KR20080109943A

KR20080109943A - 영장류 배아 줄기 세포 기원의 신경 줄기 세포, 운동 뉴런 및 도파민 뉴런의 시험관내 분화 방법

Info

Publication number: KR20080109943A
Application number: KR1020087028900A
Authority: KR
Inventors: 수-천 창; 제임스 에이. 톰슨; 이안 데이비드 던칸; 수에-준 리
Original assignee: 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2004-08-27
Publication date: 2008-12-17
Also published as: GB0605851D0; JP2007503811A; IL173832A; KR20060115351A; IL173832A0; GB2421029B; EP1670901A4; CA2536588A1; CA2536588C; GB2421029A; WO2005021720A2; IL198450A; AU2004269361A1; WO2005021720A3; AU2004269361B2; EP1670901A2; JP5529561B2; JP2010162024A

Abstract

본 발명은 배아 줄기 세포를 신경 및 운동 세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 조기 로제트 형태 및 Sox1^-/Pax6⁺를 특징으로 하는 다수의 세포를 포함하는 세포군을 FGF2, FGF4, FGF8, FGF9 또는 RA의 존재하에 배양하는 단계를 포함하고 여기서, 당해 세포는 신경관형 로제트 형태 및 Pax6⁺/Sox1⁺를 특징으로 한다.

Description

영장류 배아 줄기 세포 기원의 신경 줄기 세포, 운동 뉴런 및 도파민 뉴런의 시험관내 분화 방법{METHOD OF IN VITRO DIFFERENTIATION OF NEURAL STEM CELLS, MOTOR NEURONS AND DOPAMINE NEURONS FROM PRIMATE EMBRYONIC STEM CELLS}

사람 배아 줄기(ES) 세포는 이식전 배아의 내부 세포 매쓰로부터 유래하는 만능세포이다[문헌참조: Thomson, J. A., et al., Science 282: 1145-1147,1998]. 마우스 ES 세포와 유사하게 이들은 삼배엽층 모두를 갖는 다양한 체세포로 분화하는 잠재력을 유지하면서 다수로 증식될 수 있다[문헌참조: Thomson, J. A., et al., supra, 1998; Reubinoff, B. E., et al., Nat. Biotech. 18: 399, 2000; Thomson, J. A. and Odorico, J. S., Trends Biotech 18: 53-57,2000 ; Amit, M., et al., Dev. Biol. 227: 271-278,2000]. ES 세포의 시험관내 분화는 이식 치료를 위한 공여체 세포의 초기 발육 및 생성에 대한 세포 및 분자 기작을 연구하기 위한 새로운 전망을 제공한다. 실질적으로, 마우스 ES 세포는, 조혈 세포[문헌참조: Wiles, M. V. and Keller, G., Development 111: 259-267,1991], 심근세포[문헌참조: Klug, M. G., et al., J. Clin. Invest. 98: 216-224, 1996], 인슐린 분비 세포[문헌참조: Soria, B., et al., Diabetes 49: 157-162, 2000] 및 신경교[문헌참조: Bain, G., et al., Dev. Biol. 168: 342-357,1995 ; Okabe, S., et al., Mech. Dev. 59: 89-102, 1996; Mujtaba, T., et al., Dev. Biol. 214: 113-127,1999 ; Brustle, O., et al., Science 285 : 754-756, 1999]를 포함하는, 많은 임상적으로 관련된 세포 유형으로 시험관에서 분화하는 것으로 밝혀졌다. 설치류 중추신경계(CNS)로 이식된 후, ES 세포 유래 신경 전구체는 숙주 조직에 통합하고 몇몇 경우에 기능을 개선시키는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: McDonald, J. W., et al., Nat. Med. 5: 1410-1412,1999]. 사람 ES 세포의 임상적 적용은 특정 조직 및 기관에 대한 고도로 순수한 공여체 세포의 생성을 필요로 한다.

당업계에서는 분화하는 사람 ES 세포 배양물로부터 이식가능한 신경 세포 및 운동 뉴런 전구체를 분리하기 위한 단순하면서도 효율적인 전략이 요구된다.

발명의 요약

한 양태에서, 본 발명은 조기 로제트(rosette) 형태를 특징으로 하고 Sox1^-, Pax6⁺인 배아 줄기 세포로부터 배양된 동조 세포군을 포함하는 세포군을 생성시키는 방법이다. 한 양태에서, 본 발명은 (a) 배아 줄기 세포를 배상체로 증식시키는 단계 및 (b) 배상체를 신경 관형 로제트 형태의 신경 줄기 동조 세포군으로 증식시키는 단계를 포함하고 여기에서, 증식은 FGF2, FGF8, FGF4 또는 FGF9의 존재하에 수행된다. 배아 줄기 세포의 증식에서 조기 로제트 발육까지의 총 시간은 바람직하게 8일 내지 10일이다. 바람직하게, 전체 Pax6⁺/Sox1^-의 세포군은 총 세포군의 70% 이상이다.

본 발명은 또한 당해 방법에 의해 생성되는 세포군에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 신경 관형 로제트 형태임을 특징으로 하고 Pax6⁺/Sox1⁺인 신경 줄기 동조 세포군을 생성하는 방법에 관한 것이고 이러한 방법은 조기 로제트 형태를 특징으로 하고 FGF2, FGF4, FGF8 또는 RA의 존재하에 4 내지 6일 동안 Sox1^-, Pax6⁺인 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 당해 방법에 의해 생성되는 세포군에 관한 것이다.

한 양태에서, 조기 로제트 세포는 바람직하게 4 내지 7일 동안 FGF8과 함께 배양되고 EN1⁺이다. 또 다른 양태에서, 세포는 바람직하게 4 내지 7일 동안 FGF2와 배양되고 Bf1⁺이다. 또 다른 양태에서, 세포는 바람직하게 4 내지 7일 동안 RA와 함께 배양되고 Hox⁺이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 중뇌 도파민 뉴런군을 분리하는 방법에 관한 것이고, 당해 방법은 상기된 세포를 FGF8의 존재하에 SHH와 함께 배양하는 단계를 포함하고 여기에서, 수득한 세포는 TH, AADC, EN-1, VMAT2 및 DAT를 발현하지만 DbH 및 PNMT를 발현하지 못한다. 본 발명은 또한 당해 방법에 의해 생성되는 세포군에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 척수 운동 뉴런군을 분리하는 방법에 관한 것이고, 당해 방법은 상기된 세포를 RA의 존재하에 SHH와 함께 배양하는 단계를 포함하고, 여기에서, 수득한 세포는 HB9, HoxB1, HoxB6, HoxC5, HoxC8, ChAT 및 VAChT를 발현한다. 본 발명은 또한 당해 방법에 의해 생성되는 세포군에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 전뇌 도파민 뉴런군을 분리하는 방법에 관한 것이고 당해 방법은 상기된 세포를 SHH와 함께 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 당해 방법에 의해 생성되는 세포군에 관한 것이다.

본 발명은 또한 정상 사람 신경 발육에 영향을 미치는 능력에 대해 제제를 스크리닝하기 위한 상기된 세포군 시험 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적, 잇점 및 특징은 명세서, 특허청구범위 및 도면을 검토한 후에 명백해질 것이다.

여기에서, 본 발명자는 사람 배아 줄기 세포로부터 도파민(전뇌 및 중뇌) 및 운동 뉴런의 생성 방법을 기재한다. 바람직한 방법은 일반적으로 하기 표 1 내지 3에 기재되어 있다.

특히, 본 발명자는 배상체 중간체를 통해 ES 세포로부터 조기 로제트(Pax6⁺/Sox1^-)를 분화시키는 방법을 소개한다. 차등 처리에 의해, 본 발명자는 이들 조기 로제트를 3개의 상이한 형태의 신경관형 로제트로 분화시킬 수 있었고 이어서 당해 로제트는 전뇌 도파민 뉴런, 중뇌 도파민 뉴런 또는 운동 뉴런으로의 발육을 위해 적합하다.

본 발명자는 도파민 및 운동 뉴런을 생성하기 위한 1단계 및 2단계를 기재하는 하기의 표 2를 참조한다. 표 2는 또한 출원인이 적합한 발육 마커인 것으로 여기는 다양한 중간체 생성물을 기재하고 있다.

사람 배아 줄기 세포로부터 도파민 및 운동 뉴런의 생성
단계 1	배아 줄기 세포의 증식 및 이들 세포의 신경관형 로제트 형태의 신경 줄기 동조 세포군으로의 발육
단계 2	차등 배양 조건을 통한 단계 1 세포의 전뇌 도파민 뉴런, 중뇌 도파민 뉴런 또는 운동 뉴런으로의 발육

상기된 바와 같이, 본 발명은 2개의 주요 양태를 포함한다. 한 양태는 동조 신경 줄기 세포군(또는 신경상피세포)을 신경관형 로제트 형태로 생성하고 신경상피세포 마커 Pax6, Sox1, 네스틴, 무사쉬-1을 발현시키는 과정이다. 본원에 사용된 바와 같이, 동조는 이종성 분화를 유도하는 RA에 의해 유도되는 것(즉, 배양물은 선구체에서 분화된 뉴런까지의 발육 단계에 있는 세포를 포함한다)과 반대로 동일한 발육 단계에 있는 세포군을 의미한다. 이 경우에 본 발명자는 조기 단계에서 Pax6⁺/Sox1^- 조기 신경상피세포를 또는 후기 단계에서 Pax6⁺/Sox1⁺ 신경상피세포를 관찰한다. 어느 단계에서든, 본 발명자는 임의의 분화된 뉴런을 관찰하지 못했다. 당해 동조 발육은 본원에 기재된 바와 같이 특정 신경 페이트를 향한 직접적인 분화를 허용한다.

제2 양태는 신경상피 세포를 특정 뉴런, 예를 들어, 중뇌 도파민 뉴런, 전뇌 도파민 뉴런 및 척수 운동 뉴런으로 추가로 분화시키는 방법이다.

하기의 표 3은 본 발명의 세포를 수득하기 위한 바람직한 방법을 기재하고 있다. 표 3은 유사한 배양액 및 중요한 성장 인자 및 타이밍 성분에 의해 대체될 수 있는 일반 배양 브로쓰 성분들을 포함한다. 본 발명자가 신경 세포 배양 배지를 언급하는 경우, 많은 배양 성분들이 적합할 수 있다. 하기 부분은 올바른 분화를 위해 필요한 배양 성분들을 강조한다.

일반적으로, 적합한 배지는 신경 세포를 성장시키기 위해 사용되는 임의의 배지이다. 문헌[참조: Bain, G., et al., supra, 1995; Okabe, S., et al., supra, 1996; Mujtaba, T., et al., supra, 1999; Bustle, O., et al., supra, 1999; Zhang, S. C., et al., J. Neurosci. Res. 59: 421-429,2000 ; Zhang, S. -C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4089-4094,1999 ; Svendsen, C. N., et al., Exp. Neurol. 137: 376- 388,1996 ; Carpenter, M. K., et al., Exp. Neurol. 158: 265-278, 1999; Vescovi, A. L., et al., Exp. Neurol. 156: 71-83,1999]은 동일하거나 유사한 매질을 사용한다.

1. 사람 ES 세포로부터 신경상피 세포(신경 줄기 세포)의 분화

신경상피 세포의 생성은 4-6일 동안 현탁 배양물에서 배상체의 형성에 이어서 각각의 콜로니 중앙에서 세포가 원주가 되고 로제트 형태로 구성되는 경우, 성장 인자, 바람직하게 FGF2 또는 FGF8의 존재하에 4 또는 5일 동안의 접착 배양을 포함한다(도 1A, 도 4A, 도 9A, B)[문헌참조: Zhang, et al., Nature Biotechnol., 2001]. FGF4 및 FGF9은 또한 적합한 성장 인자이다.

이들 로제트에서 원주 세포는 신경 전사인자 Pax6을 발현하지만 또 다른 신경 전사인자 Sox1을 발현하지 않는다(도 9C, D). 본 발명자는 이들 로제트를, 이들이 조기에 나타나고 루멘 없이 단층의 원주 세포에 의해 형성되기 때문에 "조기 로제트"라고 부른다. 단일 콜로니 마다 조기 로제트를 소유한다. 총 조기 로제트 세포군은 총 세포의 70% 이상이다.

이들 조기 로제트의 4 내지 6일 동안의 추가의 배양은 신경관형 로제트 형성을 유도한다(도 1B, 도 4B, 도 9E). 신경관형 로제트는 명백한 루멘과 함께 다층의 원주 세포에 의해 형성된다. 로제트내 세포는 Pax6 뿐만 아니라 Sox1을 발현한다(도 4C, 도 9F, G, H). 조기 로제트로부터 신경관형 로제트로의 진행은 10 내지 20ng/ml의 FGF2, FGF4, FGF8, FGF9의 존재하에 또는 0.001 내지 1μM의 RA의 존재하에 본 발명의 무혈청 배양 조건하에 약 4 내지 6일 걸린다.

ES 세포에서 신경관형 로제트 형성으로의 신경상피 분화 과정은 14 내지 16일 걸린다. 사람 ES 세포는 5.5일된 사람 배아로부터 유래된다(문헌참조: Thomson, J.A., et al., supra. 1998). 따라서, 본 발명의 배양 시스템에서 사람 ES 세포 기원의 신경상피 세포의 발육은 사람 배아에서 19 내지 21일 동안 발육된 것에 상응한다. 정상 사람 발육에서, 신경관은 20 내지 21일에서 형성된다. 따라서, 사람 ES 세포로부터 신경상피의 분화는 정상 사람 배아 발육을 반영한다[문헌참조: Zhang, S. C., J. Hematother. Stem Cell Res. 12: 625-634, 2003]

형태적 형질전환 및 명백한 유전자 발현 패턴에 의해 입증되는 바와 같이 2단계 신경상피 발육은 이전에 기술된 적이 없다. Pax6 및 Sox1은 개구리, 관상어, 닭 및 마우스에서 신경관이 형성될 때, 신경상피세포에 의해 동시에 발현되는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Pevny, et al., Development 125: 1967-1978,1998]. 따라서, 본 발명자는 사람 ES 세포에서 신경상피 분화에 따라 연속 Pax6 및 Sox1 발현의 발견이 신규한 것이고 사람에게 유일한 것일 수 있다고 믿고 있다. Pax6⁺/Sox1^- 신경상피 세포는 지금까지 동정된 것중에서 가장 조기의 신경상피 세포이다. 이들 세포의 기능적 중요성은 신경관형 로제트에서 Pax6⁺/Sox1⁺ 신경상피 세포가 아니라 조기 로제트에서 Pax6⁺/Sox1^- 신경상피 세포가 중뇌 도파민 뉴런 및 척수 운동 뉴런과 같은 전뇌 이외의 위치적 실체를 갖는 뉴런이 되도록 효율적으로 유도될 수 있다는 점에서 본 발명에 적절하다(상기 표 1 참조).

분화하는 ES 세포 콜로니 마다, 신경관형 로제트를 형성한다. 신경상피 세포는 총 분화 세포중 적어도 70 내지 90%를 차지한다.

신경관형 로제트 형태의 신경상피 세포는 저농도의 디스파제 및 차등 접착에 의한 처리를 통해 정제될 수 있다[미국 특허출원 제09/960,382호에 기재됨].

2. 중뇌 도파민 뉴런의 생성

잠재적인 치료학적 응용성을 갖는 기능성 뉴런은 뉴런이 되는 것 뿐만 아니라 2개 이상의 추가의 특징을 가져야만 한다: 특이적 위치적 실체 및 신경 전달물질을 합성하고 분비하고 흡수하는 능력.

중뇌 도파민 뉴런을 생성하는 제1 단계는 중뇌 실체의 유도이다. Pax6⁺/Sox1⁺ 신경관형 로제트 세포가 아닌 Pax6⁺/Sox1^- 조기 로제트 세포를 FGF8(50 내지 200ng/ml)로 6 또는 7일 동안 처리하여 길쭉해진 중뇌 전사 인자 1(En-1) 및 Pax2(도 4E, F)를 발현하고 전뇌 마커 Bf-1(도 4D)을 하향 조절하는 선구체로 세포를 효율적으로 분화시킨다.

제2 단계는 소닉 헤지호그(SHH, 50 내지 250ng/ml)의 존재하에 6 내지 7일 동안에 이어서 일반 신경 분화 배지에서(표 3에 기재된 바와 같음) 추가로 2주동안 도파민 뉴런이 발육될때까지 중뇌 선구체를 배양하는 것이다. 바람직하게, 총 분화된 세포의 35% 이상이 도파민 뉴런이 될 것이다.

바람직한 분화 배지는 표 3에 기재되어 있다.

도파민 뉴런은 TH, AADC를 발현하지만 DbH 및 PNMT를 발현하지 않아(도 5) 도파민은 합성할 수 있지만 노르에피네프린 또는 네프린으로의 추가 대사는 발생하지 않는다.

도파민 뉴런은 En-1, ptx3, Nurr1 및 Lmx1b(도 6A, B), 중뇌 도파민 뉴런 발육을 위해 요구되는 전사 인자를 발현한다.

도파민 뉴런은 GABA(도 6C)를 발현하지 않는다. GABA와의 동시 발현은 후각망울에서 도파민 뉴런의 특징이다.

도파민 뉴런은 칼빈딘(도 6D)을 발현하지 않는다. 칼빈딘과의 동시 발현은 중뇌의 외피 영역에서의 도파민 뉴런의 특징이다.

이와 함께, 상기 특징은 본 발명의 배양 시스템에서 생성된 도파민 뉴런이 흑색질에서의 뉴런과 보다 유사한 중뇌 도파민 뉴런이고 이는 파킨슨 질환에서 상실된 도파민 뉴런이다.

도파민 뉴런은 c-ret, GDNF에 대한 수용체(도 7A, B, C), 도파민 뉴런의 생존 및 기능을 위해 요구되는 성장 인자를 갖는다.

도파민 뉴런은 또한 저장 및 분비 도파민을 위해 요구되는 수송체인 VMAT2(도 7D, E,F)를 발현한다. 이들은 또한 방출 후 도파민 흡수에 필요한 수송체인 DAT(도 7G, H, I)를 발현한다. 따라서, 본 발명의 배양 시스템에서 생성된 도파민 뉴런은 전달물질 도파민의 합성, 저장, 방출 및 흡수를 위해 필요한 기구를 갖는다.

도파민 뉴런은 시냅스 형성을 위해 시냅토피신(도 7)을 발현한다. 이들은 활동 전위를 개시할 수 있고 자극에 응답하여 도파민을 분비할 수 있다(도 8). 따라서, 도파민 뉴런은 기능적이다.

3. 척수 운동 뉴런의 생성

척수 운동 뉴런을 생성시키는 제1 단계는 척주(미골) 실체의 유도이다. Pax6+/Sox1+ 신경관형 로제트 세포(도 10A)가 아니라 Pax6+/Sox1- 조기 로제트 세포를 RA(0.001 내지 1μM)로 6 내지 7일 동안 처리하여 HoxB1, HoxB6, HoxC5, HoxC8과 같은 척주 전사 인자 Hox 유전자를 발현하지만 전뇌 마커 Otx2 및 Bf-1 또는 중뇌 마커 En-1(도 11A, C, D, E)을 발현하지 않는 선구체로 세포를 효율적으로 분화시킨다.

제2 단계는 단지 내부 신경 선구체에 의해 발현되는 전사인자인 Olig2의 발현(도 11F, G, H)에 이어서 추가로 7 내지 10일 동안 일반 신경 분화 배지에서 척수 운동 뉴런이 발육될때까지 발현시킴에 의해 입증되는 바와 같이 내부화된 선구체의 특징을 유도하기 위해 6 내지 7일 동안 소닉 헤지호그(SHH, 50 내지 250ng/ml)의 존재하에 척주 선구체를 배양하는 것이다.

바람직한 분화 배지는 표 3에 기재되어 있다.

바람직한 양태에서, 총 분화된 세포의 22% 이상은 척수 운동 뉴런이 된다. 운동 뉴런은 척주 운동 뉴런에 의해 특이적으로 발현되는 전사인자인 HB9, islet1/2 및 Lim3(도 10)을 발현한다. 운동 뉴런은 또한 HoxB1, HoxB6, HoxC5, HoxC8을 발현하지만 전뇌 마커 Otx2 및 Bf-1 또는 중뇌 마커 En-1(도 11A, C, D, E)를 발현하지 않고 이것은 이들이 척수 운동 뉴런임을 지적한다.

운동 뉴런은 운동 뉴런 전달물질 아세틸콜린을 합성하는데 필요한 효소인 ChAT(도 12A, B, C, D)를 발현한다. 운동 뉴런은 또한 VAChT(도 12E)를 발현하고 이것은 운동 뉴런이 전달물질 아세틸콜린을 저장하고 흡수할 수 있음을 제안한다.

추가로, 운동 뉴런은 시냅스 형성을 위한 시냅신(도 12F)을 발현한다. 이들은 활동 전위를 개시할 수 있다(도 13). 따라서, 운동 뉴런은 기능성이다. 본 발명자는 운동 뉴런이 HPLC에 의해 분석된 바와 같이 아세틸콜린을 방출함을 보여주는 데이타를 갖고 있다.

4. 전뇌 뉴런의 생성

또 다른 양태에서, 본 발명은 영장류 ES 세포(바람직하게는 사람 ES 세포)를 전뇌 도파민 뉴런, 바람직하게는 신경계 복구를 위해 적합한 이식가능한 신경 전구체로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게 중뇌 도파민 뉴런 생성을 위해 상기된 바와 같은 방법을 누구나 개시할 것이다. 전뇌 뉴런을 생성하기 위해, Pax6⁺/Sox1^- 세포를 FGF2로 4 내지 6일 동안 추가로 처리함에 이어서 SHH로 처리한다. 전뇌 도파민 뉴런을 생성하는 단계 및 도파민 뉴런 특성을 측정하기 위한 분석은 중뇌 도파민 뉴런에 대해 기재된 것들과 유사하다. 주요 차이는 특정 기간에서 모르포겐의 사용 및 도파민 뉴런의 특징이다.

전뇌 도파민 뉴런을 생성하는 제1 단계는 중뇌 실체의 유도이다. Pax6+/Sox1- 조기 로제트 세포를 6 또는 7일 동안 FGF2(10 내지 20ng/ml)로 처리하여 전뇌 전사인자 Bf-1 및 Otx2를 발현하는 선구체로 세포를 효율적으로 분화시킨다.

제2 단계는, 6 내지 7일 동안 소닉 헤지호그(SHH, 50 내지 250ng/ml)의 존재하에 이어서 추가로 2주동안 일반 뉴런 분화 배지에서 도파민 뉴런이 발육될때까지 전뇌 선구체를 배양하는 것이다. 총 분화된 세포의 35%는 도파민 뉴런이 된다. 미국 특허원 제09/970,382호에서 발췌한 하기의 기재는 바람직한 방법을 기재하고 있다.

영장류 ES 세포주, 바람직하게, 사람 ES 세포주를 먼저 수득하고 증식시킨다. 문헌[참조: Thomson, J.A., et al., Science 282:1145-1147(1998)] 및 미국 특허 제5,843,780호 및 제6,200,806호에 기재된 바와 같이 또는 핵형이 정상이고 11개월 이상 및 바람직하게는 12개월 동안 연속 배양 후 미분화된 상태로 증식하는 능력을 갖는 ES 세포주를 수득하는데 적합한 다른 방법에 의해 ES 세포주를 수득할 수 있다. 배아 줄기 세포주는 또한 배양 전반에 걸쳐 외피층을 형성하는 능력 및 모든 삼배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 유래되는 조직으로 분화하는 능력을 보유할 것이다.

이어서 당해 세포를 배양한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 세포는 바람직하게 하기의 문헌[참조: Thomson, J. A., et al., supra, 1998 및 미국 특허 제5,843, 780호 및 제6,200,806호]에 기재된 바와 같이 방사선 조사된 포유동물, 바람직하게 마우스, 배아 섬유아세포의 영양 공급 층상에서 증식시킨다. 본 발명자는 또한 당해 세포가 영양 공급 세포층없이 증식할 수 있음을 고려한다.

ES 세포 콜로니는 전형적으로 디스파제로 처리하여 접착 배양으로부터 온전하게 제거되고 바람직하게 하기된 바와 같이 4일 동안 자유 유동 ES 세포 응집체(배상체로 호칭됨, EB)로서 현탁액에서 성장한다.

이어서, EB는 바람직하게 20ng/ml의 FGF2를 함유하는 배지에서 배양하여 조기 로제트 세포를 생성시킨다. 배지의 기타 바람직한 성분은 표 3에 기재된 바와 같다. 그러나, 많은 기타 배지 성분들이 적합할 수 있다. 일반적으로, 적합한 배지는 신경 세포를 성장시키는데 사용되는 임의의 배지이다. 하기의 문헌[참조: Bain, G., et al., supra, 1995; Okabe, S., et al., supra, 1996; Mujtaba, T., et al., supra, 1999; Bustle, O., et al., supra, 1999; Zhang, S. -C., et al., J. Neurosci. Res. 59: 421-429,2000; Zhang, S. -C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4089-4094, 1999; Svendsen, C. N., et al., Exp. Neurol. 137: 376- 388,1996; Carpenter, M. K., et al., Exp. Neurol. 158: 265-278, 1999; Vescovi, A. L., et al., Exp. Neurol. 156: 71-83,1999]은 동일하거나 유사한 배지를 사용하고 있다.

배지에서 약 5일 동안 배양한 후, 분주된 EB는 편평 세포의 과증식을 유발하고 7일까지 중앙이 약간 길어진 세포는 도 1B에 도시된 바와 같이 로제트 형성을 유발한다. 이들 형성은 조기 신경관과 유사하다(도 1B의 사진). 형태, 또는 하기에 기재된 바와 같이 네스틴 및 무사쉬 I와 같은 신경 마커 항원을 사용한 면역형광 분석에 의해 신경 전구체의 존재를 확인할 수 있다. 바람직하게, 신경 전구체는 총 세포의 72% 이상을 차지하고 가장 바람직하게는 84% 이상을 차지한다.

추가로, 하기 실시예에 기재된 바와 같이 바람직하게 차등 효소적 처리 및 접착에 의해 신경관형 로제트를 분리할 수 있다. 간략하게, 디스파제에 의한 처리는 중앙 신경상피 섬을 우선적으로 탈착시킨다. 로제트 세포의 클러스터를 주변 편평 세포로부터 분리하기 위해, 8일 내지 10일 동안 배양된 분화하는 EB는 바람직하게 37℃에서 15 내지 20분 동안 0.1 내지 0.2mg/ml의 디스파제(Gibco BRL, Lifetechnologies, Rockville, MD)로 항온처리한다. 또한, 0.2mg/ml의 디스파제를 사용할 수 있다. 로제트 클럼프는 후퇴하는 반면 주변 편평 세포는 접착된 상태로 남아있다. 이 점에서, 로제트 클럼프는 편평 세포가 부착되어 있는 플라스크를 흔들어서 제거될 수 있다. 클럼프는 펠렛화하고 약하게 5ml의 피펫으로 분쇄하고 30분 동안 배양 플라스크로 분주하여 오염시키는 각각의 세포를 접착시킨다. 부유 로제트 클럼프를 이어서 바람직하게 폴리-(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트)로 피복된 새로운 플라스크로 옮겨서 부착을 차단하고 FGF2(전형적으로 20ng/ml)의 존재와 함께 사람 신경 전구체를 위해 사용되는 배지에서 배양한다. 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, 디스파제로 처리함에 이어서 차등 접착시켜 전형적으로 90% 이상 및 가장 바람직하게는 96% 이상의 고도로 집적된 신경 전구체 세포군을 수득할 것이다. 추가로, PSA-NCAM에 대한 항체를 사용하는 면역 분리와 같은 기타 방법을 사용하여 신경 전구체 세포를 분리할 수 있다.

하기의 실시예는 사람 ES 세포 유래 신경 전구체가 모든 3개의 CNS 세포 유형을 시험관내에서 생성시킬 수 있음을 입증한다.

하기의 표는 본 발명의 당해 양태의 다양한 측면에 대한 흐름도이다.

시험관내 및 생체내에서 신경 전구체 세포의 특성 분석

ES 세포

배상체

신경관형 구조로의 분화

다스파제 처리를 사용한 신경 전구체의 분리

디스파제로 처리하고 4일 동안 FGF2없이 ES 배지에서 자유 유동 조건으로 배양함에 이어서 FGF2(10 내지 20ng/ml)과 함께 화학적으로 규명된 배지에서 2일 동안 배양한다. FGF2를 함유하는 화학적으로 규명된 배지에서 7 내지 9일 동안 접착 배양 조직분석 및 면역조직화학 분석에 의해 규명된 바와 같이 신경 상피 세포를 나타내는 독특한 구조가 있다. 신경 전구체 세포는 전형적으로 적어도 총 세포의 72 내지 84%를 차지한다. 디스파제로 처리함에 이어서 차등 접착에 의해 고도로 집적된 신경 전구체 세포군(바람직하게 95% 이상)을 수득한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 72% 이상 및 바람직하게는 84%의 신경 전구체 세포를 포함하는 세포군이다. 이들 신경 전구체 세포는 네스틴 및 무사쉬 I에 양성임으로 규명될 수 있다. 도 1B는 당해 세포를 특정지우는 로제트 형성을 도시한다. 로제트 형성이란 세포가 원주 형태이고 관형(로제트) 구조로 배열되어 체내 신경관(발육하는 뇌)과 유사함을 의미한다. 원주 세포 형태 및 관형 구조는 도 1B의 사진에 보여진다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 90% 이상 및 바람직하게 96% 이상의 신경 전구체 세포의 세포군이다. 바람직하게, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 차등 효소적 처리 및 접착 후 당해 세포를 수득한다.

5. 본 발명의 세포군의 용도

특이적 전달물질 표현형 및 독특한 위치적 실체를 갖는 특정 사람 신경 세포 유형의 생성은 신경 장애를 치료하기 위한 이식가능한 세포 공급원, 예를 들어, 파킨슨 질환에 대한 중뇌 도파민 뉴런, 정신 질환에 대한 전뇌 도파민 뉴런 및 척주 손상 및 ALS를 포함하는 운동 뉴런 질환에 대한 척수 운동 뉴런을 제공한다.

사람 배아 줄기 세포를 먼저 신경 상피 세포에 이어서 특정 뉴런으로 직접 분화시키기 위한 단계적 및 화학적으로 규명된 배양 시스템의 확립은 또한 독성 및 치료학적 제제를 스크리닝하기 위한 전례없는 시스템을 제공한다. 현재, 독성학적 및 치료학적 약물 스크리닝은 동물, 동물 세포 배양 또는 유전학적으로 비정상적인 사람 세포주를 사용하여 수행한다. 사람 배아 줄기 세포 및 특정 뉴런 세포로의 이의 분화는 사람 신경 발육에 정상적인 과정을 나타낸다. 따라서, 본원의 발명은 정상적인 사람 신경 발육에 영향을 주는 제제 또는 잠재적으로 비정상적으로 뇌를 발육시키는 제제 뿐만 아니라 질환 증상에서 신경 유형의 복원을 자극할 수 있는 제제를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 추가로, 기재된 시스템은 도파민 뉴런을 사멸시키는 병리학적 과정(예를 들어, 파킨슨 질환) 또는 운동 뉴런을 사멸시키는 병리학적 과정(예를 들어, ALS)과 모사하도록 용이하게 변형될 수 있어 당해 질환들을 치료하기 위해 디자인된 치료학적 제제를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

이러한 양태의 본 발명의 바람직한 방법에서, 본 발명의 세포군의 하나를 시험 화합물에 노출시키고 당해 노출 결과를 노출되지 않은 대조 세포군과 비교한다. 배양의 특성을 조사하고 이들을 본원에 포함되는 공지된 발육 특성과 비교하여 특정 시험 화합물이 세포군에 영향을 미치는지의 여부를 이해할 수 있다.

신경상피(신경 줄기) 세포-바람직한 배양 조건 및 마커

단계	세포명	세포 특이적 마커	배양 배지 성분	배양 배지 조건	전기생리학적 마커
단계 1	ES	Oct4+, SSEA4+ Pax6-, Sox1-	방사선 조사된 마우스 섬유아세포; DMDM/F12(1:1); 20% 혈청 대용물; 2㎍/ml의 헤파린; 0.1mM β-머캅토에탄올; 4ng/ml의 FGF2	매일 배지 교환; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 1	제1 디스파제 처리	N/A	1-2mg/ml의 디스파제	30분; 37℃; 주변 대기	N/A
단계 1	EB	Oct4+, SSEA4+ Pax6-, Sox1-	현탁액 배양, 마우스 섬유아세포 부재; DMDM/F12(1:1); 20% 혈청 대용물; 2㎍/ml의 헤파린; 0.1mM β-머캅토에탄올; FGF2 부재	4일; 배지를 매일 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 1	EB	Oct4+, SSEA4+ Pax6-, Sox1-	현탁액 배양, 마우스 섬유아세포 부재; DMEM/F12(1:1); 25㎍/ml의 인슐린; 100㎍/ml의 트랜스페린; 20nM 프로게스테론; 60μM 푸트레신; 30nM 나트륨 셀레니트; 10-20ng/ml의 FGF2	2일; 배지를 매일 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 1	조기 로제트	Oct4-, SSEA4- Pax6+, Sox1- 네스틴+ PSA-NCAM-	DMEM/F12(1:1); 25㎍/ml의 인슐린; 100㎍/ml의 트랜스페린; 20nM 프로게스테론; 60μM 푸트레신; 30nM 나트륨 셀레니트; 10-20ng/ml의 FGF2	5일; 배지를 2일에 1회 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 1	신경관형 로제트	Pax 6+,Sox1 + 네스틴+, Bf-1+	DMEM/F12(1:1); 25㎍/ml의 인슐린; 100㎍/ml의 트랜스페린; 20nM 프로게스테론; 60μM 푸트레신; 30nM 나트륨 셀레니트; 10-20ng/ml의 FGF2	3 내지 5일; 배지를 2일에 1회 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 1	제2 디스파제 처리	N/A	0.1 내지 0.2mg/ml의 디스파제	15 내지 20분; 36.5℃; 주변 대기	N/A

중뇌 도파민 뉴런 - 바람직한 배양 조건 및 마커

단계	세포명	세포 특이적 마커	배양 배지 성분	배양 배지 조건	전기생리학적 마커
단계 1	ES	Oct4+, SSEA4+ Pax6-, Sox1-	방사선 조사된 마우스 섬유아세포; DMDM/F12(1:1); 20% 혈청 대용물; 2㎍/ml의 헤파린; 0.1mM β-머캅토에탄올; 4ng/ml의 FGF2	매일 배지 교환; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 1	ES(제1 디스파제 처리)	N/A	1-2mg/ml의 디스파제	30분; 37℃; 주변 대기	N/A
단계 1	EB	Oct4+, SSEA4+ Pax6-, Sox1-	현탁액 배양, 마우스 섬유아세포 부재; DMDM/F12(1:1); 20% 혈청 대용물; 2㎍/ml의 헤파린; 0.1mM β-머캅토에탄올; FGF2 부재	4일; 배지를 매일 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 1	EB	Oct4+, SSEA4+ Pax6-, Sox1-	현탁액 배양, 마우스 섬유아세포 부재; DMEM/F12(1:1); N2 보충물; 2ng/ml의 헤파린; 10-20ng/ml의 FGF2	2일; 배지를 매일 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 1	조기 로제트	Oct4-, SSEA4- Pax6+, Sox1- 네스틴+ PSA-NCAM-	DMEM/F12(1:1); N2 보충물; 2ng/ml의 헤파린; 10-20ng/ml의 FGF2	5일; 배지를 2일에 1회 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 2	신경관형 로제트	Pax6+, Sox1+ 네스틴+, En1+, Pax2+	DMEM/F12(1:1); N2 보충물; 2ng/ml의 헤파린; 10-200ng/ml의 FGF8	5 또는 6일; 배지를 2일에 1회 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 2	신경 상피 세포(제2 디스파제 처리)	N/A	0.1-0.2mg/ml 디스파제	15 내지 20분; 36.5℃; 주변 대기	N/A
단계 2	신경 상피 세포의 증식	Pax 6+,Sox1 + 네스틴+, En1+, Pax2+	DMDM/F12(1:1); N2 보충물; 2ng/ml의 헤파린; 10-200ng/ml의 FGF8 + 50-250ng/ml의 SHH	5 내지 6일; 배지를 2일에 1회 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 2	제1 해리	N/A	N/A	아쿠타제(Gibco)	N/A
단계 2	중뇌 DA 뉴런	TH+, AADC+, DbH-, PNMT-, EN1+, Bf-1-, Nurr1+, ptx3+, Lmx1b+, VMAT+, DAT+, c-ret+, GABA-, 칼빈딘-, CCK-	신경기본 배지; N2; 0.1mM 비필수 아미노산; 0.5mM 글루타민; 1㎍/ml의 라미 닌; 1μM의 cAMP; 200μM 아스코르브산; 10ng/ml BDGF; 10ng/ml의 GDNF	2 내지 3주; 배지를 2일에 1회 교환; 배양 평판 접시; 36.5℃, 5% CO₂	DA의 분비, 활동 전위

척수 운동 뉴런 - 바람직한 배양 조건 및 마커

단계	세포명	세포 특이적 마커	배양 배지 성분	배양 배지 조건	전기생리학적 마커
단계 1	ES	Oct4+, SSEA4+ Pax6-, Sox1-	방사선 조사된 마우스 섬유아세포; DMDM/F12(1:1); 20% 혈청 대용물; 2㎍/ml의 헤파린; 0.1mM β-머캅토에탄올; 4ng/ml의 FGF2	매일 배지 교환; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 1	ES(제1 디스파제 처리)	N/A	1-2mg/ml의 디스파제	30분; 37℃; 주변 대기	N/A
단계 1	EB	Oct4+, SSEA4+ Pax6-, Sox1-	현탁액 배양, 마우스 섬유아세포 부재; DMDM/F12(1:1); 20% 혈청 대용물; 2㎍/ml의 헤파린; 0.1mM β-머캅토에탄올; FGF2 부재	4일; 배지를 매일 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 1	EB	Oct4+, SSEA4+ Pax6-, Sox1-	현탁액 배양, 마우스 섬유아세포 부재; DMEM/F12(1:1); N2 보충물; 2ng/ml의 헤파린; 10-20ng/ml의 FGF2	2일; 배지를 매일 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 1	조기 로제트	Oct4-, SSEA4- Pax6+, Sox1- 네스틴+ PSA-NCAM-	DMEM/F12(1:1); N2 보충물; 2ng/ml의 헤파린; 0.01-1M RA	5일; 배지를 2일에 1회 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 2	신경관형 로제트	Pax6+, Sox1+ 네스틴+, HoxC+, HoxB+, Olig2+, Otx2-, Bf1-, En1-	DMEM/F12(1:1); N2 보충물; 2ng/ml의 헤파린; 0.01-1M RA; 10-500ng/ml SHH	5 또는 6일; 배지를 2일에 1회 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 2	신경 상피 세포(제2 디스파제 처리)	N/A	0.1-0.2mg/ml 디스파제	15 내지 20분; 37℃; 주변 대기	N/A
단계 2	신경상피 세포의 증식	Pax6+, Sox1+ 네스틴+, HoxC+, HoxB+, Olig2+, Otx2-, Bf1-, En1-	DMEM/F12(1:1); N2 보충물; 2ng/ml의 헤파린; 0.01-1M RA; 50-250ng/ml SHH + 10ng/ml의 FGF2	5 또는 6일; 배지를 2일에 1회 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 2	제1 해리	N/A	N/A	아쿠타제(Gibco)	N/A
단계 2	척수 운동 뉴런	HB9+, lslet+, Lim3+, HoxC+, ChAT+, VAChAT+	신경기본 배지; N2; 0.1mM 비필수 아미노산; 0.5mM 글루타민; 1㎍/ml의 라미 닌; 50ng/ml의 SHH; 10ng/ml BDNF; 10ng/ml의 GDNF, 10ng/ml의 IGF1	2 내지 3주; 배지를 2일에 1회 교환; 배양 평판 접시; 36.5℃, 5% CO₂	활동 전위

전뇌 도파민 뉴런- 바람직한 배양 조건 및 마커

단계	세포명	세포 특이적 마커	배양 배지 성분	배양 배지 조건	전기생리학적 마커
단계 1	ES	Oct4+, SSEA4+ Pax6-, Sox1-	방사선 조사된 마우스 섬유아세포; DMDM/F12(1:1); 20% 혈청 대용물; 2㎍/ml의 헤파린; 0.1mM β-머캅토에탄올; 4ng/ml의 FGF2	매일 배지 교환; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 1	ES(제1 디스파제 처리)	N/A	1-2mg/ml의 디스파제	30분; 37℃; 주변 대기	N/A
단계 1	EB	Oct4+, SSEA4+ Pax6-, Sox1-	현탁액 배양, 마우스 섬유아세포 부재; DMDM/F12(1:1); 20% 혈청 대용물; 2㎍/ml의 헤파린; 0.1mM β-머캅토에탄올; FGF2 부재	4일; 배지를 매일 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 1	EB	Oct4+, SSEA4+ Pax6-, Sox1-	현탁액 배양, 마우스 섬유아세포 부재; DMEM/F12(1:1); N2 보충물; 2ng/ml의 헤파린; 10-20ng/ml의 FGF2	2일; 배지를 매일 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 1	조기 로제트	Oct4-, SSEA4- Pax6+, Sox1- 네스틴+ PSA-NCAM-	DMEM/F12(1:1); N2 보충물; 2ng/ml의 헤파린; 10-20ng/ml의 FGF2	5일; 배지를 2일에 1회 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 2	신경관형 로제트	Bf-1+, Otx2+, 네스틴+, En1+, Pax2+	10-20ng/ml의 FGF2	5 또는 6일; 배지를 2일에 1회 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 2	신경 상피 세포(제2 디스파제 처리)	N/A	0.1-0.2mg/ml 디스파제	15 내지 20분; 36.5℃; 주변 대기	N/A
단계 2	신경 상피 세포의 증식	Bf-1+, Otx2+	DMEM/F12(1:1); N2 보충물; 2ng/ml의 헤파린; 10-200ng/ml의 FGF8 + 50-250ng/ml의 SHH	5 내지 6일; 배지를 2일에 1회 교환; 25cm² 조직 배양 플라스크; 36.5℃, 5% CO₂	N/A
단계 2	제1 해리	N/A	N/A	아쿠타제(Gibco)	N/A
단계 2	전뇌 DA 뉴런	TH+, AADC+, DbH-, PNMT-, Bf-1+, Otx2+, c-ret+, GABA+	신경기본 배지; N2; 0.1mM 비필수 아미노산; 0.5mM 글루타민; 1㎍/ml의 라미 닌; 1μM의 cAMP; 200μM 아스코르브산; 10ng/ml BDGF; 10ng/ml의 GDNF	2 내지 3주; 배지를 2일에 1회 교환; 배양 평판 접시; 36.5℃, 5% CO ₂	DA의 분비, 활동 전위

실시예 1 - 전뇌 도파민성 뉴런의 생성

결과

사람 ES 세포는 분화하여 FGF2의 존재하에 신경관형 구조를 형성한다. 사람 ES 세포주, H1, H9, 및 H9로부터 유래하는 클론주 H9.2(문헌참조: Amit, M., et al., supra, 2000)은 방사선 조사된 마우스 배아 섬유아세포의 영양 공급층상에서 증식시켰다[문헌참조: Thomson, J. A., et al., supra, 1998]. 분화를 개시하기 위해, ES 세포 콜로니를 탈착시키고 4일 동안 배상체(EB)로서 현탁액에서 증식시켰다. 이어서 EB를, FGF2를 함유하는 화학적으로 규명된 배지[문헌참조: Zhang, S.-C., et al., J. Neurosci. Res. 59: 421-429,2000 ; Zhang, S. -C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4089-4094, 1999]에서 조직 배양 처리된 플라스크에서 배양하였다. FGF2는 제조원[Peprotech, Inc., Rocky Hill, NJ.]으로부터 구입하였다. FGF2에서 배양한지 5일 후, 분주된 EB는 과성장된 편평 세포를 생성시켰다. 동시에, 증가된 수의 작은 긴 세포가 분화하는 EB의 중앙에 나타났다(도 1A). 규명된 배지에서 7일까지 중심의 작은 긴 세포는 로제트를 형성하였고(도 1B) 이것은 톨루이딘 청색 염색된 부분에 의해 보여지는 바와 같이 조기 신경관과 유사하다(도 1B의 사진). 면역형광 분석은 신경 마커 항원 네스틴 및 무사쉬-1의 발현[문헌참조: Lendahl, U., et al., Cell 60: 585-595, 1990; Kaneko, Y., et al., Dev. Neurosci. 22: 139-153, 2000]이 대부분 로제트내 세포로 국한되고 분화하는 EB 주변의 편평 세포(도 1C-E)에서는 발현하지 않음을 나타낸다. 미분화된 ES 세포는 이들 마커에 대해 면역음성이다. 신경관형 구조의 형성은 FGF2의 존재하에 다수의 EB(H9 및 H9.2주로부터 총 350개 EB의 94%, 3개의 별도 실험)에서 나타났다. FGF2 부재하에 잘 구성된 로제트는 관찰되지 않았다.

신경관형 로제트는 차등 효소적 처리 및 접착에 의해 분리될 수 있다. FGF2에 계속 노출시키면서, 원주 로제트 세포는 증식하고 다수층을 형성하였다. 이들은 흔히, EB의 대부분을 구성하고 주변 편평 세포로부터 확실히 구별된다. 디스파제를 사용한 처리는 우선적으로 중심 신경상피 섬을 탈착시켜 주변 세포 대부분은 부착된 채로 남아있다(도 1F). 오염 단일 세포는 세포 배양 접시로 단기 접착에 의해 분리하였다. 세포 계수는 당해 분리 및 집적 과정이 분리된 신경상피 클러스와 연관된 세포가 분화된 EB 배양에서 세포의 72 내지 84%를 차지함을 보인 후 즉시 수행하였다. 면역세포화학적 분석은 분리된 로제트 세포의 96±0.6%가 4개의 별도의 실험에서 조사된 13,324개의 세포를 기준으로 네스틴에 대해 양성으로 염색된다. 대다수의 당해 세포는 또한 무사쉬-1 및 PSA-NCAM(도 1G, H, I)에 대해 양성이었다.

사람 ES 세포 유래된 신경 전구체는 모든 3개의 CNS 세포 유형을 시험관내에서 생성한다. 분리된 신경 전구체는 자유 유동 세포 응집체로서 사람 태아 뇌 조직 유래의 "신경구" 배양액과 유사한 현탁 배양액중에서 증식시켰다[문헌참조: Zhang, S.-C., et al., supra, 2000; Svendsen, C. N., et al., supra, 1996; Carpenter, M. K., et al., supra, 1999; Vescovi, A. L., et al., supra, 1999]. BrdU 혼입 연구는 전구체 세포 증식 자극이 FGF2에 의존하고 단독의 EGF 또는 LIF에 의해 유발될 수 없음을 밝혔다. 추가로, FGF2가 EGF 및/또는 LIF와 배합되는 경우(도 2A), 어떠한 부가적 또는 상승작용적 효과가 관찰되지 않았다.

ES 세포 유래된 신경 전구체의 시험관내 분화는 FGF2를 회수하고 오르니틴 및 라미닌 기질상에 분주하여 유도하였다. 몇일이내에, 개별 세포 및 다수의 성장 원뿔이 구형으로부터 돌출 성장하여 별 폭발 외형을 나타낸다. 분주한지 7일 내지 10일까지 구형으로부터 발산하는 과정은 현저한 섬유 다발을 형성시켰다. 흔히, 작은 이동 세포가 섬유와 연관하여 관찰되었다(도 2B). 분화된 배양물의 면역형광 분석은 과성장 영역에서의 대다수의 세포가 뉴런 마커 MAP2ab 및 β_III-튜불린(도 2C)를 발현함을 밝혔다. 저분자량의 신경필라멘트(NF) 및 고분자량의 NF의 발현은 분주 한 후, 각각 7일 내지 10일 및 10일 내지 14일까지 관찰되었다(도 2D). 다양한 신경전달 물질에 대한 항체를 사용하여 ES 세포 유래 뉴런의 특성을 추가로 분석하였다. 다수의 뉴런은 글루타메이트성 표현형을 나타내는 반면(도 2E), 보다 작은 비율은 GABA에 대한 항체로 표지되었다. 흔히, 이들 뉴런은 극성 형태를 보여주었다(도 2F). 소수의 뉴런은 도파민 합성을 위한 율속 효소인 TH(도 2G)를 발현함을 보여주었다. GFAP⁺ 성상세포는 성장 인자 회수 후 첫 2주이내에는 거의 관찰되지 않았지만 연장된 시험관내 분화 후 보다 흔하게 나타났다. 4주까지, 이들은 분화된 뉴런 아래에 광범위한 층을 형성하였다(도 2D). 희소돌기아교세포는 표준 배양 조건하에서 관찰되지 않았지만 전형적인 희소돌기아교세포 형태를 갖는 몇개의 O4-면역반응성 세포가, 혈소판 유래 성장 인자 A(Zhang, S.-C., et al., 상술함, 2000)의 존재하에 2주 이상동안 배양되는 경우 관찰되었다(도 2H). 따라서, ES 세포 유래 신경 전구체는 모든 3개 주요 세포 유형의 CNS를 생성한다.

사람 ES 세포 유래 신경 전구체는 생체내에서 이동하고 혼입하고 분화한다. 생체내에서 사람 ES 세포 유래 신경 전구체의 분화를 평가하기 위해, 본 발명자는 이들을 새로 태어난 마우스의 외측 뇌실에 이식하였다[문헌참조: Flax, J. D., et al., Nat. Biotech. 16: 1033-1039,1998]. 이식된 세포는 뇌실계의 다양한 영역에 클러스터를 형성하고 다양한 숙주 뇌 영역에 다수로 혼입된다. 이식 후 1주 내지 4주간에 분석된 22개의 뇌 중에서, 뇌실내 클러스터 및 혼입된 세포는 19개 및 18개의 수용자 뇌에서 각각 발견되었다. 장시간 후 분석된 각각의 동물은 이식된 세포가 이식한지 적어도 8주동안 검출될 수 있음을 보여주었다. 클러스터내 세포는 네스틴, β_III-튜불린 및 MAP2ab에 대한 항체에 대해 강한 면역반응성을 보여주었다. 응집체에서 단지 몇개의 세포는 GFAP를 발현하였다. 미분화된 ES 세포 및 비신경 상피 세포에서 전형적으로 발현되는 마커인 알칼린 포스파타제 및 사이토케라틴은 당해 클러스터내에서 검출되지 않았다. 어떠한 테라토마 형성도 관찰되지 않았다.

사람 특이적 프로브를 사용한 DNA 동일계 하이브리드화 및 사람 핵 특이적 항원의 면역조직화학적 검출은 다수의 뇌 영역에 이식된 세포가 존재함을 밝혔다. 광범위한 공여체 세포 혼입을 나타내는 회색질 영역은 피질(도 3A), 해마(도 3B, C), 후각망울, 격막(도 3D), 시상, 시상하부(도 3E), 선조(도 3F) 및 중뇌(도 3G)를 포함하였다. 백색질 영역으로의 혼입은 뇌량, 속섬유막 및 해마 섬유 트랙에서 가장 명백하다. 형태적으로, 혼입된 사람 세포는 주변 숙주 세포와 구분할 수 없고 단지 사람 특이적 마커를 사용하여 검출될 수 있다(도 3). 세포형 특이적 항체를 사용한 이중 표지는 혼입된 세포가 뉴런 및 교세포 둘다로 분화함을 밝혔다. 사람 ES 세포-유래 뉴런은 β_III-튜불린 및 MAP2에 대한 항체를 사용하여 명백하게 묘사될 수 있다(도 3H, J). 흔히, 이들은 긴 프로세스를 갖는 극성 형태를 나타낸다(도 3H). 추가로, 다극성 및 미성숙한 단일극성 형태를 갖는 뉴런이 발견되었다(도 3J). 공여체 유래 뉴런은 회색질 및 백색질 둘다에서 검출되는, 숙주 뇌로 원거리 돌출하는 다수의 축삭을 생성하였다. 이들은 특히, 단일 부분(도 3I)내에 수백 ㎛에서 흔히 추적될 수 있는 뇌량, 전교련 및 해마채와 같은 섬유 트랙내에 풍부하다.

뉴런에 추가로, 소수의 ES 세포 유래 성상세포는 숙주 뇌 조직내에서 검출되었다. 이들은 방사상 형태를 나타내고 GFAP(도 3K)를 강하게 발현한다. 대조적으로, 미엘린 단백질에 대한 항체를 사용한 혼입된 사람 세포의 이중 표지는 성숙한 희소돌기아교세포를 검출하는데 실패하였다. 숙주 뇌로 이동한 몇몇 공여체 세포는 이식 후 4주까지는 네스틴 양성 표현형을 보유하였다. 이들 많은 세포는 혈관 주변 위치에서 발견되었다.

토론

본 연구는 성숙한 뉴런 및 교세포를 생성할 수 있는 이식가능한 신경 전구체는 사람 ES 세포로부터 고수율로 생성될 수 있음을 지적한다. 성장 인자 매개 증 식/분화 및 신경 전구체 세포의 차등 접착을 사용하여, 본원에 기재된 시험관내 분화 과정은 신경 발육 연구 및 신경계 복구를 위한 공여체 세포의 생성에 대한 새로운 발판을 제공한다.

본 연구의 주요 발견은 사람 ES 세포로부터 신경 전구체의 분화가 시험관내에서 신경관형 구조 형성과 함께 신경계 발육의 조기 단계를 반복한다는 관찰이다. 당해 현상은 현재 제어 조건하에 사람 신경 발육의 조기 단계를 연구하고 실험적으로 조작하기 위해 사용될 수 있다. 화학적으로 규명된 배양 시스템은 시험관내에서 사람 신경상피 증식 및 세부사항에 대한 단일 인자의 효과를 사용하는 유일한 기회를 제공한다. 발육하는 사람 뇌로부터 유래하는 전구체와 유사하게, 사람 ES 세포 유래 전구체는 FGF2에 대해 강한 증식 반응을 보여준다[문헌참조: Flax, J. D., et al., supra, 1998]. 그러나, 증식에 대한 어떠한 부가적 또는 상승작용적 효과는 EGF 또는 LIF에 의해 유발될 수 없다. 이러한 발견은 1차 세포로 수득된 데이타와는 차이가 있고[문헌참조: Zhang, S.-C., et al., supra, 2000; Svendsen, C. N., et al., supra, 1996; Carpenter, M. K., et al., supra, 1999; Vescovi, A. L., et al., supra, 1999] 증식하는 ES 세포 유래 신경 전구체는 태아 사람 뇌로부터 유래하는 전구체 세포 보다 미성숙한 단계를 나타냄을 제안할 수 있다. 실질적으로 설치류 세포에 대한 연구는 조기 신경세포발생으로부터 분리된 신경 줄기 세포가 증식을 위해 FGF2에 의존하고 EGF에 대한 응답은 다지 신경 전구체 세포 분화의 후기 단계에서 획득됨을 지적한다[문헌참조: Kalyani, A. D., et al., Dev. Bioi. 186: 202-223,1997 ; Fricker, R. A., et al., J. Neurosci. 19: 5990-6005, 1999].

신경관형 구조의 시험관내 생성 및 이들의 차등 접착을 기초로 이들 구조물을 분리하기 위한 가능성은 사람 ES 세포 유래 신경 전구체를 고순도로 생성시키기 위한 단순하지만 효율적인 방법을 제공한다. 특히, 신경상피 구조물내의 강한 세포-세포 접촉 및 조직 배양 기질에 대한 매우 낮은 접착성은 미분화된 ES 세포 또는 또 다른 체세포 계통의 세포의 상당한 오염 없이 선택적인 신경 세포의 분리를 허용한다. 당해 과정의 고효율은 분리된 세포 95% 이상이 네스틴 양성 표현형을 나타내고 어떠한 ES 세포 또는 비신경 상피도 이식된 수용체에서 검출될 수 없다는 사실에 의해 반영된다. 미분화된 ES 세포 및 기타 계통에 대한 전구체는 종양 및 외부조직을 형성할 수 있기 때문에, 고순도의 체세포군의 생성이 ES 세포 기반 신경 이식 전략을 개발하는데 주요 전제조건이다.

신생태아 마우스 뇌로 이식 후, ES 세포 유래 신경 전구체는 다양한 뇌 영역으로 혼입되고 여기서 뉴런 및 교세포로 분화된다. 생체내에서 성숙한 희소돌기아교세포의 검출 실패는 설치류의 경우와는 반대로 사람 신경 전구체의 희소돌기아교 분화 효율이 낮기때문일 수 있다[문헌참조: Svendsen, C. N., et al., Brain Pathol. 9: 499-513, 1999]. 주목할만하게, 공여체 유래 뉴런은 출생후 신경세포 발생을 나타내는 부위로 제한되지 않지만 또한 뇌의 많은 다른 영역에서 발견된다. 유사한 데이타는 사람 CNS 유래 전구체의 성인 설치류 뇌로의 이식을 포함하는 연구에서 수득되었다[문헌참조: Tropepe, V., et al., Dev. Biol. 208:166-188, 1999]. 각각의 전구체 세포의 유사분열 후 뇌 영역으로의 혼입은 특히 성인뇌 및 척주에서의 세포 대체와 관련되어 있다. 혼입된 세포가 영역 특이적 성질을 어느정도로 획득하고 기능적으로 활성이 어느정도로 되는지를 측정하기 위해 보다 세부적인 연구가 요구된다.

성숙하고 미성숙한 신경아세포로 구성된 뇌실내 클러스터를 제외하고는 숙주 뇌에서 어떠한 공간 점유 병변이 검출되지 않았다. 가장 명백하게, 어떠한 테라토마 형성이 8주 미만의 수술 후 기간동안에 관찰되지 않았다. 특히, 비 사람 영장류에서 보다 강한 장기 안정성 연구가 잠재적인 임상적 적용을 고려하기 전에 요구된다는 것이 명백하지만 본 발명의 데이타는 분화하는 사람 ES 세포 배양물로부터 분리된 신경 전구체가 신경 복구를 위한 전망있는 공여체 공급원을 나타냄을 지적한다.

실험 프로토콜

ES 세포의 배양. ES 세포, H1(계대 16회 내지 33회), H9(계대 34회 내지 55회) 및 H9으로부터 유래된 클론주인 H9.2(계대 34회 내지 46회)(문헌참조: Amit, M., et al., supra, 2000)를 방사선 조사된 마우스 배아 섬유아세포의 영영 공급 층상에서 배양하고 이전에 기재된 바와 같은 듈베코 변형 이글 배지(DMEM)/F12, 20% 혈청 대용물(Gibco), 0.1mM β-머캅토에탄올, 2㎍/ml의 헤파린 및 4ng/ml의 FGF2(PeproTech Inc, Rochy Hill, NJ)로 이루어진 배지[문헌참조: Thomson, J. A., et al., supra, 1998]를 매일 교환한다. 핵형 분석은 주어진 계대에서 세포주는 배수체임을 지적했다.

ES 세포의 분화 배양물. ES 세포 배양물을 37℃에서 30분 동안 디스파 제(Gibco BRL, 0.1 mg/ml)로 항온처리하고 ES 세포 콜로니를 온전하게 제거하였다. ES 세포 콜로니를 펠렛화하고 FGF2가 없는 ES 세포 배지에 재현탁시키고 매일 배지를 갈아주면서 25cm² 조직 배양 플라스크(Nunc)에서 4일 동안 배양하였다. ES 세포 콜로니는 부유 EB로서 성장한 반면, 임의의 잔류 영양 공급 세포는 플라스크에 부착되었다. 영양 공급 세포는 EB를 새로운 플라스크로 이동시켜 제거하였다. EB(∼50/플라스크)를 이어서 인슐린(25㎍/ml), 트랜스페린(100㎍/ml), 프로게스테론(20nM), 푸트레신(60μM), 나트륨 셀레나이트(30nM) 및 헤파린(2㎍/ml)이 보충된 DMEM/F12에서 FGF2(20ng/ml)의 존재하에 25-cm² 조직 배양 플라스크(Nunc)에 분주하였다[문헌참조: Zhang, S. -C., et al., supra, 2000; Zhang, S. -C., et al., supra, 1999].

신경 전구체 세포의 분리 및 배양: 주변 편평 세포로부터 로제트 세포 클러스터를 분리하기 위해, 배양물을 15 내지 20분 동안 37℃에서 0.1mg/ml 디스파제와 항온처리하였다. 로제트 클럼프는 후퇴하는 반면, 주변 편평 세포는 접착된 상태로 존재한다. 이 점에서, 로제트 클럼프는 플라스크를 흔들어서 제거하고 편평 세포는 여전히 부착되어 있다. 클럼프를 펠렛화하고 5ml의 피펫으로 약하게 분쇄하고 30분 동안 배양 플라스크상으로 분주하여 오염시키는 각각의 세포가 부착되도록 한다. 이어서, 부유 로제트 클럼프는 부착을 억제하는 폴리-(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트)로 피복된 새로운 플라스크로 옮기고 FGF2(20ng/ml)의 존재하에 사람 신경 전구체를 위해 사용되는 배지에서 배양하였다[문헌참조: Zhang, S.-C., et al., supra, 2000]. 신경 분화 및 분리의 효율성을 정량하기 위해, 새롭게 분리된 세포 클러스터 및 잔류하는 편평 세포를 트립신(0.1% EDTA중에 0.025%)으로 해리하고 계수하였다. ES 세포로부터 분화되는 총 세포중에서 추정 신경 전구체(로제트 세포)의 %는 H9 및 H9.2 세포주에 대한 3개의 독립적인 실험을 기준으로 구하였다. ES 세포 유래된 신경 전구체의 분화 잠재력을 분석하기 위해, 세포를 FGF2 부재하에 DMEM/12, N2 보충물(Gibco), cAMP(100ng/ml) 및 BDNF(10ng/ml, PeproTech)로 이루어진 배지에서 오르니틴/라미닌 기질상에서 배양하였다. 희소돌기아교세포 분화를 위해, ES 세포 유래된 신경 전구체를 문헌[참조: Zhang, -S.-C., et al., supra, 2000]에 기재된 바와 같이, N1(Gibco) 및 혈소판 유래 성장 인자 A(PDGFA)(2ng/ml)이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 형태적 관찰 및 전구체 및 보다 성숙한 신경 세포에 대한 마커를 사용한 면역염색은 분화과정동안에 수행하였다.

조직화학적 및 면역조직화학적 염색. 로제트 형성을 보다 잘 가시화하기 위해, 로제트를 갖는 배양물을 PBS로 세정하고 4%의 파라포름알데하이드 및 0.25%의 글루타르알데하이드중에서 1시간동안 고정화시킨다. 고정화된 세포를 이어서 문헌[참조: Zhang, -S.-C., et al., supra, 1999]에 기재된 바와 같이 플라스틱 수지중에 매립시켜 프로세싱하였다. 이어서 배양된 세포를 1㎛ 두께로 절단하고 톨루이딘 청색으로 염색시켰다. 면역염색을 위해, 커버슬립 배양물을 문헌[참조:Zhang, S.-C., et al., supra, 2000; Zhang, S.-C., et al., supra, 1999]에 상세히 기재된 적당한 형광 2차 항체에 의해 검출되는 하기의 1차 항체: 항-네스틴(문헌참조: polyclonal, gift of Dr. R. McKay of NINDS, 1: 1,000); 항-폴리시알 화된 뉴런 세포 접착 분자 (PSA-NCAM, 마우스 IgM, 루곤 지 박사(G. Rougon)(university of Marseille, France)로부터 기증받음 , 1: 200); 항-무사쉬-1 (랫트 IgG, 오카노 에이취 박사(Dr. H. Okano)(University of Tokyo, Japan)로부터 기증받음, 1: 500); 항-GFAP(폴리클로날, Dako, 1: 1,000); 항-사람 GFAP (슈에른베르크 모노클노날(Sternberg monoclonals), 1: 10,000) ; 04 (마우스 IgM, 하이브리도마 상등액, 1: 50); 항-타이로신 하이드록실라제 (TH, Pel 동결, 1: 500)를 사용하여 면역염색시켰다. 나머지 항체는 시그마(Sigma)로부터 구입하였다: 항-ß_III 튜불린(마우스 IgG, 1: 500); 항- 신경필라멘트 (NF) 68 (마우스 IgG, 1: 1,000); 항-NF 200 (폴리클로날, 1: 5,000); 항- MAP2ab (마우스 IgG, 1: 250); 항-y-아미노부티르산 (GABA, 폴리클로날, 1: 10,000) ; 항-글루타메이트 (마우스 IgG, 1: 10,000). 브로모데옥시우리딘(BrdU) 혼입을 위해, 각각의 그룹에서 4개의 커버슬립 배양물을 4% 파라포름알데하이드중에 고정화하고 1N HCl로 변성시키고 면역표지화 및 세포 계수를 위해 프로세싱하기전에 16시간동안 2μM의 BrdU로 항온처리하였다[문헌참조: Zhang, S.-C., et al., supra, 2000; Zhang, S.-C., et al., supra, 1999].

대뇌뇌실내 이식 및 생체내 분석. 100,000개의 생존 세포/㎕의 현탁액을, 트립신(37℃에서 5 내지 10분 동안 0.1% EDTA중에서 0.025%)으로 신경 전구체의 응집체를 해리시킨 후 L15 배지(Gibco)중에서 제조하였다. 머리 이하의 조명을 사용하여 2 내지 3㎕의 세포 현탁액을 냉동마취된 신생 마우스(C3HeB/FeJ)의 외측 뇌실 각각으로 서서히 주사하였다. 이식된 동물을 사이클로스포린 A(10mg/kg, i.p.)을 매일 주사하여 면역억제시킨다. 이식한지 1주, 2주, 4주 및 8주후에 마우스를 링거액에 이어서 4% 파라포름알데하이드를 사용하여 경심관류시킨다. 뇌를 절개하고 사용할때까지 4℃에서 동일한 고정화제에서 고정화시킨다. 공여체 세포는 디곡시게닌 표지된 프로브를 사용하여 사람 alu 반복 요소[문헌참조: Brustle, O., et al., Nat. Biotech. 16: 1040-1044, 1998]에 대한 동일계 하이브리드화에 의해 또는 사람 특이적 핵 항원에 대한 항체[문헌참조: MAB1281, Chemicon, 1:50]를 사용하여 여 50㎛ 코로날 바이브라톰 절개로 동정하였다. 면역양성 세포는 GFAP(1:100), 네스틴, β_III-튜불린(TUJ1, BabCo, 1:500), MAP2ab(Sigma, clones AP-20 및 HM-2, 1: 300) 및 인산화된 배지 분자량 사람 신경필라멘트[클론 HO-14, 1:50, 트로야노브스키 제이 박사(J. Trojanowski)로부터 기증받음]에 대한 항체로 이중 표지시켰다. 1차 항체를 적당한 형광단 접합된 2차 항체로 검출하였다. 절개부를 현미경[Zeiss Axioskop 2 and Leica laser scan microscopes]상에서 분석하였다.

실시예 2 - 중뇌 도파민성 뉴런의 생성

신경학적 증상에서 줄기 세포 치료의 잠재적인 응용을 위한 제1 단계는 올바른 위치적 및 전달물질 표현형을 갖는 신경 세포의 직접적인 분화이다. 여기에서 본 발명자는 특정 순서의 모르포겐 작용을 통한 사람 배야 줄기(ES) 세포로부터 기능성 도파민성(DA) 뉴런의 왕성한 생성을 보여준다. Sox1의 발현 전, 조기단계에 서 FGF8을 사용한 사람 ES 유래 신경외배엽 세포의 처리는 올바른 중뇌 DA 돌출 뉴런 표현형을 갖는 DA 뉴런의 특수화를 위해 필수적이다. 시험관내 생성된 DA 뉴런은 독성학적 및 약제학적 스크리닝 및 파킨슨 질환에서 잠재적인 세포 치료를 위해 사용될 수 있다.

파킨슨 질환(PD)은 중뇌, 특히, 흑색질에서 DA 뉴런의 진행성 퇴화로부터 비롯된다. PD를 위한 현재 치료법은 주로 레바도파와 같은 DA 전구체의 전신 투여에 의한 증상 경감에 의지한다. 당해 치료는 처음 몇년동안은 효과적이지만 거의 영구적으로 이의 효능을 상실하고 심각한 부작용을 유발한다. 교세포주 유래 신경원성 인자(GDNF)와 같은 성장 인자의 투여는 소규모 임상 시험에서 효과적인 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Gill, S. S., et al., Nat. Med. 9: 589-595,2003]. 이러한 치료는 충분한 수의 생존 DA 뉴런에 의존하고 이의 장기 치료학적 잠재력은 연구과제로 남아있다. 신경 퇴화의 병소 특성 때문에 세포 이식은 또 다른 치료법으로서 제안되었다[문헌참조: Bjorklund, A. and Lindvall, O., Nat. Neurosci. 3: 537-544, 2000]. 몇몇 성공적인 경우에, 이식된 태아 중뇌 세포는 10년 이상동안 생존하고 증상의 경감에 기여[문헌참조: Kowdower, J. H., et al., N. EnL J. Med. 332: 1118-1124,1995 ; Piccini, P., et al., Nat. Neurosci. 2: 1137-1140, 1999]하지만 최근 조절된 임상 시험은 PD용 태아 조직 이식 치료법의 효능에 대해 의구심을 부여한다[문헌참조: Freed, C. R., et al., N. Engl. J. Med. 344: 710-719,2001 ; Olanow, C. W., et al., Ann. Neurol. 54: 403-414, 2003]. 이들 현상은 PD의 복잡한 경향을 지적한다. 신임할 수 있는 새로운 기능적 사람 중뇌 DA 뉴 런의 공급원이 DA 뉴런의 생존 및 기능에 영향을 주는 병원성 과정인 DA 시스템의 발생에 대한 체계적 연구 및 PD에 대한 장기간 치료법의 개발를 위해 급하게 요구된다.

DA 뉴런은 배반포 단계에서 이식전 배아의 내부 세포 매쓰로부터 유래하는 마우스 ES 세포로부터 효율적으로 생성될 수 있는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Evans, M. J. and Kaufman, M. H., Nature 292: 154- 156,1981; Martin, G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7634-7638,1981]. 마우스 ES 세포는 먼저 FGF2에 의해[문헌참조: Lee, S. H., et al., Nat. Biotechnol. 18: 675-679,2000] 또는 간질 세포 유래 유도 활성에 의해[문헌참조: Kawasaki, H., et al., Neuron 28: 31-40,2000; Barberi, T., et al., Nat. Biotechnol. 21: 1200-1207, 2003] 신경외배엽 세포로 유도된다. 이어서 신경외배엽 세포는 DA 뉴런 유도를 위해 FGF8에 이어서 SHH로 노출된다. 당해 연구에서, 본 발명자는 사람 ES 세포를 유도하여[문헌참조:Thomson, J. A., et al., Science 282: 1145-1147,1998] FGF8 및 SHH에 응답하여 중뇌 돌출 특성을 갖는 다수의 DA 뉴런을 생성시키는 신경외배엽 세포로 분화시키는[문헌참조: Zhang, S. C., et al., Nat. Biotechnol. 19: 1129-1133,2001] 강한 시스템을 구축하였다. 본 발명자는 중뇌 돌충 뉴런 표현형을 갖는 DA 뉴런을 생성하기 위해, 사람 ES 세포는 전구체 세포가 Sox1⁺를 발현하는 신경외배엽 세포가 되기 전에 FGF8로 노출되어야 함을 밝혔다.

결과

사람 ES 유래 신경외배엽 세포는 전뇌 특성을 나타낸다.

영양 공급 층으로부터 탈착된 ES 세포 콜로니를 ES 세포 성장 배지에서 4일 동안 응집체로서 현탁액중에서 배양함에 이어서 FGF2(20ng/ml)를 함유하는 화학적으로 규명된 신경 배지에서 접착 배양 접시에서 성장시킨다[문헌참조: Zhang, S. C., et al., supra, 2001]. 콜로니 중앙의 세포는 원주 형태를 나타내고 정렬하면서 9일경에 로제트를 형성한다(도 4A). 이들 원주 세포는 Pax6에 대해 양성이지만 범 신경 전사 인자 Sox1에 대해서는 음성이고(나타내지 않음) 이것은 조기 신경외배엽 세포임을 지적한다. 추가로 5 또는 6일 동안(14일 내지 15일) 원주 세포는 증식하고 신경관형 로제트로 구성되고(도 4B) Sox1을 발현하고(도 4C), 전사인자가 신경관 폐쇄동안에 한정적인 신경외배엽 세포에 의해 발현된다[문헌참조: Pevny, L. H., et al., Development 125: 1967-1978,1998]. 이들은 전뇌 세포에 의해 발현되는 전사 인자인 뇌인자(Bf1)[문헌참조: Tao, W. and Lai, E., Neuron 8: 057-966,1992]에 대해 양성이지만 중뇌 세포에 의해 발현되는 전사인자인 톱니모양 1(En-1)에 대해서는 음성이고(도 4D)[문헌참조: Davidson, D., et al., Development 104: 305-316,1988 ; Wurst, W., et al., Development 120: 2065-2075, 1994] 이것은 시험관내 전뇌가 신경외배엽 세포를 생성시킴을 제안한다.

중뇌 표현형의 유도는 FGF8의 조기 작용을 요구한다.

DA 뉴런으로의 분화를 위해, 신경관형 로제트에서 신경외배엽 세포는 차등 효소 및 접착 처리를 통해 집적시키고[문헌참조:Zhang, S. C., et al., supra, 2001] FGF2와 함께 현탁액중에서 응집체로서 4일 동안 증식시킴에 이어서 라미닌 기질상으로 분주하고 6일 동안 SHH(50 내지 200ng/ml) 및 FGF8(20 내지 100ng/ml)로 처리하였다. 면역세포화학적 분석은 대다수의 신경외배엽 세포가 En-1에 대해서는(나타내지 않음) 아니지만 Bf1에 대해서는 양성인채로 남아있음을 밝혔다.

En-1을 발현하도록 Sox1⁺ 신경외배엽 세포를 유도하기 위한 FGF8의 실패는 Sox1을 발현하는 신경외배엽 세포가 패턴화된 시그날에 저항적일 수 있음을 제안한다. Sox1 발현 세포는 사람 ES 세포(6일된 배아체와 동일한(문헌참조: Thomson, J. A., et al., supra, 1998))의 분화 후 2주째에 생성되고 신경관형 구조를 형성하기 때문에 이들은 신경외배엽 세포가 Sox1을 발현하고 지역적으로 특정화되는 신경관 폐쇄에서 신경외배엽 세포에 상응할 수 있다[문헌참조: Lumsden, A. and Krumlauf, R., Science 274: 1109-1115, 1996]. 이것은 본 발명자로 하여금 FGF8이, 신경외배엽 세포가 Sox1을 발현하기 전에, 중뇌 특정화를 촉진할 수 있다는 가정을 세우도록 하였다. 따라서, 본 발명자는 콜로니 중앙에 세포가 9일째에 원주가 되는 경우 그 시점에서 FGF8(100ng/ml)을 적용하였다. 6일 후, 콜로니 중앙에 세포는 FGF2의 존재하에 보여지는 바와 같이 신경관형 형성체를 생성하였다. 이들 신경외배엽 세포는 유사하게 집적되고 4일 동안 FGF8에서 증식하고 이어서 라미닌 기질상에서 6일 동안 SHH로 처리된다. 당해 배양 조건하에, En-1 발현은 네스틴 발현 신경외배엽 세포(도 4E)에서 관찰되었지만 Bf1(도 4F)을 여전히 발현하는 세포가 여전히 존재한다. 따라서, 신경외배엽 세포는 이들이 Sox1⁺이 되기전에 효율적으로 지역화된다.

지역화된 신경외배엽 세포는 DA 뉴런으로 분화한다.

신경외배엽 세포는 신경 분화 배지에서 해리되고 분화하였다. 이들은 미분화된 사람 ES 세포에 의해 고도로 발현되는 당단백질인 단계 특이적 배아 항원 4(SSEA4)를 발현하지 않았다. 해체된 신경외배엽 세포는 처음에 고루게 분포하지만 분주 후 3 내지 5일 동안 로제트를 형성하였다. 분화한 후 3주째에 총 분화된 세포군의 약 3분의 1(4개의 실험으로부터 계수된 17,965 세포중 31.8±3.1% TH⁺ 세포)이 타이로신 하이드록실라제(TH)(도 5A)에 양성이었다. TH⁺ 세포의 유사한 %가 H9 및 H1 사람 ES 세포주로부터 수득되었다. 대부분의 TH 발현 세포는 직경이 10 내지 20㎛이다. 이들은 다극성 형태를 나타내고 분화가능한 축삭 및 수상돌기를 갖는다(도 5A). 모든 TH⁺ 세포는 뉴런 마커 β_III-튜불린⁺ 뉴런과 함께 양성으로 염색되고 약 50%가 TH⁺이었다[도 5B, 4개의 실험으로부터 12,859 β_III-튜불린⁺ 뉴런중의 6,383 TH⁺ 세포].

모노아민의 생합성에서, TH는 타이로신을 L-DOPA로 하이드록실화하고 이어서 이것은 AADC에 의해 탈카복실화되고 DA가 된다. 또 다른 2개의 효소, DβH 및 페닐에탄올아민 N-메틸트랜스퍼라제(PNMT)는 각각 DA를 노르에피네프린으로 전환시키고 노르에피네프린을 에피네프린으로 촉매한다. 면역염색은 모든 TH⁺세포가 AADC(도 5C-E)임을 보여주지만 몇몇 AADC⁺ 세포는 TH(도 5E)에 대해 음성이다. 그 러나, TH⁺ 세포는 DβH(도 5F) 및 PNMT(나타내지 않음)에 대해 음성이지만 DβH는 성인 랫트에서 및 배아 몽키 뇌 줄기(도 5F의 사진)에서 노르아드레날린성 뉴런을 강하게 염색시켰다. 이들 데이타는 TH 발현 뉴런이 도파민 생합성에 필요한 2개의 효소를 소유하고 당해 뉴런은 노르아드레날린 뉴런 또는 아드레날린 뉴런이라기 보다는 차라리 DA 뉴런이다.

ES 세포 생성된 DA 뉴런은 중뇌 표현형을 나타낸다.

RT-PCR 분석은 중뇌 DA 뉴런 발육에 관여하는 Nurr1, Limx1b, En-1 및 Ptx3[문헌참조: Zetterstrom, R. H., et al., Science 276: 248-250,1997; Smidt, M. P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13305-13310, 1997; Saucedo-Cardenas, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 4013-4018, 1998; Wallen, A., et al., Exp. Cell Res. 253: 737-746,1999 ; Smidt, M. P., et al., Nat. Neurosci. 3: 337-341,2000; Simon, H. H., et al., J. Neurosci. 21: 3126-3134,2001; Van den Munckhof, P., et al., Development 130: 2535-2542,2003; Nunes, I., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100: 4245-4250,2003]은 신경외배엽 세포가 DA 뉴런(도 6A)으로 분화될때까지 고수준으로 발현되지 않음을 지적했다. 면역염색은 다중 프로세스를 갖는 대부분의 TH⁺ 세포가 핵에서 중뇌 마커 En-1을 동시발현함을 밝혔다(도 6B). 따라서, 상기 방법을 사용하여 생성된 DA 뉴런은 중뇌 위치적 실체를 소유한다.

후각망울내 DA 뉴런은 흔히, γ-아미노부티르산(GABA)을 동시발현한다[문헌 참조: Kosaka, T., et al., Exp. Brain Res. 66: 191-210, 1987; Gall, C. M., et al., J. Comp. Neurol. 266: 307-318, 1987]. TH 및 GABA의 이중 면역염색은 DA 뉴런의 대부분이 GABA에 대해 음성이지만 GABA⁺ 뉴런은 배양물중에서 발견되었음을 지적했다(도 6C). 모든 TH⁺ 세포중에서, TH⁺ 세포의 8%(8.7±3.9%, 4개의 실험으로부터 계수된 6,520 TH⁺ 세포)는 GABA를 동시발현하였다. 이들 이중 양성 세포의 대부분은 작은 쌍극성 세포이다(도 6C에서의 사진). 몇몇 중뇌 DA 뉴런, 특히, 배쪽 피개부 영역중의 뉴런들은 TH와 함께 콜레시스토키닌 옥타펩타이드(CCK8) 또는 칼빈딘을 동시발현한다[문헌참조: McRitchie, D. A., et al., J. Comp. Neurol. 364: 121-150, 1996; Hokfelt, T., et al., Neurosci. 5: 2093-2124, 1980]. 면역조직화학적 분석은 TH⁺ 뉴런이 관찰됨을 지적했다(도 6D). 당해 칼빈딘 뉴런은 대부분 소형 세포이다. 어떠한 CCK8 양성 세포도 배양물중에서 검출되지 않았다.

ES 세포-생성된 DA 뉴런은 생물학적으로 기능성이다

면역염색은 모든 TH⁺ 뉴런이 GDNF에 대한 수용체의 성분인 c-Ret를 발현함을 보여주었다(도 7A-C). 다수의 TH⁺ 세포, 특히 측쇄 신경돌기를 갖는 세포들은 모노아민 뉴런에서 도파민을 아세포 격실로 팩키징하는데 관여하는 다공성 모노아민 수송체 2(VMAT2, 도 7D-F)를 발현하였다[문헌참조: Nirenberg, M. J., et al., J. Neurosci. 16: 4135- 4145, 1996]. 추가로, TH⁺ 뉴런은 시냅스 형성에 필수적인 막 당단백질인 시냅토피신을 발현하였다[문헌참조: Calakos, N. and Scheller, R. H., J. Biol. Chem. 269: 24534-24537, 1994](도 7A-I).

도파민 방출은 DA 뉴런의 기능적 특징이다. 고수행능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석은 아스코르브산(AA), FGF8 및 SHH로 처리된 배양물중에 230.8±44.0pg/ml로서 AA, FGF8 및 SHH 처리 부재의 대조군 배양물중에서는 46.3 ± 9.2pg/ml로서 DA 분화 배양물 배지중에 도파민이 존재함을 밝혔다(도 8A). 배양된 세포가 세척되고 14분 동안 HBSS중에서 항온처리되는 경우, 도파민 수준은 2개 배양물간에 유사하였다(도 8A). 그러나, HBSS중에 56mM KCl에 의한 배양된 뉴런의 탈분극은 DA의 양(AA, FGF8 및 SHH 처리 부재 및 존재하에 각각 35.8±9.2 및 111.0 ±15.0 pg/ml; 도 8A)을 상당히 증가시켰다. 이들 관찰은 시험관내 생성된 DA 뉴런이 DA를 분비할 수 있고 DA의 방출은 활성 의존적임을 제안한다.

전기생리학적 기록을 사용하여 ES 생성된 DNA 뉴런이 기능적으로 활성인지를 측정하였다. 30일 내지 38일 동안 계속 배양된 세포에서(n = 14) 휴지기 막 전위(V_휴지기) 범위는 32 내지 -72mV(-54±2.9mV)이고 세포 캐패시턴스(Cm)의 범위는 11 내지 45pF(21 ± 2.7pF)이고 입력 저항(R_in)의 범위는 480 내지 3500MQ(1506±282MΩ)이다. 탈분극 전류 단계(0.2nA x 200 내지 500ms)는 일반적으로 단일 작용 전위를 유발하지만 여러 경우에 작용 전위가 계속 감소하는 것으로 관찰되었다(도 8bi 및 ii). 작용 전위(AP)의 역치의 범위는 -26 내지 -5.2mV(-17.4±2.1mV)이고 -9.6 내지 30mV에서 최고에 이른다. 50.2mV 이하의 AP가 관찰되었다(32±2.8mV). AP 지속 범위는 3 내지 20.6ms(7.2±1.3ms)이다. 자발적 개시는 2개의 세포에서 관찰되었다(도 8C).

전압 클램프 모드에서, 내향 및 외향 전류 모두가 모든 세포(나타내지 않음)에 관찰되었지만 이의 상대적 증폭정도는 상당히 다양하였다. 내향 전류는 신속하게 활성화되고(< 1ms) 1 내지 3ms내에서 최고조에 달한다. 활성화 역치는 -30±1mV이고, 최대 피크 전류 진폭은 -13±1.9mV의 평균 접압에서 수득되었고 당해 전류는 테트로도톡신(TTX, n=3)에 의해 완전히 차단되었다. 이들 성질들은 작용 전위 발생의 기초가 되는 전압 개폐 나트륨 채널의 존재와 일관성이 있다. 3개의 세포에서, 본 발명자는 신속한 상승 및 보다 느린 감소단계를 포함하는 시냅스 전류의 특징을 갖는 자발적 일시 전류를 관찰하였다. 이들 기록중 하나는 K-글루코네이트 기본 피펫 용액을 사용하여 수행되었고 당해 세포를 -40mV 에서 유지시키면 본 발명자는 외향(억제) 및 내향(자극) 전류 둘다를 관찰할 수 있다(도 8di 및 dii). 모든 14개의 세포에 바이오시틴을 주사하였지만 단지 5개의 세포만이 면역염색 과정 종결 후 회복되었다. 그러나, 5개의 바이오시틴 충전된 세포 모두는 표지시킨 TH(도 8E-G)이었다.

토론

본 발명자는 여기에서, 중뇌 뉴런 돌출 특성을 갖는 기능성 DA 뉴런이 3개의 단순한 비유전학적 단계: FGF2를 사용한 신경외배엽 세포의 유도, 신경외배엽 형성동안에 FGF8 및 SHH에 의한 뇌실 중뇌 실체의 특정화 및 지역적으로 특정화된 선구체의 DA 뉴런으로의 분화를 통해 사람 ES 세포로부터 효율적으로 생성될 수 있음 을 입증하였다. 중뇌 특성을 갖는 DA 뉴런이 증식된 신경외배엽 세포로부터 생성될 수 있다는 마우스 ES 세포 연구로부터 수득된 발견[문헌참조: Lee, S.H., et al., supra, 2000]과 같지 않게 본 발명자는 전구체 세포가 Sox1⁺ 신경외배엽 세포가 되기 전에 FGF8을 사용한 특정화 또는 지역화는 올바른 중뇌 및 기능적 표현형을 갖는 사람 DA 뉴런의 왕성한 생성을 위해 필수적임을 밝혔다.

줄기 세포 생물학 관점에서, 마우스 ES 세포를 신경외배엽 세포로 관련시키고 이들을 증식시키고 이들을 FGF8 및 SHH로 지역화하거나 특정화함에 이어서 이들을, 맥케이(McKay) 및 동료들에 의해 개발된 단계적 프로토콜을 사용하여 DA 뉴런으로 분화시키는 것이 매우 논리적인 것 처럼 보인다[문헌참조: Lee, S. H., et al., supra, 2000]. 본 발명자는 동일한 원칙이 사람 영장류에게 적용되어야만 한다고 가정하였다. 실질적으로, 본 발명자는 사람 ES 세포를, FGF2의 존재하에 Sox1을 발현하고 신경관형 로제트를 구성하는 신경외배엽 세포로 분화시키고[문헌참조: Zhang, S.C., et al., supra, 2001] 신경외배엽 세포를 FGF8 및 SHH로 처리하여 배쪽 중뇌 페이트를 유도하고 최종적으로 세포를 뉴런으로 분화시킴에 의해 다수의 DA 뉴런을 생성시킬 수 있다. 그러나, 이러한 방식으로 생성된 DA 뉴런의 대부분은 중뇌 돌출 DA 뉴런의 주요 특성중 일부, 예를 들어, 복합한 형태를 갖는 대형 크기 및 단백질 수준에서 중뇌 전사 인자의 발현이 없다. Sox1 양성 신경외배엽 세포는, FGF8 및 SHH로 처리한 후에도, 여전히 En-1에 대해 음성이지만 Bf1에 대해서는 양성이어서 Sox1 발현 신경외배엽 세포가 중뇌 페이트로의 특정화를 위해 무반응함을 제안한다. 본 발명의 배양 시스템에서 사람 ES 세포로부터 신경외배엽의 분화 과정은 생체내 발육동안에 보여지는 것과 병행한다[문헌참조: Zhang, S.C., supra, 2003]. 생체내에서, 신경관은 사람 임신 3주 말기에 형성하고 Sox1은 마우스 배아 연구를 기초로 신경관 폐쇄 동안에 신경외배엽에 의해 발현된다[문헌참조: Pevny, L. H., et al., Development 125: 1967-1978,1998]. 배양물에서, 신경외배엽 세포는 신경관형 로제트를 형성하고 6일된 사람 배아와 동일한 사람 ES 세포로부터의 분화 2주 후에 Sox1을 발현한다[문헌참조: Thomson, J. A., et al., supra, 1998]. 중뇌 DA 뉴런을 포함하는 돌출 뉴런은 조기 단계에서 신경관 튜브에서 신경외배엽 세포로부터 분화하고 이들 신경외배엽 세포는 이미 신경관 폐쇄 과정 동안에 지역적으로 특정화되어 있다[문헌참조: Lumsden, A. and Krumlauf, R., supra, 1996] 이것은 전뇌 표현형을 갖는 사람 ES 세포 생성된 Sox1 발현 신경외배엽 세포가 중뇌 표현형을 갖는 DA 뉴런을 생성시키기 위한 모르포겐에 응답하지 않는 이유를 설명할 수 있다. FGF8이 조기 전구체가 중뇌 실체를 사용하도록 지시할 수 있다는 본 발명자의 가정은, 조기 로제트에서 Sox1^- 원주 세포가 FGF8로 처리된 후 중뇌 마커 En1의 복잡한 과정 및 발현과 함께 대형 세포체와 같은 돌출 뉴런의 특성을 갖는 DA 뉴런의 생성에 의해 확인된다.

현재, 사람 ES 세포 유래된 신경외배엽 세포와는 다르게 FGF2 유도된 마우스 ES 세포 유래된 신경외배엽 세포가 증식후 효율적으로 지역화될 수 있는 이유는 명백하지 않다. 마우스 척주로부터 분리된 신경 선구체의 등쪽 또는 배쪽 실체가 배 양시, 특히, FGF2의 존재하에 탈조절될 수 있다는 최근 증거가 있고[문헌참조: Gabay, L., et al., Neuron 40: 485-499,2003] 이것은 증식된 마우스 ES 유래 신경외배엽 세포가 재특정화될 있는 능력을 부분적으로 설명할 수 있다. 척수 운동 뉴런과 같은 기타 돌출 뉴런의 분화에 대한 본 발명자의 연구는 대형 돌출 뉴런의 생성이 모르포겐의 조기 작용을 요구한다는 본 발명의 관찰과 일치한다.

DA 뉴런은 중뇌, 시상하부, 망막 및 후각망울을 포함하는 뇌의 여러 영역에 존재한다. 본 연구에서 사람 ES 세포 생성된 DA 뉴런은 중뇌 돌출 DA 뉴런과 유사하다. DA 뉴런의 대부분은 GABA를 동시 발현하지 않는 반면 GABA 및 TH의 동시 발현은 후각 DA 상호뉴런의 주요 특징이다[문헌참조: Kosaka, T., et al., supra, 18987; Gall, C. M., et al., supra, 1987]. 중뇌에는 2개 이상의 DA 뉴런의 주요 그룹이 있고 이들 한 그룹은 흑색질(A9)에 있고 또 다른 하나는 배쪽 피개 영역(A10)에 있으며 각각 상이한 표적물을 갖는다[문헌참조: Bjorklund, A. and Lindvall, O., Handbook of Chemical Neuroanatomy, Vol. 2: Classical Transmitters in the CNS (Bjorklund, A., Hokfelt, T., eds), Amsterdam, Elsevier Science Publishers, pp. 55-111,1984]. 배쪽 피개 영역에서 대부분의 DA 뉴런은 칼빈딘 또는 CCK를 발현하는 반면 흑색질에서는 거의 나타나지 않는다[문헌참조: McRitchie, D. A., et al., J. Comp. Neurol. 364: 121-150, 1996; Hokfelt, T., et al., Neurosci. 5: 2093-2124, 1980; Haber, S. N., et al., J. Comp. Neurol. 362: 400-410,1995]. 사람 ES 세포 생성된 DA 뉴런은 CCK8 또는 칼빈딘과 함께 TH를 동시발현하지 않는다는 본 발명자의 관찰은 이들 DA 뉴런이 흑색 질 DNA 뉴런과 보다 유사함을 제안한다.

중뇌 DA 뉴런과 같은 적당한 지역적 실체를 갖는 대형 돌출 뉴런을 생성하는 사람 ES 세포의 왕성한 능력은 사람 ES 세포 시스템을 사용하는 신경 발육의 조기 단계를 해부하기 위한 전례없는 기회를 개방하였다. 본 발명의 데이타는 FGF8과 같은 모르포겐이 조기 출현 중뇌 돌출 DA 뉴런의 생성을 위해 비특정화된 조기 신경외배엽 세포에 작용해야만 한다는 것을 입증한다. 이것은 이미 특정화된 배아 및 성인 포유동물 뇌로부터 분리되고 증식된 줄기 세포 또는 선구체가 돌출 뉴런을 생성하는데 무반응한 이유를 설명할 수 있다[문헌참조: Svendsen, C. N., etai., Exp. Neurol. 148: 135-146,1997 ; Daadi, M. M. and Weiss, S., J. Neurosci. 19: 4484-4497, 1999; Storch, A., et al., EXp. Neurol. 170: 317-325,2001]. 시험관내 생성된 사람 DA 뉴런은 또한 사람 DA 뉴런에 영향을 미칠 수 있는 화학물질 및 약물에 대한 독성학적 및 약제학적 스크리닝을 위한 시스템을 제공한다. 연구는 배양 평판 접시에서 생성된 이들 사람 DA 뉴런이 PD 동물 모델에서 기능적인지를 결정하기 위해 진행중에 있다.

방법

ES 세포 배양. 사람 ES 세포주, H9(p21-56) 및 H1(p35-40)은 문헌[참조: Thomson, J.A., et al., supra, 1998]에 기재된 바와 같이 듈베코 변형 이글 배지(DMEM)/F12(Gibco), 20% 혈청 대용물(Gibco), 1mM의 글루타민(Sigma), 0.1mM의 비필수 아미노산(Gibco), 2㎍/ml이 헤파린(Sigma), 0.1mM β-머캅토에탄올(Sigma) 및 4ng/ml의 FGF2(R & D Systems)으로 이루어진 ES 세포 성장 배지를 매일 갈아주 면서 방사선 조사된 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 상에서 매주 증식시켰다. 분화된 콜로니는 굴곡 파스테르 피펫을 사용하여 물리적으로 제거하고 미분화된 상태의 ES 세포는 전형적인 형태 및 Oct4 및 SSEA4로 면역염색시켜 확인하였다.

신경외배엽 세포의 분화 및 집적. 사람 ES 세포 콜로니는 배양물을 0.2mg/ml의 디스파제(Roche Diagonostics)으로 처리함에 의해 MEF 층으로부터 탈착시키고 ES 세포 배지를 매일 갈아주면서 4일 동안 부유 세포 응집체(배상체)로서 성장시킨다. 이들을 이어서 N2(Gibco), 0.1mM의 비필수 아미노산, 2㎍/ml의 헤파린이 보충된 DMEM/F12(2:1)로 이루어진 신경 배지에서 배지를 2일에 1회 갈아주면서 접착 기질로 성장시킨다. ES 세포 응집체는 부착하고 약 6일째에 각각의 콜로니를 형성하였다. 신경관형 로제트를 구성하는 원주 세포에 의해 나타나는 신경외배엽 세포는 약 14일째에 발육하였다[문헌참조: Zhang, S.C., et al., supra, 2001]. 신경 로제트는 차등 효소적 반응을 통해 분리하였다[문헌참조: Zhang, S.C., et al., supra, 2001]. 성장 인자는 분화 과정동안에 첨가하여 지역화에 영향을 준다(결과를 나타냄)

DA 뉴런 분화. 집적된 신경외배엽 세포는 37℃에서 10 내지 15분 동안 PBS중의 0.025% 트립신 및 0.27mM EDTA에 의해 해리하고 12-mm 커버슬립(100㎍/ml의 폴리오르니틴 및 10㎍/ml의 라미닌으로 예비 피복시킴)상으로 커버슬립당 40,000-50,000개 세포의 밀도로 분주한다. 신경분화 배지는 N2, 0.1mM의 비필수 아미노산, 0.5mM의 글루타민, 1㎍/ml의 라미닌, 1μM의 cAMP, 200μM의 AA(Sigma), 10ng/ml의 BDNF(R & D Systems) 및 10ng/ml의 GDNF(R & D Systems)가 보충된 신경 기본 배지(Gibco)로 이루어진다. 당해 세포를 2일에 1회 배지를 갈아주면서 3주 내지 4주동안 배양하였다.

면역세포화학 및 세포 정량. 커버슬립 배양물을 10 내지 20분 동안 PBS중에 또는 5분 동안 메탄올(-20℃) 중에서 4% 파라포름알데하이드중에 고정화시키고 면역염색을 위한 처리를 하였다[문헌참조: Zhang, S.C., et al., supra, 2001]. 하기의 1차 항체를 사용하였다: 마우스 항-SSEA4(1:40), 마우스 항-En-1(1:50) 및 마우스 항-Pax6(1:5000, 모두 발육 연구 하이브리도마 뱅크로부터 구함); 래빗 항-Sox1(1:500), 래빗 항-사람 네스틴(1:200), 래빗 항-AADC(1:1000), 양 항 DβH(1:400), 마우스 항-시냅토피신(1:5000) 및 래빗 항-CCK8(1:2000, 모두 케미콘(Chemicon)으로부터 구함); 마우스 항-TH(1:1000), 마우스 항-βIII 튜불린(1:500), 래빗 항-GABA(1:5000) 및 마우스 항-칼빈딘(1:400, 모두 시그마로부터 구함); 래빗 항-TH(1:500) 및 래빗 항-VMAT2(1:500, 모두 펠 프리즈(Pel-Freez)로 부터 구함); 염소 항-c-Ret(1:400) 및 마우스 항-Oct4(1:1000, 둘다 산타 크루즈(Santa Cruz)로부터 구함); 래빗 항-Bf1(1:5000; 로렌즈 스튜더(Lorenz Studer)로부터 기증받음). 항체-항원 반응은 적당한 형광-접합된 2차 항체로 밝혀졌다. 세포 핵은 훽스트 33342로 염색시켰다. 염색은 니콘 형광 현미경으로 가시화하였다. 성인 랫트 및 E38 배아 몽키 기원의 뇌 절편을 신경 유형 및 신경전달물질에 대한 많은 항체에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 음성 대조군은 또한 면역염색 과정에서 1차 또는 2차 항체를 제외시켜 설정하였다. 세포 계수는 대안렌즈 및 40 x 대물렌즈상에서 그물주머니를 사용하여 맹검 수행하였다. 10개의 가시적 영 역에서의 세포는 각각의 커버슬립으로부터 무작위로 선별하고 계수하였다.

RT-PCT

총 RNA를 RNA Stat-60(Tel-Test, Friendswood, TX)를 사용함에 이어서 DNaseI(DNA 부재, Ambion)를 사용하여 처리하여 배양된 세포로부터 추출하였다. cDNA의 합성은 제조업자의 지침에 따른 RT-PCR(Invitrogen)용 슈퍼스크립트 제1쇄 합성 시스템을 사용하여 수행하였다. PCR 증폭은 Taq 폴리머라제(Promega)를 사용한 표준 과정을 사용하여 수행하였다. 사이클 수는 특정 풍부한 mRNA에 따라 25 내지 35 사이클로 다양하고 15초동안 94℃에서 변성시키고 프라이머에 따라 55℃ 또는 60℃ 온도에서 30초동안 어닐링시키고 45초동안 72℃에서 연장시킨다. 음성 대조군은 역전사동안에 역전사효소 또는 PCR동안에 cDNA 샘플을 제외시켜 성취하였다. 프라이머 및 생성물 길이는 다음과 같다: GAPDH(5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3', 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3', 450 bp); Nurr1 (5'- CGATGCCTTGTGTTCAGGCGCAG-3', 5'-AGCCTTTGCAGCCCTCACAGGTG-3', 858 bp); Ptx3 (5'-GTGGGTGGAGAGGAGAACAA-3', 5'- TTCCTCCCTCAGGAAACAATG-3', 175 bp); Lmx1 b (5'- GGGATCGGAAACTGTTACTGC-3', 5'-GTAGTCACCCTTGCACAGCA-3', 218 bp); En-1 (5'-CCCTGGTTTCTCTGGGACTT-3', 5'-GCAGTCTGTGGGGTCGTATT-3', 162 bp).

DA 측정

DA 신경 분화한지 21일 후에, 48시간 동안 조건화된 배지를 수거하였다. 배양된 세포로부터 활성 의존적 도파민 방출은 15분 동안 행크 균염 용액(HBSS)중에서 배양된 세포를 조건함에 이어서 이를 37℃에서 14분 동안 56mM KCl을 함유하는 HBSS로 대체하여 측정하였다. 배양 배지 또는 HBSS 중의 도파민은 20㎕의 안정화 완충액(10ml의 0.1M NaOH 중의 900mg의 EGTA 및 700mg의 글루타티온)을 첨가하여 안정화시키고 샘플을 -80℃에서 저장하였다. HPLC 키트(Chromsystems)를 사용하여 모노아민을 추출하였다. 모노아민 수준은 MD-TM 이동상을 사용하여, 전기화학 검출기(Coulochem II, ESA Inc.)와 커플링된 HPLC(모델 508 자동샘플 채취기 및 모델 118 펌프, Beckman)로 측정하였다. 각각의 그룹내 배양물은 3등분하여 3개의 별도의 실험으로부터 데이타를 수거하였다.

전기생리학적 기록

사람 ES 세포로부터 분화된 DA 뉴런의 전기생리학적 성질은 전세포 패치 클램프 기록 기술을 사용하여 조사하였다[문헌참조: Hammill, O. P., et al., Pflugers Arch. 391: 85-100, 1981]. 피펫에, (mM)KCl 140 또는 K-글루코네이트 140, Na⁺-HEPES 10, BAPTA 10, Mg²⁺-ATP 4, (pH 7.2, 290mOsm, 2.3-5.0MΩ)을 함유하는 세포내 용액을 채웠다. 비오시틴(0.5%, Sigma)을 기록 용액에 첨가하고 이어서 스트렙트아비딘-알렉스 플루르 488(1:1000, Molecular Probes) 및 TH에 대한 항체로 표지시켜 DA 뉴런을 동정하는데 사용하였다. 욕조 용액은 mM로 NaCl 127, KH₂PO₄ 1.2, KCl 1.9, NaHCO₃ 26, CaCl₂ 2.2, MgSO₄ 1.4, 글루코스 10, 95% O₂/5% CO₂(pH 7.3. 300mOsm)을 함유하였다. 몇몇 양태에 대해, TTX(1㎛)를 욕조 용액에 적용하여 전압 개폐 나트륨 전류를 차단하였다.

전류 클램프 및 전압 클램프 기록은 멀티클램프 700A 증폭기(Axon Instrument)를 사용하여 수행하였다. 시그날을 4kHz에서 거르고 디지데이타 1322A 아날로그-디지탈 컨버터(Axon Instruments)를 사용하여 10kHz에서 샘플링하여 획득하고 시판되는 소프트웨어(pClamp9, Axon Instruments)를 사용하여 컴퓨터 하드 디스크에 저장하였다. 접근 저항성은 전형적으로 818MΩ이고 증폭기 회로를 사용하여 50 내지 80%까지 보상하였다. 전압은 +13mV의 액체 접속 전위에 대해 보정하였다[문헌참조: Neher, E., Methods Enzymol, 207:123-131, 1992]. V_휴지기 및 작용 전위는 전류 클램프 모드로 조사하였다. 자발적 자극(내향) 및 억제(외향) 시냅스 전류는 K-글루코네이트 기본 피펫 용액을 사용한 전압 클램프 모드 및 V_유지 = 40mV에서 특성 분석되었다. 시냅스 반응은 주형 검출 알고리듬(소형 분석 프로그램 4.6.28, 시냅토소프트)을 사용하여 검출하였고 불활성화 단계는 레벤베르크-마르쿠아르트(Levenberg-Marquardt) 알고리듬을 사용한 이중 대수 함수로 조정하였다. 데이타는 평균 ± SE로서 제공되었다.

실시예 3 - 운동 뉴런의 생성

척추 동물에서 운동 뉴런의 생성은 3개 이상의 단계가 관여하고 있다: 외배엽 세포의 신경화, 신경외배엽 세포의 꼬리쪽화 및 꼬리쪽화된 신경 선구체의 배쪽화[문헌참조: Jessell, T. M., Nat. Rev. Genet. 1: 20-29,2000]. 본 발명자는 먼저 척추동물의 신경외배엽이 FGF 및/또는 항-BMF(골 형태유전학적 단백질) 시그날에 응답하여 발육한다는 원칙을 기초로[문헌참조: Wilson, S. I. and Edlund, T., Nat. Neurosci. 4: Suppl. : 1161-1168, 2001] FGF2의 존재하에 접착 콜로니 배양 을 사용하여[문헌참조: Zhang, S. C., et al., Nat. Biotechnol. 19: 1129-1133, 2001] hES 세포로부터 효율적인 신경외피 분화를 위한 배양 시스템[문헌참조: Thomson, J. A., et al., Science 282: 1145-1147, 1998) (H1 및 H9 주)]을 확립하였다. 신경분화의 제1 징후는 ES 세포가 분화용 영양 공급 세포로부터 제거된 후 8 내지 10일된 콜로니 중앙에서 로제트를 형성하는 원주 세포의 출현이었다. 로제트내 원주 세포는, 신경관 형성동안에 신경상피 세포에 의해 발현되는 범-신경외배엽 전사 인자 SoxI(도 9A)[문헌참조: Pevny, L. H., et al., Development 125: 1967-1978, 1998]가 아니라 신경외배엽 마커 Pax6을 발현하지만 과성장 영역에서 편평 세포는 발현하지 못했다. 4 또는 5일 동안 동일한 배지에서 추가로 배양하면서, 원주 세포는 루멘과 함께 신경관형 로제트를 구성하고(도 9B) Pax6 및 Sox1(도 9C, D) 둘다를 발현시켰다. 따라서, hES 세포로부터 신경외배엽 세포의 분화는 2개 이상의 특징적인 단계를 포함한다: 신경 유도 후 8일 내지 10일째에 조기 로제트내 Pax6⁺/Sox1^- 원주 세포 및 유도 후 14일째에 신경관형 후기 로제트를 형성하는 Pax6⁺/Sox1⁺ 세포.

면역세포화학적 분석은 Pax6(도 9E), Sox1 및 네스틴을 발현하는 로제트 세포는 전뇌 및 중뇌 세포에 의해 발현되는 호메오도메인 단백질인 Otx2(도 9F, H)에 대해 양성이지만 척주내 세포에 의해 생성되는 호메오도메인 단백질인 HoxC8(도 9H)에 대해서는 음성임을 밝혀내었다. 이들은 또한 중뇌 세포에 의해 발현되는 En1에 대해 음성이다(도 9G). 이들 결과는 신경외배엽 세포가 조기 생체내 발육동 안에 신경외배엽 세포에 의해 초기에 획득되는 것(문헌참조: Stem, D.C., Nat. Rev. Neurosci.2:92-98, 2001)과 유사한 전뇌 표현형을 소유함을 제안한다.

신경외배엽 세포로부터 운동 뉴런을 분화시키기 위해, 신경관형 로제트내 Sox1⁺ 신경외배엽 세포를 효소적 처리를 통해 분리하고[문헌참조: Zhang, S. C., et al., Nat. Biotechnol. 19: 1129-1133, 2001] 레티노산(RA, 0.001 - 1μM), 꼬리쪽화 시약(문헌참조: Blumberg, B., et al., Development 124: 373-379,1997) 및 SHH(50 내지 500ng/ml), 배쪽화 모르포겐(문헌참조: Jessell, T. M., Nat. Rev. Genet. 1: 20-29,2000 ; Briscoe, J. and Ericson, J., Curr. Opin. Neurobiol. 11: 43-49, 2001]의 존재하에 라미닌 기질상에서 분화시켰다. 분주한 후 14일까지, 과성장 영역에서 다수의 세포가 이들의 프로세스를 통해 네트워크를 형성하였다(도 10A). 면역염색 분석은 분화된 세포가 신경 마커 β_III-튜불린 및 MAP2에 대해 양성임을 지적하였다. 이들중 대부분(>50%)은 또한 운동 뉴런 발육과 연관된 전사 인자인 Isl1(도 10A) 및 Lim3(보이지 않음)에 양성이다[문헌참조: Jessell, T. M., supra; Briscoe, J. and Ericson, J., supra, 2001; Shirasaki, R. and Pfaff, S. L., Annu. Rev. Neurosci. 25: 251-281, 2002]. 그러나, 1 내지 3주 사이에 배양물중의 매우 적은 세포가 운동 뉴런-특이적 전사 인자[문헌참조: Arber, S., et al., Neuron 23: 659-674, 1999]인 HB9(도 10A)를 발현하였다. 이들은 Sox1⁺ 신경외배엽 세포가 운동 뉴런 유도에 대해 무반응일 수 있음을 시사한다.

Sox1 발현 세포는 3주된 사람 배아와 동일한 시점에서 신경관형 로제트가 형 성되고 Sox1이 발현되는 경우, 신경관내에서 신경외배엽 세포와 상응할 수 있다. 신경관에서 신경외배엽 세포는 지역적으로 특정화된다[문헌참조: Lumsden, A. and Krumlauf, R., Science 274: 1109-1115,1996]. 이러한 고려는 본 발명자로 하여금 RA가, 신경외배엽 세포가 Sox1을 발현하기 전에, 꼬리쪽화 및/또는 운동 뉴런 특정화를 촉진할 수 있는 것으로 가정할 수 있도록 하였다. 본 발명자는 따라서 조기 단계, 즉 원주 세포가 로제트를 구성하기 시작하여 Pax6을 발현하는 경우에 신경외배엽 세포를 RA(0.001 내지 1μM)로 처리하였다. 6일 동안 이러한 방식으로 처리된 배양물은 신경관형 로제트로 발육하고 Sox1을 발현하여 FGF2 처리된 배양물 기원과 구분할 수가 없다. 로제트 클러스터를 분리하고 라미닌 기질로 접착시킨 후, 다수의 돌기세포를 분주 후 24시간 내지 48시간 만큼 일찍이 클러스터로부터 연장시켰다. 분주 후 14일까지, 돌기세포 과성장 영역은 과성장 영역에 제한된 수의 신경 세포체가 있지만(도 10A) 전체(11-mm 직경) 커버슬립을 덮었다. 대다수의 세포는 lsl 1/2에 대해 양성이고 이중에서 약 50%는 또한 HB9⁺(도 10B)이고 이것은 이들 이중 양성 세포가 운동 뉴런임을 제안한다. lsl 1/2⁺ 및 HB9^_ 세포는 상호뉴런이다.

HB9-발현 세포는 먼저 신경 로제트가 분화를 위해 분주된 후 6일째에 나타나고 약 10일 내지 12일 후에 고비율에 도달하였다. 이들은 크게 클로스터로 국한되었고 클러스터내 총 세포의 약 21%이고 과성장 영역에서는 세포가 거의 없다(도 10A, D). 가장 고비율의 HB9⁺ 세포는 0.1 내지 1.0μM의 RA의 존재하에 유도하였 다. 1.0μM 초과의 용량에서 RA는 화학적으로 규명된 부착 배양물에서 몇몇 세포를 퇴화시킨다. RA 또는 SHH 또는 이 둘다의 부재하에, 매우 적은 수의 HB9⁺ 세포(도 10D)가 있다. 모든 HB9-발현 세포는 β_III-튜불린(도 10C)으로 염색시켰다. 따라서, 조기 신경외배엽 세포에 대한 RA로의 처리는 운동 뉴런의 효율적 유도를 위해 요구된다.

RA가 후기가 아니라 조기에 신경외배엽 세포가 운동 뉴런으로 분화하도록 유도하는 이유를 이해하기 위해, 본 발명자는 먼저 신경외배엽 세포의 꼬리쪽화에 대한 RA의 효과를 조사하였다. 7일 동안 RA(0.001 내지 1.0μM) 또는 FGF2(20ng/ml)를 사용한 조기 로제트 세포(Pax6⁺/Soxl^-)의 처리는 Otx2의 발현을 감소시키고 용량 의존 방식으로 HoxB1, B6, C5 및 C8과 같은 Hox 유전자의 발현을 증가시켰다(도 11A). 보다 많은 꼬리쪽 세포에 의해 발현되는 유전자는 보다 고용량의 RA에 의해 유도되었다. 1주일 동안 RA를 사용한 후기 로제트 세포(Pax6⁺/Sox1⁺)의 처리는 FGF2에 의해 유도된 Hox 유전자 발현의 패턴을 변화시키지 않았다(나타내지 않음). 신경 분화 배지에서 분리되고 배양된 RA 처리된 조기 로제트 세포는 처음 6일째 및 대부분은 분화 후 10일 내지 12일째에 HoxC8 단백질을 발현하였고 이것은 면역세포화학에 의해 밝혀졌다(도 11D). 이러한 단계에서의 세포는 Otx2를 발현하지 못한다(도 11C). 모든 HoxC8⁺ 세포는 β_III-튜불린⁺ 뉴런(도 11E)이었다. 대조적으로, 1주일 동안 RA로 처리되고 이어서 2주동안 분화된 후기 로제트 세포는 약간의 HoxC8⁺ 세포를 생성시켰지만 Otx-2 발현 세포는 감소하였다(나타내지 않음). 따라서, 후기가 아니라 조기에 RA로 신경외배엽 세포의 처리는 척수 운동 뉴런과 연관된 HoxC 단백질을 발현하면서 효율적인 꼬리쪽화를 유도한다[문헌참조: Liu, J. P., et al., Neuron 32: 997- 1012,2001].

본 발명자는 따라서 배쪽화를 위한 조기 및 후기 신경외배엽 세포에 대한 SHH의 효과를 비교하였다. Pax6⁺ 또는 Sox1⁺ 이든 상관없이 hES 세포 유래 신경외배엽 세포는 척주에서 운동 뉴런 및 희소돌기아교세포가 되도록 운명지워진 배쪽 신경 선구체 세포에서 발현되는 호메오도메인 단백질인 Olig2(도 11F)를 발현하지 않았다[문헌참조: Lu, Q. R., et al., Cell 109: 75-86,2002 ; Zhou, Q., et al., Neuron 31: 791-807,2001]. Pax6⁺/Sox1^- 신경외배엽 세포를 1주동안 RA의 존재하에 배양함에 이어서 분리하고 추가로 SHH 부재하에 2주동안 분화시키는 경우, 극소수의 세포가 Olig2(나타내지 않음)를 발현하였다. 그러나, SHH의 존재(50 - 500ng/ml)하에, 많은 세포가 핵에서 Olig2를 발현하였다(도 11G). 대조적으로, 동일한 조건하에 2주 동안 분화된 Pax6⁺/Sox1⁺ 신경외배엽 세포는 소수의 Olig2-발현 세포(도 11H)를 생성하였다. 따라서, 후기 단계가 아니라 조기 단계에서 RA로 처리된 신경외배엽 세포는 SHH에 응답하여 배쪽 신경 선구체 페이트로 효율적으로 유도될 수 있다.

FGF2가 또한 꼬리쪽 페이트(도 11A)를 유도한다 하더라도 조기 RA 처리가 운 동 뉴런 특정화를 위해 요구되는지의 이유를 추가로 분석하기 위해, 본 발명자는 척주에서 선구체 도메인을 정련하는데 중요한 클래스 I(Irx3, Pax6) 및 클래스 II(Olig2, Nkx2.2, Nkx6.1)의 발현을 조사하였다[문헌참조: Jessell, T. M., supra, 2000; Briscoe, J., and Ericson, J., supra, 2001]. RA는 후기 신엽외배엽 세포에서 보다 조기에 SHH 및 클래스 II 유전자 특히 Olig2 및 Nkx6.1를 보다 강하게 발현하도록 유도한다(도 11B). 따라서,조기 신경외배엽 세포는 운동 뉴런 특정화를 위해 필수적인 SHH의 발현 및 클래식 II 요소의 발현을 상향조절하는데 있어서 RA에 보다 민감성이다.

콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT)를 발현하는 세포는 꼬리쪽화된 신경외배엽 세포가 운동 뉴런 분화를 위해 분주된 후 3주째에 나타나고 이들 세포는 본 연구에서 분석된 가장 긴 배양 기간인 7주까지동안 안정하게 증가하였다(도 12A). ChAT-발현 세포는 대부분 HB9⁺ 세포의 국소화에 상응하는 클러스터(도 12A)로 국소화된다. 이들 세포는 주로 다극성 세포이고 직경이 15 내지 20㎛인 대형 체세포이고 몇몇은 30㎛일정도로 크다(도 12A, B). 핵에서 HB9과 체세포 및 프로세스에서 ChAT의 동시발현은 배양 3주 후에 관찰되었다(도 12C). 대부분의 뉴런은 또한 아세틸콜린의 저장 및 분비를 위해 필수적인 다공성 아세틸콜린 수송체(VAChT, 도 12D)에 대해 양성으로 염색되었다. 특히 배양 5주 후에 많은 ChAT⁺ 세포는 세포체 및 프로세스상에서 시냅신에 대해 양성으로 표지되었다(도 12E).

본 발명자는 전기생리학적 기술(n= 28개 세포)을 사용하여 기능적 성숙화를 평가하였다. 평균 휴지기 전위는 ∼36.9±2.6mV이고 입수 저항은 920±57MΩ이었다. 단일 활동 전위(AP, 도 12Fi) 또는 계속적인 감소(도 12Fii)는 시험된 13개의 뉴런중 11개에서 전류 단계(0.15-0.2nA x 1s)를 탈분극시킴에 의해 유발되었다. 자발적 탈분극 시냅스 입수에 의해 유발되는 자발적 AP가 또한 관찰되었다(도 12G). 모든 세포가 기록 및 이에 따른 면역조직화학 분석중에 생존하는 것은 아니지만, 비오시틴 및 ChAT를 사용한 이중 면역염색은 본 발명자가 기록한 많은 세포가 운동 뉴런임을 입증하였다(도 12J).

전압 클램프 분석은 나트륨 및 지연된 정류기 칼륨 전류와 일치하는 시간 및 전압 의존성 내향 및 외향 전류를 밝혔다. 내향 전류 및 활동 전위는 1.0μM 테트로도톡신(TTX, n=3)에 의해 차단됨으로 전압 활성화된 나트륨 채널의 존재를 확인시켜 주는 것이다. 외향 전류의 특징은 추가로 분석되지 않았다. 본 발명자는 또한 자발적인 시냅스 전류를 관찰하였다(도 12H, n= 시험된 23개의 세포중 21). 이들은 1.0μM의 TTX에 의해 주파수가 감소하였으나 제거되지는 않았으며 이것은 기능적으로 온전한 시냅스 신경전달이 존재함을 입증하는 것이다. Cs글루코네이트 기본 피펫 용액을 사용하여, 외향(억제)전류는 서서히 쇠퇴(13.6ms, n = 10 이벤트)하고 스트리크닌 및 비쿠쿨린의 배합물에 의해 차단되는 반면 잔류 내향(자극)전류는 신속하게 쇠퇴(2.1ms, n= 17 이벤트)하고 D-AP5 및 CNQX(도 12H, J)의 배합물에 의해 차단됨으로 이것은 억제(GABA/글라이신) 및 자극(글루타메이트) 신경전달이 온전한 척주에서와 같이 발생함을 입증하는 것이다[문헌참조: Gao, B. X., et al., J. Neurophvsiol. 79: 2277-2287, 1998].

본 발명의 연구는 기능적 운동 뉴런이 FGF2에 의한 신경외배엽 분화, 신경화의 후기 단계 동안에 RA에 의한 특정화 및/또는 꼬리쪽화 및 이어서 배쪽화 모르포겐 SHH의 존재하에 유사분열 후 운동 뉴런으로 분화함을 통해 사람 ES 세포로부터 효율적으로 생성될 수 있음을 입증한다. 따라서, 동물로부터 터득된 신경 발육의 기본 원리는 사람 영장류에 적용될 수 있고 시험관내에서 반복될 수 있다. 마우스 ES 세포로부터 운동 뉴런 분화의 최근 입증[문헌참조: Wichterle, H., et al., Cell 110: 385-397, 2002]과는 반대로, 본 발명자는 신경외배엽 분화 과정을 밝혔고 척수 운동 뉴런과 같은 조기 신생 돌출 뉴런의 특정화를 위해 전구체가 Sox1 발현 신경외배엽 세포가 되기 전에 모르포겐으로 처리되어야만 한다는 것을 발견하였다.

마우스 ES 세포는 먼저 신경외배엽 세포로 지시되었고 이어서 이것은 도파민성 뉴런으로의 분화를 위해 FGF8 및 SHH[문헌참조: Barberi, T., et al., Nat. Biotechnol. 21: 1200-1207, 2003; Lee, S. H., et al., Nat. Biotechnol. 18: 675-679, 2000] 또는 운동 뉴런 분화를 위해 RA 및 SHH[문헌참조: Wichterle, H., et al., supra, 2002]와 같은 모르포겐으로 처리된다. 이들 관찰은 뉴런이 상피로부터 뉴런관으로 특정화된다는 개념과 맞는 것처럼 보인다. 본 발명의 관찰은, 또한 전뇌 표현형을 갖는 hES 유래 Sox1 발현 신경외배엽 세포가 척수 운동 뉴런을 생성시키는데 무반응함을 지적한다. 본 발명의 배양 시스템에서 hES 세포로부터 생성된 Sox1 발현 세포는, 이들이 6일된 사람 배아와 동등한 hES 세포로부터 2주 분화 후에 신경관형 구조를 형성하고 Sox1을 발현함으로 신경관의 세포들과 유사하 다[문헌참조: Zhang, S. C., J. Hematother. Stem Cell Res. 12: 625-634, 2003]. 생체내에서 신경관은 사람 임신 3주 말기에 형성되고[문헌참조: Wood, H. B. and Episkopou, V., Mech. Dev. 86: 197-201,1999] Sox1은 동물에서 신경관의 형성동안에 신경외배엽에 의해 발현된다[문헌참조: Pevny, L. H., et al., Development 125: 1967- 1978,1998 ; Wood, H. B. and Episkopou, V., supra, 1999]. 본 발명자의 발견은 한 부류의 뉴런, 운동 뉴런과 같은 적어도 큰 돌출 뉴런의 특정화가, 줄기세포가 Sox1-발현 신경외배엽 세포가 되기전에 개시됨을 제안하고 따라서, 이것은 뇌 유래 신경외배엽 세포가 상이한 지역의 실체의 돌출 뉴런을 생성시키지 못하는 이유를 설명할 수 있다.

hES 세포의 새로운 공급원으로부터 기능적 운동 뉴런은 ALS와 같은 운동 뉴런 관련된 장애를 치료하기 위해 디자인된 약제를 스크리닝하기 위한 일반적인 사람 운동 뉴런을 제공한다. 이들 세포는 또한 언젠가는 운동 뉴런 질환 또는 척주 손상을 갖는 환자에게 적용될 수 있는, 운동 뉴런의 실험적 세포 대용물을 위한 유용한 공급원을 제공한다.

방법

ES 세포의 배양 및 신경 분화

사람 ES 세포(세포주 H1 및 H9, 계대 19회 내지 42회)를 배양하고 문헌[참조: Thomson, J. A., et al., supra, 1998]에 기재된 바와 같이 방사선 조사된 배아 마우스 섬유아세포의 영양 공급 층상에서 주마다 계대하였다. 미분화된 상태의 ES 세포는 전형적인 형태 및 Oct4 및 SSEA4의 발현에 의해 확인하였다. 신경외배 엽 분화에 대해, hES 세포는 4일 동안 응집하였고 이어서 N2, 헤파린(2ng/ml) 및 FGF2(20ng/ml) 또는 RA가 보충된 F12/DMEM에서 10일 동안 접착 플라스틱 표면상에서 배양하였다[문헌참조: Zhang, S. C., et al., supra, 2001].

운동 뉴런 유도를 위해, 모르포겐 처리된 신경외배엽 세포를, 1주일 동안 RA(0.1μM) 및 SHH(10-500 ng/ml, R&D)의 존재하에 신경기본 배지(Gibco), N2 보충물 및 cAMP(Sigma, IgM)로 이루어진 신경 분화 배지에서 오르니틴/라미닌-피복된 커버슬립상에 분주하였다. 이후에, BDNF, GDNF 및 인슐린형 성장 인자-1(IGF-1)(10ng/ml, PeproTech Inc.)를 배지에 첨가하고 SHH의 농도를 50ng/ml로 감소시켰다.

면역세포화학 및 현미경(Zhang, S.C., et al., supra, 2001)

본 연구에 사용되는 1차 항체는 신경 부류 III β-튜불린(Covance Research Products, Richmond, CA, 1: 2000), 네스틴 (Chemicon, Temecula, CA, 1: 750), Sox1 (Chemicon, 1: 1000), 시냅신 I (Calbiochem, Darmstadt, German, 1: 500), ChAT (Chemicon, 1: 50), 및 VAChT (Chemicon, 1: 1000), lsll/2 (S. Pfaff), Otx2 (F. Vaccarino), 및 Olig2 (M. Nakafuku)에 대한 폴리클로날 항체를 포함한다. MNR2 또는 HB9(81.5C10), lsletl(40.2D6), Lim3(67.4E12), Pax6 및 Nkx2.2에 대한 항체는 공급원[Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, lowa City, IA)]으로부터 구입하였고 항-HoxC8는 제조원[Covance Research Products (1: 200)]으로부터 구입하였다. 전기생리학적으로 기록된 세포를 동정하기 위해, 비오시틴(Molecular Probes) 충전된 세포를 스트렙트아비딘-FITC(Sigma, 1:200)로 표지시키고 ChAT에 대해 염색시켰다. 니콘 형광 현미경 600(FRYER INC, Huntley, IL) 또는 고촛점 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)상에 탑재된 스팟 디지탈 카메라를 사용하여 이미지를 수거하였다. 본래에 비영장류 조직에 대해 개발된, 운동 뉴런 전사 인자 및 호메오도메인 단백질에 대한 항체의 특이성은 레서스 몽키 척주 및 뇌 조직(공급원: Wisconsin Primate Research Center)의 배아(E34 또는 E36)에서 입증되었다.

정량

총 분화된 세포(훽스트 표지됨) 중에서 HB9-발현 세포군은 메타모프(Metamorph) 소프트웨어(Universal Imaging Corporation, Downingtown, PA)를 사용하여 수동적으로 또는 입체학적 측정에 의해 실험 그룹에 대해 알지 못하는 사람에 의해 계수되었다. 측정되는 영역은 추적자에 의해 대략적인 윤곽을 나타내고 계수 프레임의 수를 미리 설정하여 이의 범위는 스테레오 연구자 소프트웨어(MicroBrightField Inc, Williston, VT)에 의해 작동되는 자동화된 단계 이동을 사용하여 무작위로 측정 부위를 샘플 채취하였다. 중첩 세포를 갖는 계수 영역에 대해 현미경을 미리 설정하여 상하로 움직여서 상이한 층내의 양성 세포를 촛점화하고 클러스터내 총 세포수를 소프트웨어로 평가하였다. 각각의 그룹내에 3 내지 4개의 커버슬립을 계수하고 데이타는 평균 ± SD로 표현하였다.

RT-PCT 분석

RT-PCR 증폭은 상이한 단계 및 운동 뉴런 분화 배양물에서 hES 세포 유래 신경외배엽 세포로부터 수행하였다.

하기의 프라이머를 사용하였다:

HoxC8, 5'-TTTATGGGGCTCAGCAAGAGG-3', 5'-TCCACTTCATCCTTCGGTTCTG-3', 318 bp; HoxC5, 5'-TCGGGGTGCTTCCTTGTAGC-3', 5'-TTCGTGGCAGGGACTATGGG-3', 290 bp; HoxB6, 5'-AACTCCACCTTCCCCGTCAC-3', 5'-CTTCTGTCTCGCCGAACACG-3', 340 bp; Otx2, 5'-CAACAGCAGAATGGAGGTCA-3', 5'- CTGGGTGGAAAGAGAAGCTG-3', 429 bp; HoxBl, 5'- TCAGAAGGAGACGGAGGCTA-3', 5'-GTGGGGGTGTTAGGTTCTGA-3', 218 bp; GAPDH, 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3', 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3', 450 bp; Olig2, 5'-AAGGAGGCAGTGGCTTCAAGTC-3', 5'-CGCTCACCAGTCGCTTCATC-3', 315 bp; Nkx2.2, 5'- TGCCTCTCCTTCTGAACCTTGG-3', 5'-GCGAAATCTGCCACCAGTTG-3', 337 bp; Irx3, 5'-AAGAACGCCACCAGGGAGAG-3', 5'-TTGGAGTCCGAAATGGGTCC-3', 473 bp; Pax6, 5'-GGCAACCTACGCAAGATGGC-3', 5'-TGAGGGCTGTGTCTGTTCGG-3', 459 bp; SHH, 5'-CCAATTACAACCCCGACATC-3', 5'-CCGAGTTCTCTGCTTTCACC-3', 339 bp; Nkx6.1, 5'-ACACGAGACCCACTTTTTCCG-3', 5'-TGCTGGACTTGTGCTTCTTCAAC-3', 335 bp.

전기생리학적 기록

hES 세포 유래 운동 뉴런의 전기생리학적 성질은 전세포 패취 클램프 기록 기술을 사용하여 5주 내지 6주동안 분화된 배양물에서 연구하였다[문헌참조: Gao, B. X., et al., J. Neurophvsiol. 79: 2277-2287, 1998]. 테트로도톡신(TTX, 1μM, Sigma), 비쿠쿨린(20μM, Sigma), 스트리크닌(5μM, Sigma), D-2-아미노-5-포스포노발레르산(AP-5, 40μM, Sigma) 또는 6-시아노-7-니트로퀴녹살린-2,3-디온(CNQX, 20μM, RBI, Natick, MA)을 욕조 용액에 적용하여 전압 활성화되거나 시냅스 전류의 실체를 확인하였다. 몇몇 실험에 대해, 1% 비오시틴을 기록 용액에 첨가하였다. 전류 및 전압 클램프 기록은 다중클램프 700A 증폭기(Axon Instruments, Union City, CA)를 사용하여 수행하였다. 시그날은 4kHz에서 거르고 디지데이타 1322A 아날로그-디지탈 컨버터(Axon Instument)를 사용하여 10kHz에서 샘플링하여 획득하고 시판되는 소프트웨어(pClamp9, Axon Instruments)를 사용하여 컴퓨터 하드 디스크에 저장하였다. 접근 저항성은 전형적으로 8-15MΩ이고 증폭기 회로를 사용하여 50 내지 80%까지 보상하였다. 자발적 시냅스 전류는 주형 검출 알고리듬(소형 분석 프로그램 5.6.28, 시냅토소프트, 데카투르, GA)을 사용하여 검출하고 레벤베르크-마르쿠아르트 알고리듬을 사용하여 단일 대수적 함수로 조정하였다. 당해 결과는 평균 ± SEM으로 제공한다.

도 1A-I는 ES 세포 기원의 신경 전구체의 분화 및 분리를 도시한다. 도 1A에서는 FGF2의 존재하에 5일 동안 성장한 부착된 EB가 말초에서 편평 세포이고 중앙에서 응집한 소형 신장된 세포임을 보여준다. 도 1B에서는 7일까지 많은 로제트 형성(화살표)이 분화하는 EB 중앙에서 나타남을 보여준다. 상부 우측 삽입 그림은 톨루이딘 블루로 염색된 로제트의 1㎛ 절편이고 이는 원주 세포가 관형 구조로 배열되어 있음을 보여준다. 막대 = 20㎛. 도 1C-E에서는 로제트 클러스터 세포(하부 좌측) 및 소형성 로제트(중앙)가 네스틴(도 1C) 및 무사쉬-1(도 1D)양성인 반면 주변 편평 세포는 음성임을 보여준다. 도 1E는 도 1C 및 도 1D와 DAPI로 표지된 모든 세포핵의 합성 이미지이다. 도 1F에서는 20분 동안 디스파제로 처리한 후, 로제트 형성이 후퇴하는 반면 주변 편평 세포는 부착된 채로 유지되고 있음을 보여준다. 도 1G-I에서는 분리된 세포가 네스틴에 의해 필라멘트 패턴으로 양성으로 염색되고(도 1G), 세포질내에서는 무사쉬-1로 양성으로 염색되고(도 1H) 주로 막에 대해서는 PSA-NCAM으로 양성으로 염색됨(도 1I)을 보여준다. 모든 핵은 DAPI로 염색된다. 막대 = 100㎛.

도 2A-G는 시험관내 ES 세포 유래 신경 전구체의 특성을 나타낸 것이다. 도 2A에서는 해리된 ES 세포 유래 신경 전구체에 의한 BrdU 혼입이 FGF2(20ng/ml)의 존재하에서는 상승되지만 상피 성장 인자(EGF)(20ng/ml) 또는 백혈병 억제 인자(LIF)(5ng/ml)의 존재하에서는 상승되지 않음을 보여준다. 이것은 3회 복제 실 험중 하나를 대표하는 데이타이다. ^*는 실험 그룹과 대조군 그룹간의 차이를 나타낸다(p < 0.01, n = 4, 스튜던트 t-시험). 도 2B는 3주동안의 ES 세포 유래 신경 전구체 클러스터의 분화가 경섬유를 따라 이동하는 세포와의 경섬유 다발을 형성함을 보여준다. 도 2C에서는, 3주 분화 후 면역염색 결과 대다수의 세포가 β_III-튜불린⁺ 뉴런(적색)이고 단지 몇개의 세포가 GFAP⁺ 성상세포(녹색)임을 보여준다. 도 2D에서는 45일 분화 후, 보다 많은 GFAP⁺ 성상세포(녹색)가 NF200⁺ 경섬유(적색이지만 녹색 GFAP와 중첩됨으로 인해 황색을 나타냄)와 함께 나타남을 보여준다. 도 2E-G에서는 다양한 형태를 갖는 ES 세포 유래된 뉴런이 글루타메이트(도 2E), GABA(도 2F) 및 효소 타이로신 하이드록실라제(도 2G)와 같은 명백한 신경전달물질을 발현함을 보여준다. O4⁺ 희소돌기아교세포(화살표)는 신경교 분화 배지에서 2주 분화후 관찰된다. 막대 = 100㎛.

도 3A-K는 생체내에서 ES 세포 유래 신경 전구체의 혼입 및 분화를 도시한다. 이식 세포는 프로브와 사람 alu-반복 요소(도 3A-E, G)의 동일계 하이브리드화 또는 사람 특이적 핵 항원(도 3F)에 대한 항체에 의해 검출된다. 도 3A에서는 8주된 수용체(화살표)의 숙주 피질에서의 각각의 공여체 세포를 보여준다. 도 3B에서는 해마 형성체내 ES 세포 유래 신경 전구체의 광범위한 혼입을 보여준다. 사람 alu 프로브와 하이브리드화된 세포는 적색 도트(가상 색상)으로 표지된다. 도 3C에서는 P14에서 해마 피라미드 층에 인접하여 혼입된 사람 세포를 보여준다. 도 3D에서는 4주된 수용체 마우스의 격막에서 ES 세포 유래 세포를 보여준다. 도 3E에서는 시상하부에서 각각의 공여체 세포의 고화질 조망을 보여준다. 인접한 비표지된 숙주 세포간에 이음매 없이 통합되어 있음을 주지한다. 도 3F에서는 사람 특이적 핵 항원에 대한 항체로 검출되는 4주된 숙주의 선조에서의 공여체 세포를 보여준다. 도 3G에서는 이식된 세포가 수관으로부터 배측부 중뇌로 광범위하게 이동함을 보여준다. 도 3H에서는 2주된 숙주의 피질에서 사람 ES 세포 유래 뉴런이 극성 형태 및 긴 프로세스를 나타냄을 보여준다. 세포는 사람 특이적 핵 마커(녹색) 및 β_III-튜불린(적색)에 대한 항체로 이중으로 표지된다. 도 3I에서는 사람 신경필라멘트에 대한 항체로 동정되는, 해마 체에서의 공여체 유래 축색돌기의 네트워크를 보여준다. 도 3J에서는 MAP2의 a 및 b 이소형을 인지하는 항체로 중복 표지되는 공여체 유래 다극성 뉴런을 보여준다. 도 3K에서는 사람 특이적 핵 마커(녹색) 및 GFAP에 대한 항체(적색)으로 중복 표지된 4주된 동물의 피질에서 ES 세포 유래 성상세포를 보여준다. 모든 중복 표지는 공초점 이미지이고 단일 광학 컷으로 확인됨을 주지한다. 막대: 도 3A, 도 3B, 도 3G에서 200㎛; 도 3C, 도 3D에서 100㎛; 도 3E, 도 3F, 도 3H-K에서는 10㎛.

도 4는 신경외배엽 세포의 생성 및 지역적 특수화를 도시한다.

도 4A에서는 원주 세포가 20ng/ml의 FGF2의 존재하에 9일째에 분화하는 ES 세포 콜로니에서 나타남을 보여준다. 도 4B에서는 원주 세포가 14일째에 신경관형 로제트를 형성함을 보여준다. 도 4C에서는 원주 형태를 갖는 로제트에서 세포가 Sox1(적색)에 대해 양성임을 보여준다. 도 4D에서는 FGF2 처리된 배양에서 신경 로제트 세포가 Bf1(적색)을 발현하지만 En-1(녹색)은 발현하지 않음을 보여준다. 도 4E에서는 En-1(녹색) 발현이 9일째에 섬유아세포 성장 인자 8(FGF8)(100ng/ml)로 6일까지 처리되고 4일 동안 FGF8중에서 증식함에 이어서 라미닌 기질에 대해 추가로 6일 동안 소닉 헤지호그(SHH)(200ng/ml)로 처리된 네스틴⁺(적색) 신경외배엽 세포에서 관찰됨을 보여준다. 도 4F에서는 당해 En-1⁺ 세포(녹색)가 도 4E에서와 같이 처리된 배양에서 Bf1(적색)에 대해 음성임을 보여준다. 세포 핵은 훽스트(c,d: 청색)로 염색된다. 막대: 50㎛.

도 5는 DA 뉴런의 분화를 보여준다. 도 5A에서는 분화된 세포의 약 3분의 1이 분화 3주째에 FGF8, SHH 및 아스코르브산(AA)으로 처리된 배양에서 타이로신 하이드록실라제(TH) 양성임을 보여준다. 도 5B에서는 배양물중의 모든 TH⁺ 세포(적색)가 양성으로 신경 마커 β_III-튜블린(녹색)으로 염색됨을 보여준다. 도 5C-E에서는 배양물중의 모든 TH⁺ 세포(d, 녹색)가 양성으로 방향족 산 데카복실라제(AADC)(d 및 e, 적색)로 염색되지만 몇몇 AADC⁺ 세포는 TH^-(e, 화살촉)임을 보여준다. 도 5F에서는 TH⁺ 세포가 노르아드레날린 뉴런 마커 도파민 β-하이드록실라제(DβH)(녹색)에 대해 음성임을 보여준다. 당해 사진은 DβH가 성인 랫트 뇌 줄기의 절편에서 세포를 양성으로 염색시킴을 지적한다. 세포핵은 웩스트(a, b, f; 청색)로 염색되었다. 막대 = 50㎛.

도 6은 사람 ES 세포 유래 DA 뉴런의 특성을 보여준다. 도 6A에서는 분화된 DA 뉴런이 RT-PCR에 의해 밝혀진 중뇌 페이트(fate)를 특정짓는 유전자를 발현함을 보여준다. EB: 배상체; NE: 신경외배엽 세포; 3w: 3주동안 분화된 DA 배양물; NC:음성 대조군. 도 6B에서는 배양물중의 대다수의 TH⁺ 세포(적색)가 중뇌 마커 En-1(녹색)을 발현함을 보여준다. 도 6C에서는 GABA 발현 세포(적색)가 배양물중에 존재하지만 매우 극소수의 TH⁺ 세포(녹색)가 GABA(적색, 사진)를 동시발현함을 보여준다. 도 6D에서는 TH⁺ 세포(적색)가 칼빈딘(녹색)에 대해 음성임을 보여준다. 막대 = 50㎛.

도 7은 사람 ES 세포 유래 DA 뉴런에서 수용체 및 수송체의 발현을 보여준다. 도 7A-C에서는 모든 TH⁺ 세포(a, 녹색)가 c-Ret(적색)을 발현함을 보여준다. 도 7D-F에서는 TH⁺ 세포(d, 녹색)가 VMAT2(e 및 f; 적색)를 동시 발현함을 보여준다. 도 7G-I에서는 TH⁺ 뉴런(j, 녹색)이 신나프토피신(k 및 l, 적색)을 동시 발현함을 보여준다. 막대 = 25㎛.

도 8은 시험관내 생성된 DA 뉴런의 기능 특성을 보여준다. 도 8A에서는 자발적 및 탈분극(HBSS중의 56mM KCl)-유도된 DA가 분화 3주째에 대조군 및 처리된 배양물에서 방출됨을 보여준다. 데이타는 3개 실험으로부터 평균 ± SD로서 나타 낸다. 쌍을 이루지 않는 스튜던트 t 시험에 의한 ^*p < 0.05 vs. 대조군. 도 8B에서는 30일 동안 분화된 2개의 뉴런에서 탈분극 전류 단계(0.2 nA)에 의해 유발되는 활동전위를 보여준다. 수동막 성질: (i) V_휴지기-49mV, Cm 15.5 pF, R_m 5.0 GΩ; (ii) V_휴지기-72mV, C_m 45 pF, R_m 885 GΩ. 도 8C에서는 36일 동안 분화된 뉴런에서 자발적 시냅스후 전위를 보여준다. 도 8D에서는 배양물에서 30일 동안 유지된 뉴런에서 자발적 시냅스후 전류를 보여준다. 뉴런은 K-글루코네이트 기본 피펫 용액을 사용하여 -40mV 전압에서 구부러진다. 외향 전류는 억제 반응을 반영하고 내향 전류는 당해 낮은 클로라이드 기록 용액에서 자극 반응을 반영한다. (ii) 패널 (i)에서 설명되는 세포 기원의 평균 반응. 중량 쇠퇴 시간 상수는 억제(n=17개 반응) 및 자극(n=14개 반응) 전류에 대해 61.4ms 및 9.9ms이다. 도 8E-G에서는 면역염색에 의해, 기록된 뉴런(f, 녹색)이 TH⁺(e 및 g, 적색)임을 보여준다. 막대 = 50㎛.

도 9는 FGF2 디스플레이 부리 표현형에 의해 유도되는 신경외배엽 세포를 보여준다. 10일 동안 FGF2에서 분화된 ES 세포는 콜로니 중심에서 작은 원주 형태를 보여주고 로제트를 형성하도록 구성된다. 로제트내 원주 세포 그러나 주변 편평 세포는 Pax6에 대해 양성이고 Sox1(A)에 대해서 음성이다. 14일까지 원주 세포는 신경관형 로제트(B)를 형성하고 Pax6(C) 및 Sox1(D)에 대해 양성이다. 로제트내 Pax6⁺ 세포(E)는 또한 Otx2⁺(F) 또는 En-1^-(G)이다. 신경관형 로제트에서 세포는 Otx2에 대해 양성이고 HoxC8(H)에 대해서는 음성이다. 청색은 훽스트 염색된 핵을 나타낸다. 막대 = 50㎛.

도 10은 신경외배엽 세포로부터 운동 뉴런의 생성을 보여준다. (A)는 2주동안(상부 열) Sox1⁺ 신경외배엽 세포의 분화가 과성장 영역에서 광범위하게 뉴런을 생성시키고 lsl 1를 발현시킴을 보여주지만 HB9⁺ 세포는 극소수이다. Pax6⁺/Sox1^- 신경외배엽 세포(2^nd 열)의 처리는 돌기가 광범위하게 과증식하게 하고 소수의 세포가 이동하고 lsl 1이 발현되고 HB9⁺ 세포의 비율이 높다. 조기 신경외배엽 세포로부터 분화되는 약 50%의 lsl 1/2⁺는 또한 HB9⁺(B)이다. HB9⁺는 또한 β_III-튜불린(C)에 대해 양성이다. 클러스터 중의 세포 약 21%는 배양물이 레티노산(RA) 및 SHH 둘다의 존재하에 분화되는 경우 HB9⁺인 반면, RA 단독 또는 SHH 단독에서 배양되는 경우 HB9⁺가 거의 관찰되지 않고 (D)에서도 관찰되지 않는다. 청색은 훽스트 염색된 핵을 나타낸다. 막대 = 50㎛.

도 11은 신경외배엽 세포에 대한 RA, FGF2 및 SHH의 효과를 보여준다. (A)에서는 RT-PCR 분석에 의해 지적되는 신경 유도 매질내에서 1주일 동안 RA 또는 FGF2 20ng/ml과 함께 배양된 조기 로제트 세포 기원의 문미측 유전자의 변화를 보여준다. (B)에서는 1주일 동안 RA 0.1μM로 처리된 조기 및 후기 신경외배엽 세포에서 호메오박스 유전자 발현을 비교한 것이다. RA로 처리되고 이어서 12일 동안 분화된 조기 신경외배엽 세포는 대부분 Otx2(C)에 대해 음성이지만 HoxC8(D)에 대해서는 양성이다. 모든 HoxC8⁺ 세포는 β_III- 튜블린⁺(E)이다. Pax6-발현 신경외배엽 세포는 Olig2(F)에 대해 음성이다. 1주동안 RA로 처리하고 SHH(100ng/ml)의 존재하에 2주동안 분화시킨 후, 많은 세포는 Olig2(G)를 발현한다. 후기 신경외배엽 세포가 RA로 처리되고 이어서 동일한 배양 조건(H)하에 분화되는 경우 Olig2⁺ 세포가 거의 관찰되지 않는다. 청색은 훽스트 염색된 핵을 나타낸다. 막대 = 50㎛.

도 12는 배양물내 운동 뉴런의 성숙과정을 보여준다. ChAT 발현 세포는 주로 클러스터(A)에 위치하고 대형 다극성 세포(B)이다. 공초점 이미지는 3주 배양 후(C)에 체세포 및 프로세스내 ChAT 및 핵내 HB9가 동시 위치함을 보여준다. 클러스터내 대부분의 세포는 VChAT(D)를 발현하였다. 많은 ChAT⁺ 세포는 배양 5주 후(E)에 체세포 및 프로세스에서 시냅신에 대해 양성이다. (F)에서는 42DIV로 유지되는 뉴런에서 탈분극 전류 단계(0.15nA)에 의해 유발되는 AP를 보여준다. 휴지기 막 전위(Vm) -50mV(fi) 및 -70mV(fii). (G)에서는 42DIV, Vm -50mV를 위해 유지되는 뉴런에서 자발적 AP를 보여준다. (H)에서는 대조군 조건(Hi)하에서 K-글루코네이트-기본 피펫 용액을 사용한 -40mV에서 자발적 내향 및 외향 시냅스 전류를 보여준다. 비쿠쿨린(20μM) 및 스트리크닌(5μM)의 욕조 적용이 외향 전류(IPSC, Hii)를 차단한다. 이어서 AP-5(40 μM) 및 CNQX(20μM)의 후속 적용은 잔류 내향 전류(EPSC, Hiii)를 차단한다. (i)에서는 패널 H에서 설명되는 세포 기원의 평균 sIPSC 및 sEPSC를 보여준다. (J)에서는 비오시틴(기록 전극 유래) 및 ChAT에 대한 이중 면역염색을 보여준다. 청색은 훽스트 염색된 핵을 나타낸다. 막대 = 50㎛.

도 13은 시험관내 생성된 운동뉴런의 전기생리학적 특징을 보여준다. (A)에서는 42DIV를 위해 유지되는 뉴런에서 탈분극 전류 단계(0.15nA)에 의해 유발되는 AP를 보여준다. 휴지기 막 전위(Vm)은 -59mV(ai) 및 -70mV(aii)이다. (B)에서는 42DIV, Vm-50mV에 대해 유지되는 뉴런에서 자발적 AP를 보여준다. (C)에서는 대조군 조건(ci)하에 K-글루코네이트 기본 피펫 용액을 사용한 -40mV에서의 자발적 내향 및 외향 시냅스 전류를 보여준다. 비쿠쿨린(20μM) 및 스트리크닌(5μM)의 욕조 적용은 외향 전류(IPSC, cii)를 차단한다. AP-5(40μM) 및 CNQX(20μM)의 후속 적용은 잔류 내향 전류(EPSC, ciii)를 차단한다. (D)에서는 패널 c에서 설명되는 세포 기원의 평균 sIPSC 및 sEPSC를 보여준다. (E-F)에서는 기록 후, 덮개 배양물을 ChAT로 면역염색시켜 비오시틴 충전된 뉴런이 ChAT에 대해 양성임을 보여준다. 막대 =50㎛.

Claims

(a) 배아 줄기 세포들을 배상체로 증식시키는 단계;

(b) 배상체를 조기 로제트 형태의 신경줄기 동조 세포군으로 증식시키는 단계로서, 상기 증식이 FGF2의 존재하에서 수행되는 단계; 및

(c) Sox1^-, Pax6⁺이고, 조기 로제트 형태인 세포들을 확인하는 단계를 포함하는, 배아 줄기세포로부터 배양된 동조 세포군을 포함하는 세포군의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 단계 (a)와 조기 로제트의 발달(development) 사이의 시간이 8 내지 10일인 방법.
제 1항에 있어서, Pax6⁺/Sox1^- 세포군이 총 세포군의 70% 이상인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 배상체가 FGF2의 존재하에 4 내지 6일 동안 배양되는 방법.
(a) 배아 줄기 세포들을 배상체로 증식시키는 단계;

(b) 배상체를 Sox1^-, Pax6⁺인, 조기 로제트 형태의 신경줄기 동조 세포군으로 증식시키는 단계로서, 상기 증식이 FGF2의 존재하에서 수행되는 단계; 및

(c) 단계 (b)에서 생성된 세포들을 FGF8의 존재하에 4 내지 6일 동안 배양하여 Pax6⁺/Sox1⁺및 EN1⁺인 신경관 형태의 세포들을 생산하는 단계를 포함하는, 신경관형 로제트 형태를 특징으로 하는 신경줄기 동조 세포군의 제조 방법.
(a) 배아 줄기 세포들을 배상체로 증식시키는 단계;

(b) 배상체를 Sox1^-, Pax6⁺인, 조기 로제트 형태의 신경줄기 동조 세포군으로 증식시키는 단계로서, 상기 증식이 FGF2의 존재하에서 수행되는 단계; 및

(c) 단계 (b)에서 생성된 세포들을 RA의 존재하에 4 내지 6일 동안 배양하여 Pax6⁺/Sox1⁺및 Hox⁺인 신경관(neural tube-like) 형태의 세포들을 생산하는 단계를 포함하는, 신경관형 로제트 형태를 특징으로 하는 신경줄기 동조 세포군의 제조 방법.
제 5항 또는 제 6항의 방법에 의해 제조되는 세포군.
(i) 제 5항의 방법에 따라 세포들을 배양하여 EN1⁺인 신경 줄기 세포들을 수득하는 단계; 및

(ii) 수득된 줄기 세포들을 FGF8 존재하에 SHH를 이용하여 배양하는 단계를 포함하며, 이에 따라 수득된 세포들이 TH, AADC, EN-1, VMAT2 및 DAT를 발현하지 만, DbH 및 PNMT를 발현하지 아니하며, 도파민을 생산하는, 중뇌 도파민 뉴런군의 제조 방법.
제 8항에 있어서, SHH에 대한 노출이 6 내지 7일인 방법.
(i) 제 6항의 방법에 따라 세포들을 배양하여 Hox⁺인 신경 줄기 세포들을 수득하는 단계; 및

(ii) 수득된 줄기 세포들을 SHH를 이용하여 배양하는 단계를 포함하며, 이에 따라 수득된 세포들이 HB9, HoxB1, HoxB6, HoxC5, HoxC8, ChAT 및 VAChT를 발현하며, 아세틸콜린을 생산하는, 척수 운동 뉴런군의 제조 방법.
제 10항에 있어서, 상기 세포들이 SHH에 6 내지 7일 동안 노출되는 방법.
제 8항 또는 제 9항의 방법에 의해 제조된 이식가능한 인간 세포군.
제 10항 또는 제 11항의 방법에 의해 제조된 세포군.
제 8항 또는 제 9항에 따른 방법에 의해 수득된 세포들을 시험 화합물에 노출시키는 단계 및 노출 결과를 시험 화합물에 노출시키지 않은 대조 세포군의 세포 들과 비교하여 조사하는 단계를 포함하는, 신경 세포 발달을 방해하는 활성에 관하여 시험 화합물을 조사하는 방법.
제 12항 또는 제 13항의 세포들을 시험 화합물에 노출시키는 단계 및 노출 결과를 시험 화합물에 노출시키지 않은 대조 세포군의 세포들과 비교하여 조사하는 단계를 포함하는, 신경 세포 발달을 방해하는 능력에 대해 시험 화합물을 조사하는 방법.
실시예들을 참조하여 상기한 것과 실질적으로 동일한 제 1항, 제 5항, 제 6항, 제 8항, 또는 제 10항 중 어느 한 항에 따른 방법.
실시예들을 참조하여 상기한 것과 실질적으로 동일한 제 7항, 제 12항, 또는 제 13항 중 어느 한 항에 따른 세포군.