CN108048399B - 一种meth诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法 - Google Patents

一种meth诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种METH诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法，包括如下步骤：步骤一：培养树鼩原代多巴胺神经元；步骤二：使用浓度为0.1‑1mM的METH诱导树鼩原代多巴胺神经元自噬，本发明测定了当METH浓度为0.5mM时能够诱导树鼩多巴胺神经元自噬，可以为下一步研究自噬信号及通路提供一个模型。

Description

一种METH诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法
技术领域
本发明涉及成瘾的生物学技术领域，具体涉及一种METH诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法。
背景技术
甲基丙苯胺（Methamphetamine,METH）是一种依赖性极高的精神活性物质。长期大量使用可对神经系统产生显著的毒性作用。自噬是通过溶酶体途径对细胞内受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和浸入其内的病原体进行降解的过程。但是自噬异常与很多疾病相关，包括肿瘤、免疫性疾病和神经退行性疾病等。科研人员前期研究显示，吗啡成瘾过程中线粒体功能异常，进而诱发自噬。过度自噬却是细胞程序性死亡的一种方式，与神经退行性疾病密切相关。近年来，研究表明，自噬参与了METH神经毒性的发生发展，但自噬在METH神经毒性及其依赖机制中的作用目前尚未完全阐明，本专利用METH诱导新生树鼩原代多巴胺神经元自噬，并研究自噬的信号通路，从而为进一步的研究METH的自噬机制及神经毒性提供理论基础。
发明内容
为了解决上述背景中提到的问题，本发明目的在于提供一种METH诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法，解决因测试站包含所有的测试项，一次只能测试一个样品，测试站内部功能使用率低下导致测试时间冗长的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种METH诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法，包括：
步骤一：培养树鼩原代多巴胺神经元；
步骤二：使用浓度为0.1—1mM的METH诱导树鼩原代多巴胺神经元自噬。
培养树鼩原代多巴胺神经元包括：
1）取新生3天内树鼩，麻醉后，于冰上无菌条件下取树鼩头部放于75%酒精浸泡5-10分钟，冰上取出完整大脑；
2）将步骤1的大脑放入预冷的D-Hank’s液，去除软膜血管，剥离出海马、大脑皮质及中脑，用D-Hank’s液清洗后，用眼科剪将组织反复剪碎1—1.5mm，移入15ml离心管，2500转离心5分钟；
3）将步骤2离心后弃上清，加入3ml 0.25%胰酶消化液，转入T25细胞瓶，反复吹打后放入温箱消化15-20分钟；
4）将步骤3消化后加入5ml培养液终止消化，所述培养液为高糖DMEM细胞培养基、5%FBS和1%双抗混合液，反复吹打消化后的细胞直至无肉眼可见的组织块，之后采用70目细胞筛过滤，滤液离心，弃上清，用神经元专用培养基重悬细胞并转入0.1mg/ml PDL包被的细胞板上培养，细胞板中细胞含量为1×106cell/孔，培养3d后换液，更换为神经元专用培养基，所述神经元专用培养基为neurbasal培养基、 2%B27、1%GlutamaxTM和 1%双抗，以后每3天换一次液，得到树鼩多巴胺能神经元；
5）当细胞贴壁并长汇合度为为70-80%时，进行酪氨酸羟化酶（TH）及Nestin蛋白的双荧光免疫鉴定为多巴胺神经元。
METH 诱导树鼩多巴胺神经元自噬：
1）配置有浓度分别为0，0.1mM，0.5mM，1mM的METH；
2）当细胞生长汇合度为80%-90%时，用浓度分别为0mM、0.1mM、0.5mM、1mM的MET加入细胞培养液中，24小时后在光学显微镜下观察到细胞形态出现空泡；收集细胞，提取细胞中蛋白进行自噬标志蛋白LC3B和Beclin-1的测定。
3）用浓度为0.5m的MMETH作用于原代细胞时间分别为0h、12h、24h、48h和72h，收集细胞后提取蛋白进行自噬标志蛋白LC3B和Beclin-1的测定。
4）用浓度为0.5m的MMETH作用细胞24小时，收集细胞进行细胞超微结构的检测，与METH为0mM相比。
5）用浓度为0.5m的MMETH作用细胞24小时，用4%多聚甲醛固定后进行LC3B和TH双免疫荧光标记，检测细胞中LC3B的表达。
本发明测定了当METH浓度为0.5mM时能够诱导树鼩多巴胺神经元自噬，可以为下一步研究自噬信号及通路提供一个模型。
附图说明
图1是本发明不同浓度的METH作用于树鼩多巴胺神经元的形态变化对比图；
图2是本发明不同浓度METH作用于树鼩原代多巴胺神经元效果对比图；
图3是本发明不同浓度METH作用于树鼩原代多巴胺神经元自噬蛋白LC3B的表达；
图4是本发明不同浓度METH作用于树鼩原代多巴胺神经元自噬蛋白Beclin-1的表达；
图5是浓度为0.5m的METH作用于树鼩原代多巴胺神经元不同时间效果对比图；
图6是浓度为0.5m的METH作用于树鼩原代多巴胺神经元不同时间自噬蛋白LC3B的表达；
图7是浓度为0.5m的METH作用于树鼩原代多巴胺神经元不同时间自噬蛋白Beclin-1的表达；
图8是本发明METH作用于树鼩原代神经元后的电镜图；
图9是本发明METH作用树鼩原代神经元后LC3B的表达。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明提供的实施例进行详细地描述。
首先，培养树鼩原代多巴胺神经元
1）取新生3天内树鼩，麻醉后，于冰上无菌条件下取树鼩头部放于75%酒精浸泡5-10分钟，冰上取出完整大脑；
2）将步骤1的大脑放入预冷的D-Hank’s液，去除软膜血管，剥离出海马、大脑皮质及中脑，用D-Hank’s液清洗后，用眼科剪将组织反复剪碎1—1.5mm，移入15ml离心管，2500转离心5分钟；
3）将步骤2离心后弃上清，加入3ml0.25%胰酶消化液，转入T25细胞瓶，反复吹打后放入温箱消化15-20分钟；
4）将步骤3消化后加入5ml培养液终止消化，反复吹打消化后的细胞直至无肉眼可见的组织块，之后采用70目细胞筛过滤，滤液离心，弃上清，用神经元专用培养基重悬细胞并转入0.1mg/ml PDL包被的细胞板上培养，细胞板中细胞含量为1×106cell/孔，培养3d后换液，更换为新的神经元专用培养基，以后每3天换一次液，得到树鼩多巴胺能神经元；
5）当细胞贴壁并长至70-80%时，进行酪氨酸羟化酶（TH）及Nestin蛋白的双荧光免疫鉴定为多巴胺神经元。
然后，METH 诱导树鼩多巴胺神经元自噬：
配置有浓度分别为0，0.1mM，0.5mM，1mM的METH。
用浓度分别为0,0.1mM,0.5mM,1mM的METH作用于细胞，24小时后在光学显微镜下观察到细胞形态出现空泡，以METH浓度为0.5mM时最为明显，如附图1所示；当METH作用细胞24小时后，收集细胞，提取细胞中蛋白进行自噬标志蛋白LC3B和Beclin-1的测定，发现细胞中加入METH 24小时后，LC3B和Beclin-1蛋白表达水平均有上调，其中当METH浓度为0.5mM时，LC3B和Beclin-1蛋白表达水平上调最为明显，与METH为0mM相比，分别增加了1.14倍和1.12倍，如附图2所示。
用浓度为0.5m的MMETH作用于原代细胞时间分别为0h、12h、24h、48h和72h，收集细胞后提取蛋白进行自噬标志蛋白LC3B和Beclin-1的测定，METH诱导自噬蛋白LC3B和Beclin-1蛋白质水平的表达，与0h相比，12h时分别增加了2.25倍和2.97倍，而24h后两种蛋白表达水平最高，分别增加了5.13倍和5.03倍，如附图3所示。
用浓度为0.5m的MMETH作用细胞24小时，收集细胞进行细胞超微结构的检测，与METH为0mM相比，加入METH0.5mM后，双层或多层膜结构的自噬体明显增多，如附图4所示。
用浓度为0.5m的MMETH作用细胞24小时，用4%多聚甲醛固定后进行LC3B和TH双免疫荧光标记，检测细胞中LC3B的表达，结果显示METH作用细胞后，细胞中LC3B的表达明显增多，如附图5。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种METH诱导树鼩多巴胺神经元原代细胞自噬的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：培养树鼩原代多巴胺神经元，步骤如下：
1）取新生3天内树鼩，麻醉后，于冰上无菌条件下取树鼩头部放于75%酒精浸泡5-10分钟，冰上取出完整大脑；
2）将大脑放入预冷的D-Hank’s液，去除软膜血管，剥离出海马、大脑皮质及中脑，用D-Hank’s液清洗后，用眼科剪将组织反复剪碎1—1.5mm，移入15ml离心管，2500转离心5分钟；
3）离心后弃上清，加入3ml0.25%胰酶消化液，转入T25细胞瓶，反复吹打后放入温箱消化15-20分钟；
4）消化后加入5ml培养液终止消化，反复吹打消化后的细胞直至无肉眼可见的组织块，之后采用70目细胞筛过滤，滤液离心，弃上清，用神经元专用培养基重悬细胞并转入0.1mg/ml PDL包被的细胞板上培养，细胞板中细胞含量为1×106cell/孔，培养3d后换液，更换为神经元专用培养基，以后每3天换一次液，得到树鼩多巴胺神经元细胞；所述的培养液为高糖DMEM细胞培养基、5%FBS和1%双抗混合液；所述的神经元专用培养基为neurbasal培养基、2%B27、1%GlutamaxTM和 1%双抗；
5）当细胞贴壁并长至汇合度为70-80%时，进行酪氨酸羟化酶（TH）及Nestin蛋白的双荧光免疫鉴定为多巴胺神经元；
步骤二，使用浓度为0.1-1mM的METH诱导树鼩原代多巴胺神经元自噬，步骤如下：
1）配置有浓度分别为0，0.1mM，0.5mM，1mM的METH；
2）当细胞生长汇合度为80%-90%时，用浓度分别为0mM、0.1mM、0.5mM、1mM的METH加入细胞培养液中，24小时后在光学显微镜下观察到细胞形态出现空泡；收集细胞，提取细胞中蛋白进行自噬标志蛋白LC3B和Beclin-1的测定；
3）用浓度为0.5m的MMETH作用于原代细胞时间分别为0h、12h、24h、48h和72h，收集细胞后提取蛋白进行自噬标志蛋白LC3B和Beclin-1的测定；
4）用浓度为0.5m的MMETH作用细胞24小时，收集细胞进行细胞超微结构的检测，与METH为0mM相对比；
5）用浓度为0.5m的MMETH作用细胞24小时，用4%多聚甲醛固定后进行LC3B和TH双免疫荧光标记，检测细胞中LC3B的表达。
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