JPH05504965A

JPH05504965A - ニューロン増殖及び維持を調節する方法

Info

Publication number: JPH05504965A
Application number: JP3505616A
Authority: JP
Inventors: バートレット、ペリー; マーフィ、マーク
Original assignee: アムラド・コーポレイション・リミテッド
Priority date: 1990-03-20
Filing date: 1991-03-20
Publication date: 1993-07-29
Anticipated expiration: 2015-06-05
Also published as: US6177402B1; CA2077763A1; WO1991014443A1; FI924134A0; DE69119759D1; EP0521914A1; EP0521914B1; EP0521914A4; ATE138268T1; JP3049091B2; US20070122381A1; CA2077763C; HK1002697A1; DE69119759T2; US6093390A; FI924134A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ニューロン増殖及び維持を調節する方法本発明は哺乳動物の中枢及び末梢神経系におけるニューロン増殖、維持及び再生を調節する方法並びに同様に対して有用な白血病阻害因子を含む医薬組成物に関する。本発明は哺乳動物、特にヒトの開発的及び脳異型及び神経病の処！に特に有用である。

白血病阻害因子（以下「ＬｉＦ」と云う）は、精製され、クローンされ一二セリキア・コリ及び酵母細胞から精製組換え形で大量に生成された蛋白である（国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８８１００９３）。ＬＴＦはもともとその能力を元に分離され、ネズミ骨髄性白血病細胞系、ＭＬの分化及び抑制を誘導する。ＬＩＦは、ＬＩＦレセプターが単球−マクロファージ系統の細胞に検出されるけれども正常造血細胞に明白な増殖効果はない。

本発明は、神経堤の細胞へのＬＩＦの効果の研究から一部現れた。神経堤は、胚形成の間、神経管の背側唇から現れ、一連の複雑な通路に沿って胚を通って移動する一群の前駆体細胞である。移動後、稜細胞は、知覚及び自律神経神経節のニューロン及びシュワン細胞、膓神経質系、副腎髄質、皮膚及び面間葉のメラノサイトを含む、多くの変化の細胞型を起こす。個体群レベルで研究したとき稜は幹細胞の多能性収集であるように見える。ウズラ神経堤がニワトリ胚に移植されたドウアリン及び共同研究者の広大な移植実験は、稜細胞の発育運がニワトリ胚でのこの移植の位置により測定されることを示した。これは、稜の完全発生レパートリ−が移植された稜細胞の異なるサブポピユレーションに含まれることだけでなく、環境因子が細胞の最終分化表現型で大きな役割を演じることを示した。

最後の１０年で、神経堤は特に発育した通路に既に送られる細胞のサブポピユレーションを含むことがますます明らかになった（２．３）。しかしながら、これらの細胞の分化が環境因子により測定されることも明らかである。

多（の可溶性栄養因子はニューロンを誘導する神経堤の生存剤として作用することを示したが、それらは、神経堤内のニューロン前駆体細胞に直接作用することを示さなかった。これらの因子は、神経生長因子（ＮＧＦ：４）脳誘導向神経因子（ＢＤＮＦ：５）、毛様体向神経因子（ＣＮＴ　Ｆ　：６　）及び腺維芽細胞生長因子（ＦＧＦ’Ｓ：５参照）を含む。

本発明まで導く研究で、実験は、神経堤の前駆体群への直接効果を有する剤を設けるよう実施された。本発明により驚（べきことに神経堤細胞はＬＩＦの存在で完全に成熟したニューロンに分化することが発見された。この効果は滴定可能であり、ニューロンの前駆体細胞の増殖の欠如で起きる。さらに神経堤細胞のニューロンへの分化のＬＩＦの効果は胚の背の根神経節の前駆体細胞の成熟知覚ニューロンへの分化の刺激に拡がる。

従って、本発明の一つの局面は、神経前駆体細胞のニューロンへの分化及び／又は維持及び／又は再生を可能にするに十分な時間及び条件下、有効量の白血病阻止因子（Ｌ　Ｉ　Ｆ）を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物におけるニューロン増殖及び／又は維持及び／又は再生を調節する方法を意図する。

本発明の他の局面は、中枢神経系において二ニーロンの数を増加させ及び／又は維持するに十分な時間及び条件下に有効量のＬＩＦを哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の中枢神経系におけるニューロンを増加し及び／又は刺激し及び／又は維持し及び／又は形成を再生し及び／又は生存する方法に関する。

一実施態様では、ＬＩＦは未成熟ニューロンを増加し、刺激し維持し及び／又は再生する。

本発明のさらｉ：４Ｉ！！の局面は、末梢神経系におけるニューロンの数を増加し及び／又は維持するに十分な時間及び条件下に有効量のＬＩＦを哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の末梢神経系の知覚ニューロン、例えば知覚ニューオルンを増加し、刺激し及び／又は形成を維持し及び／又は生存させる方法に関する。ここに用いられるｒＬＩＦＪは、ＬＩＦに関連していて全ての分子、例えば炭水化物。

リピド及び／又はペプチド残基への単−又は多重置換、除去及び／又は付加を含む天然に起きるアミノ酸配列又は全ての単−又は多重アミノ酸置換、除去及び／又は付加を含む天然に生じた、組換え体及び合成のＬＩＦを含むことを意味する。

従って、ここに用いられる用語ｒＬＩＦＪは、ＬＩＦの変異体、誘導体、同族体及び類似体を含む。天然に生じたＬＩＦ及びＬＩＦ様ポリペプチドを意図する。

しかしながら用いられたＬＩＦ分子に関係なく、要求されることは、それが哺乳動物において、ニューロン増殖及び／又は維持及び／又は再生を援助できることである。好ましい実施態様では哺乳動物はヒトでありＬＩＦはヒト起源又は異なる哺乳動物からであるが、またヒトに活性を有するものである。従って、ＬＩＦの起源及び処理されるべき哺乳動物は同族、即ち、同一哺乳動物でありうるか異型の即ち異なる哺乳動物からでありうる。ある場合には処理されるべき哺乳動物は本発明の方法において用いるためＬＩＦを分離するのに用いられうる。

ここに用いられる「ニューロン増殖、維持及び再生を調節すること」により、哺乳動物の中枢及び末梢神経系におけるニューロンを刺激し、増加し、及び／又は形成を維持し及び／又は生存を含むことを意味する。それは又、疾病又は損傷により起こる障害に続く、ニューロン作用に関連する性質の再生を援助する該因子の能力を含む。それは又、ニューロン、例えば、しかしこれに限定されない、神経伝達物質型、レセプター型及びこの表現型と関連する他の特徴と関連するこれらの性質を刺激し、増加し、維持し及び／又は再生することを含む。特にＬＩＦは、神経堤細胞の完全成熟ニューロンへの分化を含み、刺激し、増加し、維持し及び／又は再生することをここに示した。この効果は、滴定可能であり、ニューロン前駆体細胞の増殖に欠けるときに起きる。ＬＩＦの効果は又、胚の背の神経節（ＤＲＧ）における前駆体細胞の成熟知覚ニューロンへの分化の刺激に拡がる。

末梢神経系の知覚二ニーロンは胚神経堤における前駆体細胞から誘導される。稜移動後、これらの前駆体細胞はＤＲＧへど集まり、次いで成熟知覚二ニーロンに分化する。知覚ニューロンの生存は、増殖の間重要な段階で二つの特徴づけられた生長因子、神経生長因子（ＮＧＦ）及び脳誘導向神経因子（ＢＤＮＦ）及び他の明らかにされていない因子に依存することが示され・た。しかしながら、知覚前駆体細胞の分化を刺激する因子の同一性については全（知られていない。従って、本発明により驚くべきことにＬｊＦが胚のＤＲＧにおける前駆体細胞の成熟知覚ニューロンへの分化を刺激したこと、並びにＬＩＦが胚形成の間じゅう及び生後の生命にこれらのニューロンに生存因子として作用したことが見出された。

ＬＩＦは又、中枢神経系に影響を及ぼす。神経管の胚前駆体細胞からの中枢神経系の増殖での早い段階は、前駆体集団の拡大及びこれらの細胞の成熟ニューロン及び神経膠への分化を含む。この相は正しい標的を適切に刺激したニューロンの選択的生存に続き、そして、標的細胞により生成される生存因子の限られた有用性に基づ（と信じられる。

最近、腺維芽細胞生長因子が胚脳の増殖の拡大及び分化相に含まれることが示され（９）、加えて、又、ＦＧＦが成熟ニューロンに生存剤として作用できることが示された。バード（５）からの業績はＣＮＳニューロンのサブセットの生存、網膜神経節細胞がＢＤＮＦに依存することを示した。しかしながら、胚脳及びを髄の増殖に作用する他の因子についてはほとんど知られていない。

従って、ＬＩＦはを髄ニューロンに分化／生存及び／又は再生剤として作用し、を髄増殖を増加し、刺激し、及び／又は促進し、そして神経拡大を促進することが驚くべきことに見出された。

この方法はを髄増殖を調節し、疾病、損傷及び／又は、神経系に対する異常を処理するのに適用できる。例えば本発明の方法は、中枢及び／又は末梢神経系に関連して用いることができ、脳性麻痺、麻痺に誘発される損傷、発作に関連する血管虚血、ニューロン腫瘍、運動ニューロン病、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、多重硬化、糖尿病、重金属又はアルコール毒性に関連する末梢ニューロパン−１腎不全及び又は感染病例えばヘルペス、ｍ診、麻診、水痘：ＨＩＶ及び／又はＨＴＬＶ−１の１又はそれ以上を処置する。

本発明の他の局面は、を髄増殖及びを髄ニューロン数を増強し、刺激し、維持し及び／又は再生する方法に係り、それはを髄ニューロン数及びを髄増殖を増加するに十分な時間及び条件下で有効量のＬＩＦを該哺乳動物に投与することを含む。

さらに池の局面は、を髄及び他の中枢神経系ニューロンからの神経伸張を増強し、刺激し、維持し及び／又は再生する方法に係り、さらにを髄以外の中枢神経系に係る。

本発明のさらに他の局面は、哺乳動物における中枢及び末梢神経系における疾病及び損傷の処理方法を意図し、該疾病及び損傷は、脳性麻痺、麻痺に誘発される損傷、発生に関連する血管虚血、ニューロン腫瘍、運動性ニューロン病、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、糖尿病、重金属又はアルコール毒性に関連する多重硬化及び末梢ニューロパン−１腎不全及び／又は感染病例えばヘルペス、風諭、麻診、水痘、ＨＩＶ及び／又はＨＴＬＶ−１の１又はそれ以上を含むが、これに限られず、それは該哺乳動物に有効量のＬＩＦを疾病又は損傷を良くするのに十分な時間及び条件下に投与することを含む。

本発明の全てのこのような方法において、ニューロンの増強、刺激、維持及び／又は再生は、「ニューロン増殖をｒＡＷＪすること」として引用される。さらに、用語ｒＬＩＦＪの使用は上述したようなＬＩＦ様ポリペプチド及びその誘導体を含む。

本発明により使用されるＬＩＦの有効量は、ニューロンの調節に必要とされるものであり、一般に体重キログラム（ｋｇ）当り約０．０１から約１０．０００マイクログラム（μｇ）で、好ましくは０．１ないし１０．　ＯＯＯμｇ／ｋｇでもっとも好ましくは、１ないし１００μｇ／ｋｇ体量である。しかしながら、処理される疾病、処置及び患者のような因子に依存し、多かれ少なかれＬＩＦが使用されつるが、本発明の範囲内にある。さらに単位／ｍｌ又は単位／ｋｇでＬＩＦの有効量を測定するのが便利である。ＬＩＦ活性の態位の定義はＰＣＴ／ＡＬ ’８８１０００９３に見ることができる。例えば、ＬＩＦを限定するのではなく、１０から１０８μ／ｍｌ用いつる。投与は時間当り、１日当り、週当り、又は月当りであり得、又は単一投与でありうる。投与は又、連続注入であることが必要でありうる。

本発明に従って、ＬＩＦは単独で或いは１又はそれ以上の他のニューロン刺激因子、例えば、これらに限定されないがＦＧＦ、ＣＮＴＦ及び／又はＢＤＮＦ及び／又は他の向神経と組合せて投与しつる。「組合せＪはＬＩＦ及び／又はそれ以上の他の因子の同一組成物での同時添加或いはＬＩＦ及び１又はそれ以上の他の因子の、第１因子を与え、次いで第２因子を与える、連続的添加を意味する。添加の間の付加及び時間の正確な順位は、実施する医師により最善に決定され、患者及び／又は必要とされる処置に依存しつる。

従って、１又はそれ以上の他のニューロン刺激因子はＬＩＦと同時又は連続投与により与えつる。他のニューロン刺激因子の有効量は、約０．０１ないし約１ｏ、ｏｏｏμｇ／ｋｇ体量、好ましくは０．１ないし１０．０００μｇ／ｋｇそして最も好ましくは１ないし１，０００μｇ／ｋｇ体量であろう。再び投与は、時間当り、日当り、週当り、又は月当り単−用量又は操り返しつる。投与は又、連続的注入でありうる。

投与の経路は好ましくは筋肉内又は静脈内注射又は遺伝子療法を用いることによるが、他の投与経路、例えば注入、点滴、脳内注射及び／又はインブラントが可能である。

本発明の他の局面は、ＬＩＦの標的組織又は実施例５に要約されるように逆移送による取込みを促進するように神経の正確な位置への投与に関する。

本発明は又、ＬＩＦ及び１又はそれ以上のニューロン刺激因子及び１又はそれ以上の製薬上許容しうる担体及び／又は希釈剤を含む医薬組成物に向けられる。

このような組成物は、哺乳動物におけるニューロン増殖及び／又は維持を調節する。例えば末梢神経系におけるニューロンの形成及び生存を増強し、刺激し、維持し及び／又は調節する。及び／又は、中枢神経系における知覚ニューロンの形成及び生存を増強し、刺激し、維持し及び／又は調節する。及び／又はを髄部ニーロン及び／又はを髄増殖の形成及び生存を増強し、刺激し、及び／又は維持するのに有用である。

好ましくは組成物はヒトへの投与に適当である。本発明により組成物中に用いられるＬＴＦは既に明細書中で定義されたものであり、例えばＬＩＦ様ポリペプチド及びＬＩＦの変異体、誘導体、同族体及び／又は類似体を含む。ＬＩＦ及び他のニューロン刺激分子及び／又は向神経因子はそれらの哺乳動物根源に関して同 −又は興なり、それらは自熱発生、組換え体又は合成である。その方法でＬＩＦ及び他のニューロン刺激因子の哺乳動物起源は処理されている哺乳動物に対し同種又は異種でありうる。本発明の組成物は又、既に記載したように疾病、傷害及び／又は神経系の異常の処置に有用である。

医薬組成物は、この分野でよく知られ、引用は好都合にレミントンズ・ファーマシューテイクル・サイエンシダ１６版、１９８０、マッシ・パブリッシング・コンバニイ・オソル等による編集になすことができる。

本発明の他の局面は、末梢神経系におけるニューロンの形成及び／又は生存を増加し、刺激し、維持し及び／又は再生するための及び／又は中枢神経系におけるニューロンの形成及び／又は生存を増加し、刺激し、維持し及び／又は再生するための、及び／又は哺乳動物のを髄ニューロン及び／又はを髄増殖の形成及び／又は生存を増加し、刺激し、維持し、及び／又は再生するための医薬を製造するためのその誘導体を含むＬＩＦの使用に向けられる。好ましくは哺乳動物はヒトであり、用いられるＬＩＦは前に定義された通りである。本発明による使用はｌ又はそれ以上の他のニューロン刺激因子、例えばＦＧＦ、ＣＮＴＦ及び／又はＢＮＤＦの使用を含む。

本発明は以下の非限定図面及び実施例を引用することによりさらに説明する。

図において、図１は、神経堤培養におけるニューロン数へのＬＩＦの効果を示す。神経堤細胞を培地のみで、又はＬＩＦの存在下で６日間インキュベートし、ニスル染色（８）、ニューロンを５明分野顕微鏡を用いて数えた。「−管」実験で、神経管は２４時間後、除きＬＩＦを培養物に加えた。ニューロン数は、Ｌ　Ｉ　Ｆ＠養でのニューロンのき集群のため、おそくなると正確に数を数することが出来なかった。数は平均及び標準偏差であるｎ＝５、ｐ＜０．００５、ｐ＜　０．０５、ｔ− テスト図２は神経堤培養でのニューロンの表現型を示す写真表現である。神経堤培養は１３日間、ＬＩＦの存在下（ｂ、　ａ、　ｅ、　ｆ、　ｇ）又は不存在（ａ、　ｃ）でインキュベートした。

示される顕微鏡写真は、ａ、　ｂ、ニスル染色（８）培養の明分野見解、ｃ、　ｄ、神経細糸を■　染色した培地の蛍光見解、ｅ、ＣＧＲＰを染色したＬＩＦ処理培養の明分野見解、し　ｆ、チロシンヒドロキンラーゼを染色したＬＩＦ処理培養の明分野見解、ｇ、　（ｆ）に１　おけると同一分野の蛍光見解、バー＝　２００　μｍ（ａ、　ｂ）、５０　ｕ　ｍ（ｃ、　ｄ、　ｅ、　ｆ、　ｇ）。である。

図３は神経堤培養への３Ｈ−チミジン取込みを示す写真表現である。３Ｈ−チミジン（０，０３μｃ／ｍｌ）及びＬ　Ｉ　Ｆ　（１０’ｕ、／＋１）を培養の４日後に加えインキュベージタンを続く９日間続け、次いで培養物は神経細糸を染色し、オートラジオグラフにかけた（９）。ａ　培養の明分野顕微鏡写真、ｂ　同一分野の蛍光見解、バー’　＝５０ａｍ。

図４は以下を示すグラフ表現を含む。Ａ、Ｅ１２−Ｐ２　ＤＲＧの培養におけるニューロン数に対するＬＩＦの効果、ＤＲＧ細胞はモノムド培地、１０％ＦＢＳ（コントロール、黒バー）又は＋ＬＩＦ（線形バー）にプレートし、実施例１に記載したようにニューロン数を５日ＣＥ（２）又は２日（池の培側後測定した。

ニューロン及び最初にプレートした細胞の数は実施例１に与えられる。Ｂ、Ｐ２ＤＲＧ培養におけるニューロン生存の限界希釈分析、細胞（７０％ニューロン、その７５％、２時間後プレート）を１０　”ｕ／ｍｌ　Ｌ　Ｉ　Ｆの存在（ダイアモンド）又は不存在（四角）に指示ｆｆ（１２０ウエル／希釈）でプレーし、生のニューロンを有するウェルを２日後数えた。直線関係が入力細胞数と２ネガテイブウエルの対数の間に存在しくＲ＝０．９９２）、ニューロン生存に対するＬＩＦの効果は、ゼロオー３　ダー（シングルビット）運動性（１１）に従うことを示す。Ｃ，Ｐ２ＤＲＧ培養におけるＬＩＦ濃度に対する二ニーロンの用量反応関係、Ｐ２ＤＲＧ細胞（２００／ウエル）はＬＩＦの示されたＷでプレートし、ニューロンは２日後数えた。平均及び標準偏差はＡＢ及びＣに示す　ｎ＝６゜図５は、Ｄフィンビトロで２４ウエルプレートにＬＩＦの存在下培養したＥｌｏを髄の体外移植組織の顕微鏡写真を示す写真表現であり、方法成長を表示するａ）ＬＩＦなＬ（７）ｂ）ＬＩＦと（７）培１を示ｔ　（バー＝１００μｍ）図６ａ、ｂはＬＩＦ刺激を髄細胞から起きる培養の形態を示す写真表現である。

呼局液中の細胞は実施例１に記載したようにプレートし、９６ウエルプレートに５日間インキュベートした。ａ）ＬＩＦなし　ｂ＞ＬＩＦＣバー＝１００μｒＡ）とインキュベートした細胞の相対比写真を示す。

図５ｃ、ｄは神経細糸抗体を染色したを髄前駆体の培養を示す写真表現である。

細胞は実施例に記載のようにプレートし、固定及び染色前にＨＬ−Ａプレートに５日間インキュベートした。ｃ）ＬＩＦなしでｄ）ＬＩＦ（バー＝　１００　μ ｍ）とインキュベートした細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。

図７は方法成長へのＬＩＦの効果を示す写真表現である。ＥＩＯを髄前駆体（５ＸＩＯ’）は、材料及び方法に記載したように、９６ウ工ルプレート中５日間ＬＩＦ　（１０’ｕ／ｍｌ）の存在又は不存在でプレートした。集るため各不連続凝集の細胞から生じる突起の数を定量した。与えられた数の突起を有する凝集の頻度を測定した。方法の各５増加に対する頻度／凝集（例えばＯ−４，５−９）を集めてウェル当りの凝集の総数のａ％として表わした。これらの頻度はＬＩＦ処理及びコントロール培養とし６ウエルの平均で、平均及び標準偏差をグラフに表わした。

図８はを髄神経節から知覚ニューロンへの１２５１−ＬＩＦの結合を示すグラフ表現である。結合（黒ぬりバー）は、Ｂに示すようにニューロンにほとんど独占的に限定され、補助細胞（Ａ）にされない。事実止金ての結合は冷Ｌ４Ｆ（ハツチングしたバー）により阻害され、結合は特異的であることを示す。

図９は成熟マウスの坐骨神経による＋２５１−ＬＩＦの逆輸送を示すグラフ表現である。有意な蓄積が、注射をルートパッドにしたときＬ３、Ｌ４、Ｌ５Ｗ髄神経節に見られる（黒ぬりバー）。

図１０は新生マウスにおける知覚神経節に対する＋ｘｓ（−ＬＩＦの逆輸送を示すグラフ表現である。これは足及び筋肉注射に起きるけれども標識の有意な蓄積はＬ４上に再び集った。注射を筋肉内にしたときくちばし状知覚神経節によりいくらかの取り込みがある。

図１１は小さな一群のニューロン（ａ）Ｘ４００を越えて銀粒子の蓄積を示すＬ４を髄神経節を通ってセクションのオートラジオグラフを示す写真表現である。

ンユワン細胞（補助細胞Ｘｂ）Ｘ　１０００でなくニューロン標識だけであることに注意、ヘマトキシリン及びエオシンで染色されたセク／ヨン。

図１２は”ｒ−ＬｒＦで逆標識後Ｌ４を髄神経節のセクションでの粒子計数図１３は、超過時間ＬＩＦと共に及びなしにインビトロで延命するを髄細胞を示すグラフ表現である。

実施例１材料及び方法神経堤細胞の調製胚９日（Ｅ９）でＣＢＡマウス胎児を予言から取り１％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むへベス緩衝イーグルスメディウム（ＨＥＭ）を含むペトリ皿に置匂頭及び尾を、神経質の各側８−１２体節で体幹切片を除く、解剖顕微鏡の助けをかりてゲージンリンン針を用いて除去した。これらの体幹切片を新しいペトリ皿中、ＨＥＭＩ％（ｖ／ｖ）Ｆ　Ｂ　Ｓ中に置き体部及び回りの組織を２６ゲージ針を用い神経管から注意して除いた。次いで１又は２つの管を、予めヒブロネクチン（５μｇ／ｍｌ）で覆った２４ウエルプレート（リンプロ）の各ウェルに置いた。次いで１０％（ｖ／ｖ）　Ｆ　Ｂ　Ｓを伴うデウルベコの修飾イーグルメディウム（ＤＭＥ）を各ウェルの側に注意深く流し落とし、ウェルの底をほとんど覆う。これは神経管をフィブリネクチン基質及び粘着を関連づけることを可能にした。特別の実験で、管を２４時間後注意して除去し、移動性神経堤細胞を除いた。他の実験では、いずれの結合堤細胞も妨害しないように管をウェルに残した。１０％（Ｖ／Ｖ）　Ｆ　Ｂ　Ｓ及び特定された成長因子を含むモノムドメディウム（コモンウェルス・セルム・ラボラトリーズ、バークヴイル、ヴイクトリア、オーストラリア）２４時間後全培養物に１ｍｌまで加えた。培養物を５％Ｃｏｗ／９５％空気中３７℃でインキュベートした。

を髄神経節（ＤＲＧ）の除去２日令新生児マウスを無菌条件上首を切り落とし、無菌ペトリ皿に置いた。体幹を蒸留水中７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールの溶液で洗った。皮膚を通る垂直切り口を無菌の４５°角刃のはさみを用い作った。用いた全器具は、使用前１時間、蒸留水中７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールの溶液に浸けた。

細かい虹彩ばさみを用い、曲った時計職人鉗子を用いを軸寄の除去を可能にするを軸柱の背局面を通って切口を作った。これはを髄神経節をさらし、それらの除去を促進した。無菌ガーゼ片を用い、神経節の回りをスワブして神経節の観察を不明瞭にする血液及び組織液を吸収した。次いで真っすぐな非常に細かい先端ついた鉗子を用い、各神経節を注意して除き、を髄組織の回りをきれいにし、ベトリ皿中、少容量のＮ２ヒドロキノピペラジン−Ｎ−２０エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及び緩衝化イーグル最小必須培地（ＨＥＭ）中に置いた。約２０の神経節を各マウスから除いた。

ＤＲＧ培養回りのを髄組織を除いて切断され、そしてＨＥＭ中に置かれたＤＲＧは次いでＨＥＭ、０．２５％（Ｗ／Ｖ）　トリブ／ン、０．００１％（ｖ／ｖ）Ｄナーゼ中３７℃Ｔ　（Ｅ１２については１２分、Ｅ１５については２０分、そしてＥ１９及びＰ２については３０分）インキュベートした。ＦＢＳを２０％（Ｖ／Ｖ）まで加え、細胞を３００ｇで５分間遠心し、ＨＥＭ、０　、０１　（ｗ／ｖ）　Ｄカーゼ中２回洗浄し、１８−２５ゲー７針を通して粉砕し、蛍−細胞懸濁液を得る。ＤＲＧ細胞をＨＬ−Ａプレート（ナツクＩＩ）のフィブロネクチン被覆（１５μｇ／ｍｌ）ウェルに予め最適化した細胞数（Ｅ１２で３５００細胞、Ｅ１５で１０００そしてＥ１９及びＰ２て２００）置いた。プレート後２時間、成熟ニューロンはＥ１２培養に見られず、１１０．１２０及び１００ニユーロンの平均はそれぞれＥ１５、Ｅ１９及びＰ２培養に存在した。Ｅ１２からの培養物を５８後固定し、神経細糸を染色し、神経細糸を蛍光顕微鏡法を用いて数えた。後の胎児培養（大きい、相輝き、円い細胞）を２日後数えた。

免疫組織化学特別の抗体で染色するため、神経節を２４ウエルプレート中ガラスカバースリツプ又はプラスチック顕微鏡スライド（チンＣ１２ヤンバースライド）上に置いた。

神経細糸に対する抗体で染色するため細胞をまずメタノール中−２０℃で固定し、ＰＢＳ中３回洗浄し、ＨＥＭ、１％（ｖ／ｖ）ＰＢＳ中１１０に希釈した抗神経細糸抗体（ケミコン）と３０分間インキュベートした。ウェルを次いで洗浄し、ＰＢ８１％（ｖ／ｖ）Ｆ、ＢＳ中に１：５０に希釈した蛍光イソチオノアナート接合ＦＩＴＣヒツジ抗ラット接体（ンレナス）とインキュベートし、ＦＢＳ次いで水中で洗浄し、空気乾燥し、カバースリップはＰＢＳ／グリセロール（１：９）メルク、オースト、中、２６％１．４ンアゾビ／クロ（２，２，２）オクタン中増加した・カルノトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）を染色するため、培養物をバラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に固定し、ＤＭＳＯで清浄にしＰＢＳ中で洗浄し、ウサギ抗うットα−ＣＧＲＰ抗体（ジー、オレイ博士、モナシュ・ユニパーツティ、オースト。

）から得られ、放射イムノアソセーによりＢ−ＣＧＲＰに９％結合、カル７トニンにく１０１％結合、及びサイスタンスＰ、ノイロキニンＡ又はエンケファリンに無視しうる結合を示す）とインキュベートし、洗浄し、抗体結合はビオチン結合第二抗体、ビオチン−アビジン−西洋わさびベルオキシダーゼ錯体（ヴエクタステインＡＢＣ）及びジアミノベンジシンとの増殖を用い検出した。チロシンヒドロキシラーセ又はコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を染色するため、培養物をＰ　Ｆ　Ａ　（及びＣｈＡＴについてビラリン酸）中に固定しウサギ抗チロシンヒドロキシダーゼ抗体（ユーゲン・チク、ＵＳＡ）又はブタＣｈＡＴ（ＰＮＳ中Ｃｈ、ＡＴを認識する（１２））に対して調製されたラット抗血清とそれぞれインキュベートし、結合はフルオレセインした第二抗体で検出した。

チミジン取込み実験増殖している神経堤細胞を探すために、３Ｈ−チミジン（アマ−ジャム、特異活性１０３Ｃｉ／ｍモル）を培養物に０．１又は０．０３ｕＣｉ／ｍｌ加え、同時に成長因子として、又は相当時間にコントロール培養物に加えた。１３日後、幾つ力）の培養物をメタノール中固定し、上述したように神経細糸について染色、次いてコダソクＮＴ−８２乳化液中に漬け、２週間４℃でさらし、次いで発達させた。

を髄細胞の分離胎児は経日１０（Ｅ　１０）マウスから得た。頭を除去し、ＥＩＯにより閉Ｍ管を形成している。神経管の後端部分又は胚を髄を胎児の残りから囲んでいる体部とともに除去した。全実験に用いた髄のセクションは、耳小水泡から発達している後肢のちょうど下に伸ばした。この組織はディスパースＩＩ（ベーリンガー）中、ＨＥＰＥＳ−緩衝化イーグルメディウムＣＨＥＭ）中１５分間４℃でそして６分間３７℃でインキュベートした。次いて組織を１　、０　（Ｗ／Ｖ）胎児ラン血清（ＦＢＳ）及び０．００１％（ｖ／ｖ）Ｄナーゼを含むＨＥＭに移し、を髄は、神経管の中脳及び終編部分の調製に既に記載したように本質的にジスバーズインキュベーションにより作られた組織プレートを用い、囲んでいる外胚葉、体部及び髄膜のないよう切断した（９）。この段階での検査は中枢葉の汚染のないきれいなを髄を明らかニジた。これらの髄は移植片培養用に２４ウエルプレート（リンプロ）に直接プレートした。分離細胞懸濁液の調製のためにを髄は次いで３７℃で０．０２％（Ｗ／Ｖ）ＥＤＴＡ、１０ｍＭヘベス、０．０２５％（ｗ／ｖ）トリプシン及び０．００１％（Ｗ／Ｖ）Ｄナーゼを有するバンク′ス中、ｐＨ７，６で１２分間インキュベートした。反応をＦＢＳの添加により停止し、細胞をＣａ　”　＋　７Ｍｇ　”＋フリーバンク′ス中で洗浄し、懸濁液をゆるやかに粉砕することにより単一細胞を調製した。１．５Ｘ１０５細胞の平均を各胎児の解剖から得た。

分離されたを髄細胞の一次培養を髄細胞（３ｘｌＯ’）をモノメトメディウム中フィブロネクチン（３０μｇ、／＋１）及び最終容量１０μｍ中０．０５％ＦＢＳで被覆した９６ウエルプレート（リンプロ）中１ニブレートした。特に説明しない限り、ＬＩＦ（ネズミ組換え体、特異活性＋　１０　’ｕ／ｍｇ）を１０４単位／ｍｌの濃度に用いた。アッセーを５日にわたり通常実施し、その後、培養は這歩しはじめた。細胞計数は、細胞をトリプシンで集めそれらを細砕したのち実施した。成長方法は５日目に細胞の各分離凝集から出でくる方法の数を数えることにより定量した。全ての場合の数は、６決定の平均及び標準偏差である。細胞は又、合流物上にプレートし、２４ウエルプレート中、モノムドメディウム及び０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｆ　Ｂ　Ｓ中、５Ｘ１０３細胞／ウエルの密度でガラス顕微鏡スライド上Ｂａ１ｂ／ｃ　−３Ｔ　３細胞の単層を放射線照射（４０００ラド）した。特定された時間用にカバーグラスを固定し以下に記載するように神経細糸を染色し、スライド当りの陽性に染色された細胞の数を定量した。

ＬＩＦ及びＦＧＦの放射性ヨー素同位体物の精製組換えＬＩＦはグリコジル化蛋白としてイー・コリ中に生成した。精製された種は２０．０００の明白な分子量と９．０より大の等電点を有して電気泳動した。

１、　Ｉ　Ｆのヨード化は既に記載された（１８）ようにヨードモノクロリド法により実施した。要するに４０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル領１％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸及び０．０２％（Ｖ／Ｖ）ツイーン２０中ＬＩＦの１ｍｇ、／＋１溶液の６μｍを１ａｃｉ　Ｎａ１２５１にュー・イングランド・ヌクレアー・ノース・ライド、ＮＳＷ、オーストラリア）、４０ｕｌの２００ｒａＭリン酸ナトリウム、０，０２％（Ｖ／Ｖ）ツイーン２０のｐＨ７，４（ＰＢＳ）の添加及び２ＭＮａＣ１中２００μｍの５μｌ渦混合によりヨード化した。室温で１分後、放射ヨード化Ｌ　Ｉ　Ｆ（”　Ｉ　−Ｌ　Ｉ　Ｆ）を連続的ゲル濾過及びカチオン交換クロマトグラフィにより未取込み＋！５■から分離した。十分１こ生物活性を保つこの方法で生成した＋２５Ｉ　ＬＩＦは冷却２０％（ｖ／ｖ）　トリクロロ酢酸で９９％沈澱し、放射活性の９０％以上がＭｌ細胞に特異的に結合する（１７）。特異的放射活性は自己！換分析法により測定されたように１．ｌＸ１０’ＣＰｍ１モルであった。１１２５標識ａＦＧＦはＲＣＣ（アマーンヤム）からただで得た。ａＦＧＦの特異的活性は８００　Ｃｉ／ｍＭであった。

結合実験及びオートラジオグラフィーを髄神経節細胞は出生後２日のマウスから上記したように得、８ウエル顕微鏡スライド（ナツク）中、１０％（ｖ／ｖ）　Ｆ　ＣＳを含むが成長因子を加えないモノニドメディウム中、給温インキュベーターで３９℃−夜培養した。スライドを、２時間氷上で、１０％（ｖ／ｖ）Ｆ　ＣＳ、　１０　μｇ／＋１１の未標識ＬＩＦ２０μｌを加えまたは加えず、そして、２０μｌのＤＭＥ中’２ＳＩ−ＬＩＦの５　Ｘ　１０　’Ｃｐ１１．１０％（Ｖ／ｖ）Ｆｅ２を加えたへベス緩衝化ＲＯＭｌ−１６４０メディウムの２００　μｌ中インキュベートした。細胞を３回３００μｌのＰＢＳで洗い、ＰＢＳ中１０％（Ｖ／Ｖ）ホルマリンで２時間固定し、次いで水ですすいだ。スライドを暗室中、４２℃でコダックＮＴＢ２写真乳化液に漬け、乾燥した。次いでスライドをドリーライトを含む光を通さない箱内にジールし、２−８週間４℃でさらした。現像前にスライドを室温まで暖めて３分間コダック１）１９現像液（４０ｇ１５００＋１の水）に現像させ、１分間水中０．５％（Ｖ／Ｖ）酢酸で洗い、３分間アグファＧ３３３ｃＸ−線定看剤に定着させた。ミドスピン製剤を伴うスライドを水中５％（Ｖ／Ｖ）フィルターギームサ中で１０分間染色し、乾燥してデペックスに取りつけた。デペックス（ＢＤＨ，メルボルン、オーストラリア）。

オートラジオグラフをｘ４００．Ｘ６５０、又はＸ１００Ｏ倍率て試験し、必要な粒子計数を各型の１００連続細胞で実施し、バックグラウンド計数、一般に０．３粒子の間を引いた。

反対の標識実験新生及び成熟Ｂａ１ｂ／ｃマウスの坐骨神経を６−〇プロレンモノフィラメント（エチコン）を用い一方に結んだ。放射活性蛋白を足の皮膚に又は胃筋肉の中央に筋肉内に注射した。適当な時間ののち、動物をエーテル適用量により殺し、坐骨神経を取った。神経を結紮でカットし、２ｍｍ片を直ちにカットしたものの基部及び端部で取り、直接数えた。

新生及び成熟マウスを足踏に注射し１６時間保った。Ｔ１３から８１の神経節を切断（ｄｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＩＮ微鏡の下に除去し、放射活性をガンマカウンター中全神経節で評価した。選択神経節又は神経節に付着したを髄を動物から切断し、乳化液に埋め込む前にＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドに固定した。オートラジオグラフを３−４週間後現像し神経節及びを髄を標識細胞につき試験した。

実施例２神経堤細胞及び知覚二ニーロンへのＬＩＦの効果神経堤細胞へのＬＩＦの効果を試験するため、試験管をＥ　９　ＣＢ　Ａマウスの頚及び胸部分から切断しフィブロネクチン被覆ウェルにプレートし、神経堤細胞２４時間原買上に移動し、その時間で神経管を除くがそこに残すかし、ＬＩＦを培養液に加えた。２日後、知覚ニューロンに似ている単極又は二極の突起を有する丸い細胞が培養液に現れた。ＬＩＦ処理培養液に、６日でコントロールよりも約１２倍のこれらの細胞が存在しく図１）、それらは１４日まで増加する大きな固りを形成した（図２６）。

これは、それらの不存在でニューロン様細胞の絶対数は少なかったが、培養期の間神経管の存在に依存しなかった（図１）。これらのニューロン様細胞はニスル染色（８）で陽性に染り（図２ａ及びｂ）１５０ＫＤ神経細糸（１３）を染めた（図２０及びｄ）。この染色は固りから発生する細い突起を示しく図２ｄ）それらの二ニーロン表現型を確認する。ＬＴＦの効果は、臼１に加えたとき最大であったが、日７に加えときもまた現れた。

これらの培養液に発生したニューロンの表現型を特徴づけるため、それらは、知覚及び自覚ニューロンに見られるマーカーの発現を染色した。ＬＩＦ処理及びコントロール培養液中の全てのニューロンはＣ０ＲＰへの免疫反応性を含み（図２６）。最も広く発現したペプチドが哺乳動物の知覚ニューロン中に見られた（１４．１５）。限られた開発的研究は、このペプチドが少くともニワトリできわめて容易に発現することを示唆する（１８）。サブスタンスＰ１ペプチドへの免疫反応性は、又哺乳動物知覚ニューロンに見られた（１４．１５）が、出生後に有意レベルで、ＬＩＦ処理及びコントロール培養液中、小割合の突起中にも検出された。

これらのニューロン（ＬＩＦ処理及びコントロール共）の小割合（１−２％）が、チロシンヒドロキシラーゼ活性、カテコールアミン性細胞へのマーカーを有した（図２ｆ）。しかしながら細胞はＣｈＡＴへの免疫活性、コリン性細胞へのマーカーを示さなかった。

これらの免疫組織化学的発見及びニューロンの形態学は、ニューロンが知覚系統であることを示唆する。鳥類でのその前の仕事は少くとも知覚ニューロンの一部は神経堤の非分裂プレカーサーから起きることを示した（１−２）。ＬＩＦ処理培養液中のニューロンも非分裂プレカーサーから起きることを研究するため、１Ｈ−チミジンを付随的にＬＩＦを含む培養液に培養の１．４及び７日に添加した。

１３日のオートラジオグラフ分析は、ＬＩＦ培養液中に起きた０、２％以下のニューロン（数えた１１００ニユーロン中２）の時間の付加に関係なく’Ｈ−チミジン（図３）を取込んだことを示した。これらの観察は、ニューロン数の増加はプレカーサー分割の刺激の結果として起きないことを示す。これらの培養液中の非ニューロン細胞は３Ｈ−チミジンで標識した（図３）が、ＬＩＦの存在は標識細胞の全割合に対し有意差を示さなかった。ＬＩＦを１日目に加えた場合、細胞の８０＋／−１８％がコントロール培養の７８＋／−１２％に比べて標識され、一方、７日目では、全細胞の７０　＋／−１％及び７０　＋／−６％がＬＩＦの存在及び不存在でそれぞれ標識された（ｎ＝　３　）。

ＬＩＦが神経堤培養液中知覚様ニューロンの増加を促進するので、初期胚ＤＲＧ培養液に同様の活性を有することが予期された。即ち単一細胞懸濁液をＥ１２ＤＲＧから作り、そしてこれは、小さな多分未成熟ニューロンのサブポピユレーション及びニューロンプレカーサー（１８）を含み、ＬＩＦの存在又は不存在で、ＨＬ−Ａプレートのウェルにプレートした。３日後二ニーロン様細胞の固りがＬＩＦ処理培養液に現れはじめたがコントロール培養には現れなかった。５日後、培養液は神経細糸を染色し、ニューロンを数え（図４Ａ）、ＩｊＦ処理培養液中ではコントロールよりも約１０倍ものニューロンが存在することを示した。ニューロンは神経成長因子（ＮＧＦ）で処理した培養液中にも存在したが、５８後ＬＩＦ処理培養液中に見られるものの約１０％であった。現像中、後に分離されたＤＲＧ細胞への実験（Ｅ１５．Ｅ１９．Ｐ２）はＬＩＦの存在で２日後延命された高割合（８０−１００％）のニューロンを示した。

限られた希釈実験は、生存割合の細胞数により影響されないので、ＬＩＦがニューロンに直接作用することを示す（図４Ｂ）。加えてＰ２ＤＲＧへのＬＩＦ力価測定は１０’ｕ／■ｌの最大活性及び他の向神経因子（４，５，６）に見られるものに似ている約１．５ｕ／ｍｌで５０％活性を示した。

これらの結果は、ＬＩＦがインビトロで胚知覚ニューロン発達を通じて作用できることを示す。神経堤培養で、それはニューロン分化及び／又は知覚プレカーサーの生存を刺激するよう作用しつる。これと一致して、神経堤細胞のサブポピユレーションは特に１２５１−ＬＩＦに結合することが見出され、それらはＬＩＦレセプターを有することを示す。他は発達しているＤＲＧ細胞の生存及び／又は分化において向神経因子（ＢＤＮＦ）を得た脳を結びつけた。一つの可能性は、インビトロで細胞を誘導する中枢葉により生成されるＬＩＦはインビボで末梢組織に生成され得、ＤＲＧの発達でＢＤＮＦを誘導する中枢神経系と協力して作用する。

古いＤＲＧ培養へのＬＩＦの作用は、それがＮＧＦのようにインビトロで知覚ニューロンへの向神経因子であることを示す。ＬＩＦは出生後及び胚知覚二ニーロンに生存剤として作用する。結果はＬＩＦがニューロンの標的神経支配の臨界期の間だけでなくその後も作用することを示す。即ちＬＩＦは、知覚ニューロンの発達を通して盛人期に入ってその効果を働かせうる。

実施例３を髄部ニーロンへのＬＩＦの効果ＬＩＦは胚を髄から突起成長を刺激する。

実施例２でＬＩＦはＥ９マウス胚から得た神経堤の培養液における知覚ニューロンの発達を刺激することを示した。これらの培養液中、堤細胞は胚を髄からフィブロネクチン原買上に移動し、ＬＩＦ培養液中の知覚ニューロンは回っている固りとしてを軸体外移植組織からある距離で現れる。ＬＩＦも、体外移植組織がそれらの明らかな生存度と突起成長を増加する培養液中に残ったを髄の出現に影響したことが注目される。これらの実験はＥ１０胚からを軸体外移植組織で繰り返され、そこでほとんどのを髄は索から既に移動したが少しニューロン分化が起きた。ＩｊＦがニューロン又はを軸中それらのプレカーサーで作用するかを見るため、血清を我々のアッセーから、ニューロン分化を必要に影響することなく、おそい神経膠増殖へ除いた。期待されるようにこれらの培養液では体外移植組織かせごく少しの細胞移動があったかＬＩＦ処理培養液中依然として大量の突起成長があった（図５）。突起は体外移植組織から直すぐにあるものは束であるものは単一突起として原質へ延びた。限られた割合の突起の分校があった。突起成長の刺激は初め３日目に明らかになり７日目に最大に増加した。

これらの観察はＬＩＦが突起成長及びを髄ニューロンの発達に貢献しうることを示す。これをさらに試験するため、を髄細胞の単一細胞懸濁液を作りＬＩＦの存在及び不存在にプレートし、効果が分離された培養液に観察されるかを見た。

これらの培養液の利点は正確な数の細胞を異なる大きさの体外移植組織と対間的に各つニルにプレートでき、かくしてり、ＩＦの効果の定量がより容易となる。

これらの細胞をかなりの高細胞密度て９６ウエル及びＨＬＡプレートにプレートすると、それらは不連続の固りに集り、突起がこれの固りから出て、他の固りと橋を形成するように見える（図６）。これらの突起が明らかにニューロン起源であることは培養液の神経細糸を染色することにより確立された。ＬＩＦ処理及びコントロール培養液の全突起は抗神経細糸抗体で陽性に染った（図６）。ＬｒＦの存在で、はるかに多くのこれらの突起かコントロールよりも存在した（図６ン。ＬＩＦ培養液におけるほとんど全ての固りは突起を出し、一方、コントロールのほとんどの固りは突起を有しなかった。さらに、ＬＩＦ培養液において一般に固り当りより多くの突起があった。この効果は２日目で観察され、５日目でもつとも明らかとなり、このときまでにコントロール培養液の突起の数は減少する。

この時にＬＩＦ処理培養液中の突起の平均数はコントロールの約１０倍であった（図７）。

実施例４ｉＦはを髄培養液中のニューロンの数の増加を刺激する。

ＬＩＦによる突起成長の刺激を説明する一つの可能性は、それがプレカーサーの生存及び／又はを髄培養におけるニューロンの分化を刺激することである。初めにＩＩＦの存在及び不存在で細胞培養液中に存在する細胞の全数を調整した。

細胞計数はインビトロで３及び５日後、９６ウエルプレートから実施した。図３に示すように、ＬＩＦの存在で全細胞数がわずかに増加した。これらのデータは又、ＬＩＦ又はコントロール培養液で細胞数はわずかに増加したことを示し少しの増殖が起きたことを示唆した。

ＩｊＦ培養液中、数の増加はわずかな生存効果であるか、又は、培養中、細胞のサブポピュレーンヨンへの影響、即ちニューロンである。しかしながら、この分析方法は集団中のニューロンの固定がなされない。ニューロン数に有意な効果があるかを測定するため、培養系に達する細胞の全体の集団と対照的に、ＥＩＯ細胞を低王度で放射線照射されたＢａ１ｂ／ｃ−３丁３単層にプレートした。これらの条件下、培養液は神経細糸を染色し、個々のニューロンを数えた。４日で、ＬＩＦ処理培養液中、約２倍のニューロンがあった。１０．０００を髄細胞をプレートシた培養液中、ＬＩＦ処理培養液中１９２０ニューロンが観察され、これに対し、コントロールでは９９８であった。２５００を髄細胞をプレートした培養液中では、Ｌ［Ｆ処理培養液中６２５ニューロンが存在し、これに対しコントロールでは３４３であった。培養の７日目で、Ｌ　Ｉ　Ｆ＠１ｉ液中、依然としてニューロンの良好な生存があり、一方コントロール培養液ではほとんど全てのニューロンが死亡していた。これらのデータは、ＬＩＦがを髄ニューロンの分化及び生存を刺激することを示唆する。

これらの実験は、ＬＩＦが、未分化幹神経管から及び胚を髄から突起成長を刺激することを示す。即ち、ＬＩＦは、体の末梢組織を刺激するを髄ニューロンの分化を刺激するのに作用するように見える。これをなす三つの大クラスのニューロンは、を髄の低運動性ニューロン並びに神経節交感神経及び副交感神経系鎖である。これらのりのどれにＬＩＦが影響するのが区別できないので、低運動性ニューロンがよい候補者であり管から出る突起は厚く、神経管から長距離延びることが推測できる。低運動性ニューロンだけがを髄からインビボでこれをなす。加えて、ＬＩＦは低運動性ニューロン神経支配の天然標的である筋肉中に見出された。

粘着性仮説はＬＩＦがこれらの運動性ニューロンについての標的因子を誘導した筋肉であることである。それは標的に突起を延ばすようそれらを刺激し、次いで筋肉を刺激するニューロンの生存因子として作用する。

実施例５結合及び逆標識実験実施例２は、ＬＩＦが新生を髄神経節からの知覚ニューロンの大部分の生存を支持することを示す。これは非常に低い細胞数−単一ニューロンが支持できる−でも明らかで、ＬＩＦが大分ニューロンに直接作用し、補助細胞を経てではないことを示す。知覚ニューロンが高親和性ＬＩＦレセプターを発現することを証明するため、分離知覚ニューロンへの結合研究をインビトロで実施した。図８に示すように神経細糸のそれらの発現によりニューロンとして確認された細胞の５０％より多くを有意量の１２５Ｉ−ＬＩＦと結合し、その全てを冷ＬＩＦの添加により阻害した。さらに、培養液中、＋２５１−ＬＩＦの、非ニューロン細胞への無視しうる冷阻害可能結合がある。

これらの結果は、成馬知覚ニューロンがＬＩＦの高親和性レセプターを発現すること及び補助細胞、例えばンユワン細胞はそうでないことを示す。これは、ＬＩＦの直接ニューロン作用を強く立証し、そしてそれは、ＬＩＦが非常に少ない数の知覚ニューロンの生存を支持した限定希釈研究（実施例２）から予報された。

放射、標識されたＮＧＦとの研究は、それがインビボ定常状態で反映するのかどうか明らかでないが、インビトロでンユワン細胞及びニューロンがＮＧＦと結合することを示した。ＬＩＦと別に、他の因子ではニューロン成分に限って結合することを示さない。

レセプターの観察された分布は、ばく大な数の知覚二ニーロンがＬＩＦの存在で生存することを示すインビトロ生存での結果とよく合う。限られた分布もＬＩＦレセプターが知覚神経節発達の間ニューロン系統に限られうることを示唆する。

知覚ニューロンへのインビトロでのＬＩＦレセプターの存在を実施し、ＬＩＦの取込みを仲介するレセプターが知覚ニューロン体幹へ逆輸送されるかを研究した。神経結紮を用いる実験は、坐骨神経の軸素とニューロンによる＋２５ＩＬＩＦの逆輸送があるかどうかを測定することで実施した。足または脚への＋２５Ｉ− ＬＩＦの注射後、神経の遠位体筒での放射活性の有意な蓄積があることが判った。

この蓄積の時間経路は、それが逆輸送によること他のメカニズムでないことを示唆した。さらに注射後＋２５Ｉ−ＦＧＦの遠位蓄積は明らかでなかった。

さらに詳しくどのニューロンがＬＩＦの逆輸送に係るか実験するため、成熟マウスを再び皮膚又は筋肉に注射したが今回は坐骨神経無傷であった。足の皮膚に注射したこれらの動物中、１６時間後、知覚神経節中の放射活性の有意な蓄積が腰椎神経節４に集まった（Ｌ４、図９）。筋肉に注射した動物中、放射活性の蓄積はごくわずかしかな（、これはより吻側であることが明きらかであった（図９）。

ＦＧＦは知覚ニューロンを含むニューロンの範囲を支持することを示したが、腰椎ＤＲＧ又はを髄中１２５１−ＦＧＦの蓄積は明らかでなかった。

表１結紮した坐骨神経を有する成熟マウスへのＬＩＦの注射神経中ＬＩＦの蓄積足跡への注射注射後時間　近位　断端　遠位　断端７時間　０．１４４±０．０２４　０．３４９±０．８４１６時間　０．１７０：０．０３４　０．７７７±１０８２４時間　００６０″：領００６　０．５５１士領０イ５注射後時間　近位断端　遠位断端７時間　０．１０９±０．００８　０．４８８±０．１２８１６時間　０．１３７：０．０１４　０．、＋５０±０．１３５２４時間　００６９±０．００４　０．３９９±０１３８坐骨神経は成熟マウス中央高部分で結紮し、１μＣｉの１！５Ｉ−ＬＩＦを仔ウシの足置に注射した。種々の時間後、神経を除去し、結紮の各側２ＩＩ＋１部分を取り放射活性をガンマカウンターで測定した。

新生マウスでは、足及び脚注射で放射活性の大きな蓄積があった。再び皮膚注射はＬ４に集中した（図４）。筋肉注射からの輸送は、広く拡がり、これらの小動物の注射部位から大きく拡がって、反映した（図１０）。再び両ケースでＬ４神経節での放射活性の蓄積は逆輸送と調和した時間経路に従った。

足置に”５Ｔ−ＬＩＦを注射した成熟及び新生動物からのＬ４神経節を経る組織部分のオートラジオグラフ実験はニューロンのサブポピュレーシュンでの放射活性物質の存在を明らかにした（図１１）。有意数の粒子を有するニューロンの数は集団の５−１０％の間であり（図１２）、再び非ニューロン細胞と結合した放射活性は明らかでない（図１１）。

本発明のこの局面に従った大きな発見は、ＬＩＦが逆に様子の類似するＮＧＦに輸送されることである。これは、ＬＩＦレセプターの発現がインビトロ加工品ではなく知覚ニューロンへの向神経分子としてＬＩＦをより重要に含むという考察を再び守らせる。本発明者らの知る限り、これだけが／ＮＧＦの外に、ＦＧＦが線膜神経節細胞に前転して輸送できる証拠があるが、このような方法で輸送されるのを示す向神経分子である。ＮＧＦのようにＬＩＦは、を髄に分子の蓄積の証拠はないので前転して輸送されたようには見えない。ＬＩＦは坐骨神経中の連系への生物学的効果を及ぼし、輸送を解決させたレセプターを受けないことを示す。これは筋肉、血小板、胎児幹細胞及びいくつかの造血細胞系を含む幾種類もの細胞へのＬｌの作用の一次モードのようである。

ＮＧＦの逆輸送は、その生物作用のあるものに必要であるようであるが、そのような証拠はＬＩＦには存在しない。発達する知覚ニューロンでの２つの因子の作用の類似性はこの工程が十分な生物学的信号を周囲から細胞体幹に伝えるのに必要であることを示唆する。そのような示唆は、細胞体幹に注射されたＮＧＦはニューロン生存に関係しないという発見が与えられ非常に短絡的に見える。これは、レセプター−リガンドコンプレックスが信号送付に重要であることを示唆する。

この分野の当業者はここに記載された本発明が特に記載されたちの以外に変更及び修飾を受入れることを認識するであろう。本発明は、全てのかかる変更及び修飾を含むことを理解すべきである。本発明は又、本明細書に個々に又はまとめて引用され、又は示された段階、特徴、組成物及び化合物、及び二又はそれ以上の該段階又は特徴の組合せを含む。

引例１、し・ドウリン、エフ。エム、サイエンス　２３１　：１５１．５−１５２２、２、シラー、シー０、フッラケット、エム８、カーケイム、シー　、スミス、ジエイ、及びし・ドウリン、エフ　エム　デヴエロノブメンタル・バイオロノイ、１２０：１０１−１１１．１９８７３、アンダーマン、ディー、ジエイ、ニューロン、３　：１−１２．１９８９４　レヴイーモンタルキニ、アール　アニ　レヴ　ニューロサイ、５：３４１−３６１．１９８２゜５、バーブ、シイ　ニューロン、２：１５２５−１５３４．１９８９゜６、バービン、ン一１、マンソーブ、エム　及びグアロン。ニス、ジニイ、ニューロケミストリイ　４３　：１４６８−１４７８．１９８４゜７６　マーシイ、エム　、ドラゴ、ンエイ　及びバートレット、ビー、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・リサーチ、２５：４６３−４７５．１９９０８、ニスル、エフ、アルグ、ゼット、ブ／キアト、４８：１９７−１９８．１９８２゜９、グンド　エム、エフ３、ボイド　エイ、ダブリュ、及びノサル、ジー、ジエイ８ヴイ、ジャーナル・オブ・イムノロシイ、１３０　：　２０４６−２０５５　：　１９８３゜１０、エラケンスタイン、エフ、ビー１、バウフマン、アール、ダブリュ及びフィン、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス　２５　：　４５７−４７４．１９８１１、冥施例１、を髄細胞の分離。

１２、ヒルトン等、１９９０゜１３、ヒルトン、ディー　ジェイ４、ニコラ、エフ。エイ０、及びメトカーフ、ディー　アナリティカル・バイオケミストシイ　１７３　：３５９−３６７．１９８８゜１４、ソウ　ジー　、オスポーン、エム　、ウニバー、エッチ　ューロピアン・ジャーナル・オブ・セル・バイオロジイ、２６・６８−８２．１９８１゜１５、ユ、ジー、ホラレフト。ティー９、プロディン、イー１、ファーレンクルグ、ジエイ１、フィッシャー、ジエイ、エイ　、フレイ、ビー３、エルデ、アール、ビー、及びブラウン、ンエイ、シー、セル・アンド・ティシュ−・リサーチ２４７：４１７−４３１．１９８７゜１６　ギビンズ、アイ、エル１、フーネス、ジェイ、ビー、及びコスタ、エム。

セル・アンド・ティシュ−・リサーチ　２４８　：　４１７−４３７．１９８７゜１７、ニールリンク、ビー、エッチ　ジエイ０、ムンズ、ディ、ジー、及びデジオン。アール・エム、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・リサーチ　２６゜２３８−２４１．１９９０゜ｆｉｌｌ、ケスラー、ジェイ、エイ、及びブランク、アイ、ビー、ブロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス　ＵＳＡ　７７：６４９−６５２．１９８０゜１９　ローソン、ニス、エフ８、カディ、ケイ　ダブリュ、ティー、及びビスコ −、ティ、ジエイ、セル・アンド・ティシュ−・リサーチ　１５３：３９９−４１３．１９７４゜２０、マーケイム、シー及びンヤンドリュー、エム　デヴエロブメンタル・プレイン・リサーチ　４１ニア９−８６．１９８８゜２１、マーケイム、ソー１、バード、ワイ、エイ、ソーネン、エッチ１、及びし・ビーリン、ニス　エム、エンボ・ジャーナル　６　：　２８７１−２８７３．１９８７０コ突起の数／細胞の塊粒子／細砲粒子／細胞一一〇−−φＬＩＦＮｏ　インビトロ日の数要約書本発明は哺乳動物の神経系におけるニューロン増殖／維持及び／又は再生を調節する方法並びにそれに有用な白血病阻害因子を含む医薬組成物に関する。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年９月１８日特１庁長官殿　ＤＵｌ、特許出願の表示ＰＣＴ／ＡＵ９１１００１０３２、発明の名称ニューロン増殖及び維持を調節する方法３、特許出願人名称　アムラド・コーポレイション・リミテッド４、代理人住所　〒５４０　大阪府大阪市中央区域見２丁目１番６１号ツイン２１ＭＩＤタワー内　電話（０６）９４９−１２６１し、刺激し、維持し及び／又は再生する方法に係り、さらにを髄以外の中枢神経系に係る。

本発明のさらに他の局面は、哺乳動物における中枢及び末梢神経系における疾病及び損傷の処理方法を意図し、該疾病及び損傷は、脳性麻痺、麻痺に誘発される損傷、発生に関連する血管虚血、ニューロン腫瘍、運動性二ニーロン病、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、糖尿病、重金属又はアルコール毒性に関連する多重硬化及び末梢ニューロパン−１腎不全及び／又は感染病例えばヘルペス、風諭、麻診、水痘、ＨＩＶ及び／又はＨＴＬＶ−１の１又はそれ以上を含むが、これに限られず、それは該哺乳動物に有効量のＬＩＦを疾病又は損傷を良くするのに十分な時間及び条件下に投与することを含む。

本発明の全てのこのような方法において、ニューロンの増強、刺激、維持及び／又は再生は、「ニューロン増殖を調節すること」として引用される。さらに、用語ｒＬＩＦＪの使用は上述したようなＬＩＦ様ポリペプチド及びその誘導体を含む。

本発明により使用されるＬＩＦの有効量は、ニューロンのＥｉｆｆｉに必要とされるものであり、一般に体重キログラム（ｋｇ）当り約１０１から約１０．０００マイクログラム（μｇ）で、好ましくは０．１ないし１０，０００μｇ／ｋｇでもつとも好ましくは、ｌないし１００　Ｉ１ｇ／ｋｇ体量である。しかしながら、処理される疾病、処置及び患者のような因子に依存し、多かれ少なかれＬＩＦが使用されつるが、本発明の範囲内にある。さらに単位／ｍｌ又は単位／ｋｇでＬＩＦの有効量を測定するのが便利である。ＬＩＦ活性の単位の定義はＰ（：Ｔ／ＡＵ８８１０００９３に見ることができる。例えば、ＬＩＦを限定するのではな（，１０から１０８μ／ｍｌ用いつる。投与は時間当り、１日当り、週当り、又は月当りであり得、又は単一投与でありうる。投与は又、連続注入であることが必要でありうる。

本発明に従って、ＬＩＦは単独で或いは１又はそれ以上の他のニューロン刺激因子、例えば、これらに限定されないがＦＧＦ、ＣＮＴＦ及び／又はＢＤＮＦ及び／又は池の向神経因子と組合せて投与しつる。「組合せ」はＬＩＦ及び／又はそれ以上の他の因子の同一組成物での同時添加或いはＬＩＦ及び１又はそれ以上の他の因子の、第１因子を与え、次いで第２因子を与える、連続的添加を意味する。

添加の間の付加及び時間の正確な順位は、実施する医師により最善に決定され、患者及び／又は必要とされる処置に依存しつる。

従って、１又はそれ以上の他のニューロン刺激因子はＬＩＦと同時又は連続投与により与えうる。他のニューロン刺激因子の有効量は、約０．０１ないし約１ｏ、ｏｏｏμｇ／ｋｇ体量、好ましくはＱ、１ないし１０，０００μｇ／ｋｇそして最も好ましくは１ないし１．０００μｇ／ｋｇ体量であろう。再び投与は、時間当り、日当り、週当り、又は月当り単−用量又は操り返しつる。投与は又、連続的注入でありうる。

このような組成物は、哺乳動物におけるニューロン増殖及び／又は維持を調節する。例えば末梢神経系におけるニューロンの形成及び生存を増強し、刺激し、維持し及び／又は調節する。及び／又は、中枢神経系における知覚ニューロンの形成及び生存を増強し、刺激し、維持し及び／又は調節する。及び／又はを髄ニューロン及び／又はを髄増殖の形成及び生存を増強し、刺激し、及び／又は維持するのＩこ有用である。

好ましくは組成物はヒトへの投与に適当である。本発明により組成物中に用いられるＬＩＦは既に明細書中で定義されたものであり、例えばＬＩＦ様ポリペプチド及びＬＩＦの変異体、誘導体、同族体及び／又は顕似体を含む。ＬＩＦ及び他のニューロン刺激分子及び／又は向神経因子はそれらの哺乳動物根源に関して補正音の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）１、特許出願の表示ＰＣＴ／ＡＵ９１１００１０３２、発明の名称ニューロン増殖及び維持を調節する方法３、特許出願人名称　アムラド・コーポレイション・リミテッド４、代理人住所　〒５４０　大阪府大阪市中央区域見２丁目１番６１号、　ツイン２１ＭｒＤタワー内　電話（０６）９４９−１２６１とを示さなかった。これらの因子は、神経生長因子（ＮＧＦ：４）脳誘導向神経因子（ＢＤＮＦ：５）、毛様体向神経因子（ＣＮＴＦ：６）及び腺維芽細胞生長因子（ＦＧＦ’Ｓ：５参照）を含む゛。

本発明まで導く研究で、実験は、神経域の前駆体群への直接効果を有する剤を設けるよう実施された。本発明により驚くべきことに神経堤細胞はＬＩＦの存在で完全にＩｓしたニューロンに分化することが発見された。この効果は滴定可能であり、ニューロンの前駆体細胞の増殖の欠如で起きる。さらに神経堤細胞のニューロンへの分化のＬＩＦの効果は胚の背の根神経節の前駆体細胞の成熟知覚ニューロンへの分化の刺激に拡がる。

従って、本発明の一つの局面は、神経前駆体細胞のニューロンへの分化及び／又は維持及び／又は再生を可能にするに十分な時間及び条件下、有効量の白血病阻止因子（Ｌ　Ｉ　Ｆ）を１１１ｉ乳動物に投与することを含む哺乳動物におけるニューロン増殖及び／又は維持及び／又は再生をｖｉＪｗＪする方法を意図する。

本発明の他の局面は、中枢神経系においてニューロンの数を増加させ及び／又は維持するに十分な時間及び条件下に有効量のＬＩＦを哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の中枢神経系におけるニューロンを増加し及び／又は刺激し及び／又は維持し及び／又は形成を再生し及び／又は生存する方法に関する。

一実施態様では、ＬＩＦは未成熟ニューロンを増加し、刺激し維持しく即ち生存を促進する）及び／又は再生する。

本発明のさらに他の局面は、末梢神経系におけるニューロンの数を増加し及び／又は維持するに十分な時間及び条件下に有効量のＬＩＦを哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の末梢神経系の知覚二ニーロン、例えば知覚ユニ一オルンを増加し、刺激し及び／又は形成を維持し及び／又は生存させる方法に関する。ここに用いられるｒＬＩＦＪは、ＬＩＦに関連していて全ての分子、例えば炭水化物。

リピド及び／又はペプチド残基への単−又は多重置換、除去及び／又は付加を含む天然に起きるアミノ酸配列又は全ての単−又は多重アミノ酸置換、除去及び／又は付加を含む天然に生じた、組換え体及び合成のＬＩＦを含むことを特徴する請求の範囲プレカーサー細胞のニューロンへの増殖及び／又は該神経プしカーサ−の生存を促進するに十分な時間及び条件で該哺乳動物に投与することを含む。

２、ニューロンが末梢神経系にある請求項１の方法。

３、ニューロンが中枢神経系にある請求項１の方法。

４、哺乳動物がヒトである先行請求項のいずれか一つの方法。

５、投与経路が静脈内又は筋肉的注射又は注入により、又は遺伝子治療により、又は逆標識による請求項４の方法。

５、ＬＩＦが哺乳動物ＬＩＦである請求項５の方法。

７、　＃乳動物ＬＩＦがマウス、ラット、ヒト又は家畜類動物ＬＩＦである請求項６の方法。

８、ＬＩＦの哺乳動物起源及び処理されるべき哺乳動物が同一種に属する請求項７の方法。

９、ＬＩＦの有効量が約０．０１から約１０．０００μｇ／ｋｇ体重である先行請求項のいずれか一つの方法。

１０、　１又はそれ以上の他のニューロン刺激因子を同時に又は順次に投与することをさらに含む請求項９の方法。

１１、他のニューロン刺激因子がＦＧＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ及び／又はＢＮＤＦ及び／又は１又はそれ以上の同神経因子を含む請求項１０の方法。

１２、それぞれの他のニューロン刺激因子が約０．０１から約１０．　ＯＯＯ：ｇ／ｋｇ体重の有効量で投与される請求項１１の方法。

・１３．ニューロンが知覚ニューロンである請求項２の方法。

国際調査報告Ｍ　Ｔｏ　’ｆ）ＥＥ　１１１ｆｉｌＥＲａ’ｌｌ’ｌＧ＠Ｌ　Ｗ　ＲＥＰＩＦｒ　Ｇｉ摺沼−五ｊにＶにＤ万国１ｇＥＴ９

Claims

【特許請求の範囲】

１．哺乳動物において、ニューロン増殖及び／又は再生及び／又は維持を調節する方法であって、有効量の白血病阻害因子（ＬＩＦ）を神経プレカーサー細胞のニューロンヘの増殖及び／又は維持をさせるに十分な時間及び条件で該哺乳動物に投与することを含む。
２．ニューロンが末梢神経系にある請求項１の方法。
３．ニューロンが中枢神経系にある請求項１の方法。
４．哺乳動物がヒトである先行請求項のいずれか一つの方法。
５．投与経路が静脈内又は筋肉内注射又は注入により、又は遺伝子治療により、又は逆標識による請求項４の方法。
６．ＬＩＦが哺乳動物ＬＩＦである請求項５の方法。
７．哺乳動物ＬＩＦがマウス、ラット、ヒト又は家畜類動物ＬＩＦである請求項６の方法。
８．ＬＩＦの哺乳動物起源及び処理されるべき哺乳動物が同一種に属する請求項７の方法。
９．ＬＩＦの有効量が約０．０１から約１０，０００μｇ／ｋｇ体重である先行請求項のいずれか一つの方法。
１０．１又はそれ以上の他のニューロン刺激因子を同時に又は順次に投与することをさらに含む請求項９の方法。
１１．他のニューロン刺激因子がＦＧＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ及び／又はＢＮＤＦ及び／又は１又はそれ以上の向神経因子を含む請求項１０の方法。
１２．それぞれの他のニューロン刺激因子が約０．０１から約１０，０００μｇ／ｋｇ体重の有効量で投与される請求項１１の方法。
１３．ニューロンが知覚ニューロンである請求項２の方法。
１４．ニューロンが脊髄ニューロンである請求項１又は３の方法。
１５．哺乳動物において、脊髄増殖及び／又は回復及び／又は維持及び／又は再生を調節する方法であって、有効量のＬＩＦを、数を増加し、脊髄ニューロン及び／又は神経突起を維持又は再生するに十分な時間及び条件で該哺乳動物に投与することを含む。
１６．哺乳動物がヒトである請求項１５の方法。
１７．投与経路が静脈内又は筋肉内注射又は注入により、又は遺伝子治療により又は逆標識による請求項１５又は１６の方法。
１８．ＬＩＦが哺乳動物ＬＩＦである請求項１７の方法。
１９．哺乳動物がマウス、ラット、ヒト又は家畜類動物ＬＩＦである請求項１８の方法。
２０．ＬＩＦの哺乳動物起源及び処理されるべき哺乳動物が同一種に属する請求項１９の方法。
２１．ＬＩＦの有効量が約０．０１から約１０，０００μｇ／ｋｇ体重である請求項１５ないし２０のいずれか一つの方法。
２２．１又はそれ以上の他のニューロン刺激因子を同時に又は順次に投与することをさらに含む請求項２１の方法。
２３．他のニューロン刺激因子がＦＧＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ及び／又はＢＮＤＦ及び／又は１又はそれ以上の向神経因子を含む請求項２２の方法。
２４．それぞれの他のニューロン刺激因子が約０．０１から約１０，０００μｇ／ｋｇ体重の有効量で投与される請求項２３の方法。
２５．哺乳動物の神経系に対する疾病及び／又は傷害を処理する方法であって、該哺乳動物に有効量のＬＩＦを疾病及び／又は傷害を回復するに十分な時間及び条件で投与することを含む。
２６．哺乳動物がヒトである請求項２５の方法。
２７．神経系が末梢神経系である請求項２６の方法。
２８．神経系が中枢神経系である請求項２６の方法。
２９．疾病又は傷害が脳性痳痺、麻痺を誘導された外傷、打撃に関連した血管虚血、ニューロン腫瘍、運動性ニューロン病、アルツハイマー病、多発硬化、パーキンソン病、ハンチントン病、糖尿病、重金属、又はアルコール毒性に関連する末梢ニューロパシー、腎不全及び／又は感染病である請求項２７又は２８の方法。
３０．感染病がヘルペス、風診、麻疹、水痘、ＨＩＶ及び／又はＨＴＬＶ−１を含む請求項２９の方法。
３１．ＬＩＦが哺乳動物ＬＩＦである請求項２５ないし３０のいずれか一つの方法。
３２．哺乳動物ＬＩＦがマウス、ラット、ヒト又は家畜類動物ＬＩＦである請求項３１の方法。
３３．ＬＩＦの哺乳動物起源及び処理されるべき哺乳動物が同一種に属する請求項３２の方法。
３４．ＬＩＦの有効量が約０．０１から約１０，０００μｇ／ｋｇ体重である請求項２６又は３０の方法。
３５．一又はそれ以上の他のニューロン刺激因子の同時又は順次の投与をさらに含む請求項３４の方法。
３６．他のニューロン刺激因子がＦＧＦ、ＣＮＤＦ、ＮＧＦ及び／又はＢＮＤＦ及び／又は１又はそれ以上の何神経因子を含む請求項３５の方法。
３７．ＬＩＦ、１又はそれ以上の他のニューロン刺激因子及び１又はそれ以上の製薬的に許容しうる担体及び／又は希釈剤を含む医薬組成物。
３８．ニューロン刺激因子がＦＧＦ、ＣＮＤＦ及び／又は１又はそれ以上の他の何神経因子を含む請求項３７の医薬組成物。
３９．ニューロンの調節及び／又は哺乳動物の神経系に対する疾病又は傷害の処理のための医薬の製造でのＬＩＦの用途。
４０．神経系が末梢神経系、中枢神経系及び／又は脊髄である請求項３９の用途。
４１．１又はそれ以上の他のニューロン刺激因子の使用をさらに含む請求項３９又は４０の用途。
４２．他のニューロン刺激因子がＦＧＦ、ＣＮＴＦ及び／又はＢＮＤＦ及び／又は１又はそれ以上の他の何神経因子を含む請求項４１の用途。