KR20010022641A - 신경학적 결함의 치료방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경학적 결함이 있는 환자의 치료를 위한 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 이 방법은, 예를 들어, 환자의 중추신경계(CNS)의 신경 원조 세포를 표피 성장 인자(EGF) 수용체에 결합하는 폴리펩티드와 접촉시키고(생체 내 또는 배지 내에서), 증식하는 원조 세포의 자손들을 이들이 신경학적 결함을 감소시키기에 충분한 방식으로 존재하고 기능할 CNS의 부분으로 한꺼번에 이동시킴으로써 수행될 수 있다. 이 방법은 신경 전구체 세포들의 자손을 분화를 자극하는 화합물과 접촉시키는 추가적인 단계를 포함할 수 있다.

Description

신경학적 결함의 치료방법{METHOD FOR TREATING NEUROLOGICAL DEFICITS}

본 발명은 본 명세서에서 전문이 참고로 반영된, 1997년 8월 4일에 출원된 임시 출원 일련 번호 60/055, 383으로부터의 잇점을 청구한다.

본 발명의 분야는 중추신경계에 영향을 미치는 발육장애, 질병 또는 손상으로 인한 신경학적 결함의 치료이다.

신경영양성 인자는 신경 세포의 생존, 증식, 분화, 크기 및 기능을 여러가지로 지원하는 펩티드이다(재검토를 위해, Loughlin and Fallon, Neurotrophic Factors, Academic Press, San Diego, CA, 1993 참조). 확인된 영양성 인자, 또는 성장 인자의 수는 항상 증가하는 반면, 대부분은 구조 또는 결합 친화도를 기준으로 설정된 여러 군에 배정될 수 있다. 표피 성장 인자(EGF) 군을 포함하여, 다양한 군으로부터의 성장 인자들이 흑질선조체 계의 도파민작용성 뉴런(본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 지역)을 지지하는 것으로 입증되어왔다(재검토를 위해, Hefti, J. Neurobiol. 25: 1418-1435, 1994; Unsicker, Prog. Growth Factor Res. 5: 73-87, 1994).

EGF 군의 기초 원인 EGF는 25 년 이상 전에 그 특성이 기술되었다 (Savage and Cohen, J. Biol. Chem. 247,:7609-7611, 1972; Savage et al., J. Biol. Chem. 247: 7612-7621, 1972). 그 이후로, 추가적인 원들이 확인되었다; 종두증 바이러스 성장 인자 (VGF; Ventatesan et al., J. Virol. 44: 637-646, 1982), 점액종바이러스 성장 인자 (MGF; Upton et al., J. Virol. 61: 1271-1275, 1987), 쇼프 섬유종 바이러스 성장 인자 (SFGF; Chang et al., Mol. Cell. Biol. 7: 535-540, 1987), 암피레귤린(AR; Kimura et al., Nature 348: 257-260, 1990) 및 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자(HB-EGF; Higashiyama et al., Science 251: 936-939, 1991)가 포함된다. 이러한 인자들의 공통점은, 3 개의 이황화 교차결합을 형성하고 EGF 수용체에 결합하는 이들의 공통적인 능력의 기초가 되는 보존 구조를 지지하는 6 개의 시스테인를 함유하는 아미노산 서열이다.

EGF는 지금까지 이 군의 가장 연구된 원이고 뇌조직에 국한된 최초의 것이다: EGF-유사 면역반응(IR)은 담창구, 복측 담창구, 내각 핵, 흑질, 및 칼레하 섬을 포함하여 발육하는 성인의 전뇌 및 중뇌 부위에서 발견된다(Falllin et al., Science 224: 1107-1109, 1084).

EGF 군의 또다른 원인, TGFα도 뇌조직에 국한되어 왔다. 이것은 EGF 수용체에 결합하고(Todaro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5258-5262, 1980), 수용체의 티로신 키나아제 활성을 자극하고, 광범위한 세포 유형에서 유사한 유사분열촉진 반응을 끌어낸다.(재검토를 위해, Derynck, Adv. Cancer Res. 58: 27-52, 1992 참조). TGFα는 또한 추가적인 미확인된 수용체에 결합할 수도 있다(이 것은 몇몇 세포에서의 특이한 작용의 설명을 도울 수 있다). 예전에 TGFα-IR은 성숙한 래트 CNS 곳곳의 뉴런의 핵주위부, 및 전뇌 성상세포의 부차집단에 불균일하게 분포되어 있는 것으로 나타났다(Code et al., Brain Res. 421: 401-405, 1987; Fallon et al., Growth Factors 2: 241-250, 1990). TGFαmRNA는 모든 설치류 뇌에서(Lee et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3655-3646, 1985; Kudlow et al., J. Biol. Chem. 264: 3880-3883, 1989) 및 선조체 및 다른 뇌 부분에서 뉴클레아제 보호 분석(Weickert and Blum, Devel. Brain Res. 86: 203-216, 1995) 및 원위치에서의 핵산 혼성화(Seroogy et al., Neuroreport 6: 105-108, 1994)에 의해 검출되었다.

TGFα및 EGF mRNA는 생후 초기에 상대적으로(총 RNA에 비해) 가장 많고, 그후 감소하여, 발육에서의 역할을 제시한다(Lee et al., 1985, supra; Lazar and Blum, J. Neurosci. 12: 1688-1697, 1992). 전체 뇌에서는, 감소가 50 % 초과인 반면(Lazar and Blum, 1992, supra), 선조체에서는 상대적인 TGFαmRNA가 최대 수준의 2/3 가 내려간다(Weickert and Blum, 1995, supra). 시험된 모든 발육 단계에서, 전체 뇌 TGFαmRNA는 EGF mRNA 수준을 한 자리수 이상으로 초과한다(Lazar and Blum, 1992, supra).

EGF 수용체는 면역세포화학에 의해, 래트 뇌에서는 피질 및 소뇌의 뉴런의 부차집단 및 성상세포에, 인간 부검 뇌 검체에서는 뉴런에 국한되었다(Gomez-Pinilla et al., Brain Res. 438: 385-390, 1988; Werner et al., J. Histochem. Cytochem. 36: 81-86, 1988). 방사선표식된 EGF로의 자가방사기록 연구에서, EGF 결합 부위는, 선조체를 포함하여, 래트 피질 및 피질하 부분에서 드러났다(Quirion et al., Synapse 2: 212-218, 1988). 원위치 혼성화 연구는 복측 중뇌의 세포 및 선조체(Seroogy et al., 1994, supra) 내, 및 발육 중 및 성숙한 래트 뇌에서 증식하는 부분(Seroogy et al., Brain Res. 670: 157-164, 1995)내의 EGF 수용체 mRNA를 입증하였다. 상대적인 EGF 및 TGFαmRNA에 관해서는, EGF 수용체 mRNA가 발육 초기에 선조체 및 복측 중뇌에서 가장 풍부하고, 동물이 성숙하면서 점차적으로 감소한다(Seroory et al., 1994, supra).

생리학적으로, TGFα는 많은 신경계통의 기원을 포함하여, 신체 곳곳의 매우 많은 세포 유형에서 작용한다(재검토를 위해, Derynck, 1992, supra 참조). 이것은 배양되는 중추 뉴런의 생존을 지지하고(Morrison et al., Science 238,:72-75, 1987; Zhang et al., Cell. Regul. 1: 511-521, 1990), EGF와는 달리, 배근신경절 감각 뉴런의 신경돌기 성장 및 생존을 강화한다(Chalazonitis et al., J. Neurosci. 12: 583-594, 1992). 또한 이것은 발육 중 또는 성숙한 뇌로부터의 뉴런 및 신경교 원조 세포 증식 및 분화를 자극한다(Anchan et al., Neuron 6: 923-936, 1991).

배지에서 중뇌의 도파민작용성 뉴런에 대한 EGF-군 펩티드의 영양성 효과도 최근 연구되어왔다. EGF는 혼합된 중뇌 배양에서 E16 도파민 뉴런의 생존을 강화하지만(Casper et al., J. Neurosci. Res. 30: 372-381, 1991), 도피민 섭취를 자극하는 정도는 높지 않다(Knusel et al., J. Neurosci. 10: 558-570, 1990). ＴGFα 또한 분리된 세포 배양에서 중뇌의 도파민 뉴런의 생존을 지지하지만, 이것의 효과는 EGF의 효과보다 더 선택적이다(Ferrari et al., J. Neurosci. Res. 30: 493-497, 1991; Alexi and Hefti, Neurosci. 55: 903-918, 1993).

EGF-군 성장 인자의 또다른 중요한 특징은 신경독의 공격으로부터 중뇌 도파민 세포들을 보호하는 능력이다. EGF는 분리된 세포 배양에서 글루타메이트 또는 퀴스쿠알레이트 독성자극으로부터 도파민 뉴런을 보호하는 것으로 나타난다 (Casper and Blum, J. Neurochem. 65: 1016-1026, 1995). 또한 배양된 도파민 세포들을 선택적인 도파민 신경독인 1-메틸-4-페닐피리디늄 (MMP⁺, Park et al., Brain Res. 599: 83-97, 1992) 으로부터 보호하는 것 및 MMP⁺-처리된 배양물로부터 도파민 섭취를 증가시키는 것(Hadjiconstantinou et al., J. Neurochem. 57: 479-482, 1991).

생체내 EGF의 연구 결과는 배양물에서 수득된 것과 일치하였다: EGF는 두 경우 모두에서 신경보호를 일으켰다. 예를 들어, EGF의 대뇌실 내(ICV) 주입은, 암페타민-유도 순환을 감소시켰고, SN 내 타이로신 가수분해효소 면역반응성(TH-IR) 세포의 생존수를 증가시켰고, PD의 래트 모델에서 흑질선조체 경로의 횡단면 후의 선조체의 TH-IR 섬유를 증가시켰다(Pezzoli et al., Movement Disord. 6: 281-287, 1993; Ventrella, J. Neurosurg. Sci. 37: 1-8, 1993). 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘(MPTP) 로 손상된 마우스의 뇌로의 EGF ICV 주입은 선조체 내의 타이로신 가수분해효소의 활성 및 도파민과 3,4-디히드로-지페닐아세트산 (DOPAC)의 함량을 강화시켰다(Hadjiconstantinou et al., 1991, supra; Schneider et al., Brain Res. 674: 260-264, 1995).

EGF에 비해 더욱 강력한 생체외 활성에 불구하고, TGFα의 생체 내-특히 신경학적 결함이 있는, 인간을 포함하여, 동물에서- 영양 효과는 불명료하다. 본 발명은 새로이 발견된, 정상 또는 비정상(손상된) 중추 신경계 내의 세포에 대한, TGFα주입의 효과를 기초로 하고, 이것은 본 명세서에서 설명된다.

발명의 개요

본 발명은 신경학적 결함을 갖는 환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 이 방법은, 예를 들어, 환자의 중추신경계(CNS)의 신경 원조 세포를 표피 성장 인자(EGF) 수용체에 결합하는 폴리펩티드와 접촉시키고(생체 내 또는 배지 내에서), 증식하는 원조 세포의 자손들을 이들이 신경학적 결함을 감소시키기에 충분한 방식으로 존재하고 기능할 CNS의 부분으로 한꺼번에 이동시킴으로써 수행될 수 있다. 이 방법은 신경 전구체 세포들의 자손을 분화를 자극하는 화합물과 접촉시키는 추가적인 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 목표, 장점, 및 새로운 특징은 하기의 도면의 간단한 설명, 발명의 상세한 설명, 및 실시예로부터 명백해질 것이다.

도 1은 래트 전뇌의 관상절단면의 구성도이다. 오른쪽에 그려진 주입 피펫은 성장 인자가 주입될 수 있는 한 위치인 선조체(str)를 나타낸다. (대뇌 피질 = ctx; 측뇌실 = lv).

도 2A-2D는 EGF 수용체 mRNA의 분포를 보이는 것으로 증명된 성숙한 래트 뇌의 중뇌를 통한 관상절단면의 현미경사진이다. 도 2A에서, "센스" 탐침이 대조군으로 적용되었다. 도 2B-2D에서는, 흑질(sn)을 통한 단면이 해마(hip), sna의 내측 부분, 복측 피개 지역(vta)의 아가미모양 및 흑질모양의 핵에서의 적당히 풍부한 발현을 드러낸다. 중뇌의 가장 아랫부분에서(도 2D), 각간의 핵(ip)이 가장 진하게 표식되었다. 스케일 막대 = 5 ㎜.

도 3은 TGFα가 주입되고 EGF 수용체 mRNA의 분포를 보이는 것으로 증명된 성숙한 래트 뇌의 선조체를 통한 관상절단면의 현미경사진이다. 주입된 쪽에서, 혼성화 밀도의 극적인 증가가 측뇌실에 가까운 내측의 선조체에서 명백하다.

도 4는 TGFα가 주입되고 6-OHDA로 손상된 성숙한 래트 뇌의 전뇌를 통한 관상절단면의 현미경사진이다. 원위치 혼성화를 수행하여 EGF 수용체 mRNA를 국소화시켰는데, 이것은 선조체의 본체까지 잘 확장된 진한 융기로 나타난다.

도 5는 시험된 다섯 군의 동물(정상; aCSF 주입, 손상 없음; aCSF 주입, 손상; TGFα 주입, 손상없음; TGFα 주입, 손상) 각각의 선조체에서의 TGFαmRNA 혼성화의 평균 표준화된 밀도를 나타내는 막대그래프이다. 짝지워진 막대들은 처리에 대해 선조체의 동측 및 반대측에서의 밀도를 나타낸다. 흑질의 6-OHDA 손상을 받은 양쪽 모두에서 평균 혼성화 밀도는 처리에 대해 동측에서 상당히 1/4이 감소하였다. TGFα 펩티드의 선조체 주입은 감소에 영향을 미치지 않았다. 평균 ±S. E. M. (스튜던트 t-검정, 동측-반대측 비교를 위해 짝지워짐; P 값, * p＜0.005, ** p＜ 0.001).

도 6은 도 5에서 설명된 동일한 5 개의 테스트 군에서 동물의 측뇌실에 접하는 선조체의 가장자리를 따르는 상의하의 부분에서의 EGF 수용체 mRNA 혼성화의 평균 표준화된 밀도를 나타내는 막대그래프이다. 짝지워진 막대들은 처리에 대해 선조체 동측 및 반대측에서의 밀도를 나타낸다. TGFα선조체가 주입된 양쪽 군 모두에서 평균 혼성화 밀도는 동측 상의하의 부분에서 약 2 배였다. 평균 ±S. E. M. (스튜던트 t-검정, 동측-반대측 비교를 위해 짝지워짐; P 값, * p＜0.01, ** p＜ 0.0001).

도 7은 선조체 융기가 있는 모든 동물에서 선조체 융기, 선조체의 비융기체, 및 상의하 부분에서의 EGF 수용체 mRNA 혼성화의 평균 표준화 밀도를 나타내는 막대그래프이다. 짝지워진 막대들은 처리에 대해 선조체 동측 및 반대측에서의 밀도를 나타낸다. 평균 혼성화 밀도는 처리에 동측인 선조체 부분에서 가장 높았다. 반대측 선조체에서는 선조체 융기가 나타나지 않았다. 평균 ±S. E. M. (스튜던트 t-검정, 동측-반대측 비교를 위해 짝지워짐; P 값, * p＜0.005, ** p＜ 0.001).

도 8A 및 8B는 흑질 6-OHDA 손상 및 14 일동안 TGFα 주입을 받은 성숙한 래트의 선조체를 통한 관상절단면의 현미경사진이다. 도 8A에서, 처리에 동측인 미상핵-피각에서 은으로 염색을 하면, 융기의 배면 부분에서 거대한 수의 세포들이 나타나는데, 이들중 많은 세포들이 길게 늘어난 형태를 나타내고, 상의하의 지역에 법선으로 배향된다. 또한 측뇌실(lv)을 따라 세포의 수가 증가된다. 반대측의 선조체에서는(도 8B), 선조체 내에서 또는 측뇌실을 따라 세포집단이 확장되지 않는다.

도 9A-9D는, 6-OHDA로 손상되고 다양한 기간의 시간동안 TGFα가 주입된 동물로부터의 성숙한 래트 뇌의, 티오닌으로 염색된 관상절단면의 현미경사진이다. 도 9A에서는, 주입 4 일후에 상의하 부분에서의 세포 확장이 배경 염색 위에서 거의 검출될 수 없다. 도 9B에서는, 주입 6일 후에, 측뇌실 근처에서 티오닌으로 염색된 세포들의 응집이 훨씬 더 확실하다. 도 9C에서는, 주입 9일 후에, 진하게 염색된 세포들의 부분이 세포 확장의 복측 끝에서 상의하 대의 약간 측면에서 나타난다. 도 9D에서는, 주입 14일 후에, 진하고 잘 형성된 융기가 선조체의 본체내로 매우 명확하다.

도 10A 및 10B는 흑질 6-OHDA 손상 및 14 일동안 TGFα 주입을 받은 동물로부터의 성숙한 래트의 선조체의 관상절단면의 현미경사진이다. 도 10A에서는, 네스틴(nestine) 면역조직화학이 진한 선조체 융기를 나타낸다. 도 10B에서는, 가깝고 근접한 절편의 티오닌 염색이 네스틴-IR 세포와 선조체 융기 사이의 등록(registry)을 확실히한다.

도 11A-11C는 흑질 6-OHDA으로 손상되고, 측뇌실로부터 다양한 거리에서 14 일동안 TGFα 주입을 받은 동물로부터의 성숙한 래트의 선조체로부터의 티오닌으로 염색된 관상절단면의 현미경사진이다. 도 11A에서는, 선조체의 매우 측면에 주입관이 심어졌는데, 융기가 상의하 대와 평행하고 중앙-선조체 주입으로 보이는 것보다 덜 진하다. 도 11B에서는, 주입관이 중앙-선조체에 심어졌는데, 융기가 특징적으로 S 형이고, 복측 부분이 복측 선조체 내로 멀리 밖으로 확장된다. 도 11C에서는, 측뇌실에 바로 인접한 곳에서 주입되었는데, 선조체 융기가 L 형이고 일반적으로 매우 진한 티오닌 염색을 나타낸다.

도 12는 6-OHDA로의 흑질 손상 및 14 일동안의 TGFα중앙-선조체 주입 후에 성숙한 래트 뇌의 관상절단면에서 선조체 융기의 최대 변위(측뇌실로부터; mm)를 나타내는 막대그래프이다. "계획 A"(왼쪽 막대)에 따라 처리된 동물들은 먼저 손상을 받은 후 4 내지 8 주 후에 TGFα 주입을 받았다. "계획 B"에 따라 처리된 동물들은 14-일 TGFα 주입이 시작된 지 2 일 후에 손상을 받았다. 평균 ±S. E. M. (스튜던트 t-검정; P 값, * p＜0.01).

I. 선조체 및 흑질선조체계

A. 해부학, 결합 및 신경화학

뇌에 있어서, 선조체, 담창구, 흑질, 복측 피개부 (VTA), 시상하부의 핵 및 편도체를 집합적으로 기초 신경절이라 한다. 선조체는 배측 성분 및 복측 성분을 함유하는데, 이들 각각은 부가적인 해부학적 구조로 더욱 세분된다. 인간에게 있어서, 배측 선조체는 미상핵 및 피각으로 구성된다. C-형 미상핵은 측뇌실의 곡선에 이어진다. 그 꼬리 부분은 하각의 말단을 지나 연장되어 각 측두엽에 있는 편도체와 연결된다. 미상핵의 머리 부분은 전각의 전방 말단으로부터 배측으로 돌아 피각과 융합된다. 인간 뇌와는 해부학적으로 많이 다르다해도, 그들은 설치류에 있어서는 공통적인 구조, 미상핵-피각 또는 미상피각으로 조합되어 있다.

복측 선조체는 측중격핵, 후결절 및 연관된 선조체의 세포간교로 이루어진다. 담창구에는 창백핵, 각내핵, 흑질 망양부(SNr), 및 복측 담낭구가 포함된다. 각내핵 및 SNr 은 매우 유사한 구심성 및 원심성 연결체를 갖는다. 복측 담낭구는 창백핵과 각내핵 모두에 유사한 혼합 연결체가 있는 부분을 함유한다. 흑질의 또다른 부분인, 치밀부(SNc)는 흑질-복측 피개부 (SN-VTA)에 걸쳐져 있는 도파민 뉴런과, 또한 SNr 에 있는 도파민 세포 클러스터를 포함한다. 기초 신경절의 회로도는 복잡하지만, 쥐와 사람 모두에게 있어서 매우 유사하므로 (Fallon and Loughlin, Cerebral Cortex, E.G. Jones and A. Peters, Eds., Vol. 6, pp. 41-127, Plenum Press, New York, 1987; Alheid and Heimer, Progr. Brain Res. 107: 461-484, 1996), 쥐는 포유류 뇌에 있어서 상기 계의 연결, 신경화학, 약리학, 기능 및 임상학적 연관성을 연구하는데 유용한 모델이다.

기초 신경절의 다른 핵들과 함께, 선조체는 운동 및 감정의 조절에 기여한다. 상기 계 또는 그의 신경지배에 영향을 주는 많은 질병들은 몹시 쇠약해진 운동신경 손상과 연관되며, 자주 감정적 질환을 수반한다.

미상핵 및 피각은 기초 신경절의 일차적인 투입 핵으로, 대뇌 피질 및 시상의 중심핵 및 층간핵으로부터의 흥분성 투사를 주로 받아들인다. 선조체 피질의 구심성은 글루타메이트 작용성이다. 시상으로부터의 구심성도 역시 글루타메이트 작용성인 것으로 생각된다. 흑질 치밀부(SNc)는 흑질 경로를 통해 선조체로 밀집된 도파민 작용성 투입을 제공한다 (쥐에 있어서, 상기 계의 재검토를 위해, Fallon and Loughlin, The Rat Nervous System, G. Paxinos, Ed., pp. 215-237, Academic Press, San Diego, 1995 참고). 복측 선조체 및 측중격핵은 복측정중의 중뇌에 있는 VTA 의 도파민 세포로부터 대량의 도파민 작용성 신경지배를 받아 들인다. 편도체로부터의 구심성 변연계 및 중뇌 또는 봉선으로부터의 세로토닌 작용성 섬유도 또한 복측 선조체에서 종료된다.

선조체 구심성의 분포 및 그의 종료는 그들의 기원 영역에 대한 단순히 균일한 표시는 아니다. 선조체는 기능적으로 및 화학적으로 별개의 주변 매트릭스에 포매된 패치 또는 스트리오좀으로 조직된다. 이러한 조직은 원래 아세틸콜린에스테라제 (AChE)에 대한 조직화학을 이용하여 증명되었고, 이는 매트릭스를 선별적으로 염색한다 (Graybiel and Ragsdale, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5723-5726, 1978). 그 이후로, 두 개의 분획에 차별적으로 분포된 많은 부가적인 마커들을 동정하기 위해서, 효소 조직화학, 면역세포화학, 원위치 혼성화, 방사능표지된 리간드와 수용체의 결합, 전행성 변성 및 기타 방법들이 사용되고 있다. 매트릭스용 마커로는 칼빈딘, 소마토스타틴, 및 도파민 흡착([³H)마진돌 결합) 부위가 있다 (Gerfen, J. Comp. Neurol. 236:454-476, 1985; Voorn et al., J. Comp. Neurol. 289:189-201, 1989). 스트리오좀은 그의 상대적으로 더 많은 양의 엔케팔린, 흑질 기능장애에 대한 5'-뉴클레오다제 활성, 티로신 히드록실라제, 뮤 오포이드 수용기 결합, 및 물질 P 에 의해 확인될 수 있다(Graybiel et al., Neurosci. 6:377-397, 1981; Schoen and Graybiel, J. Comp. Neurol. 322:566-576, 1992). 그러나, 예측될 수 있는 바와 같이, 이와같은 많은 마커들에 있어서는 종간 및 발육상의 변형이 있으며 일부는 선조체의 일정 영역에만 유용하다.

화학적 마커의 이질성은 패치 또는 매트릭스 분획에서 많은 선조체 경로의 선택적 기원 및 종료에 의해 더욱 복잡하다. 예를 들어, 피질의 운동성, 색대를 갖는, 체성감각 및 시각 영역으로부터의 구심성은 매트릭스에서 종료된다 (Gerfen, Nature 311:461-464, 1984; Donoghue and Herkenham, Brain Res. 365:397-403, 1986). 대뇌변연 피질의 심층 V 및 층 VI 으로부터의 많은 선조체피질 구심성은 패치에서 종료되는 반면, 보다 피층인 V 및 층 II 및 III 으로부터의 대부분은 매트릭스로 투입을 제공한다 (Gerfen, Science 246:385-388, 1989). SNc 의 복면층 및 VTA 로부터의 구심성은 매트릭스로 도파민 작용성 투입을 제공한다. 패치는 SNc 의 복면층과 SNr 에서의 도파민 세포 클러스터로부터의 도파민 신경지배를 수용한다 (Schoen and Graybiel, J. Comp. Neurol. 322:566-576, 1992). 배측 선조체에 있어서, 시상의 내측 분열에서 핵으로부터의 투입은 패치에서 종료되는 반면, 외측 분열로부터의 구심성 - 전방 및 후방 층간 및 문측의 복면층 핵을 포함 - 은 주로 매트릭스 조직을 신경자극한다 (Ragsdale and Graybiel, J. Comp. Neurol. 311:134-167, 1991). 또한, 편도체의 기저외측 핵에서 유래하는 편도형선조체 섬유는 선택적으로 패치 분획을 신경자극한다 (Ragsdale and Graybiel, J. Comp. Neurol. 269:506-522, 1988).

선조체 원심성은 또한 패치-매트릭스 조직에 대해 차별적으로 분포한다. 선조체에서 유래하는 2 가지 주요 경로중 하나인, 선조체흑질 경로는 2 개의 별개의 투사로 이루어진 것으로 나타나고 있다. 패치 분획에서 뉴런에서 비롯된 섬유들은 복측 SNc 에 있는 도파민 뉴런 주변에서 및 SNr 에 있는 도파민 세포 클러스터에서 종료된다. 매트릭스 뉴런은 비-도파민 작용성 영역 및 수상돌기가 SNr 에 위치하는 도파민 뉴런을 포함하여, SNr 에 대한 국소해부적으로-배열되는 돌기를 생성한다 (Gerfen, 1984, supra; Jiminez-Castallanos and Graybiel, Neurosci. 32:297-321, 1989).

선조체담창구 경로인, 다른 주요 원심성 투사는 창백핵으로 투사한다. 패치-매트릭스 조직에 대해 분포하는 것으로 나타나지는 않지만, 선조체흑질계와는 신경화학적으로 구분된다. 선조체담창구 섬유의 대부분은 엔케팔린을 발현하지만 다이노르핀 또는 물질 P 는 발현하지 않는다. 대조적으로, 선조체흑질 투사는 거의 엔케팔린을 함유하지 않지만, 대부분은 다이노르핀 및 물질 P 를 발현한다 (Gerfen and Young, Brain Res. 460:161-167, 1988). 영장류에서, 2 개의 계는 또한 그들의 해부학상 기원 영역이 상이하다 : 선조체담창구 원심성은 주로 피각에서 생기지만 선조체흑질 원심성은 주로 미상핵에서 유래한다 (Parent et al., Brain Res. 303:385-390, 1984).

선조체 연결의 비균일한 분포와 더불어, 뉴런의 몇가지 형태학적으로 및 화학적으로 별개인 유형의 뉴런이 선조체에서 발견된다 (Albin et al., Trends Neurosci. 12:366-375, 1989; Groves, Brain Res. Rev. 5:234-238, 1983). 그들은 전형적으로 그들의 수상돌기 형태를 근거로 가시가 있는것 또는 가시가 없는 것으로 분류된다. 선조체에는 일반적으로 인식되는 2 가지 형태의 가시가 있는 뉴런이 있다. 그들은 GABA, 물질 P, 엔케팔린 및 다이노르핀의 다양한 조합물을 함유하지만, 주로 GABA 작용성이다. 중간의 가시있는 뉴런 (가시가 있는 타입 I)은 전체 선조체 뉴런중 90-95 % 으로, 가장 많다. 그들은 평활 세포체이고, 그들의 수상돌기의 떨어진 부분에서 가시모양의 돌기들이 밀집하여 축적되어 있다. 그들의 수상돌기 분지는 체세포로부터 약 200 ㎛ 범위내에 있다. 중간의 가시가 있는 뉴런은 SNc 에 있는 도파민 작용성 뉴런에 대한 본래의 최종 표적으로, 이는 수상돌기 가시들의 목부분상에서 주로 시냅스를 형성한다. 가시가 있는 타입 II 뉴런은 체세포로부터 약 600 ㎛ 미만으로 신장된 각종 분지에 비교하여 훨씬 더 크다.

가시가 있는 뉴런은 선조체의 돌기 뉴런이다. GABA 및 물질 P 를 함유하는 매트릭스에서의 상기 뉴런들은 창백핵 (GP_i) 및 SNr 의 내부 부분쪽으로 주로 향해 있다. 한편, 엔케팔린을 함유하는 가시가 있는 GABA 작용성 매트릭스 뉴런은 창백핵 (GP_e)의 외부 부분을 신경자극한다. 패치 분획에서의 가시가 있는 뉴런은 그들의 원심성 대부분을 SNc 로 전달한다 (Albin et al., 1989, supra).

2 개의 주요 원심성 경로의 선조체 돌기 뉴런은 또한 그들의 도파민 수용체 서브타입에 의해 구분될 수 있다. 흑질로 향한 물질 P/다이노르핀 뉴런은 주로 D₁도파민 수용체를 발현하고, 엔케팔린 작용성 선조체담낭구 뉴런은 주로 D₂수용체를 발현한다. 그러나, 수용체 타입 모두 단지 어느 한 돌기에서만 발현되지는 않는다 (Besson et al., Neurosci. 26:101-119, 1989; Gerfen et al., Science 250:1429-1432, 1990).

가시가 없는 뉴런의 인식되는 3 가지 타입은 선조체 개재뉴런의 군집을 구성한다 (Groves, 1983, supra; Carpenter, In: Core Text of Neuroscience, pp. 325-360, Williams and Wilkins, Baltimore, 1991). 이와 함께, 그들은 선조체 뉴런수의 전체중 10 % 이하를 구성한다. 가시가 없는 타입 I 뉴런은 상기 3 가지 타입중 가장 보편적이고 중간의 가시가 있는 뉴런의 것 보다 훨씬 더 작은 분지에서 평활 수상돌기를 갖는다. 그들은 대부분 GABA 작용성이지만, 많은 것들은 소마토스타틴 및 뉴로펩티드 Y 를 함유한다. 가시가 없는 타입 II 뉴런은 그들의 큰 세포체 및 AChE 및 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (ChAT) 염색에 의해 구별된다. 이러한 세포 타입은 중간의 가시가 있는 뉴런과 대칭적인 시냅스를 형성한다. 중간의 가시가 없는 타입 III 뉴런은 가장 덜 특징화되었으나 GABA 를 함유하는 것으로 생각된다. 아마도 이미 확인된 뉴런 이외에 상기 분류의 뉴런중 부가적인 화학적으로-정의된 및 결합적으로-정의된 부분집합이 있을 것이다.

B. 국소해부학 및 발육

중뇌의 도파민계의 선조체 돌기중 선행성 및 퇴행성 트레이서로의 실험은 성숙한 설치류에 있어서 상세한 국소해부를 나타낸다 (Fallon and Moore, J. Comp. Neurol. 180:545-580, 1978). 배측 선조체는 복측 및 중간 SN 및 VTA 에서의 뉴런으로부터 도파민 작용성 신경지배를 받는다. 복측 선조체 및 측중격핵은 배측 VTA 및 중간 SN 으로부터 도파민 작용성 도입을 받는다 (Fallon, Ann. NY Acad. Sci. 537:1-9, 1988).

발육중인 계에서의 신경원성 구배는 성숙한 계에서의 돌기들의 국소해부학적 배열과 평행하다. SN의 배외측면부는 쥐에서 배형성 15일 (E15) 전에, 배에서 가장 처음 생성된다 (Altman and Bayer, J. Comp. Neurol. 18:677-716, 1981). 이 영역으로부터의 돌기들은 선조체의 후측 및 복측 영역을 신경자극하고 (Carter and Fibiger, Neurosci. 2:569-576, 1977; Veening et al., Neurosci. 5:1253-1268, 1980), 이는 또한 최초로 생성된 선조체 부분이다 (Bayer, Neurosci. 4:251-271, 1984). 선조체는 복외측에서-배중간측 구배에 있어서 더 어린 뉴런들로 가득하기 때문에, 구심성은 SN (E15 후 생겨난)의 보다 배중간측인 (및 이후 생겨나는) 부분으로부터 돌아와서 이후 생겨난 선조체 영역을 신경자극한다. 따라서, 가장 어린 (배내측) 흑질의 도파민 뉴런은 가장 어린 (복내측) 선조체 뉴런을 신경자극하고, 보다 오래된 (배외측) 흑질의 도파민 뉴런은 보다 오래된 (복외측) 선조체 뉴런을 신경자극한다. 이러한 패턴은 GABA 작용성 선조체흑질 돌기에서도 또한 반복된다 (Bunney and Aghajanian, Brain Res. 117:423-435, 1976).

선조체의 뉴런은 출생전 및 생후 초기 뇌에서 측뇌실 주변 신경상피로부터 유래한다. 뇌실 대가 초기에 뇌실에 그어져 있고, 이후 바로 밑에 겹쳐져 있는 부뇌실 (또는 상의하) 대에 의해 결합된다. 뇌가 성숙되면서, 뇌실 대는 사라지지만, 상의하 대는 세포의 얇은 층으로서 유지된다. 이러한 대는 한정되고 제한된 경로를 따라 이동하여 후각구의 불안정한 개재뉴런 세포 군집을 보충하는 신경간세포 및 원조세포를 함유한다 (Luskin, Neuron 11:173-189, 1993; Lois and Alvarez-Buylla, Science 264:1145-1148, 1994).

C. 병리학

선조체 및 그의 도파민 작용성 신경지배는 헌팅톤병 (HD) 및 파킨슨병 (PD)와 같은, 몇몇 신경변성 질병을 포함하여 수 많은 질환에 공격받기 쉽다 (Albin et al., 1989, supra). HD 는 선조체의 진행성 변성을 특징으로 하는 상염색체성 우성 유전병 (염색체 4) 이다. 이는 팔다리 및 얼굴의 불수의 무도 운동 및 수의 운동의 분열과 연관된다 (Purdon et al., J. Psychiatr. Neutosci. 16:359-367, 1994). 매트릭스 분획에서 중간의 가시가 있는 GABA 작용성 뉴런, 특히 GP_e로 향한 GABA/엔케팔린 작용성 뉴런이 가장 영향을 받는다 (Albin et al., 1989, supra). 소마토스타틴, 뉴로펩티드 Y 및 NADPH-디아포라제를 함유하고, 또한 매트릭스 분획에서 발견되는, 큰 가시가 없는 콜린 작용성 개재뉴런 및 작은 가시가 없는 개재뉴런은 비교적 예비되어 있다 (Ferrante et al., Science 230:561-563, 1985; Reiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5733-5737, 1988). 그러나, HD 의 더 진보적인 단계에서, 신경원 변성은 모든 형태의 선조체 뉴런을 포함하고 기초 신경절, 대뇌 피질, 시상하부 및 소뇌의 다른 핵으로 전개된다.

파킨슨병 (PD)는 휴식진전, 경직, 운동개시불능 (무동증) 및 운동의 느려짐 (운동완서)를 특징으로 한다 (Marsden, Lancet 335:948-952, 1990). 운동 결핍은 도파민 작용성 흑질 경로의 진행성 변성, 및 다양한 정도로, 창백핵에 대한 도파민 작용성 신경자극의 상실 및 청반의 노르아드레날린 작용성 세포 및 봉선의 세로토닌 작용성 뉴런의 변성과 연관된다 (Javoy-Agid et al., Adv. Neurol. 40:189-198, 1984; Agid, Lancet 337:1321-1327, 1991). 흑질의 도파민 뉴런의 80 % 이하는 운동 결핍이 충분히 나타나기 전에 상실될 수 있다.

신경변성 질병의 치료에 있어서의 치료제로서 신경영양성 인자로 알려진 펩티드를 이용하기 위한 주요 방법중 하나는 변성 과정을 저지하고 남아있는 세포들의 작용을 향상시키는 것이다. 하기 실시예에서 제시된 연구들은 본 발명이 이전에 제안되었던 것 외에 신경영양성 인자의 이용을 어떻게 발전시켰는지를 설명해 줄 것이다.

II. 신경학적 결함의 치료

하기 실시예에 의해 증명되는 바와 같이, 성인 전뇌 상의하 대에서 신경 전구체들은 EGF 수용체에 결합된 폴리펩티드(예를 들어, TGFα; 본 발명에서 사용되는 용어 "폴리펩티드" 는, 길이나 번역후 변형에 상관없이, 아미노산 잔기의 임의 사슬을 의미한다)의 주입에 반응하여 자극을 받아 급격히 증가하고 한꺼번에 중추신경계(CNS) (예를 들어, 선조체)로 이동할 수 있다. 더욱이, 이는 증식 세포를 밀집한 융기로 이동하도록 유도할 수 있다. 하기 기재되는 바와 같이, 유도된 이동은 여러가지 방법들로 수행될 수 있다. 예를 들면, 표적 영역의 신경제거 (이는 신경화학 또는 기계적인 힘에 의해 달성될 수 있다), 폴리펩티드 성장인자 (예를 들어, TGFβ, 이는 피브로넥틴 및 라미닌과 같은 세포 부착 분자의 국부적인 발현을 증가시킨다)의 이용, 및 이와는 달리 이동을 저해하는 자연 발생 시그날을 저해하는 화합물을 목적하는 이동 경로를 따라 세포와 접촉시킴 (즉, 저해제를 저해함으로써 임의 미세환경을 만들어냄)에 의해 촉진된다 .

더욱이, 이동성 융기의 모양은 주입 위치를 변화시킴으로서 (예를 들어, 주입관 또는 본 발명의 활성 화합물을 함유하는 생분해성 캡슐의 위치를 변화시킴으로서) 조절될 수 있다. 유사하게, 융기내의 세포수는 활성 화합물의 투여량 (예를 들어, TGFα의 투여량), 또는 상의하 영역에서 신경 전구세포 군집에 관련하여 방출되는 거리를 변화시킴으로서 조절될 수 있다. 하기 기재된 바 (및 제 10A, 10B, 11A, 11B 및 11C 도에 예시)된 바와 같이, 동물에 중앙-선조체 또는 내측 선조체 주입시킨 경우, 그들이 주입관에 도달하기 전에 이동하는 세포가 멈추고, 이는 S-형 또는 L-형 융기를 형성한다. 따라서, 이는 세포의 이동 뿐 아니라 이동이 끝나는 곳을 조절하는 것이 가능하다. 성장 인자 (및 아마도 다른 화합물)의 투여량 및 방출 위치를 조절하는 것은 상대적으로 제한된 표적 영역에 영향을 주는 영역을 제한할 수 있다.

성숙한 포유류 뇌에서 신경 전구 세포의 증식 및 이동은 개별적으로 조절될 수 있는 별개의 일이다. 구심로차단 없이 TGFα또는 EGF 의 대뇌실내 (ICV) 또는 선조체내 주입은 증식을 유도할 수 있으나, 변성되고, 손상된 (예를 들어, 구심로차단 또는 다른 손상에 의해), 또는 이와는 달리 비정상 (즉, 기능부전인) 세포들은, 최소한 연관된 신경학적 결함으로의 회복에 강한 영향을 주기에 충분히 반응 규모로, 이동을 촉진하도록 존재해야 한다. 하기에 또한 기재되는 바와 같이, 약리학적 제제로 변성, 손상 또는 그 밖에 비정상 세포들의 촉진 효과를 흉내낼 수 있다. 예를 들어, 유도성 화합물을 투여함으로써 선조체에서 세포 부착 분자의 일시적인 발현을 자극할 수 있다. 예를 들어, 피브로넥틴은 소뇌의 성상세포의 배양액에서 성장인자 베타 (TGFβ)를 형질전환시킴으로써 강력하게 상향 조절된다 (Baghdassarian et al., Glia 7:193-202, 1993). TGFβ를 과발현하는 형질전환 쥐에서, 피브로넥틴 및 라미닌은 또한 CNS 에서 정상 수치 보다 훨씬 증가된다 (Wyss-Coray et al., Am. J. Pathol. 147:53-67, 1995). 따라서, 세포외 매트릭스 분자 또는 세포 부착 분자의 발현을 자극하는 임의 화합물이 특히 목적하는 이동 경로를 따라 이동을 유도한다는 것은 본 발명의 범주내인 것으로 간주한다.

원조세포의 이동을 일으키는 전뇌 신경간세포는 뇌실벽을 따라 적당히 잔류하는 것으로 여겨진다 (Morshead et al., Neuron 13:1071-1082, 1994). 하기 기재되는 실험에 있어서, 강력한 EGF 수용체 혼성화의 영역은 이동 융기가 선조체내로 이동한 후 측뇌실을 따라 지속된다. 또한, 신장된 세포는 융기와 측뇌실 사이에서 항상 발견된다. 따라서, 상의하 대가 없는 대량의 세포 이동임에도 불구하고, 간세포 자체는 이동하는 융기의 일부가 아니다. 상기 신경간세포는 새로운 뉴런 및 신경교의 회복할 수 있는 근원을 제공할 것이다. 그러므로, 다중 웨이브의 신경 전구세포는 자극되어 뇌의 손상된 영역, 또는 변성된 영역 또는 신경학적 결함에 기여하는 영역으로 이동될 수 있다. 이러한 세포의 존속은 또한 성인의 전뇌에서 간세포의 정상적인 기능- 현재 후각구에 대한 새로운 뉴런인 것으로 제시되고 있다 -이 치료에 의해 비가역적으로 파괴되어서는 안된다는 것을 제시한다.

TGFα(및 그의 mRNA)의 풍부한 선조체 발현 및 도파민 작용성 신경지배의 결핍은 또한 발육 초기의 선조체의 특징이다 (Weickert and Blum, Devel. Brain Res. 86:203-216, 1995; Bayer, Intl. J. Devel. Neurosci. 2:163-175, 1984). 유사하게, TGFα-주입 동물의 상의하 영역에서 EGF 수용체 mRNA 발현의 증가는 발육중인 뇌의 뇌실주위 신경상피에서 관찰되는 풍부한 EGF 수용체 mRNA 혼성화를 흉내낸다 (Seroogy et al., Neuroreport 6:105-108, 1994; Seroogy et al., Brain Res. 670:157-164, 1995). 피브로넥틴, 및 그의 수용체, 및 신경 전구체의 이동을 촉진할 수 있는 기타 세포 부착 분자를 코딩하는 메신저 RNAs 는 또한 발육적으로 조절된다 (Pesheva et al., J. Neurosci. Res. 20: 420-430, 1988; Prieto et al., J. Cell Biol. 111:685-698, 1990; Pagani et al., J. Cell Biol. 113:1223-1229, 1991; Linnemann et al., Int. J. Devel. Neutosci. 11:71-81, 1993). 따라서, 본 연구에 있어서 TGFα-주입 및 6-OHDA 손상 동물에서 관찰되는 효과를 개념화하는 한 방법은 미성숙 신경조직 발육의 선택적 발육 반복에 관한 것이다. 다시 말하면, 성숙한 포유류 뇌에서 신경간세포는 증식 신호에 반응하고, 그들의 자손은 발육중인 동물내에 있는 것과 같이 이동 신호에 반응할 수 있다.

신경간세포는 최근에 성숙한 설치류 CNS 곳곳의 상의하 (Weiss, Soc. Neurosci. Abstr. 25:101, 1995; Ray et al., Soc. Neurosci. Abstr. 22:394.5, 1996) 및 성인 전뇌의 상의하 (Kirschenbaum et al., Cerebral Cortex 4:576-589, 1994)에서 발견되었다. 본 발명에 기재된 방법에 따라서, 이러한 세포들을 조작함으로써 뇌 및 척수의 여러 영역에서 병들거나, 손상을 입거나 또는 그 밖에 손상 또는 기능부전인 CNS 뉴런에 대한 새로운 뉴런의 근원을 제공할 수 있다.

A. 본 발명의 장점

하기에 또한 기재되는 바와 같이, 신경학적 결함을 치료하기 위해 제안된 방법들중 하나로는 이러한 결핍을 가지고 있는 환자로부터 신경 전구체를 제거하고 상기 세포를 배양액중에 성장시켜 많은 수의 신경 원조세포를 생성하도록 하는 것이 있다. 이러한 세포를 이어서 당 분야의 숙련자에게 공지된 방법들을 이용하여 동일한 환자에게 재이식시킬 수 있다(예를 들어, Stein et al., In: Brain Repair, pp. 87-103, Oxford University Press, New York, 1996, 또는 Leavitt et al., Soc. Neurosci, Abstr. 22:505, 1996 참조). 분명하게, 이러한 방법은 현재 유산된 태아로부터의 배 세포를 필요로하는 용도에 유익하며; 이는 유산된 태아를 조직 제공자로서 이용하는 요구에 의해 야기되는 윤리적인 문제들을 함께 피할 수 있다. 또한, 이식 거부에서 높은 빈도로 나타나는 면역반응을 자극하지 않기 때문에 보다 성공적일 수 있다.

생체내에서 신경 전구체의 증식 및 이동을 자극하는 것은 부가적인 장점이 있다; 생체내 자극은 침입성의 신경외과적 처리의 횟수를 가능한 어느 정도 감소시킨다. 간세포 절제 수술을 수행하지 않으며, 배 또는 배양된 세포 이식에 전형적으로 요구되는 이식 세포의 다중 플러그가 필요치 않게 된다. 또한, 이식 처리로 인해 미분화된 신경 원조 세포의 대량적인 격감도 없게 될 것이다. 대표적으로, 인간 태아 도파민 작용성 세포 이식에 있어서, 이식된 세포의 90 % 내지 99 % 가 그들이 숙주의 뇌에 정착되기 전에 사멸된다 (Freed et al., Soc. Neurosci. Abstr. 22:481.3, 1996).

본 발명에 의해 제공되는 또 다른 장점은 신경 원조세포를 반흔조직에 의해 숙주 뇌로부터 분리시키지 않는다는 것이다. 이식된 세포의 플러그는 글리오틱 반흔조직 및 반응성 신경성상세포의 피막내에 캡슐화된다. 밀집한 글리오틱 조직의 물리적 장벽에 더하여, 반흔조직내의 반응성 성상세포는 신경돌기의 성장을 억제하는 인자들을 방출한다 (McKeon et al., 1995). 생체내에서 생성되는 신경 원조세포는 반흔조직에 의해 나머지 뇌로부터 분리되지 않는다. 그러므로, 그들의 신경돌기의 성장은 반응성 성상세포의 대량적인 증식에 의해 억제되지 않는다. 그러므로, 본 발명에 의해 유도된 이동은 손상되지 않은 영역을 침범하지 않고 많은 수의 새로운 세포로 CNS 의 특정 손상 부위를 선별적으로 재군집화 (다양한 정도로)시킬 수 있다.

본 발명에 제시된 기술들은 또한 생체내 자극된 전뇌 신경간세포의 단일 선행 연구에 대한 진전을 나타낸다. 선행된 연구에서는, 성숙한 쥐에 6 일간 EGF 를 ICV 주입시키고 주입후 6 주 까지 지켜보았다 (Craig et al., J. Neurosci. 16:2649-2658, 1996). 본 연구에서는, TGFα를 14 일간 주입하고 주입이 끝난 다음 3 개월 동안 지켜봤다. 이러한 차이점은 본 연구에서만 뇌실주위 확장의 세포들이 겹쳐진 선조체 내로 한꺼번에 이동한다는 점에서 중요하다. 신경 원조세포의 선별된 표적 부위로의 유도된 대량 이동은 변성된 뇌부위에 새로운 신경들로 재군집화시키는 매우 바람직한 방법인 것이다.

최근 가장 주목받는 분야는 신경간세포 분화의 조작이다. 일단 분화된 세포의 최종 위치 및 신경화학적 표현형 모두가 일차적으로 중요하고 이는 하기에서 더욱 논의된다.

신경 전구세포를 성숙한 설치류 뇌로부터 제거하여 생체외 분화시키는 경우, 신경성상세포, 희돌기교세포 및 뉴런으로서 면역화학적으로 확인된 세포가 나타난다 (Reynolds and Weiss, Science 255:1707-1710, 1992; Reynolds et al., J. Neurosci. 12:4565-4574, 1992; Lois and Alvarez-Buylla, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2074-2077, 1993). 뉴런으로 확인된 많은 세포들 또한, 선조체에서 보통 발견되는 2 가지 세포 타입에 대한 신경화학적 마커인, GABA 및 물질 P 에 면역반응성이 있다. 성인 뇌로부터 외식된 전구체 세포도 또한 신경원 마커를 발현하고 뉴런과 연관된 전기생리학적 성질을 나타낸다 (Kirschenbaum et al., Cerebral Cortex 4:576-589, 1994).

이러한 실험들은 선조체 융기의 세포들이 자발적으로 생체내 분화되는 경우, 그중 많은 세포들은 선조체 뉴런의 전형적인 표현형을 가진 세포가 될 것이라는 것을 제안한다. 최근 일부 데이타는 그들의 표현형이 상이하게 조합된 신경영양에 노출되어 변화될 수 있다는 것을 제안한다 (Lachyankar et al., Soc. Neurosci. Abstr. 22:394.7, 1996). 상이하게 처리된 원조세포들은 일단 분화되면, 아세틸콜린에스테라제; GABA, 티로신 히드록실라제 (TH), 및 칼빈딘을 포함하여, 상이한 신경화학적 면역마커들을 발현한다. TH 의 발현은, 복합된 증식, 이동 및 도파민 세포로의 유도 분화는 파킨슨병(PD)에서 상실된 선조체 도파민을 대신하는 새로운 방법을 제공할 수 있기 때문에, 특히 주목되고 있다.

PD 환자에서, 기능적으로 상당한 수의 새로운 도파민-생성 선조체 세포는 유산된 태아 중뇌 조직의 이식과 유사한 방법으로 운동성 결핍의 전도를 돕는다. 헌팅톤병(HD) 환자에서는, 새로운 중간의 가시가 있는 GABA 작용성 뉴런 및 질병으로 인해 상실된 기타 뉴런을 가진 선조체를 재군집화하도록 신경 전구체가 자극될 것이다. 상이한 계열의 연구로부터 최근의 증거는 선조체담창구 경로 자체의 재구축이 가능할 수 있다는 것을 제시한다. 선조체로 이식된 조건부 불멸화된 신경 원조세포는 분화하여 선조체로부터 창백핵으로 돌기를 전달한다 (Lundberg et al., 1996).

B. 치료될 수 있는 신경학적 결함

본 발명은 다능성 전구체 세포가 자극받아 분할되어 뇌를 통해 이동한다는 발견에 근거하고 있기 때문에, 매우 다양한 질병, 장애 및 손상에 의해 유발되는 신경학적 결함의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 손상들로는 하기를 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다 (또 다른 당업자는 하기 나열되는 질병 및 장애를 다르게 분류할 수 있으나, 분류되어도 그에 관련된 신경학적 결함은 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있다).

1. 변성 질환

본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 변성 질환으로는 알츠하이머병 (AD), 파킨슨병 (PD), 헌팅톤병 (HD), 피크병, 진행성핵상마비 (PSP), 선조체흑질 변성, 피질-기저 변성, 소아 분해성 장애, 올리브교소뇌위축 (OPCA; 유전형 포함), 라이병, 영아 괴사성뇌증, 헌터병, 점다당질증, 각종 백질이영양증(예컨대 크라베병, 펠리체우스-메르츠바허병 등), 흑내장(가족성)백치, 쿠프스병, 쉬피엘마이머-보그트병, 테이-삭스병, 바텐병, 얀스키-비엘쇼브스키병, 레이병, 뇌성운동실조증, 만성알콜중독, 각기, 할러보르덴-쉬파츠 증후군, 소뇌 변성 등이 포함된다.

2. 중추 신경계에 대한 외상 및 신경독 손상

본 발명의 방법에 따라 치료되어질 수 있는 외상 및 신경독 손상은, 총상, 강한 힘에 따른 손상, 침투에 의한 손상 (예로써, 자상), 외과 시술 중의 손상 (예로써, CNS로부터의 농양 또는 암의 제거, 또는 간질의 치료), 중독 (예로써, MPTP 또는 일산화탄소), 셰이큰-베이비 증후군 (shaken-baby syndrome), 약물에 대한 역반응 (특이 체질 반응 포함), 약물 과다투여 (예로써, 암페타민), 외상-이후의 뇌질환 (encephalopathy) 등을 포함한다.

3. 국소 빈혈

신경계에 대한 어떠한 혈류 또는 산소 공급의 교란 모두, 뉴런 및 신경교 세포를 포함하는 세포들을 사멸 또는 손상할 수 있다. 이러한 손상은 본 발명에 따른 방법으로 치료가능하며, 전체적인 졸중 (심장 마비, 심부전, 또는 심근경색으로 인한 것) 또는 국소적인 졸중 (혈전, 색전, 출혈 또는 기타 동맥 막힘으로 인한 것)를 포함하는 졸중, 산소결핍증, 과산소증, 부분 익사, 간대성근경련 (myoclonus), 심한 연기 흡입, 이긴장증 (dystonias; 유전성 이긴장증 포함), 후천성 수두증 (hydrocephalus) 등에 의한 손상을 포함한다.

4. 발육 질환

본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 발육 질환은 정신분열증, 심한 정신 지체의 특정 형태, 대뇌 마비 (감염, 산소결핍증, 조산, 비상용적인 혈액형 등에 의해 야기되거나, 시력손실, 난청, 지체, 운동 능력 결함으로 표현되는 것), 선천적인 수두증, CNS에 영향을 주는 대사질환, 심한 자폐증, 다운 증후군, LHRH/시상하부 질환, 이분척추 (spina bifida) 등을 포함한다.

5. 시력에 영향을 끼치는 질환

시력에 영향을 끼치는 질환, 특히, 망막 세포의 손실 또는 이상에 의해 야기되는 질환도 본 발명의 방법에 의해 치료 가능하다. 이러한 질환은, 당뇨병성 망막 장애, 심한 망막 분리, 녹내장과 연관된 망막 손상, 망막에 대한 외상, 망막 혈관 폐색, 황반 변성, 유전성 망막 이영양증 (dystrophy), 시신경 위축, 및 기타 망막 변성 질환을 포함한다.

6. 척수의 손상 및 질환

척수에 영향을 미치는 손상 또는 질환 또한 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있다. 이러한 손상 또는 질환은, 소아마비-이후 증후군, 근위축성 외측 경화증, 비특정 척수 변성, 척수 세포를 분쇄, 부분 절단, 완전 절단하거나 그 기능에 부작용을 일으키는 임의의 손상을 포함하는 외상성 손상 (예컨대 자동차 또는 운동 사고에 의한 손상), 척수 수술에 의한 손상 (예로써, 암 제거), 전각 세포 질환, 마비성 질환 등을 포함한다.

7. 탈수질 또는 자가면역 질환

탈수질 또는 자가 면역 반응에 의한 신경학적 결함을 본 발명의 방법에 의해 치료할 수 있다. 이러한 결함은 다중 경화증, 가능하게는 루퍼스 등에 의해 야기될 수 있다.

8. 감염 또는 염증성 질환

감염 또는 염증성 질환에 의해 야기된 신경학적 결함이 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있다. 치료 가능한 결함을 초래할 수 있는 감염 또는 염증성 질환은, 크루즈펠트-제이컵 질환 (Creutzfeldt-Jacob) 및 기타 느린 바이러스 감염 질환, AIDS 뇌질환, 뇌염-이후의 파킨슨이즘 (Parkinsonism), 바이러스성 뇌염, 박테리아성 뇌막염 및 기타 생물에 의한 뇌막염, 두개골 내 정맥성 비강의 정맥염 및 혈전정맥염, 매독성 파킨슨이즘, CNS 결핵 등을 포함한다.

9. 기타

당업자는, 원인에 관계없이 신경학적 결함을 또한 인식할 수 있으며, 이러한 결함이 있는 환자를 치료하는데 본 발명의 방법을 이용할 수 있다. 본 명세서에서 기술한 방법에 의해 치료 가능한 상기의 상태이외에도, 신경학적 결함은 레시-나이한 증후군 (Lesch-Nyhan syndrome), 미야쎄니아 그래비스 (myathenia gravis), 각종 치매, 수많은 병원충성 질환, 간질 등에 의해 야기될 수 있다. 본 발명의 방법은, 이들 및 다른 질환, 장애, 손상에 의한 신경학적 결함을 경감시키는데 쉽게 사용될 수 있다.

C. EGF 수용체에 결합하는 폴리펩티드

1. EGF 군

EGF 군의 폴리펩티드는, 어느 면에서는 상호 연관되어 있지 않다. TGFα 및 EGF는 단지 30%의 구조 유사성을 가진다 (Marquardt et al., Science 223: 1079-1082, 1984). 그러나, 이들은 M_r180,000 EGF 막 수용체에 대해 유사한 결합 동력학을 보이고 이 수용체의 타이로신-특이적 인산화를 촉진한다 (Cohen et al., J. Biol. Chem. 255; 4834-4842, 1980; Reynolds et al., Nature 292: 259-262, 1981). 이들 두 성장 인자들의 기능적인 동등성은, 컨센서스(consensus) 서열 (CX₇CX_4.5CX₁₀CXCX₈C)내의 "C"로 표현되는 6개 시스테인 기의 상대적 위치가 동일하다는 점에 부분적으로 기인한다. 이들 보존기는, 유사한 이황화 결합-매개 구조적 제어를 갖게되며, 따라서 연관된 삼차원 구조를 내포하게된다 (Twardzik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5300-5304, 1985). 당업자는, 주어진 아미노산 서열을 EGF-군 컨센서스 서열과 비교함으로써, 폴리펩티드가 EGF와 기능적으로 동등한지의 여부를 결정할 수 있다 (만약 동등하다면, 본 발명의 실시에 유용함) (EGF, TGFα및 종두증 바이러스의 19kDa 초기 단백질의 서열 내의 시스테인 및 글라이신기의 유사 패턴을 밝힌 컴퓨터 조사의 설명을 위해서는, 일례로 Blomquist et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7363-7367, 1984 참조).

EGF, TGFα, 종두증 성장 인자 (VGF) 외에도, EGF 군은, 암피레귤린 (AR), 베타셀룰린 (BTC), 에피레귤린 (ER), 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자 (HB-EGF), 슈완노마-유래 성장인자 (SDGF), HUS 19878, 점액종바이러스 성장인자, 쇼프 섬유종 바이러스 성장 인자, 기형암종-유래 성장 인자-1 [TDGF-1; Cripto-1 (CR-1)으로 또한 알려짐)]을 포함한다.

2. EGF 수용체 결합 측정법

당업자는, 임의의 주어진 폴리펩티드의 EGF 수용체에 대한 결합 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 여기에서 사용된 "결합"은, 폴리펩티드와 EGF 수용체간의 특이한 상호작용으로서, 생물학적 반응, 바람직하게는 신경학적 결함을 경감하는데 기여하는 반응을 유도하기에 충분한 신호 전달을 도모하는 것을 가리킨다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 유용한 임의의 주어진 폴리펩티드는, EGF 자체 결합도의 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 90% 이상의 결합도로 EGF 수용체와 결합할 것이다(EGF 수용체 결합에 관한 VGF, TGFα, 및 EGF의 생물학적 활성 비교; Twardzik et al., supra).

만약 EGF 결합 검증 (binding assay) 실시를 위해 지침이 필요하다면, 당업자는 적절한 방법을 기재한 다수의 출판물을 참조할 수 있다 (이러한 주제의 하기 5 개 출판물은, 그 전체를 여기에서 참고로 도입한다). 일례로, Cohen 및 Carpenter (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 1317-1321, 1975), 또는 이의 변형으로는 상기의 Twardzik 등을 참조할 수 있다. 유사하게, 특이 결합, 서열 정보를 포함하여, EGF 수용체, 신호화 및 수용체 토폴로지의 재검토를 위해서는, 일례로, McInnes 및 Sykes (Biopolymers 43; 339-366, 1997), Boonstra et al (Cell Biol. Intl. 19: 413-430, 1995), 또는 Gill (Mol.Reprod.Dev. 27: 46-53, 1990)을 참조할 수 있다.

D. 유도된 이동

또한 하기의 실시예들은, 신경 전구세포의, 특히 성숙한 설치류 전뇌에서의 성공적인 유도된 이동에 관한 증거를 제공한다. 하기 실시예에 사용된 면역조직화학적 및 기타 방법 (및 거기에 자세히 설명된 것), 및 기타 당업자에 의해 일반적으로 실시되는 상응 기술을, 성장 인자 주입 및 세포 이동을 조절하기 위해 가해진 기타 자극의 효과를 확인하는데 사용할 수 있다. 실제로, 세포 이동을 어느 정도 자세히 추적할 수 있다 (즉, 세포 개수, 세포 크기, 형태, 및 신경계 내의 위치를 측정할 수 있다).

다양한 자극을 생체 내에서 세포에 가하여 세포가 한꺼번에[en masse: "한꺼번에"라는 용어는, 본 명세서에서 세포의 이동을 기술하기 위해 사용되는데, 상당한 시간 동안 실질적으로 동일한 방향으로 이동함으로써 덩어리로 보이는 세포 군집의 이동을 가리킨다(예로써, 도 9, 10, 및 11에서 명백한 바와 같음)] 이동하도록 할 수 있다. 넓게는, 하기 두 가지 중 하나의 방법으로 이동을 유도할 수 있다: (1) 조절 방식, 즉, 이동 세포를 적극적으로 당기는 자극을 가하는 것 [주화인자, 신경영양성 인자, 또는 세포 부착 분자 또는 세포외 매트릭스 분자 (예로써, 피브로넥틴, 라미닌, 또는 신경 세포 부착 분자)의 발현을 증가시키는 화합물 (예로써 TGFβ)], 또는 (2) 허용 방식, 즉 이동하는 세포를 저해하는 신호를 저해하는 자극을 가하는 것.

이동을 유도하는 자극은 표적 부위 내 조직의 파열을 포함한다 (이러한 부위는, 세포가 손상된 부위, 예로써, 도파민작용성 세포가 각종 쇠약성 신경변성 질환과 연관되어 손실되는, 선조체 또는 흑질: 예를 들어, 혈전 또는 색전에 의한 빈혈 증상에 수반되어 뉴런 및 신경교가 손상되는 대뇌 피질; 또는 예를 들어, 외상에 의해 운동 뉴런이 손실된 척수이거나; 또는 발육 장애에 의해 세포가 비정상적인 연결을 만드는 임의의 부위일 수 있다). 이와 다르게는, 신경 원조세포의 근원으로부터 이들의 이동의 원하는 종점까지 확장된 경로를 따라서 또는 이 경로 내에서 조직을 파열시킬 수 있다.

조직은, 물리력 (예로써, 신경의 절제 또는 절단, 또는 신경원 세포체에서 뻗어나간 하나 이상 돌기의 차단) 또는, 독 또는 신경독과 같은 화학 물질 (예로써, ricin 또는 6-OHDA), 부식성 화합물 (예로써, 산성 또는 염기성 용액), 세포사멸 유도 화합물 (예로써, Leavitt et al., Soc. Neurosci. Abstr. 22: 505, 1996), 탈수질 화합물 (예로써, Lachapelle et al., Soc. Neurosci. Abstr. 23: 1689, 1997), 또는 세포의 활성을 저해할 수 있는 화합물, 예로써, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (세포의 주요 신경전달물질을 코딩하는 유전자의 전사를 억제하는 올리고뉴클레오타이드와 같은 것), 항체, 또는 폴리펩티드와 같이, 세포 활성을 저해할 수 있는 화합물을 가함으로써 파열시킬 수 있다. 이러한 다수 화합물은 당업자에게 공지되어 있고, 글루타메이트와 보통 결합하는 대사영양 수용체와 같은 세포 표면의 수용체에 결합은 하되, 활성화시키지는 못하는 화합물을 포함한다. 예로써 하기의 연구에서는, 세포 이동에 대한 6-OHDA (TGFα와의 동시 주입)의 도파민 탈신경화 효과가 자명하다.

당업자는 특히, 예로써 자기 공명 영상화 또는 계산된 단층촬영상 스캔으로 현재 생성 가능한, 환자의 뇌 및 척수의 매우 명료하고 정확한 영상이 주어졌을 때, 신경계의 목적 부위에 상기 임의의 화학물질을 적용함으로써, 세포 이동을 잘 유도할 수 있다.

또한 하기의 연구로부터, 이동을 유도하는 화합물의 적용과 관련된 하나 이상의 변수 (적용의 성질, 위치, 농도, 및 기간을 포함하는 변수)를 변화를, 보다 정확하게 세포가 따르는 이동 경로를 유도하고 이들이 정지하는 장소를 찾아내도록 변화시킬 수 있다는 것이 명백하다.

E. 분화 인자

일부 신경 전구 세포가 자발적으로 분화함에 반하여, 시간이 충분한 경우, 분화의 발생 시간 및 장소를 제어함으로써 상당히 훌륭한 이익을 도모할 수 있다; 이러한 제어를 실시함으로써, CNS의 필요한 부분에 신경 "군집" (신경학적 결함을 경감시킬 수 있는 한, 이는 부분적이거나 또는 완전한 것일 수 있다)를 도모할 수 있다. 따라서, EGF 수용체에 결합하는 폴리펩티드와 신경 원조 세포를 접촉시키기 이전, 접촉시키는 동안, 또는 이후에 다양한 자극을 가할 수 있다.

광범위하게, 분화 촉진 자극은 "일반적" 또는 "유도된" 것일 수 있다. 일반적 분화 자극은, 자연 상태처럼 세포가 분화하는 것을 자극하고, 세포를 자극하여 자연 표현형을 발현하도록 함으로써 신경학적 결함이 경감될 수 있는 경우에 적용되는 것이다. 일례로, 일반적인 분화 자극에 노출될 때, 선조체 상의하대의 세포가 GABA작용성 뉴련으로 분화된다는 것은 당업계에 공지되어있다. 따라서, 일반적 분화 인자를 가하여 이들 세포를 자극하는 것은, 헌팅턴병 (이들 환자에 있어서는, GABA작용성 중간의 가시가 있는 척추 신경이 선택적으로 손실되어 있다)과 연관된 신경학적 결함을 경감시킬 수 있다.

당업자는, 본 발명의 세포 이동과 증식의 분화를 자극하기 위한 일반적 분화 자극의 공지 방법을 잘 적용할 수 있다. 일례로, 세포를 망막아세포종 단백질과 접촉시키면, 분화의 요건인 세포 주기에서 세포가 벗어나게 되고 (최근의 연구로, Slack et al., J. Cell Biol. 140: 1497-1509, 1998), 세포 주기 연관 키나아제 저해제인 p21과 세포를 접촉시키면, 세포를 후-핵분열 (즉, 분화된) 단계로 유지시킨다 (Berger et al., Soc. Neurosci. Abstr. 22: 505, 1996). 본 방법의 의미 내에서, 분화를 자극하기 위해 적용될 수 있는 다른 자극은, 사이클린 D 세포 주기 조절제이다 (Ouaghi et al., Soc. Neurosci. Abstr. 22: 1706, 1996). 올리고덴드로사이트 전구체의 분화를 자극하고자 한다면, 인테그린을 적용할 수 있다 (예로써, Buttery et al., Soc. Neurosci. Abstr. 22: 1723, 1996 참조). 뇌-유도된 신경영양성 인자 (BDNF) 및 레틴산 (RA)은 세포 분화를 자극하는 것으로 공지되어있다 (예로써, Ahmed et al., J. Neurosci. 15: 5765-5778, 1995 참조).

이동 유도 전에 신경 전구 세포를 배양시키는 경우, 이들 세포의 분화에 영향을 미칠 수 있는 뇌 영역에 세포를 이식할 수 있다. 일례로, 보다 측면 부위에 놓여진 세포 (단지 0-8%의 세포만이 분화)보다, 뇌실하의 영역 근처에 놓여졌을 때 (높게는 35% 까지), 이식된 신경 전구 세포가 더 높은 퍼센트로 신경으로 분화하였다 (Catapano and Macklis, Soc. Neurosci. Abstr. 23: 345, 1997). 이와 유사하게, 이식된 소뇌 전구체는 해마에 이식될 때, 해마 뉴런을 위한 표식을 발현한다 (Vicario-Abejon et al., J. Neurosci. 15: 6351-6363, 1995). 따라서 당업자는, 증식 신경 원조 세포의 자손을 이들의 분화를 자극하는 화합물과 접촉시키는 것 대신, 세포 분화를 유도할 수 있는 뇌 영역 또는 그 가까운 부근에 세포를 이식함으로써 본 발명을 실행할 수 있음을 알 수 있다.

유도된 분화 자극은 세포가 분화되도록 자극하는 것이나, 표현형이 다른 것은 자연히 발현하게 된다. 유도된 분화 인자는, 비천연 표현형을 발현하기 위해 세포를 자극하여 신경학적 결함을 경감시킬 수 있는 어느 경우에나 적용될 수 있다. 일례로는, 파킨슨 병이 있는데, 여기서 흑질에서의 도파민작용성 신경지배의 손실을, 선조체 세포의 도파민 형성 세포로의 분화가 대치할 수 있는 경우이다. 이와 유사하게, 세포가 선택적으로 손실되는 알쯔하이머 병에서, 중격 영역; 근위축성측색경화증 및 수반되는 외상성 척추 손상에서 손실되는 척추 운동 신경; 다중 경화증과 같은 탈수질 이상에서 손실되는 올리고덴드로사이트 내의 콜린 형질의 발현을 자극시킬 수 있다.

신경교 세포주 기원의 GDNF/뉴르튜린 (TGFβ) 군의 인자는, 신경세포에서의 분화를 유도할 수 있고 (RA에 의해 보다 더 유도됨) (Hishiki et al., Cancer Res. 58: 2158-2165), GDNF는 래트 복측 중뇌 배양에서 운동 뉴런 분화를 촉진한다. BDNF 및 섬모 신경영양성 인자 (CNTF) 또한 운동 뉴런 분화를 촉진한다 (이들의 효과는 GDNF의 효과에 대해 가산적이거나, 상승효과적이다) (Zurn et al., J. Neurosci. Res. 44: 133-141, 1996). 또한, 운동 뉴런 분화는 신경관의 복측 지역에 발현되는 비트로넥틴의 적용(Martinez-Morales et al., Development 124: 5239-5247), 및 소닉 헤지혹 (sonic hedgehog)에 의해 코딩되는 단백질 (Tanabe et al., Curr. Biol. 5: 651-658, 1995)에 의해 유도될 수 있다. 소닉 헤지혹 군의 일원인 인디언 헤지혹은 발육중 및 성숙한 망막에서 발현되며, 망막 원조세포의 증식 및 광수용체 발육을 촉진한다 (Levine et al., J. Neurosci. 17: 6277-6288, 1997).

피질성 신경 원조세포는, EGF, TGFα 및 성장되어지는 기질의 유형에 영향을 받는, 지역-특이적인 표현형을 나타낸다. EGF 또는 TGFα는, 성장 인자-결핍 매트리젤™ (Matrigel™) 또는 콜라겐 타입 IV 상에서 배양될 때 비-사지성 (non-limbic) 지역 전구체에서 유도된 사지 뉴런의 백분율을 2배로 증가시킨다 (Ferri et al., Development 121: 1151-1160, 1995).

인슐린은 IGF-1 이상으로, 미성숙 신경 세포 배양의 분화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Abboud et al., Soc. Neurosci. Abstr. 23: 1425, 1997). 기본 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) 및 뉴로트로핀을, 해마 세포의 분화 유도를 위해 사용할 수 있다 (Vicario-Abejon et al., Neuron 15: 105-114, 1995).

하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은, 변성 질환으로 손실된 신경 경로를 복구하기 위해 사용될 수 있다. 일례로, 분화된 선조체 GABA작용성 뉴런은, 선조체담창구 돌출을 이들의 분화 중 복구시킬 수 있다. 당업자는, 본 발명 방법에 의해 재구축될 수 있는 각종 신경 경로를 잘 인식할 수 있다.

F. 약학적 조성물

본 발명에서 사용하기에 적당한 폴리펩티드 (즉, EGF 수용체에 결합하거나 분화를 자극하는 것으로, 여기에서 "활성 화합물"로 언급됨)는, 투여에 적합한 약학적 조성물로 혼입 가능하다. 이러한 조성물은 하나 이상의 폴리펩티드 및 "약학적으로 허용되는 담체"를 일반적으로 포함하는데, "약학적으로 허용되는 담체"는 임의 또는 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제, 항진균제, 등장 및 흡수지연제 등, 약학적 투여와 상용가능한 것들을 포함한다. 이러한 매질 및 시약의 사용은 당업계에 공지되어있다. 활성 화합물과 비상용성인 통상적인 매질 또는 시약을 제외하고는, 조성물 내에서 이들의 사용이 고려되어진다.

당업자는 목적하는 투여 경로 (정맥내, 내피 또는 근육내 주사와 같은 비경구; 구강 투여; 또는 문제 부위에 직접 적용 등을 포함한다)에 따라 약학적 조성물을 제제화할 필요를 느끼게 된다. 본 발명이, 뇌에서 수확하여 배양한 신경 전구체에 또는 생체내의 전구세포에 직접 폴리펩티드를 적용시킴으로써 [예로써, 주사관 또는 문합(shunt)를 통한 주입, 또는 예로써 생분해성 캡슐인 담체 내의 이식에 의함] 수행된다는 것이 예측되지만, 다른 경로의 투여, 특히 비경구성 (바람직하게는 내정맥) 투여 역시 본 발명의 범주 내이다.

본 발명의 약학적 조성물 (예로써, EGF 수용체에 결합하는 폴리펩티드와 신경 전구체의 분화를 자극하는 화합물을 함유하는 조성물)에 유용한 용액 또는 현탁액은 하기를 포함한다: 물, 정상 식염수, 개질 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 기타 합성 용매와 같은 살균 희석제; 벤질 알콜, 파라벤 (예로써, 메틸 파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티머로살 등과 같은 항박테리아 또는 항진균제; 아스코르브산 또는 이황산 나트륨과 같은 항산화제; EDTA와 같은 킬레이트화제; 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트와 같은 완충제; 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같이 긴장도 (tonicity) 조절을 위한 시약. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절한다.

주사에 적합한 약학적 조성물은, 살균 수용액 (활성 화합물이 수용성일 때) 또는 분산액 및, 살균 주사용 용액 또는 분산액의 즉각 제조를 위한 살균 분말을 포함한다. 정맥내 주사를 위한 적합한 담체로는, 생리 식염수, 정균수 (bacteriostatic water), Cremophor EL™ (BASF; Parsippany, NJ) 또는 인산 완충 식염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에 있어, 조성물은 모두 살균된 것으로, 주사가 용이할 정도로의 액체이어야 한다 (적절한 유동성은, 예로써, 레시틴과 같은 코팅을 사용하거나, 분산의 경우 특정 입자 크기를 유지시키고, 계면활성제를 첨가함으로써 얻어진다). 조성물은 제조 및 보관 조건하에서 안정하여야 하며, 상기한 바와 같이, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대항하도록 보존되어야한다. 많은 경우에 있어, 일례로, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜, 당류, 염화나트륨과 같은 등장제를 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직하다. 주입 가능한 조성물의 지속적 흡수는, 예로써 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 시약을 조성물 내에 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.

살균 주사성 용액은 필요량의 활성 화합물 (예로써, EGF에 결합하는 폴리펩티드)을, 상기 성분 하나 또는 그 조합을 포함하는 적절한 용매 내로 요구되는 대로 혼입한 후, 여과 살균을 함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로 분산액은, 기본 분산 매질 및 상기한 기타 필요 성분을 함유한 살균 부형제에 활성 화합물을 혼입시켜 제조된다. 살균 주사성 용액 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은, 활성 화합물 분말 및 앞서의 살균-여과 용액의 임의의 추가적인 목적 성분을 제공하는, 진공 건조 및 동결 건조이다.

한 구현예에서 활성 화합물은, 이식물 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어된 용출 제제로, 신체로부터 급속히 제거되는 것을 방지할 수 있는 하나 이상의 담체와 함께 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생상용성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 당업자에게 공지되어있다. 물질들은, 예로써 알자 코포레이션 (Alza Corporation) 및 노바 약품 주식회사 (Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 시판되는 것을 구할 수 있다. 또한 리포좀 현탁액도 약학적으로 허용되는 담체로써 사용될 수 있다. 이들은 당업자에게 공지인 방법에 따라, 예를 들어 미국 특허 제 4,522,811 호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위로 제제하는 것이 특히 유용하다. 본 발명에서 사용되는 투여량 단위는, 치료 대상에 대한 단위 투여량으로써 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미한다; 각 단위는 목적하는 치료 효과를 도모하기 위해 계산된 선결된 량의 활성 화합물과, 목적하는 약학 담체를 포함한다. 본 발명 투여량 단위의 구체 사항은 활성 화합물의 고유 특성, 달성하고자하는 특별한 치료효과, 및 개인 치료를 위한 활성 화합물과 같은 조제의 고유한 제한에 의해 조절되며 또한 직접적으로 의존한다.

EGF 수용체에 결합하거나 세포 분화를 자극하는 폴리펩티드의 직접적인 적용 대신, 이들 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 벡터에 삽입하여 유전자 치료 벡터로 사용할 수 있다. 유전자 치료 벡터는, 일례로, 정맥내 주사, 국소 투여 (미국 특허 5,328,470) 또는 입체공간적 주사 (일례로, Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057, 1994 참조)에 의해 환자에 전달될 수 있다. 유전자 치료 벡터의 약학적 제제는, 허용 가능한 희석제 내의 유전자 치료 벡터를 포함하거나, 유전자 전달 부형제가 예를 들어 뇌 또는 척수 내에 함침되는 서방성 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 유전자 전달 벡터가 재조합 세포, 예로써 레트로바이러스 벡터로부터 완벽하게 생산될 수 있는 경우, 약학적 제제는 유전자 전달 시스템을 생성할 수 있는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.

약학적 조성물은, 투여 설명서와 함께 용기, 팩, 또는 디스펜서 내에 포함될 수 있다.

G. 치료 계획

실시예로서 [당업자는 하나의 모델 (생체 내 또는 생체 외 모델)에서 다른 모델로, 인간 환자의 최적 투여량을 위해 진행, 확장해 나갈 수 있다] 설치류 뇌에서, 신경 전구 세포의 증식을 자극하기 위한 주입을 최소한 2주 동안 지속하였다. 결과는, 인접 뇌실을 따라 미분화 원조 세포의 개수가 현격히 증가한 것이었다. 또한 하기 실시예에서 가해진 지속적인 TGFα 주입도 방사형 세포 이동을 입증하지만, 그 자체만으로는 특정 동물에서 관측되는 방사형 이동을 자극하기에 충분치 않다. 여기에서 기술한 방법에 따라 실시하는 임의의 치료의 기간은, 목적하는 결과에 따라 가변이다. 일례로, 하기의 실시예에서, 세포는 뇌실로부터의 거대한 이동 1 주일 이상 이전에 그 개수가 매우 증가한다. 또한, 신경화학적 또는 기계적으로 목표 지역을 탈신경화함에 의해 지연된 이동을 촉진할 수 있고, 이러한 이동은 방사형 이동을 뒷받침한다고 알려진 세포 부착 분자의 지역적인 발현을 증가시키는 다른 신경영양성 인자인 TGFβ와 같은 인자의 동시 주입에 의해 약학적으로 촉진될 수 있다 (상기). 이동 패턴과 이동 세포 융기의 최종 위치는 주입의 위치를 변화시킴으로써 제어할 수 있다.

당업자는 본 발명의 내용 중에서 투여되는 화합물의 목적 투여량을 쉽게 결정할 수 있다. 투여량은 바람직하게, 주입되거나 또는 시간-방출성 부형체에서 유출되거나, 활성 화합물 또는 성분 (일례로, TGFα 또는 상기 인자 중의 하나) 1 내지 100ng/kg/일 의 범위이다; 보다 바람직하게는, 1 내지 50 ng/kg/일; 가장 바람직하게는, 1 내지 10 ng/kg/일을 투여한다.

실시예 1: 발육중 또는 성숙한 정상 흑질선조체 계에서의 TGFα및 EGF 수용체 mRNA의 발현

상세한 설명에서 재검토되었듯이, EGF-군 신경영양성 인자를 코딩하는 mRNA들은 흑질선조체 계에서 발육적으로 조절된다. 하기에 설명되는 연구에서, TGFα및 EGF 수용체 mRNA의 발현을 정상적인 발육중 또는 성숙한 설치류 계에서 시험하였다.

A. 동물 및 조직 제조

시몬센(Simonsen: Gilroy, CA)로부터 성숙한 수컷 및 시간이 정해진 임신한 암컷 스프라그-돌리Sprague-Dawley) 래트(250-350 g)을 구입하였다. 이 실험 및 본 명세서에서 설명되는 모든 다른 실험을 위해, 동물들은 온도 및 습도가 조절되는 사육장 내에서 유지시켰다. 사용되는 모든 실험적 과정용 동물의 사용은 국립 위생 연구소의 지침에 따라 "University of California, Irvine, Animal Reaserch Committee"에 의해 허가되었다.

신생(P0), 출생 후 1 일(P1), 및 P4 동물들을 저체온법으로 마취시키고, 단두로 희생시켰다. P10, P21, 및 성숙한 동물을 단두로 희생시키고, -20 ℃에서 이소펜탄 내에서 냉동시키고, -70 ℃에서 보관하였다. 관상 저온장치 절편을 20 ㎛로 절단하고, 정렬된 앞면 대 뒷면 열인 Vectabond™(Vector Labs, Inc) 코팅된 슬라이드에 해동-접착시켰다. 절편을 0.1 M 완충액 내 4 % 파라포름알데히드로 1 시간동안 후고정시키고, 인산염 완충액으로 헹구고 공기건조시켰다. 절편을 건조제와 함께 -20 ℃에서 처리할 때까지 보관하였다.

B. 혼성화 탐침

TGFαmRNA 탐침을 랫트 TGFα의 5′ 말단으로부터의 550 뉴클레오티드 XbaI/BamHI cDNA 단편으로부터 생성시키고, pGEM 7Zf(Promega, Inc.)으로 서브클로닝하였다. 안티센스 및 센스 탐침을 각각 SP6 및 T7 중합효소로 전사하였다. 래트 EGF 수용체 mRNA 탐침을 pGEM 7Zf 내에서, 유전자의 5′ 말단으로부터의 718 염기쌍 BamHI/SphI 삽입물로부터 제조하였다. pGEM 7Zf내로 서브클로닝된 1.2 kb BamHI/EcoRI 단편을 사용하여 래트 TH용 탐침을 만들었다. EGF 수용체 및 TH용 안티센스 서브클론을 T7 중합효소로 전사하였다. EGF 수용체 및 TH용 서브클론을 SP6 중합효소로 전사하였다. [³⁵S]UPT (NEN REsearch Products, Inc.)의 존재 하에 전사하여, 모든 탐침들을 방사능표식하였다.

C. 원위치 혼성화 및 분석

발육중인 뇌를 0.0001 % 프로테이나아제 K 용액 및 0.05 M EDTA로 처리한 것 이외에는 시몬스 등(Simmons et al., J. Histotech. 12: 1169-181, 1989))이 설명한 방법에 따라 원위치 핵산 혼성화를 수행하였다. 절편을 10⁷cpm/㎖의 농도에서 센스 또는 안티센스 탐침과 65 ℃에서 하룻밤동안 혼성화시켰다. 동일한 동물로부터의 인접한 절편을 각 탐침에 혼성화시켜서 해부학적인 분포를 직접적인 비교할 수 있었다.

발육중 및 성숙한 동물로부터의 슬라이드를 함께 분류하고¹⁴C-표식된 뇌 페이스트스탠다드로 방사선 사진 베타맥스 하이퍼필름(Amersham, Inc.)에 6 내지 7일동안 병치하였다. 방사선 사진 필름의 성공적인 현상 후에, 슬라이드를 코닥 NTB-2 에멀션에 담그고 4 주동안 노출시켰다. 방사선사진 시트 필름 및 NTB-2 에멀션을 D-19 현상액 및 래피드 픽스(Rafid Fix: Kodak, Inc)로 현상하였다. 이어서, 뇌 절편을 티오닌으로 대조염색하고, 커버슬립을 덮었다. 침지염색된 절편을 반정량적으로 시험하고 명암 시야 현미경하에서 사진찍었다.

흑질선조체 계 내에서의 TGFα및 EGF 수용체 mRNA의 발현을 초기 출생후 발육부터 성숙했을 때까지 선택된 시점동안 추적하였다. TGFα mRNA 혼성화는 초기 출생후 선조체에서는 풍부하게 발견되었으나, 성숙체 수준에 근접할수록 P21에 의해 서서히 감소되었다. 뇌량에서의 발현량은 출생후 발육동안 선조체에서의 발현량과 견줄수 있는 수준까지 증가하였다. TGFα mRNA는 발육 중 또는 성숙한 흑질에서는 현저히 풍부하게는 검출되지 않았다.

선조체 EGF 수용체 mRNA는 출생후 발육 단계의 초기에는 최대치를 나타내었으나 P21에 의해 다시 감소되었다. EGF 수용체는 측뇌실 주위의 신경상피에 가장 많이 존재하였으나, 선조체의 본체에서도 또한 중간정도의 수준으로 발견되었다. 발육중인 복측 중뇌에 있어서, EGF 수용체 mRNA는 초기 출생후 뇌에서는 거의 검출되지 않았으나, P21에 의해 중간정도의 수준으로 서서히 증가하였다.

성숙한 동물에서 TGFα mRNA 발현량은 선조체에서는 중간정도였으며 복측 선조체 및 핵 대위체 (accumbens)에서는 적거나 중간정도였다. EGF 수용체 mRNA 혼성화는 선조체의 본체에서는 저수준으로 발견되었으며 핵 대위체에서는 고르게 분산된 고도의 작은 반점으로 발현되었다. 측뇌실에 바로 접하는 선조체 영역에서는 중간정도의 수준으로 유지되었다.

성숙체 복측 중뇌에 있어서, EGF 수용체 mRNA 혼성화는 흑질 (SN), 특히 내측부 치밀층, 및 복측 피개 구역 (VTA)의 부흑질 및 부새 (parabranchial) 핵에서 발견되었다.

이전의 연구는 TGFα 및 EGF 수용체 mRNA가 흑질선조체 계의 개체 발육 동안 강력하게 조절되며 성숙체에서의 그의 발현은 연속적인 발육 패턴을 주로 나타낸다는 것을 보여주었다 (Lazar and Blum, J. Neurosci. 12: 1688-1697, 1992; Weickert and Blum, Devel. Brain Res. 86: 203-216, 1995). 발육중 및 성숙 동물에서의 TGFα 및 EGF 수용체 mRNA 혼성화는 이러한 이전 보고서의 발견과 밀접하게 부합한다. 성숙 선조체 및 중뇌에서의 그의 발현의 지속성은 성숙 흑질선조체 계에서의 지원 역할과 일치한다.

전뇌 측뇌실을 따라 존재하는 성숙 상의하 영역에서의 중간정도의 EGF 수용체 mRNA 발현은 또한 이 영역에서의 세포의 유지 또는 기능에서의 역할을 암시한다 (Seroogy et al., Brain Res. 670: 157-164, 1995; Weickert and Blum, 1995, supra). TGFα (또는 EGF)는 EGF 반응성 세포가 생체외에서 체외배양되고 생장될 경우 이 영역으로부터의 상기 EGF 반응성 세포의 생존 및 분화를 지원하는 것으로 밝혀졌다 (Reynolds and Weiss, Science 255: 1707-1710, 1992; Reynolds et al., J. Neurosci. 12: 4565-4574, 1992). TGFα (또는 EGF)는 발육 동안 생체내에서 유사한 기능을 수행할 수 있다.

실시예 2: 6-히드록시도파민 손상 및 선조체 TGFα주입에 의한 TGFα 및 EGF 수용체 mRNA 발현의 조절

원위치 혼성화를 사용하여 흑질선조체 TGFα 또는 EGF 수용체 mRNA가 TGFα의 선조체 내 주입에 의해 변했는지를 측정하였다. 또한 주입되거나 주입되지 않은 동물에서 수용체 발현에 대한 단일측면성 6-OHDA 손상의 영향을 조사하였다.

A. 처리군

무게가 250 내지 300 그램인 성숙한 수컷 스프라그-돌리 래트를 Simonsen사 (Gilroy, CA)서 구입하여 하기 5가지의 처리군 중 하나에 할당하였다:

(1) 선조체 TGFα 주입, 흑질 6-OHDA 손상 (하기에서 "손상"이라 함); (2) TGFα주입, 손상 없음; (3) 인공 뇌척수액 (aCSF) 주입, 손상; (4) aCSF 주입, 손상 없음; (5) 주입 없음, 손상 없음.

실험군 당 4 내지 8마리의 동물을 사용하였다. 동물은 각각의 외과적 처리 후에 완전히 회복될 때까지 모니터링하고, 온도 및 습도가 조절된 사육장에서 모든 다른 시간 동안 유지하였다.

B. 6-히드록시도파민 손상

체중 1 kg 당 자일라진 8 mg 및 케타민 100 mg으로 쥐를 마취시켰다. 0.01% 아스코르브산을 포함하는 0.9% 식염수 중 4.8 mg/ml의 6-히드록시도파민 HCl (6-OHDA; Sigma Chemical Co.)의 냉각 용액을 제조 직후 주입하였다. 살균 기술을 사용하여, 대조로서 귀사이 0을 이용하여 (Paxinos and Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic Press, San Diego, 1986) 1 ㎕/분의 속도로 8 ㎕ 부피를 좌측 흑질 내로 입체공간적으로 주사하였다 (+3.7 A/P; +2.1 M/L; +2.0 D/V). 6-OHDA 손상의 결과 및 정도를 중뇌에서의 티로신 히드록실라제 (TH) mRNA의 원위치 혼성화로 모니터링하였다. TH는 도파민 합성 경로에서 속도 제한 효소이며 도파민 생성 뉴런의 통상적인 마커이다. 불완전한 손상을 갖는 1마리의 동물 (흑질 TH-IR 세포를 상당한 수로 보유함)을 동물의 총수에 포함시키지 않고 연구 대상에서 제외하였다.

C. 주입

삼투 미니펌프 (모델 2002, Alzet, Inc.)을 손상후 4 내지 5주에 이식하였다. 미니펌프에 인공 뇌척수액 (aCSF) 중 0.05 μg/ml의 TGFα 약 200 ㎕ (실험 동물의 경우), 또는 aCSF 단독 (대조 동물의 경우)을 충전하고, 이것을 이식 전 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기와 같이 마취시킨 후, 그리고 살균 조건 하에, 미니펌프에 부착된 5 mm 관 (뇌 주입 키트, Alzet, Inc.)를, 참조로 브레그마(Bregma)를 사용하여 (Paxinos and Watson, 1986, supra) 좌측 미상 피각 내에 입체공간적으로 이식하고 (+1.2 A/P; +2.7 M/L), 카르복실레이트 시멘트로 두개골에 고정시켰다 (도 1). 미니펌프 그 자체는 견갑골내 피하 영역에 두었다. 주입물은 2주에 걸쳐 0.5 ㎕/시간의 속도로 선조체 내로 직접 전달하였다.

D. 조직 제조

주입의 마지막에 동물의 두부를 제거하여 희생시켰다. 이들 동물의 뇌를 재빨리 옮겨, -20℃의 이소펜탄 중에 냉동시키고, -70℃에 보관하였다. 관상 냉각 절단부를 20 ㎛로 절단하고, 앞열에서 뒷열 순서로 배열된 벡타본드 (Vectabond™, Vector Labs, Inc.)가 코팅된 슬라이드에 해동 결합시켰다. 절단부를 0.1 M 인산염 완충액 (pH 7.4) 중 4% 파라포름알데히드로 1시간 동안 후고정시키고, 인산염 완충액으로 헹구고, 공기 건조시켰다. 절단부를 처리할 때까지 -20℃에서 건조 하에 보관하였다.

E. 혼성화 탐침

pGEM 7zf (Promega, Inc.)에 서브클로닝한 쥐 TGFα의 5' 말단으로부터의 550개의 뉴클레오티드 XbaI/BamHI cDNA 단편으로부터 TGFα mRNA 탐침을 만들었다. 안티센스 및 센스 탐침을 각각 SP6 및 T7 중합효소로 전사시켰다. 래트 EGF 수용체 mRNA 탐침을 pGEM 7Zf에 들어있는 유전자의 5' 말단으로부터의 718개의 염기쌍 BamHI/SphI 삽입물로부터 만들었다. 쥐 TH의 탐침은 pGEM 7Zf 내로 서브클로닝한 1.2 kb의 BamHI/EcoRI 단편을 사용하여 만들었다. EGF 수용체 및 TH의 안티센스 서브클론은 T7 중합효소로 전사시켰다. EGF 수용체 및 TH의 센스 서브클론은 SP6 중합효소로 전사시켰다. 모든 탐침은 [³⁵S]UTP (NEN Research Products, Inc.)의 존재하에 전사시킴으로써 방사형 동위원소로 표지하였다.

F. 원위치 혼성화

원위치 핵산 혼성화는 Simmons 등의 1989년도 상기 문헌에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 실험 동물과 대조 동물로부터의 상응하는 절단부를 10⁷cpm/ml의 농도의 센스 또는 안티센스 탐침으로 65℃에서 하룻밤동안 혼성화하였다. 동일한물로부터의 인접한 절단부를 각각의 탐침과 혼성화하여 그의 해부학적 분포를 직접 비교할 수 있었다.

실험 동물과 대조 동물의 슬라이드를 함께 분류하고,¹⁴C-표지 뇌 페이스트 표준물과 함께 방사선사진용 베타맥스 하이퍼필름™(Amersham, Inc.)에 3 내지 7일 동안 병치하였다. 방사선 사진 필름의 성공적인 현상 후, 슬라이드를 코닥 NTB-2 에멀젼에 침지시키고 4주 동안 노출시켰다. 방사선 사진 시트 필름 및 NTB-2 에멀젼은 D-19 현상액 및 Rapid Fix (Kodak, Inc.)로 현상하였다. 이어서 뇌 절편을 티오닌으로 대조염색하고 커버슬립을 덮었다.

G. 분석 및 정량

침지 염색한 절편을 명암 시야 현미경 하에서 조사하고 사진을 찍었다. 방사선사진을 MCID 시스템 (마이크로컴퓨터 화상 장치, Imaging Research, Inc.)을 사용하여 정량적으로 분석하였다. 농도계 판독치를 관심있는 각각의 해부학적 영역 내의 다수의 부위에서 샘플링하여 평균치를 구하였다. 이어서¹⁴C 뇌 페이스트 표준물로부터 만든, 컴퓨터로 생성한 3차원 다항식 표준 곡선을 사용하여 TGFα와 EGF 수용체 혼성화의 상대적인 농도를 평가하였다. 이어서 각 처리 군에서의 각 영역에 대한 평가치를 평균하고, 그의 평균 오차를 계산하였다. 실험 처리군의 동측 뇌 영역을 동일 절편의 상응하는 반대측 영역, 또는 대조 뇌의 거의 동일한 위치의 상응하는 영역과 비교하였다. 비교치의 유의성은 스튜던트 t-시험 (Student's t-test)를 사용하여 측정하였다.

H. 정상 발현 및 대조 주입

aCSF의 선조체 주입을 받는 대조 동물에서, 선조체, 선조체 상의하 영역, 및 SN에서의 TH, TGFα 및 EGF 수용체 mRNA의 발현은 정상 동물의 것과 구별할 수 없었다 (정상 발육중 및 성숙 동물의 발현에 대한 실시예 1). TH mRNA 혼성화는 SN-VTA 내내 우세하였다. TGFα mRNA는 SN에서 검출되지 않았다. 그러나 EGF 수용체 mRNA는 내측 흑질부 치밀층 (SNc), 부흑질, 부새, 및 VTA의 각간 핵에 두드러지게 존재하였다 (도 2).

TGFαmRNA 혼성화는 미상-피각 및 핵 대위체 (nucleus accumbens, NA)에서 나타났는데, NA에서 조금 덜 진하였다. EGF 수용체 혼성화는 선조체 전반에 걸쳐서는 낮은 수준이었고, NA에서는 낮은 수준의 배경에 더 큰 수준의 반점형 발현이 분산되어 있고, 측뇌실에 접하는 선조체의 증식 영역에서는 중간 정도의 수준이었다.

I. 6-OHDA 손상 효과

단일측면성 흑질 6-OHDA 손상은 동측 선조체에서의 TGFα mRNA 혼성화를 25% 감소시켰지만, 반대측 TGFα mRNA 혼성화에는 아무런 영향을 미치지 않았다 (도 5). 선조체 및 상의하 EGF 수용체 혼성화는 정상 동물과 비교하여 손상된 동물에서 변화하지 않았다 (도 6). 중뇌에서는 6-OHDA 손상에 의해 동측 SN-VTA에서의 EGF 수용체 혼성화가 일어나지 않았다.

J. TGFα주입 효과

TGFα주입물을 수여받는 비손상 동물에서는 주입된 선조체에서의 TGFα mRNA 혼성화가 반대측 선조체 또는 정상 동물로부터의 선조체와 비교하여 변화하지 않았다 (도 5). TGFα 또는 aCSF 중 어느 하나가 주입된 동물 중 몇몇 동물에서는 주입관 자국 바로 주위에 TGFαmRNA 혼성화가 약간 증가하였다. 흑질에서의 TGFαmRNA 혼성화는 상기 주입에 의해 검출가능한 수준으로 증가하지 않았다.

TGFα가 주입된 모든 동물에서 EGF 수용체 mRNA에 대한 혼성화는 동측 상의하 영역에서 극적으로 증가하였지만, 나머지 선조체에서는 그렇지 않았다 (도 6). TGFα만이 단독으로 주입된 SNc에서의 EGF 수용체 혼성화에서는 정상 동물과 다르지 않음이 관찰되었다.

K. TGFα 주입 및 6-OHDA 손상의 조합

선조체 TGFα 주입 및 그 후의 흑질 6-OHDA 손상을 받은 동물에서의 선조체 TGFα mRNA 혼성화는 손상만이 존재하는 동물에서의 혼성화와 별반 다르지 않았다 (도 5). 유사하게, TGFα 주입/6-OHDA 손상 동물의 중뇌에서의 EGF 수용체 혼성화는 손상만이 존재하는 동물에서의 혼성화와 별반 다르지 않았다.

전뇌에서의 EGF 수용체 mRNA 혼성화에 의하면, 동측 선조체에서 파격적으로 진한 혼성화 융기가 나타났으며, 또한 상의하 영역에서도 혼성화가 증가하였다 (도 4, 6 및 7). 이 융기는 TGFα 주입/손상 군에서 6마리의 쥐 중 5마리에서 발견되었지만, TGFα 주입/비손상 군에서는 6마리의 쥐 중 단지 1마리에서만 발견되었다. 주위 선조체에서의 EGF 수용체 혼성화에서는 변화가 없었다.

L. 논의

상기 결과에 의해 성숙한 설치류의 흑질선조체계에서의 TGFα 및 EGF 수용체 코딩 mRNA의 발현에 대한 흑질 6-OHDA 손상 또는 TGFα의 선조체 주입, 또는 이 둘 모두의 조절 효과의 분석이 가능해진다. 상기 결과는 각 처리 개개와 결부된 발현에서의 변화 및 두가지 처리를 동시에 행하였을 경우의 유일한 선조체 발현 패턴에서의 변화를 명확하게 증명하였다.

1. 6-OHDA 손상의 효과

6-OHDA가 손상된 중뇌는 손상 수주 후에 선조체에서의 TGFα mRNA 혼성화를 25% 감소시켰다. 상기 시스템에서 TGFα 폴리펩티드 수준이 TGFα mRAN의 발현량과 평행할 경우, TGFα mRNA의 감소는 자연발생적 인간 PD와 유사하지 않은 설치류 손상 모델의 한 측면일 수 있다: TGFα는 PD 환자의 선조체에서 크게 증가하였다 (Mogi et al., Neurosci. Lett. 180: 147-150, 1994). TGFα는 생체외에서 도파민 뉴런 기능의 척도의 수를 증가시키는 것으로 나타났다 (Alexi and Hefti, Neurosci. 55: 903-918, 1993). 따라서 TGFα (및 EGF와 기타 영양 인자)의 증가는 도파민 뉴런 및 그의 선조체 원심성의 지속적인 변성에 대한 반응을 반영할 수 있으며, 선조체 도파민 신경지배 손실에 대한 나머지 중뇌 도파민 세포의 보상 능력에 기여할 수 있다 (Mogi et al., 1994, supra). 따라서, 부분- 또는 아마도 만성-손상 모델은 인간 PD의 이러한 측면을 더 잘 나타낼 수 있을 것이다.

도파민 세포의 시간 진행에 따른 손실에서의 차이점은 또한 6-OHDA 설치류 모델과 인간 PD 사이의 명확한 불일치를 설명하는 것을 도와줄 수 있다. 쥐 모델에서, 중뇌 도파민 뉴런은 신경독소의 단일 주입에 의해 비교적 빨리 사멸된다. 인간 PD에서 중뇌 도파민 뉴런의 만성적인 진행성 변성은 여러 해에 걸쳐 일어난다. 본 연구에 의하면, 동물은 중뇌 도파민 세포가 변성된 후에 잘 희생되었다. 본 발명자들의 실험에서는 명확하지 않은 이러한 동물에서의 선조체 TGFα mRNA 발현에서의 초기 변화가 존재했을 수 있다. 래트 모델에서, 도파민 뉴런이 변성 단계에 있는 동안, 손상 후 짧은 기간에 걸쳐 어떻게 TGFα mRNA 발현이 달라지는지를 측정하는 것도 흥미로울 것이다.

미상-피각에서의 중간 정도의 TGFα mRNA 발현은 중뇌 도파민 뉴런의 표적 유래 성장 인자로서의 그의 추정 역할과 일치한다. 중뇌 신경독소 손상 후 동측 선조체에서 이것이 감소하는 잠재적인 원인은 명확하지 않다. 도파민 수용체 결합은 시상하부에서의 TGFα mRNA 발현에 영향을 주는 것으로 나타났지만 (Borgundvaag et al., Endocrinol. 130: 3453-3458, 1992), 선조체에서는 그러한 상호작용이 아직 증명되지 않았다. TGFα mRNA는 정상 성숙 설치류의 선조체 뉴런 및 신경교의 아집단에서 발현된다 (Seroogy et al., J. Neurochem. 60: 1777-1782, 1993). 선조체의 도파민 탈신경은 후시냅스 뉴런, 성상세포 또는 이 둘 모두에서의 TGFα mRNA 발현에 잠재적으로 영향을 줄 수 있다.

반대측 선조체 TGFα mRNA 발현은 6-OHDA 손상에 의해 현저하게 변경되지 않았다. 이러한 발견은 또한 도파민 탈신경에 의해 매개되는 TGFα mRNA 발현에서의 감소와 일치한다. 중선조체 도파민 수용체의 단지 몇 퍼센트만이 반대측에 존재하기 때문에 (Loughlin and Fallon, Neurosci. Lett. 32: 11-16, 1982), 상기 손상으로부터 기인하는 반대측의 조절 효과는 동측 효과와 비교하여 중요하지 않을 것이라 기대된다.

DA-탈신경 선조체에서의 EGF 수용체 mRNA 혼성화는 반대측 CP 또는 비손상 대조 선조체의 것과 현저하게 다르지 않았다. 다시 중뇌 손상 또는 주입관의 이식에 기인한, 손상 수주 후 또는 이식 2주 후에는 명백하지 않은 발현에서의 초기 변화가 존재할 수 있다. 손상된 SNc에서 EGF 수용체 mRNA 혼성화가 일어나지 않는 것은 중간 전뇌 다발의 6-OHDA 손상 후의 유사한 관찰결과를 확인해 준다 (Seroogy et al., Neuroreport 6: 105-108, 1994). 손상에 의해 유도되는 이러한 감소는 흑질 도파민 뉴런에 의한 EGF 수용체 발현의 증거로서 이미 언급되었지만 (Seroogy et al., 1994, supra), 흑질 근처 도파민 뉴런의 손상 또는 사멸에 의해 EGF 수용체 mRNA의 흑질 신경교 생성이 조절될 가능성이 존재한다. 흥미롭게도, 사후 PD 환자의 중뇌에서의 EGF 수용체 결합은 정상인과 다르지 않았다 (Villares et al., Brain Res. 628: 72-76, 1993). 따라서, 손상 후의 EGF 수용체 mRNA 발현의 손실은 설치류 손상 모델과 인간 PD에서의 다른 차이점을 나타낸다. 선조체에서의 TGFα 발현과 관련하여, 부분 손상 모델이 파킨슨증후군 인간 뇌에서 보여지는 변화를 쥐 뇌에서 더 우수하게 모방할 수 있다.

2. TGFα 주입의 효과

비손상 동물에서, TGFα 또는 aCSF의 주입은 중뇌 또는 선조체에서의 TGFα mRNA 혼성화를 정상 수준으로부터 현저하게 변경시키지 않았다. 다른 조직 또는 세포 유형에서 TGFα 발현이 자가자극된다는 보고에도 불구하고 (Coffey et al., Nature 328: 817-820, 1987; Bernard et al., J. Biol. Chem. 269: 22871-22822, 1994), 본 연구 결과는 상기 시스템에서의 그러한 활성에 대한 증거를 제공하지 않는다. 초기 연구에서의 자가자극 효과는 몇시간 단위로 만들어졌다. 본 연구에서의 뇌 조직은 2주일에 걸친 성장 인자에의 연속 노출 후에 얻어졌다. 따라서, 나중에는 진정되는 주입 시작 근처의 초기 상승조절은 분명하지 않다.

단지 손상만이 존재하는 동물에서의 TGFα 및 EGF 수용체 전사체의 경우, 실험 처리 개시 후 초기 시간 지점에서의 시간 경과에 따른 조절을 조사해 보는 것이 흥미로울 것이다. 몇몇 동물에서 주입 흔적의 바로 주위에 나타나는 TGFα mRNA의 약간의 증가가 TGFα 및 aCSF가 둘 다 주입된 선조체에서 발견되었다. 따라서, 상기 mRNA의 증가는 관 그 자체에 의해 야기된 계속된 기계적 손상 및 신경교증이 그 원인이며 주입에 기인하는 것은 아닌 것 같다.

TGFα 주입은 동측 상의하 대에서의 EGF 수용체 mRNA 혼성화를 극적으로 증가시켰지만, 나머지 선조체에서는 그러하지 못하였다. 다른 조직에 있어서, EGF 수용체 mRNA는 여러 화학적 및 기계적 수단에 의해 조절될 수 있다. EGF 펩티드는 생체외에서 다수의 포유류 세포 유형에서 EGF 수용체 mRNA를 증가시켰다 (Earp et al., J. Biol. Chem. 261: 4777-4780, 1986; Kesavan et al., Oncogene 5: 483-488, 1990). 레틴산은 정상 설치류 섬유아세포 (Thompson and Rosner, J. Biol. Chem. 264: 3240-3234, 1989), 및 형질전환 쥐 간 세포주 (Raymond et al., Cell. Growth Diff. 1: 393-399, 1990)에서 유사한 증가를 야기하였다. 시클로헥사미드 그 자체에 노출시키거나 이것과 EGF에 동시에 노출시키면, 인간의 배양 세포영양층 및 안정화된 EGF 수용체 전사체의 증가가 자극되었는데, 이것은 총 EGF 수용체 mRNA의 증가에 대한, 전사체 증강 이외의 기작을 제공하는 것이다 (Kesavan et al., 1990, supra).

쥐에서의 좌골부 신경의 횡단면에서는 엄밀한 말단에서의 EGF 수용체 mRNA의 단계적 증가가 일어났다 (Toma et al., J. Neurosci. 12: 2504-2515, 1992). 프로타민으로 처리하면 생체외에서 생쥐 및 인간 세포주에서¹²⁵I-EGF 결합 및 세포 표면 수용체 수가 증가되었다 (Lokeshwar et al., J. Biol. Chem. 264: 19318-19326, 1989). TGFα는 현존하는 상의하 세포에서 이러한 작용을 모방하여 EGF 수용체 전사체의 생성 및/또는 수명을 증가시킬 수 있다. 또한 TGFα는 뚜렷한 양의 EGF 수용체 mRNA를 정상적으로 발현하지 않는 세포에서의 전사를 자극할 수 있다. 이러한 효과 모두는 또한 당 업계의 숙련자에게 알려진 통상의 기술을 사용하여 생체내에서 용이하게 연구될 수 있다.

추가적인 가능성은 TGFα가 상의하 세포의 증식을 자극하고 EGF 수용체 mRNA의 총 수를 증가시킨다는 것이다. EGF 및 TGFα는 상의하 영역으로부터 체외배양된 "EGF 반응성" 세포에 대한 강력한 유사분열물질이다 (Reynolds and Weiss, Science 255: 1707-1710, 1992). 상의하 EGF 수용체 mRNA 혼성화에 대한 선조체 TGFα 주입의 강한 유도 효과는 생체내에서 온전한 뇌에서의 증식성 세포가 상기 세포에 유사하게 반응한다는 것을 나타낼 수 있다.

3. TGFα 주입 및 6-OHDA 손상의 조합

손상된 동시에 TGFα가 주입된 동물에서, 선조체 TGFα mRNA 혼성화는 손상된 동시에 aCSF가 주입된 동물의 혼성화와 구별할 수 없었다. TGFα는 다른 조직에서도 강력한 자가자극 효과를 가지지만, 본 연구에서 선조체 TGFα mRNA 혼성화의 감소를 현저하게 변화시키지는 않았다. 중뇌 EGF 수용체 mRNA의 6-OHDA 매개 손실은 TGFα 주입에 의해 유사하게 영향받지 않았다. 후자의 경우, 중뇌를 손상시켰고, 주입 개시 수주 전에 동측 도파민 세포를 파괴하였다. 따라서, 성장 인자에게는 상기 세포 제거를 방지할 기회가 없었다.

도파민 세포 그 자체가 EGF 수용체 mRNA를 발현시키고(Seroogy et al., 1994, supra), TGFα가 신경독소와 함께 투여될 경우 선조체 도파민 신경분포에 대한 마커의 손실을 완화시킬 수 있다는 몇몇 증거가 있다. 따라서, 신경독소 손상과 TGFα 투여 사이의 시간 간격은 TGFα 주입이 중뇌 EGF 수용체 mRNA의 박멸에 아무런 영향을 미치지 못하는 이유를 설명할 수 있다.

인간 파킨슨증후군 뇌에서는, 중뇌 EGF 수용체 결합이 정상 뇌에서 나타나는 것과 다르지 않다 (Villares et al., 1993, supra). PD에 의한 선조체 TGFα (및 기타 신경영양성 인자)의 큰 증가 (Mogi et al., 1994, supra)는 나머지 뉴런에서의 발현 수준을 증가시킴으로써 EGF 수용체 발현 도파민 세포의 수의 감소를 저지할 수 있다. 반면, 생체외 실험은 중뇌 도파민 뉴런에 대한 TGFα의 다수의 영양 효과가 적어도 부분적으로 신경교를 통하여 매개됨을 암시한다 (Alexi and Hefti, 1993, supra). 따라서 TGFα는 파라크라인을 통한 (직접), 또는 순차적인 (간접) 이송 방식으로 작용하여 도파민 뉴런에 영향을 미친다.

TGFα 손상 동물의 상의하 대에서의 EGF 수용체 mRNA 혼성화 패턴은 TGFα 비손상 동물에서 나타나는 것과 유사하였다. 이들 동물의 동측 선조체에서의 가장 눈에 띄는 특징은 상의하 대에서의 증강된 혼성화에서의 융기보다도 더 강렬한 선조체로부터 멀리 떨어진 곳에서의 진한 혼성화 융기였다. 이 융기는 모든 공지된 해부학적 특징에도 상응하지 않았으며, TGFα 또는 TH 탐침을 사용했을 경우에도 명확하지 않았다. 융기가 없는 선조체에서의 EGF 수용체 mRNA 혼성화는 모든 다른 군의 선조체에서의 혼성화와 동일하였다.

6-OHDA 손상으로부터의 신경독 손상 및 주입관의 이식으로부터의 기계적 손상은 신경교 세포의 증식 및 활성화를 촉진할 수 있다. 이전의 연구에서, 손상의 결과로서 신경교증 및 성상세포 EGF 수용체 발현 증가가 증명되었다 (Nieto-Sampedro et al., Neurosci. Lett. 91: 276-282, 1988; Fernaud-Espinoza et al., Glia 8: 277-291, 1993). 또한 TGFα는 성상세포의 반응성에서 그 역할을 할 수 있다 (Junier et al., J. Neurosci. 14: 4206-4216, 1994). 다른 가능성은 상의하 영역의 증식성 세포가 주입과 중뇌 손상이 조합된 성장 인자에 의해 상기 뇌실로부터 나와 그 위에 가로놓인 선조체로 끌어당겨진다는 것이다. TGFα는 다양한 세포 유형의 강력한 주화인자이지만 (Reneker et al., Development 121: 1669-1680, 1995), 그 자체는 대부분의 동물에서 상기 융기의 형성을 촉진할 만큼 충분하지 않았다. 세포 융기의 형성은 중뇌 손상에 의해 촉진될 수 있다. 이러한 세포의 기원 및 신원은 하기 실시예에서 조사될 것이다.

실시예 3: 선조체 융기의 특징화

상기한 바와 같이, 흑질 6-OHDA 손상과 조합된 선조체 TGFα 주입은 EGF 수용체 mRNA를 풍부하게 발현하는, 그러나 TGFα는 고작 주위 조직 정도로만 발현하는 선조체에서의 세포의 진한 융기의 형성을 유도한다. 이 융기는 진하게 패킹된 많은 세포로 이루어져 있어 간단한 티오닌 염색법을 사용하여 명확하게 검출할 수 있다. 특이한 선조체 융기의 신원은 명확하지 않았지만, 세 가지 가능성이 고려되었다.

손상에 대하여 반응하는 신경교증은 뇌 조직에 대한 외상 및 신경독소 손상 모두의 특징이다. 전형적으로는, 두 유형의 뇌 손상은 성상세포 및 미세신경교에 의한 손상 조직의 성상세포화 및 침입을 자극한다 (Fernaud-Espinoza et al., Glia 8: 277-291, 1993). 성상세포는 특히 뇌 손상에 반응하여 EGF 수용체 면역반응을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (Gomez-Pinilla et al., Brain Res. 438: 385-390, 1988; Nieto-Sampedro et al., Neurosci. Lett. 91: 276-282, 1988). 또한 TGF 그 자체는 성상세포의 증식을 자극한다 (Alexi and Hefti, Neurosci. 55: 903-918, 1993). 따라서, 선조체 융기가 조합된 신경독소 및 기계적 손상와 성장 인자 주입에 반응하는 신경교 세포의 덩어리라는 가능성이 고려되었다.

설치류 선조체의 독특한 해부체와 관련된 융기의 두번째 강력한 기원을 연구하였다. 융기는 이전에 확인된 모든 해부학적 특징에 해당되지 않았다. 설치류에서, 미상핵 및 피각은 해부학적으로 독특한 구조가 아니다. 이와 같이, 지금까지는 설치류에서의 기저 신경절의 이 두 핵을 구별하는 해부학적 또는 신경화학적 마커가 전혀 확인되지 않았다. 그러나, 출생전 및 초기 출생후 발육 동안, 발육 중인 선조체의 상이한 영역 내의 신경조직 발육 구배는, 미상핵 및 피각의 두 핵이 해부학적으로 구별되는 동물에서 상기 미상핵 및 피각에서의 특징적인 구배에 해당한다 (Bayer, Intl. J. Devel. Neurosci. 2: 163-175, 1984). 설치류에 있어서, 앞쪽 교련부의 교차지점 위쪽의 새로운 선조체 뉴런은 측면에서 중앙 방향의 구배로 첨가되어 가장 늦게 생겨난 뉴런은 측뇌실에 가장 가까운 것이다. 미상핵의 발육에서도 동일한 패턴이 관찰되는데, 이는 설치류에서 전선조체가 미상핵과 더 유사한 영역임을 암시하는 것이다. 전교련의 교차지점의 꼬리쪽으로, 뉴런은 중앙-측면 구배로 첨가되는데, 이는 해부학적으로 전혀 다른 동물에서의 발육중인 피각과 유사하다. 따라서, 설치류 후선조체는 피각과 더 유사할 수 있다. 그렇다면, 선조체 융기가 아마도 몇몇 신경화학적 차이점에 기인하여, 세포의 많은 생성을 가능하게 하는 래트 선조체의 이들 두 영역 사이의 이전에 알려지지 않은 경계를 나타낼 수 있다는 가능성이 고려되었다.

선조체 융기의 기원에 대한 세 번째 가능성도 조사하였다. 성숙 포유류의 전뇌 측뇌실의 상의하 대으로부터의 체외배양 세포는 특히 TGFα를 포함하여 EGF-군 신경영양 인자의 존재 하에 배양할 경우 새로운 뉴런 및 신경교로 증식 및 분화할 수 있음이 밝혀졌다 (Reynolds et al., J. Neurosci. 12: 4565-4574, 1992; Morshead et al., Neuron 13: 1071-1082, 1994). 최근에는 측뇌실 내로 주입된 EGF 또는 TGFα가 성숙 생쥐 뇌에서 "EGF-반응성" 간세포 및 신경 원조 세포의 증식을 촉진함이 밝혀졌다 (Craig et al., J. Neurosci. 16: 2649-2658, 1996). 본 연구에서의 선조체 융기의 기원에 대한 가능성은 TGFα 주입이 래트의 뇌에서 유사한 증식 활성을 촉진하였다는 것이다. 추가로, 선조체 융기가 상의하 영역으로부터 유래된 증식 신경 원조 세포의 대량 이동체일 가능성도 고려되었다.

하기 실험은 다양한 조직화학적 및 면역조직화학적 기술을 사용하여 상기 특이한 선조체 융기를 특징화하는 기능을 한다. 또한 융기의 기원 및 그의 출현에 영향을 주는 인자는, 선조체에서 시간 경과에 따른 그의 형성을 조사하고 외과적 및 화학적 처리의 조합을 변경시킴으로써 연구하였다.

A. 실험 프로토콜

무게가 250 내지 300 그램인 성숙 수컷 스프라그-돌리 쥐를 연구 내내 사용하였다. 24마리의 동물에 쥐 TGFα (0.5 μg/일; Sigma Chemical Co.)의 표준 중간선조체 주입물을 수여하였다. 다른 26마리의 쥐에는 인공 뇌척수액 (aCSF)을 수여하거나 주입물을 전혀 수여하지 않았다. 표준 TGFα 주입군 및 대조군의 동물에는 주입이 시작된지 48시간 후에 흑질 내로 입체공간적 6-OHDA 주입물을 수여하였다. 본 연구 부분에서 사용된 동물은 그의 주입-손상 조합에 따라 하기와 같이 여섯 군으로 분류하였다: TGFα 주입, 손상 (n=13); TGFα 주입, 손상 무 (n=11); aCSF 주입, 손상 (n=12); aCSF 주입, 손상 무 (n=9); 주입 무, 손상 (n=1); 주입 무, 손상 무 (n=4).

추가적인 동물들에 선조체, 뇌측뇌실, 대뇌 피질, 또는 중격 이외의 지역에서 TGFα를 주입했다. 4 마리의 동물(1 군당 2 마리)에 중뇌선조체에 TGFα를 표준 투여량의 반 내지 1/10으로 주입했다. 또한, 두 마리의 동물에 표피 성장인자(EGF)를 TGFα대신 추가하였다. 이 래트들에게 표준 0.5 ㎍/일 투여량으로 EGF를 투여하였다. 모든 실험에서 사용된 래트들을 손상후 1 내지 16 일에(주입의 3-18 일) 전형적으로 관류하였다. 주입이 끝난 후에도 융기가 지속되는지 여부를 측정하기 위해, 미니펌프를 TGFα주입을 받는 4 마리의 동물로부터 2 주 말기에 제거하지만, 이 동물들을 여러날이 지날 때까지 관류하지 않았다. 뇌 절편을 준비하고 각종 면역세포하학 및 조직화학적 기술들을 사용하여 염색하였다.

B. TGFα주입

래트를 8 mg 질라질 및 100 mg 케타민/kg으로 마취하였다. 알제트 삼투성 미니펌프(2002)로 18 일동안 TGFα를 주입하였다. 대조 동물용으로 약 200 ㎕의 aCSF 또는 실험 동물용으로 400 ㎕의 aCSF 내 20 ㎍의 TGFα를 채웠다. 멸균 상태하에서, 주입 배관을 브레그마(Paxonos and Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic Press, San Diego, 1986)를 기초로 한 입체공간식 코디네이트(+1.2 A/P,; +2.7 M/L; -6.0 D/V)에 두고, 치과시멘트로 두개골의 맨위에 접합시켰다. 주입물을 약 0.5 ㎕/시간으로 배관을 통해 배출하였다. 몇몇 추가적인 대조 동물들에게 측뇌실, 위에 있는 피질, 또는 기타 지역으로 주입하였다.

C. 신경독성 손상

미니펌프 이식 48 시간 후에, 상기와 같이 래트를 마취시켰다. 6-OHDA HCl의 냉각 용액 4.8 mg/㎖ 를 주사 전에 제조하였다. 멸균 기술을 사용하여, 신경독을 입체공간적으로 귀사이 영을 참조로 사용하여(Paxinos and Watson, 1986, supra) 동측 흑질 내로 주사하였다(+3.7 A/P,; +2.1 M/L; +2.0 D/V). 6-8 ㎕ 부피를 1 ㎕/분의 속도로 주입하였다.

D. 조직 제조

손상 후 1 내지 16일에 동물에 0.1 M 인산염로 완충된 식염수(PBS; pH 7.4) 내의 4 % 파라포름알데히드 500 ㎖을 관류시켰다. 다음날, -20 ℃에서 이소펜탄 내에서 뇌를 냉동시켰다. 이어서 40-미크론 피질 절편을 냉동 현미경절편도 상에서 0.1 M PBS 내의 2 % 파라포름알데히드 내로 절단하였다. 연속적인 절편을 선조체 및 흑질-VTA를 따라 취하였다. 대표적인 절편을 나머지 뇌를 따라 취하였다.

E. 니슬 염색

현미경절편도로 절단된 니슬 염색용 뇌 절편을 겔라틴-코팅된 슬라이드 상에 올려놓고 하룻밤동안 건조시켰다. 이어서, 이들을 탈수시키고 에탄올 중탕으로 재수화시키고, 약 4 분동안 티오닌 용액에 놓았다. 일련의 에탄올 중탕으로 탈수시키고, 연속적인 조직제거 세척으로 깨끗이하고, 커버슬립을 덮었다. 광현미경 하에서 절편을 보고, 테크니칼 판 필름(Kodak, Inc.)으로 ISO 100에서 사진을 찍었다(6 분동안 HC-110 처리).

F. 은 염색

핑크-헤이머(Fink-Heimer)의 과정 I(Giolli and Karamanlidis, In: Neuroanatomical Research Techniques, R. T. Robertson, Ed., pp. 211-240, Academic Press, New York, 1978)과 유사한, 나우타 염색 방법의 변형을 사용하여, 융기의 쇠퇴하는 섬유 및 세포들을 표식하였다. 간단하게, 움직이지 않는 절편들을, 신선한 1 % 히드로퀴논-1 % 옥살산으로 처리하기 전에, 0.05 % 페르만가네이트 내에 놓았다. 이들에게 우라닐 니트레이트/질산은 용액을 연속적으로 증가시키는 처리를 하였다. 또다른 헹굼 후에, 절편을 암모니아성 은 내에서 반응시키킨 후, 에탄올/시트르산/파라포름알데히드 환원제 내에서 반응시키고, 마지막으로, 소듐 티오설페이트 내에서 반응시켰다. 염색 후에, 절편을 유리 슬라이드 위에 올려 놓고 슬라이드 건조기 상에서 15 분동안 건조시켰다. 이어서 절편을 에탄올 농도를 증가시켜서 연속적으로 탈수시키고, 3 번의 연속적인 조직제거 세척으로 지방을 제거하고, 커버슬립을 덮었다.

G. 면역조직화학법

흑질 손상의 특성 및 정도를 동측 복측 중뇌에서의 TH-IR 의 손실로 측정하였다. 성상세포용 마커인 신경교의 원섬유성 산성 단백질(GFAP)에 대한 항체, 신경 원조 세포용 마커인 네스틴, 및 방사의 신경교 세포용 마커인 비멘틴을 융기의 신경화학적 특징화에 사용하였다. 부유가 없는 절편 상에서 면역조직화학법을 수행하였다. 간단히, 뇌 절편을 0.1 M PBS 또는 트리스 완충화된 식염수(TBS; 3 ×10 분)에서 세척한 후, 250 ㎕ 트리톤 X-100과 함께 0.1 M PBS 또는 TBS 내의 3 % 염소 혈청으로 구성된 차단 용액 내에서 1 시간동안 항온배양했다. 이어서, 이들을 차단 용액으로 희석된 항체 용액과 함께 회전기 상에서 실온에서 하룻밤동안 항온배양하였다: 토끼 항-TH 항혈청(1:500; Eugene Tech Intl., Inc.), 토끼 항-GFAP(1:6400; Dako Corp.), 마우스 모노클로날 항-비멘틴(1:50; Sigma Chemical Co.), 또는 마우스 항-네스틴 상층액(1:20; University of Iowa Hybridoma bank).

이어서, 절편을 세척하고, TH 또는 GFAP 면역염색용으로 비오틴화된 염소 항-토끼 항혈청(1:200; Vector Labs, Inc.), 또는 네스틴 또는 비멘틴 면역염색용으로 비오틴화된 말 항-마우스 항혈청(Vector Labs, Inc.)과 함께 1 시간동안 항온배양한 후, 세척하고 아비딘-비오틴 복합물(ABC Elite kit, Vector Labs, Inc.) 내에서 1 시간동안 항온배양하였다. 일차 항체 결합의 국소화는 디아미노벤지미딘 (DAB) 과산화효소 기술을 사용하여 나타냈다. 절편을 철저하게 세척하고, 겔라틴이 밑에 칠해진 슬라이드 상에 올려놓고 하룻밤동안 건조시켰다, 마지막으로, 절편을 탈수시키고, 깨끗하게 하고, 상기 설명된 대로 커버슬립을 덮었다.

연구에서 사용된 어떤 동물도 미니펌프 이식 또는 손상 수술로부터 역효과를 나타내지 않았다. 모두 실험 과정동안 음식 및 물 섭취를 계속하였다. 손상, 주입, 또는 이 둘 모두가 성공적이지 않으면, 동물들을(n=6) 초기 실험군에서 배재하여 별도로 시험하였다. 성공적인 손상은 복측 흑질 TH-IR의 제거를 완전하거나 거의 완전하게 일으킨 것으로 정의한다. 성공적인 선조체 주입은 주입관의 팁이 선조체의 몸체에 성공적으로 고정되어 있는 것으로 정의한다.

원위치 혼성화 연구에서와 같이, 6 일 이상동안 선조체 내 TGFα주입을 받은 모든 동물들이 주입 동측의 뇌실을 따라, 티오닌 염색으로 볼 수 있는, 세포들의 극적인 증강을 나타냈다. 반면에, 반대측 선조체는 증가를 보이지 않았고, aCSF-주입된 동물에서의 것과 구별할 수가 없었다. 손상된 동물에서의 EGF 주입은 뇌실을 따라 세포의 확장을 일으켰지만, 선조체 융기의 형성은 일으키지 않았다. 더 적은 투여량의 TGFα는 세포 확장 및 융기 형성 모두를 일으켰지만, 양적으로, 각각에서의 세포수는 감소하였다.

1. 6-OHDA 손상의 효과

aCSF가 주입된 손상된 동물 중 어느 것도 동측 뇌실을 따르는 세포의 확장 또는 선조체 융기의 증거를 나타내지 않았다. TGFα가 주입된 손상된 동물들은 뇌실을 따라 세포의 증강을 일정하게 나타내지 않았고, 전형적으로 선조체 융기를 나타냈다. 손상되지 않은 동물과 비교하여, 흑질 손상은 융기 형성의 발생을 증가시켰다(표 1).

2. 융기의 형태 및 지속성

중앙 선조체 주입 결과, 배중선의 미상핵-피각으로부터 생기고 선조체 내로 지나가고 복측 말단에서 약간 중선쪽으로 고리모양을 만드는, 특징적인 S-형 융기가 나타났다. 융기의 가장 배측인 부분은 상의하 영역에서의 세포의 증강과 함께 계속되었다. 전형적으로, 티오닌 염색은 EGF 수용체 mRNA 혼성화와 평행한 융기의 배측 부분에서 가장 진했다. 세포 융기는 일반적으로 선조체의 문측-꼬리쪽 대부분의 지역 두루에서 발견되었다. 융기는 TGFα 주입 펌프가 제거된 후 3 달동안 선조체에서 여전히 두드러졌다.

주입물 손상 수 확장
aCSF	없음	9	0 %	0 %
aCSF	있음	12	0 %	0 %
TGFα	없음	11	100 %	27 %
TGFα	있음	13	100 %	92 %

3. GFAP 면역조직화학법

성상세포용 마커인, 신경교 원섬유성 산성 단백질(GFAP)에 대한 항혈청은 선조체 융기의 세포들 또는 뇌실을 따르는 세포성 확장을 염색하지 못했다. 정상적인 GFAP-IR 성상세포 염색은 융기의 중간 및 측면에서 발견되었지만, 융기 자체로부터는 거의 배제되었다.

4. 은 염색

나우타 방법의 변형으로 비특이적으로 세포들을 표식하는 것은 뇌실성 세포 확장 및 선조체 융기를 포함하여 세포들에 대한 추가적인 정보를 제공하였다. 가장 현저한 특징 중의 하나는 상의하 세포 증강 및 융기를 일으킨 거대한 수의 세포들이었다(도 8). 세포들은 진하게 팩킹되었고, 현저히 방추모양이었다(도 8). 융기의 복측 부분에서, 신장된 세포들이 내부 캡슐의 섬유 다발 주위에 흘러가는 것으로 나타났고, 이것은 세포들이 선조체를 통해 이동한다는 것을 제안한다.

5. 융기 형성의 시간 경과

융기의 세포들의 밀도는 간단한 티오닌 염색을 사용하여 이것의 형성을 관측하도록 하였다(도 9). 시간 경과 실험용으로 사용되는 모든 동물에게 6-OHDA 손상 및 중선조체 TGFα주입을 하였다. 주입 6일 전의 시점에, 상의하 부분에는 매우 소량의 세포 형성만이 있었고, 선조체 융기의 증거는 없었다. 주입 6 일에, 뇌실을 따라 명백한 세포의 확장이 있었다. 주입 9 일에, 융기의 복측 부분이 뇌실로부터 약간 옮겨지기 시작하였다. 주입 12 일에, 융기의 복측 부분이 뇌실벽으로부터 400 ㎛이상 위치에 있었다. 주입 16 일에, 융기가 뇌실로부터 2 mm 이하의 복측 부분인 중선조체에서 나타났다. 따라서, 융기는 뇌실 영역에서 생기고, 주입 후 시간이 지나면선 위에 있는 선조체에서 방사형으로 점점더 옮겨졌다. 주입 12 일 및 16 일에서 뇌실 벽과 융기의 측면 확장 사이의 거리 간에 추정되는 차이는 약 1.6 mm였다.

6. 네스틴 면역조직화학

신경상피 원조 세포용 마커인, 네스틴에 대한 모노클로날 항체는 융기 도처의 밀집된 섬유 집합을 강하게 염색하였다. 융기 측면에서는 네스틴-IR 섬유가 보이지 않았지만, 융기 중앙에서는 때때로 섬유가 관찰되었다. 섬유는 본질적으로 융기에 대해 직각으로 배향되었다.

7. 융기 형태의 변화

TGFα가 중선조체에 주입된 손상된 동물들은 일률적으로 관상절단면에서 특징적인 S-형 선조체 융기를 나타냈다. 이 형태는 미상핵-피각의 다른 영역에서 주입한 래트들에서는 극적으로 변화하였다(도 11). 내측의 선조체 주입은 관 주입 부위 근처에, "L"의 수직 부분은 뇌실을 따라, 수평 부분은 뇌실로부터 선조체 내로 직각으로 확장된, L-형 융기를 일으켰다. 가장 측면의 선조체로의 주입은 측뇌실의 벽에 평행한 선형 융기의 형성을 자극하였다.

8. 비멘틴 면역조직화학법

방사형 신경교 세포용 마커인 비멘틴을 인식하는 항혈청은 주입 2 주에 선조체, 상의하 대, 또는 선조체 융기 내의 어떤 세포도 염색하지 못했다. 그러나, 대조군이 미발달 동물에서 부정확한 네가티브의 제거를 확신할 수 없는 조건 하에서 수행되었기 때문에, 이 결과는 더욱 연구중이다.

9. 융기 위치의 조절

원위치 혼성화 실험을 위해 사용되는 래트에서의 융기의 세포에 비교하여, 본 발명의 일련의 실험에서의 융기 세포들은 뇌실로부터 더 멀리 최대한 분산되어 있다(도 12). 이 두 군의 동물들 간의 차이는 실험적으로 주입 및 손상의 계획표이다.

원위치 혼성화 실험을 위해 제조된 동물들을 손상시킨 후에, 손상 2 주후에 시작되는 일련의 행동에 관한 테스트들을 하여 단일측면성 손상의 성공을 확실히 하였다. 전형적으로, 이 동물들은 손상 후 5 주동안 주입을 받지 않았다. 따라서, 도파민 변성 과정 및 TGFα의 선조체 주입이, 시간적으로 분리된 사건이었다.

본 발명의 일련의 실험에서, 주입이 먼저 시작되었고; 주입 펌프가 이식된 후 48 시간까지 손상이 수행되지 않았다. 이러한 동물들에서, 흑질 도파민 뉴런의 변성, 생성된 선조체 도파민작용성 신경지배의 손실. 및 성장 인자의 선조체 투여가 시간적으로 동시에 일어나는 사건이었다.

10. 선조체 이외의 뇌 부분으로의 주입

선조체 이외의 뇌 부분으로의 주입을 받은 모든 래트들은 2 주 TGFα주입 및 6-OHDA 손상을 받았다. 손상 동측으로 성장인자를 대뇌실내(ICV) 주입하는 것은 인접한 뇌실 벽에서의 세포의 형성을 자극하였지만, 어떠한 동물에서도 선조체 융기의 형성은 일으키지 않았다.

중격 및 몇몇 선조체 주입은 측뇌실의 내측 벽과 연관된 중격 융기의 형성을 자극하였다. 선조체 융기와 같이, 중격 융기는 EGF 수용체 mRNA 원위치 혼성화 또는 티오닌 염색으로 쉽게 검출되었지만, 세포의 밀도 및 수의 관점에서 양적으로 덜 강했다.

배측의 피질 주입, 즉 뇌량을 투과하지 않을 정도로 얇은 주입은 측뇌실을 따르는 세포 밀도에 대해 식별할 수 있는 효과를 갖지 않았다. 또한 이 배측 주입은 융기의 형성도 일으키지 않았다. 뇌량을 약간 통과하는 피질 주입은 동측 뇌실을 따라 세포의 확장을 자극하였지만, 선조체 융기의 형성은 자극하지 않았다. 이 동물들은 뇌량의 융기로 간주될 수 있는 뇌량 내에서의 세포 밀집을 나타냈다.

H. TGFα는 세포 증식을 자극한다

본 실험은, 상기에서 설명된 것과 함께, TGFα투여가 세포성 증강 및 선조체 융기의 형성에 필요하였다는 것을 증명한다. 선조체 aCSF 주입을 받은 동물(손상되었거나 되지 않았거나) 중 어느 하나도 정상적인 동물 또는 주입에 대해 반대측인 상의하 영역과 비교했을 때, 명백한 실주위의 세포 확장을 나타내지 않았다. 측뇌실을 따라 증식함으로써, 분명히 전뇌의 세포들이 TGFα의 선조체 주입에 반응한다.

마우스에서 6 일동안의 EGF 또는 TGFα를 ICV 주입하는 최근의 연구는 세포 증식용 마커인, 5-브로모-2′-데옥시우리딘(BrdU) 또는 [³H]티미딘으로의 면역표식된 뇌실 주위의 세포의 수가 많이 증가하는 것을 증명하였다(Craig et al., J. Neurosci. 16: 2649-2658, 1996). 또한 이 세포들의 95 % 초과는 EGF 수용체에 양성적으로 면역활성이었다. 크레실 바이올렛 니슬 염색 또한 이 동물들에서 성장 인자 투여에 대한 반응으로 뇌실 주위의 세포 수의 증가를 나타냈다.

측뇌실을 따라 확대된 세포 군집이 조합된 신경독 손상 및 전뇌의 기계적 손상, 및 주입된 TGFα에 의해 자극된 신경교 세포라는 가능성이 가장 먼저 검토되었다. 성상세포는 증식 및 그들의 형태 및 기능적 특징들을 변화시킴으로써 뇌 손상에 반응하는 것으로 알려져 있다(재검토를 위해, Norenberg, J. Neuropath. Exper. Neurol. 53: 213-220, 1994). 또한, 선조체의 성상세포는 EGF 수용체를 갖고(Gomez-Pinilla et al., 1988, supra; Nieto-Sampedro et al., 1988, supra), TGFα에 의해 자극되어 증식한다(Alexi and Hefti, 1993, supra). 본 연구에서, 성상세포용 마커인 신경교 원섬유성 산성 단백질(GFAP)에 대한 항혈청은 주입 2 주에 뇌실 영역 또는 융기 내의 성상 세포의 증가를 보이지 못했다. 실제로, GFAP-IR 은 이 부분에서 대규모로 배제되었다. 정상적인 성상세포 염색은, 에를 들어, 융기의 중앙 또는 측면에서 보였지만, 융기 자체 내에서는 극소의 GFAP-IR 섬유가 관찰되었다. 이러한 발견은 EGF 또는 TGFα의 6 일동안의 ICV 주입 실험에서와 일치한다: GFAP 및 성상세포용 추가적인 마커인 S100β는 측뇌실 주위에서 상당한 증가를 보이지 않았다(Craig et al., 1996, supra). 또한 비멘틴은 반응성 성상세포에 의해서 발현될 수도 있지만(Federoff et al., J. Neurosci. Res. 12: 14-27, 1984), 비멘틴-IR은 시험된 어느 절편에서도 관찰되지 않았다. 소교세포(MAC-1) 및 희돌기교세포(MAG, CNP, O4 및 Rip) 용 마커 또한 상당히 변하지 않았다(Criaig et al., 1996, supra). 따라서, 면역조직화학적 증거는 TGFα에 의해 유도된 뇌실을 따라, 및 선조체 융기 내에서의 세포 확장이 신경교증의 결과가 아니라는 것을 증명한다.

1. 세포 형태 및 기원

은 및 티오닌 염색은 뇌실을 따르는 세포 응집 내에 거대한 수의 세포를 명확하게 나타낸다. 융기 및 상의하대의 배측 부분에서 가장 진하고 가장 많았다. 세포들은 주로, 이동하는 발육중인 뇌의 신경 원조 세포와 유사하게, 긴 축이 뇌실 벽(또는 배측 선조체과 경계를 이루는 상의하대의 배측면 확장)에 직각인 방사형형태였다. 융기의 배측 부분에서 은으로 염색된 세포들은 내부 캡슐의 섬유 다발 주위에 흐르는 것으로 나타났는데, 이것은 이들이 선조체를 통과하여 이동한다는 것을 제안한다.

세포들이 실제로 이동하는지를 결정하기 위해, 시간 경과 실험을 수행하여 융기의 발육 및 이것의 위치를 성장 인자 주입 시작 후에 시간의 함수로 실험하였다.

2. 선조체 융기 세포의 이동

측뇌실을 따르는 세포들의 진행성 확장 및 이어지는 이 세포들의 짙은 융기로서의 방사형 이동은 세포들이 실제로 선조체를 통과하여 함께 이동한다는 것을 증명하였다. 그 자체만으로는, 융기가 설치류의 추정적 "미상핵과 같은" 및 "피각과 같은" 선조체 부분 사이의 해부학적 서술일 수 없다.

3. 신경 전구 세포의 자극

성숙한 성상세포, 뉴런, 소교세포, 또는 희돌기교세포용 면역마커들 중 어느 것도 실주위의 확장 또는 선조체 융기의 세포들을 표식하지 않지만, 신경상피 전구 세포에 의해 발현되는 중간체 섬유인, 네스틴을 인식하는 모노클로날 항체는 융기 내 및 뇌실을 따라서 세포 돌기들을 진하게 염색하였다. 또한 반응성 성상세포들은 네스틴-IR을 발현시킬 수 있지만, 융기의 세포 내 음성 GFAP-IR은 성상세포가 융기 세포의 상당한 부분을 형성한다는 가능성을 없앴다. 네스틴-IR 은 최근 신경 전구 세포들을 생체 외 및 생체 내에서 확인하고 표식하는데 사용되어왔다(Lendahl et al., Cell 60: 585-595, 1990; Craig et al., 1996, supra). 선조체 융기 내의 강한 네스틴-IR 및 신경교 마커용 면역염색의 결여는 융기의 세포들이 주로 신경 원조 세포라는 결론을 지지한다.

따라서 지금까지, 새로운 뉴런 및 신경교가 될 수 있는 두개의 별개의 세포 집단이 성숙한 포유류 뇌에서 확인되었다(Morshead et al., 1994, supra). 상대적으로 활발하지 않는 세포 집단인 하나는 본질적인 다능성 신경 간세포로 여겨진다. 지속적으로 증식하는 집단인 다른 하나는 간세포로부터 파생한 신경 원조 세포인 것으로 여겨진다. 간세포 집단은 상의 또는 상의하 대에 남아있고, 원조 세포 집단이 죽거나 멀리 이동했을 때 이들을 보충하는 것으로 생각된다. 여기서 "신경 전구체"라는 용어는, 성숙한 포유류의 뇌에서 뉴런 또는 신경교가 될 수 있는 임의의 미분화된 증식성 세포를 묘사하는 것으로 사용되는데, 이 뇌에서 이들은 신경 간세포 또는 신경 원조이다.

이전의 연구들은 많은 신경 원조 세포들이 이 부분에서 이동하기 전에 상의하대에서 죽는다는 것을 보여왔다(Morshead and Van der Kooy, J. Neurosci. 12; 2249-256, 1992). 그러나, 최근 많은 다른 것들이 실제로 생존하고 매우 제한된 경로를 따라 후각구로 이동하여 여기서 후각 중간뉴런으로 분화한다는 것이 발견되었다(Luskin, Neuron 11: 173-189, 1992; Lois and Alvarez-Buylla, Science 264: 1145-1148, 1994). 이들은 이동하는 세포들의 연쇄물이 특이화된 GFAP-IR 성상세포에 의해 싸여지는 "연쇄 이동"이라고 불리는 과정에서, 측뇌실의 벽을 따라 접하면서 이동한다(Rousselot et al., 1994; Lois et al., Science 271: 978-981, 1996).

이어서, 전뇌 측뇌실을 따르는 상의하대는 미성숙한 신경상피의 휴면 잔유물보다 더 많다. 정상적인 비조작된 뇌에서, 이것은 문측으로 이동하고 뉴런으로 분화하는 새로운 신경아세포를 일으키는 것을 계속한다. TGFα를 포함하여, EGF-군 신경영양성 인자의 영향 하에서, 상의하 신경 전구체들은 생체 외에서 많은 수의 새로운 뉴런, 성상세포 및 희돌기교세포를 일으키는 것을 자극할 수 있다 (Reynolds and Weiss, Science 255: 1707-1710, 1992). 이러한 체외배양편 연구로부터, 가장 높은 농도의 신경 전구체 세포들이, 미상핵-피각의 배측 경계를 따라, 상의하대의 배측 부분에서 발견된다는 것이 명백해졌다.

심지어 최근에는 신경 전구체가 이들의 수를 증가시키도록 자극될 수 있고 생체 내에서 새로운 뉴런 및 신경교를 생산할 수 있다는 몇몇 증거들도 있다(Craig et al., 1996, supra). 성숙한 뉴런 및 신경교용 마커 및 BrdU로 이중 표식된 세포들은 EGF의 ICV 주입 6 일 후에 및 후-주입 생존의 7 주까지 선조체, 중격, 및 피질에 걸쳐 분산적으로 분포되어 발견되었다. 그러나, 상의하 세포의 인접한 선조체로의 거대한 이동은 이 연구에서 관찰되지 않았고(본 방법에 의해 수득된 결과에 현저하게 비교되어), 본 명세서에서 설명된 선조체 융기에서 관찰되는 세포의 진하게 팩킹된 덩어리와 비교하여 세포의 수는 꽤 적절하였다. 또한, 크래이그(Craig) 등에서 어떤 동물도 곧 관찰되는 거대한 이동을 자극하기에 충분한 주입을 받지 않았고, 이 연구에서 어떠한 동물도 본 명세서에서 처음으로 이동의 발생을 극적으로 증가시키는 것으로 나타난 흑질 6-OHDA 손상을 받지 않았다.

4. 신경원 표현형의 증거

남아있는 질문은 뇌실 및 이동하는 선조체 융기를 따르는 거대한 확장 내의 세포들이 진짜로 신경 원조 세포인지 여부이다. 표 2는 이 세포들이 실제로 신경 원조라는 결론을 지지하는 데이타들을 요약한다. 신격화학적 증거들은 이들이 성숙한 뉴런, 성상세포, 희돌기교세포, 또는 소교세포용 마커를 나타내지 않는다는 것을 보인다. 그러나, 이들은 미성숙한 신경 원조 세포용 마커는 진하게 나타내었다. 이들은 세포 증식용 마커를 나타내었다. 이들은 성숙한 설치류 뇌에서 신경 전구체가 위치하고, 측면으로 확장하고 방사형으로 뇌실로부터 멀리 이동하는 측뇌실의 벽으로부터 생겼다. 또한, 미성숙한 뇌에서 이동하는 신경 원조와 유사하고 상의하 부분에서의 이들의 이동과 일치하게, 이들의 세포 형태는 방사형이었고, 이들의 돌기는 뇌실 및 융기에 직각으로 향하였다. 하기의 표(표 2)에서 요약된 데이타들은 실주위 확장의 세포 및 선조체 융기가 상의하 신경 간세포로부터 생기는 신경 원조라는 것을 가리킨다.

확장 및 융기의 세포에 대한 원조 표현형의 증거

신경화학적

풍부한 EGF 수용체 mRNA 및 면역활성의 발현

성상세포용 마커인, GFAP* 또는 S-100β에 대한 면역음성

성숙한 뉴런용 마커인, NeuN에 대한 면역음성

희돌기세포용 마커인, MAG, CNP, 04, 또는 Rip에 대한 면역음성

방사형 신경교용 마커인, 비멘틴*에 대한 면역음성

소교세포용 마커인, MAC-1에 대한 면역음성

신경상피 전구체용 마커인, 네스틴*에 대한 면역음성

형태학적

상의하대에 직각으로 배향된 융기에서 신장된 소마타(somata)

상의하대에 정상으로 배향된 융기에서 네스틴-IR 돌기

해부학적

상의하대로부터 생김

가장 높은 밀도의 세포들이 배측 상의하 영역에 있다

생리학적

수를 증가시킴으로써 TGFα투여에 반응

5. 이동 메카니즘

이러한 세포들의 선조체로의 덩어리 이동은 선조체 도파민 탈신경 및 주입관의 배치에 의해 조절될 수 있지만, 이동 메카니즘은 불명확했다. 융기의 모양이 간단히 초기에 주입 부위를 변화시킴으로써 변형될 수 있다는 사실은 주화인자 효과를 제안하였다. TGFα는 다양한 세포 유형에 대해 강력한 주화성 약제로 알려져있다(Ju et al., J. Invest. Dermatol. 100: 628-632, 1993; Panagakos, Biochem. Mol. Biol. Int. 33: 643-650, 1994). 분만기의 미상핵-피각에서의 이것의 풍부한 발현은 이것이 선조체의 발육에서와 유사한 역할을 수행한다는 것을 가리킬 수 있다.

정상적인 뇌의 신경 전구체 세포들은 측뇌실 벽 내의 가느다란 부분에 위치한다. 중앙-선조체로의 주입은 이 영역의 배측 말단의 세포들에 더욱 가까왔다. 아마, 선조체 내로 이동하는 세포들은 TGFα가 방출되는 주입관의 팁에서 성장인자의 추정되는 더 높은 농도를 향하여 이동할 것이다. 중앙-선조체 주입을 받은 동물에서의 특징적인 S-형의 융기는 주입관에 가장 가까운 상의하대의 배측 부분에서의 세포의 수용체 포화로 인한 것일 수 있다. EGF 수용체가 포화된 세포들은 일단 이들이 주입 부위로 가깝게 이동하면 이동을 멈추는 것일 수도 있다. 상의하대의 복측 말단 근처의 세포들은 더 낮은 추정되는 성장 인자 농도를 볼 수 있고, TGFα농도가 수용체를 포화시키기에 충분할 정도로 증가하기 전에 주입 부위를 향해 더 멀리 이동해야 할 것이다. 이 수용체 포화와의 특징적인 이동은 이 융기들의 특징적인 S-형을 설명할 수 있다.

내측 선조체로의 주입 결과, L-형 융기가 생기고, 다시 신경화학적 농도/ 수용체 포화 효과가 유지된다. 이러한 예에서, 배측 상의하의 세포들은 이들의 수용체를 포화되게 할 수 있고, 이들이 상의하대로부터 나타날 수 있기 전에 이동을 멈출 수 있다. 상의하 지역의 가장 복측 부분의 세포만이 뇌실로부터 멀리 이동할 수 있다.

극도로 측면에서의 주입은 본질적으로 증식하는 부분의 길이의 대부분을 따르는 세포에 유사한 추정적인 농도 구배를 제공할 것이다. 상의하의 세포들 모두는 뇌실로부터 유사한 거리를 이동하여, 주화인자, 신경화학적 농도 구배의 생각과 일치하는, 대략 선형인 융기가 생긴다.

그러나, 특징화 연구로부터의 면역조직화학적 증거들은 단순한 주화인자 효과가 덩어리 방사형 이동을 전체적으로 설명할 수 있다는 이 생각에 불신을 제공한다. 이동하는 세포들의 네스틴-IR 돌기는 성장 인자의 농도가 가장 높을 것으로 추정되는 부분인 주입관의 팁과 일렬로 되지 않았다. 대신에, 이들은 뇌실 및 융기에 법선으로 배향되었다. 이러한 배향은 세포들이-이동하는 신경 원조들이 미성숙한 선조체 신경상피로부터 그러는 것처럼- 주입관의 팁을 향해 비스듬하게가 아니라 미상핵-피각 내로 직각으로 이동하였다는 것을 제안하였다.

2 개의 추가적인 발견은 융기의 이동에서 단순한 주화성의 역할의 효과를 감소시켰다. 우선, 세포들은 이들이 생기는 데로 이동하기 시작하지 않았다; 이들은 1 주 초과의 기간동안 뇌실을 따라 이들의 수를 증가시킨 후, 함께 진한 세포의 시트로서 이동하였다. 또한, 동측 흑질의 손상은 이동의 발생을 매우 증가시켰다. 이러한 관찰 모두는 세포의 이동에 영향을 미치는 더욱 복합적인 세트를 제안하였다. 이 데이타들은 융기의 이동에서 주화성에 대한 역할을 완전히 제외하는 것이 아니라, 단순한 주화성 효과는 혼자서 융기의 이동을 설명할 수 없다는 것을 가리킨다.

성숙한 선조체에서 신경 원조의 방사형 이동에 기여할 수 있는 또다른 메카니즘은 신경독 손상, 주입관의 수술 이식으로 생긴 기계적 손상, 또는 두가지 모두로 인한 방사형 신경교 골격의 재구축이었다. 방사형 신경교는 발육중인 뇌의 많은 부분에서 신경 원조 세포의 이동을 안내한다. 이들은 뇌실을 따라 고정되고 이들의 돌기를 방사형으로 위에 있는 신질로 확장시킨다. 이들은 일단 신경아세포 이동이 끝나면 초기 생후 기간에 정상적으로 GFAP-IR 성상세포로 변형되고, 비멘티 및 네스틴의 발현을 멈춘다.

신생 래트의 피질판의 동결 손상은 방사형 신경교 변형을 저해하였고, 성숙한 뇌의 손상된 부분에서 비멘틴 및 네스틴의 신경교 발현의 지속을 일으켰다 (Rosen et al., Dev. Brain Res. 82: 127-135, 1994). 성숙한 래트 해마의 카이네이트 손상은 방사형 신경교 형태 및 해마의 상의하대의 성상세포에서 네스틴-IR 및 비멘틴-IR의 발현을 일으켰는데, 이것은 뇌 손상이 성상세포의 표현형을 미성숙 뇌에서 발견되는 것으로 전환시키는 것을 자극할 수 있다는 것을 제안하였다(Clarke et al., Neuroreport 5: 1885-1888, 1994).

본 면역조직화학적 실험은 이러한 현상에 대한 지지를 제공하지 않는다. 네스틴-IR 섬유는 주입 9일에 뇌실을 따라 방사형으로 배향된 섬유에서 풍부하게 발견되었지만, 그 이후에는, 더이상 뇌실을 따라 남아있지 않았다. 융기의 세포들이 상의하 부분으로부터 멀리 이동하면서, 네스틴-IR 섬유들도 이동하였다. 또한, 방사형 신경교에 대한 특이적 마커인 비멘틴용 면역염색은 융기 또는 상의하 부분 어디에서도 어떠한 표식된 섬유도 나타내지 않았다. 따라서, 모든 성상세포가 미성숙 방사형 신경교 표현형으로 전환되었다거나, 성상세포의 전환이 신경 원조 세포의 방사형 이동에서 역할을 다했다는 것은 생각하기 힘들다.

특히 성숙한 포유류 뇌의 신경 원조에 의해 사용되는 새롭게 설명되는 이동의 모드는 전뇌 상의하대로부터 후각구로의 이 세포들의 접하는 이동을 설명한다(Lois et al., 1996, supra). 돌기가 있게 이동하는 신경아세포들은 진하게 팩킹되고 이들의 매우 제한된 이동경로의 가장자리를 이루는 GFPA-IR 성상세포에 의해 싸여진다. 이동하는 세포들은 본질적으로 특이하된 신경교 안내 세포들의 관 내에 이동하는 세포들의 고체 흐름을 형성한다. 본 실험 내의 신경 전구체들은-제한된 경로를 따라서가 아니라-선조체 신경망을 통해 시트로서 이동하였고, GFPA-IR 세포들과 관련되지 않았다. 실제로, 증식성 상의하대 및 세포성 융기는 GFPA-IR을 대부분 배제하였다. 따라서, 연쇄 이동의 메카니즘은 본 연구에서 보이는 방사형 이동을 설명할 수 없엇다.

덩어리 신경 원조 이동의 기초가 될 수 있는 또다른 메카니즘은 선조체의 세포들인 이들이 성장인자, 세포 부착 분자, 또는 손상에 반응하는 기타 물질의 발현을 변화시킬 수 있다는 것이었다. 이러한 계획에서, 선조체가 자극되어 이들 자신의 주화인자 또는 방사형 이동을 촉진하는 분자들을 제공할 수 있다. 대안적으로, 또한 이것은 이동을 저해하는 물질의 발현을 억제조절하도록 유도될 수도 있다.

선조체 및 상의하 영역에서 세포 부착 분자를 시험하는 최근의 연구는 특히 흥미로운 식견을 제공한다. 매우 폴리시알리레이팅된(polysialylated) 신경 세포 부착 분자(PSA-N-CAM) 면역반응성은 발육중인 설치류 선조체에서 진하게 발현되지만, 성숙한 동물에서는 감소한다(Aaron and Chesselet, Neurosci. 28: 701-710, 1989; Szele et al., Neurosci. 60: 133-144, 1994). 그러나, PSA-N-CAM 발현은 성숙한 전뇌 상의하 영역을 따라 지속된다(Rousselot et al., 1994; Szele et al., 1994, supra). 부분적인 피질박리-유도 선조체 구심로차단은 상의하대에서 PSA-N-CAM 및 또다른 부착 분자인 L1의 발현을 극적으로 증가시켰다(Poltorak et al., J. Neurosci. 13: 2217-2229, 1993; Szele and Chesselet, J. Comp. Neurol. 368: 439-454, 1996). 인간의 뇌에서, PSA-N-CAM 발현은 정상 선조체에서는 낮지만, 헌팅턴병 환자의 선조체, 특히 상의하대에서는 증가한다(Nihei and Kowall, Ann. Neurol. 31: 59-63, 1992).

특히 흥미로운 것은 부분적인 단일측면적 정면의 피질 박리 후에 선조체에서의 피브로넥틴 mRNA 발현에서 일어나는 변화였다(Popa-Wagner et al., Neuroreport 3:853-856, 1992). 피브로넥틴은 생체 내에서 신경 이동을 지지하는 것으로 보이는 다수의 분자 중 하나이다(Fishman and Hatten, J. Neurosci. 13: 3485-3495, 1993). 피브로넥틴 mRNA 혼성화는 손상 공동 아래에서 선조체의 부분에서 72 시간에 즉시 최대 수준으로 증가하였다. 이 초기의 증가는 단기 손상 치료 과정의 성분으로서 설명되었다. 더 큰 동측 선조체에서의 피브로넥틴 발현 후에는 더 오랜 기간동안 증가가 있었고, 손상 후 약 10 일에 최대였다. 이 2 차 증가는 구심로차단에 대한 선조체 반응으로 설명되었다. N-CAM 및 알파 튜불린을 코딩하는 2 개의 다른 mRNA의 발현이 증가된 후 초기 손상 치료-관련 공간적 및 시간적 양상이 있었다.

구심로차단 후 선조체 피브로넥틴 mRNA 발현의 10 일 최대치는 본 연구에서 선조체 도파민 탈신경 후 융기 이동의 지연에 잘 상응한다. 최대 피브로넥틴 mRNA 발현의 지연은 왜 본 발명의 원조 세포가 주입의 약 9일까지 이동하기 시작하지 않았는지 및 왜 최종적으로 이동할 때 한꺼번에 이동했는지를 설명하는 것을 도울 수 있다. 주입 및 손상이 여러 주로 분리된 동물에서, 주입 2 주에서 최대 측면 이동 거리는 극적으로 감소하였다. 이 관찰도 선조체 피브로넥틴 발현에서의 일시적인 최대치와 일치한다. 흑질 손상도 받지 않은 융기를 갖는 소수의 동물에서, 위에 있는 피질의 기계적 손상은 선조체 내의 피브로넥틴 발현이 이동을 촉진하기에 충분하도록 자극할 수 있다. 이어서, 피브로넥틴은 동측 선조체의 도파민 탈신경에 반응하여 상향조절될 수 있고, 이어서, 상의하대로부터 신경 원조의 방사형 이동을 일시적으로 촉진할 수 있다.

성숙한 선조체 내에서 신경 원조의 방사형 이동에 대한 또다른 가능한 영향은 세포 부착 분자에 의한 2 차 효과로부터 유래될 수 있다. 선조체를 포함하여, 뇌의 각종 부분으로의 자상을 입은 성숙한 래트의 뇌로 N-CAM을 주입했더니, 성상세포의 증식이 저해되었다(Krushel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4323-4327, 1995). 성상세포는 신경돌기 성장을 저해하는 인자들을 방출하고, 따라서 신경 재생 반응을 저해할 수 있다. 따라서, 선조체의 탈신경, 및 관련된 상의하의 PSA-N-CAM에서의 증가는 신경 재생을 저해할 수 있다.

또한 도파민-탈신경된 선조체에서의 이동효과의 강화는 도파민작용성 신경지배의 손실과 직접적으로 관련될 수잇다. 선조체의 배아성 발육동안에, 미성숙한 뉴런은 뇌실 부분에서 생겨 방사형으로 이동한다(Bayer, 1984, supra; Bayer and Altman, Prog. Neurobiol. 29: 57-106, 1987). 비록 TGFα발현의 도파민 수용체-중개 저해는 상의하대에서 연구되어지지 않았지만, 이것은 비손상된 동물에서의 이동의 발생이 약해진 것과 일치한다. 따라서, 발육 중의 도파민 신경지배는 전뇌의 도파민작용성 신경지배가 확립될 때 선조체 세포의 이동을 저해할 수 있다.

또한 선조체 도파민은 출생후 발육 초기에 도파민작용성 구심성이 설립될 때 선조체 TGFα의 하향조절에 기여할 수 있다. 성숙한 선조체의 도파민 탈신경은 선조체 세포에 대해 발육중인 선조체에서만 정상적으로 보일 수 있는 국소적인 화학적 환경적 신호-예를 들어, 선조체 뉴런 상에서 발현되는 도파민 수용체에 대한 가능한 리간드의 감소-와 흡사할 수 있다. 또한 선조체 도파민 신경지배는 세포외 매트릭스(ECM) 분자의 발현에 성상세포의 의해 상반된 방식으로 연결될 수 있다 (Gates et al., J. chem. Neuroanat 6: 179-189, 1993). 흥미롭게도, TGFα는 태아의 선조체에서의 향샹된 발현과 유사하게 PD 환자의 선조체에서 선택적으로 향상된다(Mogi et al., Neurosci. Lett. 180: 147-150, 1994). 선조체의 TFα가 도파민 탈신경에 의해 조절된다면, 이 증가는 선조체 도파민의 감소 및 그 결과인 TGFα발현 저해물의 방출과 관련될 것이다.

기본적인 메카니즘과 상관없이, 시간 경과 실험은 상의하의 세포들이 자극되어 이들의 수를 증가시키고 인접한 성숙한 래트 뇌의 선조체 내로 전체적으로 방사형으로 이동할 수 있다는 것을 증명하였다. TGFα주입의 위치 및 투여량이 바뀌는 실험은 선조체 융기의 이동 및 수반되는 엄청난 수의 세포들을 조절할 수 있다는 것을 보인다. 특징화 실험은 상의하의 세포성 확장 및 진한 선조체 융기가 신경 원조 세포로 구성된다는 풍부한 증거들을 제공하였다. 이러한 발견들의 중요성은, 인간의 신경변성 질병 및 외상성 뇌 손상의 치료용으로의 이들의 잠재적인 용도와 함께, 하기에서 논의된다.

이제 본 발명은 특별한 실시예 및 구현예를 참조로 설명되어 왔다. 다른 구현예가 본 명세서를 참고로 당업계의 기술자에게 제안될 것이다.

상술한 발명이 이해를 명확히 하기 위해 설명 및 실시예의 방식으로 일부 자세하게 설명되어왔지만, 첨부된 청구항의 범주 내에서 일부 변화 및 변형이 실행될 수 있다는 것이 명백할 것이다.

Claims (25)

1. 신경학적 결함이 있는 환자를 치료하기 위한 방법으로,

   (a) 환자의 중추신경계(CNS)의 신경 원조 세포를, 표피 성장 인자(EGF) 수용체에 결합하는, 신경 원조 세포의 증식을 자극하기에 충분한 투여량의 폴리펩티드와 접촉시키고,

   (b) 증식하는 원조세포의 자손을 이 세포들이 신경학적 결함을 감소시키기에 충분한 방식으로 존재하고 기능할 CNS의 부분으로 한꺼번에 이동시키는 것을 포함하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 증식하는 신경 원조 세포들의 자손이 분화되도록 자극하는 화합물과 세포들을 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 신경학적 결함이 신경변성 질환, 외상, 신경독 손상, 국소빈혈, 발육장애, 시력에 영향을 미치는 장애, 척수의 손상 또는 질환, 탈수질 질환, 자가면역질환, 감염, 또는 염증성 질환으로 인한 것인 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 신경변성 질환이 알츠하이머병, 헌팅톤병, 또는 파키슨병인 방법.
5. 제 3 항에 있어서, 국소빈혈이 졸중과 관련되는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, EGF 수용체에 결합하는 폴리펩티드가 암피레귤린(AR), 베타셀룰린(BTC), 표피 성장 인자(EGF), 에피레귤린(ER), 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자(HB-EGF), 슈완노마-유래 성장인자(SDGF), 점액종바이러스 성장 인자, 쇼프 섬유종 바이러스 성장 인자, 기형암종-유래 성장 인자-1(TDGF-1), 형질전환 성장 인자 알파(TGFα), 또는 종두증 성장 인자(VGF)인 방법.
7. 제 1 항에 있어서, EGF 수용체에 결합하는 폴리펩티드가 TGFα인 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 신경 원조 세포가 EGF 수용체와 결합하는 폴리펩티드와 생체 내에서 접촉하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 신경 원조 세포가 EGF 수용체와 결합하는 폴리펩티드와 배지 내에서 접촉하는 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 원하는 이동 경로를 따라 또는 그 끝에서, 세포 부착 분자 또는 세포외 매트릭스 분자의 발현을 증가시키는 화합물과 세포를 접촉시킴으로써 이동이 일어나는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 화합물이 TGFβ인 방법.
12. 제 10 항에 있어서, 세포 부착 분자가 피브로넥틴인 방법.
13. 제 10 항에 있어서, 세포 부착 분자가 라미닌인 방법.
14. 제 10 항에 있어서, 화합물이 신경 전구 세포와 이들의 자손이 이동되는 위치 사이의 경로를 따라 적용되는 방법.
15. 제 1 항에 있어서, 경로를 따라 자연적으로 발생하는 이동을 저해하는 신호를 저해하는 화합물과 세포를 원하는 경로를 따라 접촉시킴으로써 이동이 일어나는 방법.
16. 제 1 항에 있어서, CNS 내의 조직을 기계적으로 파열시킴으로써 이동이 일어나는 방법.
17. 제 1 항에 있어서, CNS 내 세포의 활성을 신경화학적으로 차단함으로써 이동이 일어나는 방법.
18. 제 2 항에 있어서, 분화를 자극하는 화합물이 레틴산 또는 뇌-유래 신경영양성 인자인 방법.
19. 신경학적 결함이 있는 환자의 치료 방법으로,

    (a) 환자의 중추신경계(CNS)의 신경 원조 세포를, 표피 성장 인자(EGF) 수용체에 결합하는, 신경 원조 세포의 증식을 자극하기에 충분한 투여량의 폴리펩티드와 접촉시키고,

    (b) 증식하는 원조 세포의 자손을 한꺼번에 CNS의 두번째 부위로 이동시키고,

    (c) 이동된 세포들을 분화를 자극하는 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
20. 제 19 항에 있어서, 신경 간세포의 증식을 자극하는 화합물 및 분화를 자극하는 화합물이 연속적으로 투여되는 방법.
21. 표피 성장 인자(EGF) 수용체에 결합하는 폴리펩티드 및 신경 원조 세포의 분화를 자극하는 화합물을 함유하는 약학적 조성물.
22. 제 21 항에 있어서, EGF 수용체에 결합하는 폴리펩티드가 TGFα인 약학적 조성물.
23. 제 21 항에 있어서, EGF 수용체에 결합하는 폴리펩티드가 TGFα이고, 신경 원조 세포의 분화를 자극하는 화합물이 뇌-유래 신경영양성 인자인 약학적 조성물.
24. 제 1 항에 있어서, 중추신경계에 대한 손상이 척수에 대한 손상인 방법.
25. 제 1 항에 있어서, 중추신경계에 대한 손상이 망막에 대한 손상인 방법.