBLIN)으로 포매하였다.

능동 차폐 경사 코일이 장착된 Varian 7.0T 수평 자석에 인터페이스된 Varian DirectDrive™ 콘솔을 이용하여 T2 및 T2^* 가중 MRI를 수행하였다. 쿼드러쳐 모드로 구동되는 하프 볼륨 코일을 신호 전송 및 수신에 사용하였다. 경색 용적의 측정을 위해, 단열 리포커싱 펄스 TR = 3 s, TE = 80 ms, 매트릭스 크기 256×128, 35×35 mm²의 FOV 및 1 mm의 절편 두께로 더블 스핀 에코 시퀀스를 이용하여 T2^* 가중 다중 절편(12~14개의 연속 절편) 이미지를 얻었다.

출혈의 검출을 위해, 동일한 해상도 및 TR = 700 ms, TE = 15 ms, 숙임각 약 50°로, 같은 절편으로부터 표준 경사 에코 이미지화 시퀀스를 이용하여 T2^* 가중 이미지를 얻었다. 인하우스 작성 소프트웨어를 이용하여 각각 경색 용적 및 출혈의 존재에 대해 T2 및 T2^* 가중 이미지를 분석하였다.

체외 이미지화 후, 뇌를 PBS로 세척하여, 뇌 조직 정밀 슬라이서로 6 mm 두께의 2개의 관상 뇌 블록(선조체 및 해마 블록)으로 절단하였다. 30% 슈크로스 중에서 +4℃로 2일 동안 내동 처리한 후, 뇌 블록을 액체 질소로 냉동시켜 가능한 후속 조직학적 분석 및 면역조직학적 분석을 위해 -80℃에 보존하였다.

통계 분석

모든 값은 평균±표준편차(SD) 또는 평균의 표준오차(SE)로서 나타내고, 차이는 P<0.05 수준에서 통계적으로 유의한 것으로 간주된다. 통계 분석은 StatsDirect 통계 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. 그룹 평균 간의 차이는 (대조군(=비이클) 그룹에 비교하여) 일원 ANOVA와 듀넷 검정(Dunnet's test)을 순차로 이용하여 분석하였다. 기저선에 대한 그룹 내 비교는 이원 ANOVA와 듀넷 검정을 순차로 이용하여 수행하였다. 비모수 데이터는 각각 Kruskal-Wallis ANOVA 또는 Friedman ANOVA로 분석하였다. 경색을 나타내지 않은(0 경색) 동물은 연구로부터 제외시켰다.

결과

7 포인트 신경 점수는 HBMSC, HBMSC-L0₂, HFNSC-L0₂, HBMSC-L0₂ 및 HBMSC-L0₂/HFNSC-L0₂ 세포 조성물의 유효성을 입증한다. 결과는 도 8에 도시된다.

결과

결과는 도 1~5 및 표 1에 나타내었다.

Claims

a. 약학적으로 허용되는 담체 중의 치료량의 신경 줄기 세포; 및
b. 약학적으로 허용되는 담체 중의 치료량의 중간엽 줄기 세포
를 포함하는, 재생성 줄기 세포 치료용 키트로서,
c. 상기 신경 줄기 세포 및 상기 중간엽 줄기 세포는 하나 이상의 환경 요인에 노출된 것인 키트.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 환경 요인이 감소된 산소 분압을 포함하는 것인 키트.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 환경 요인이 중간엽 줄기 세포 및 신경 줄기 세포를 감소된 산소 분압 하에 배양하는 것을 포함하는 것인 키트.
제3항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포 및 상기 중간엽 줄기 세포를 혈청 함유 배양 배지에서 배양하는 것인 키트.
제4항에 있어서, 상기 배양 배지가 약 0.1~2.0%의 혈청을 포함하는 것인 키트.
a. 치료량의 신경 줄기 세포를 환자에게 투여하는 단계; 및
b. 치료 유효량의 중간엽 줄기 세포를 환자에게 투여하는 단계
를 포함하는, 환자의 의학적 질병의 치료 방법으로서,
c. 상기 신경 줄기 세포 및 상기 중간엽 줄기 세포는 하나 이상의 환경 요인에 접촉된 것인 치료 방법.
제6항에 있어서, 상기 하나 이상의 환경 요인이 감소된 산소 분압을 포함하는 것인 치료 방법.
제6항에 있어서, 상기 하나 이상의 환경 요인이 신경 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포를 감소된 산소 분압 하에 배양하는 것을 포함하는 것인 치료 방법.
제8항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포 및 상기 중간엽 줄기 세포를 혈청 함유 배양 배지에서 배양하는 것인 치료 방법.
제9항에 있어서, 상기 의학적 질병이 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머병, 척수 손상, 파킨슨병, 외상성 뇌손상, 고형 종양, 다발성 경화증, 근위축성 측삭경화증, 헌팅턴병, 근이영양증, 망막 색소 변성, 뇌성 마비, 치매, 화학요법 또는 방사선요법에 기인한 신경장애 및 신경근육병증으로 구성된 군에서 선택되는 것인 치료 방법.
a. 치료 유효량의 중간엽 줄기 세포를 환자에게 투여하는 단계
를 포함하는, 환자의 의학적 질병의 치료 방법으로서,
b. 상기 중간엽 줄기 세포는 하나 이상의 환경 요인에 접촉된 것인 치료 방법.
제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 환경 요인이 감소된 산소 분압을 포함하는 것인 치료 방법.
제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 환경 요인이 신경 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포를 감소된 산소 분압 하에 배양하는 것을 포함하는 것인 치료 방법.
제13항에 있어서, 신경 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포를 혈청 함유 배양 배지에서 배양하는 것인 치료 방법.
제14항에 있어서, 상기 의학적 질병이 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머병, 척수 손상, 파킨슨병, 외상성 뇌손상, 고형 종양, 다발성 경화증, 근위축성 측삭경화증, 헌팅턴병, 근이영양증, 망막 색소 변성, 뇌성 마비, 치매, 화학요법 또는 방사선요법에 기인한 신경장애 및 신경근육병증으로 구성된 군에서 선택되는 것인 치료 방법.
a. 신경 줄기 세포로부터 유래된 유효량의 줄기 세포 인자;
b. 중간엽 줄기 세포로부터 유래된 유효량의 줄기 세포 인자
를 포함하는, 의학적 질병 치료용 키트로서,
c. 상기 신경 줄기 세포 및 상기 중간엽 줄기 세포는 하나 이상의 환경 요인에 노출된 것인 키트.
제16항에 있어서, 상기 하나 이상의 환경 요인이 감소된 산소 분압을 포함하는 것인 키트.
제16항에 있어서, 상기 하나 이상의 환경 요인이 신경 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포를 감소된 산소 분압 하에 배양하는 것을 포함하는 것인 키트.
제18항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포 및 상기 중간엽 줄기 세포를 혈청 함유 배양 배지에서 배양하는 것인 키트.
제14항에 있어서, 상기 의학적 질병이 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머병, 척수 손상, 파킨슨병, 외상성 뇌손상, 고형 종양, 다발성 경화증, 근위축성 측삭경화증, 헌팅턴병, 근이영양증, 망막 색소 변성, 뇌성 마비, 치매, 화학요법 또는 방사선요법에 기인한 신경장애 및 신경근육병증으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.