CN106497871A - 一种提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的方法，该方法为在人羊膜间充质干细胞中添加诱导组合物，该组合物包括0.1～2g/L透明质酸、0～200mg/L前列腺素E2受体选择性激动、1～100 nmol/L地塞米松、0～10mmol/L β‑甘油磷酸钠和1～100mg/L抗坏血酸。本发明与常规诱导方法相比，可显著提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率，促进碱性磷酸酶的表达及活性，增强RunX2、Osx、BSP、Ocn、ALP和Col1α1等成骨相关基因的表达，以及矿化钙结节的形成。本发明可在人间充质干细胞成骨分化中应用，以及在骨缺损、骨创伤等骨病中应用。

Description

一种提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的方法及应用
技术领域
本发明属于干细胞生物技术与骨组织工程技术领域，涉及到一种提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的方法及应用。
背景技术
骨因创伤、感染、退行性病变、肿瘤切除等原因导致损伤或缺损，是骨科疾病中的常见病、多发病。仅以骨关节炎为例，目前我国患者约有1.5亿，WHO推测到2025年全球患者将超过8亿，数量仅次于心血管相关疾病，已成为严重影响人类健康的重要疾病。目前，骨缺损的修复与功能重建，传统的治疗方法难以取得理想效果，已成为医学领域的一大难题。近年来，随着干细胞工程技术体系的快速发展和完善，以干细胞移植为核心的再生医学及组织工程学作为一种新型的治疗技术，使人们看到了彻底攻克这一医学难题的希望。大量的研究表明，人羊膜间充质干细胞具有比骨髓间充质干细胞有更强的扩增能力、分化能力、低免疫原性、无致瘤风险和伦理学限制等优势，被认为是再生医学的理想种子细胞，亦是骨组织工程的最佳种子细胞来源(肖建辉. 人羊膜干细胞：再生医学的理想种子细胞资源. 遵义医学院学报 38(5): 439-449, 2015)。
干细胞在外界适当的因子条件干预下，对其增殖和分化进行调控，定向发展。这个调控过程主要是通过自身细胞内源性和外源性相关调控因子的响应，来决定干细胞命运。这是一个极其复杂的生命过程，直接影响到干细胞的临床应用，亦是当前干细胞领域研究的重点方向。因此，干细胞在骨疾病方面的临床应用关键，在于寻找到高效、无毒、无副作用，生物相容性好的促进干细胞成骨分化的诱导剂或诱导策略。目前，诱导人羊膜间充质干细胞等干细胞成骨分化的体系中，加入的外界信号物质（诱导因子）主要是非人体细胞存在的一些物质，譬如骆驼蓬碱、枸橘苷、葛根素（任艳玲,宋囡,何文智,等. 一种成骨分化诱导剂. 申请号 201310471912.2）等。然而，目前干细胞的定向诱导分化存在诱导体系较复杂、分化效率低等诸多因素影响其临床应用。
Martin MJ等医学界人士发现，体外扩增的干细胞极易受到来自培养介质中存在的一种人体内没有的物质Ｎ-羟乙酰神经氨酸污染，而被其污染的干细胞很容易被人类免疫系统识别和攻击，这危及到干细胞的临床应用。透明质酸是人体细胞外基质主要结构成分。而细胞外基质决定细胞的形状、影响细胞的活力、迁移、增殖分化，并参与信号传递，透明质酸在其中扮演重要角色，并在机体正常和病理状态下发挥多重生物学功能。因此，利用人体细胞存在的因子(人源性因子)来调控干细胞分化可规避潜在的临床风险。然而，迄今尚未见发掘人源性因子来调控干细胞的分化。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种安全、高效促人羊膜间充质干细胞成骨分化的方法及应用。
一种提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的方法，其具体步骤为：
（1）人羊膜间充质干细胞的分离培养：将健康足月剖宫产新鲜胎盘钝性机械剥离羊膜，用含1%双抗的D-Hank’s液反复冲洗羊膜，除去残留血渍和表面粘液后。将羊膜剪成1～3cm2大小，分装于50 mL离心管内，加入约羊膜组织2倍体积的含0.02% EDTA-2Na 的0.05%胰蛋白酶消化液，于35～37℃恒温水浴箱中，150～185rpm旋转消化约30 min，经300目不锈钢滤网过滤后，弃去含有羊膜上皮细胞的消化液，重新加入新鲜的含0.02% EDTA-2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，重复消化一次，再次经300目不锈钢滤网过滤后，弃去消化液。经上述胰蛋白酶消化后剩余的羊膜组织用含1% 双抗的D-Hank’s液清洗一次，除去残留的胰蛋白酶消化液，加入含0.05 mg/mL DNase I的 0.5 mg/mL II型胶原酶消化液，于35～37 ℃恒温水浴箱中，150～185rpm旋转消化1～2 h，直至剩余的羊膜组织碎片完全消化成絮状，经300目不锈钢网过滤，收集细胞滤液，1500 rpm，4℃离心10 min，弃上清，细胞沉淀即为人羊膜间充质干细胞；用含10%胎牛血清的低糖DMEM重悬细胞，种于T25细胞培养瓶，在35～37℃，含1℃的10% CO2及85℃的100%空气饱和湿度恒温培养，待细胞融合度达80%以上进行传代培养；
（2）人羊膜间充质干细胞向成骨分化诱导组合物的制备：在1L高糖DMEM完全培养基中，加入0.1～2 g/L透明质酸、0～200mg/L 前列腺素E2受体选择性激动、1～100 nmol/L地塞米松、0～10mmol/L β-甘油磷酸钠和1～100mg/L抗坏血酸的诱导剂，即得提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的诱导组合物；
（3）、诱导组合物促人羊膜间充质干细胞成骨分化的方法：取2代对数生长期人羊膜间充质干细胞，按2×105 cells/孔的细胞量，接种于6孔板内，0～48小时后加入诱导组合物，每2～3天换一次应用基质和诱导组合物，在35～37℃，含1～10% CO2及85～100%空气饱和湿度恒温培养箱内培养14～21天，诱导分化终止。
所述用于诱导分化的人羊膜间充质干细胞为2～5代。
所述用于诱导分化的人羊膜间充质干细胞初始种子密度，按5×105 -5×106个/瓶的细胞接种密度种于25cm2培养瓶。
所述诱导组合物中透明质酸的分子量为20～2200KD。
本发明所述方案调控人羊膜间充质干细胞向成骨分化，可应用于骨相关疾病细胞移植和骨组织工程种子细胞。
本发明所述方案调控人羊膜间充质干细胞向成骨分化，可作为种子细胞替代成骨细胞，避免体外获取成骨细胞难和细胞移植后高免疫原性问题。
本发明所述诱导组合物可制备治疗骨疾病药物，联合人羊膜间充质干细胞移植治疗相关骨疾病。
本发明相比常规诱导方法，可显著提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率，促进碱性磷酸酶的表达及活性，增强RunX2、Osx、BSP、Ocn、ALP和Col1α1等成骨相关基因的表达，以及矿化钙结节的形成。本发明可在人间充质干细胞成骨分化中应用，以及在骨缺损、骨创伤等骨病中应用。
附图说明
图1为人羊膜间充质干细胞诱导分化21天后的形态特征图（×100），（a）为对照组，（b）为阳性对照组，（c）为加诱导组合物的实验组；
图2为人羊膜间充质干细胞诱导分化14天后碱性磷酸酶ALP的BCIP/NBT染色及酶活力检测结果（×100），（a）为对照组，（b）为阳性对照组，（c）为加诱导组合物的实验组；
图3为人羊膜间充质干细胞诱导分化21天后矿化钙结节的茜素红S染色结果（×200），（a）为对照组，（b）为阳性对照组，（c）为加诱导组合物的实验组；
图4为人羊膜间充质干细胞诱导分化7天、14天后的成骨相关基因的表达情况。
具体实施方式
本发明通过如下实施例和附图作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的方法及应用
1、人羊膜间充质干细胞的分离培养
将健康足月剖宫产新鲜胎盘钝性机械剥离羊膜，用含1%双抗的D-Hank’s液（终浓度为青霉素：100 IU/mL，链霉素:100 IU/mL，临用前新鲜配制）反复冲洗羊膜，除去残留血渍和表面粘液后。将羊膜剪成1～3 cm2大小，分装于50 mL离心管内，加入约羊膜组织2倍体积的含0.02% EDTA-2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，于35～37 ℃恒温水浴箱中，150～185rpm旋转消化约30 min，经300目不锈钢滤网过滤后，弃去含有羊膜上皮细胞的消化液，重新加入新鲜的含0.02% EDTA-2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，重复消化一次，再次经300目不锈钢滤网过滤后，弃去消化液。经上述胰蛋白酶消化后剩余的羊膜组织用含1% 双抗的D-Hank’s液清洗一次，除去残留的胰蛋白酶消化液，加入含0.05 mg/mL DNase I的 0.5 mg/mL II型胶原酶消化液，于35～37 ℃恒温水浴箱中，150～185rpm旋转消化1～2 h，直至剩余的羊膜组织碎片完全消化成絮状，经300目不锈钢网过滤，收集细胞滤液（即消化液），1500 rpm，4℃离心10 min，弃上清，细胞沉淀即为人羊膜间充质干细胞。用含10%胎牛血清的低糖DMEM重悬细胞，种于T25细胞培养瓶，在35～37℃，含1～10% CO2及85～100%空气饱和湿度恒温培养，待细胞融合度达80%以上进行传代培养，第2～5代用于以下实验。
2、诱导人羊膜间充质干细胞向成骨分化诱导组合物的制备
在1L高糖DMEM完全培养基中，加入0.1～2 g/L 20～2200KD透明质酸、0～200mg/LONO-4819、1～100 nmol/L地塞米松、0～10mmol/Lβ-甘油磷酸钠和1～100mg/L抗坏血酸的诱导剂，即获得提高间充质干细胞成骨分化效率的诱导组合物。
3、诱导组合物促人羊膜间充质干细胞成骨分化的方法
取2代对数生长期人羊膜间充质干细胞，按2×105 cells/孔的细胞量，接种于6孔板内，24小时后加入诱导组合物，每2天换一次应用基质和诱导组合物。连续培养7～21天。
细胞水平分析实验：光学显微镜下观察细胞形态变化；反应成骨分化水平指标包括碱性磷酸酶(ALP)和矿化钙结节（钙盐沉积）。采用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒的方法染色测定碱性磷酸酶ALP，采用碱性磷酸酶检测试剂盒，在405nm测定OD值，计算出ALP酶活力，采用茜素红S染色法测定矿化钙结节。在培养到21天时，与对照组相比，阳性对照组（阳性组）及加诱导组合物的实验组（实验组）诱导的细胞均从长梭形变成铺路石状，部分细胞重叠生长呈不透光的结节，且实验组诱导的不透光结节数量明显多于阳性组（图1）；在培养到14天时，ALP染色，与对照组相比，阳性组和实验组均有呈浅蓝紫色的阳性细胞，即ALP呈阳性，而且实验组阳性细胞数量显著多于阳性组，而且两者ALP酶活力的结果均显著高于对照组，但两者差异不明显（图2）；在培养到21天时，阳性组合实验组茜素红S染色呈强阳性，能观察到大量的红色矿化钙结节，尤其是实验组结节数量明显多于阳性组（图3）。
分子水平检测结果：分别采用RT-qPCR法定量测定了RunX2、Osx、BSP、Ocn、ALP和Col1α1等成骨相关基因的表达情况，用β-actin作为内参。在培养到7天时，阳性组和实验组所检测的基因转录水平均明显高于对照组，而实验组的表达量又明显高于阳性组，但到14天时，这些成骨相关基因的转录水平均表达下调，实验组的RunX2、ALP基因的相对表达量明显高于阳性组，除Ocn基因外，其它几个基因的表达量低于阳性组。而且，对照组的Col1α1基因转录水平高于实验组和阳性组，三者的Ocn基因转录水平相当（图4）。
实施例2. 促进人羊膜间充质干细胞成骨在其它方面的用途
人羊膜间充质干细胞在体外用本发明诱导组合物诱导向成骨分化，可作为骨组织工程和细胞移植的种子细胞的用途。对骨折及骨代谢性疾病均有一定的防治作用。用本发明诱导组合物诱导分化人羊膜间充质干细胞作为种子细胞替代成骨细胞，可避免成骨细胞体外较难获取和高免疫原性的问题。

Claims (5)

1.一种提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的方法，其特征在于：所述提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的具体步骤为：
（1）人羊膜间充质干细胞的分离培养：将健康足月剖宫产新鲜胎盘钝性机械剥离羊膜，用含1%双抗的D-Hank’s液反复冲洗羊膜，除去残留血渍和表面粘液后；将羊膜剪成1～3cm2大小，分装于50 mL离心管内，加入约羊膜组织2倍体积的含0.02% EDTA-2Na 的0.05%胰蛋白酶消化液，于35～37 ℃恒温水浴箱中，150～185rpm旋转消化约30 min，经300目不锈钢滤网过滤后，弃去含有羊膜上皮细胞的消化液，重新加入新鲜的含0.02% EDTA-2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，重复消化一次，再次经300目不锈钢滤网过滤后，弃去消化液；经上述胰蛋白酶消化后剩余的羊膜组织用含1% 双抗的D-Hank’s液清洗一次，除去残留的胰蛋白酶消化液，加入含0.05 mg/mL DNase I的 0.5 mg/mL II型胶原酶消化液，于35～37 ℃恒温水浴箱中，150～185rpm旋转消化1～2 h，直至剩余的羊膜组织碎片完全消化成絮状，经300目不锈钢网过滤，收集细胞滤液，1500 rpm，4℃离心10min，弃上清，细胞沉淀即为人羊膜间充质干细胞；用含10%胎牛血清的低糖DMEM重悬细胞，种于T25细胞培养瓶，在35～37℃，含1～10% CO2及85～100%空气饱和湿度恒温培养，待细胞融合度达80%以上进行传代培养；
（2）人羊膜间充质干细胞向成骨分化诱导组合物的制备：在1L高糖DMEM完全培养基中，加入0.1～2 g/L透明质酸、0～200mg/L 前列腺素E2受体选择性激动、1～100 nmol/L地塞米松、0～10mmol/L β-甘油磷酸钠和1～100mg/L抗坏血酸的诱导剂，即得提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的诱导组合物；
（3）诱导组合物促人羊膜间充质干细胞成骨分化的方法：取2代对数生长期人羊膜间充质干细胞，按2×105 cells/孔的细胞量，接种于6孔板内，0～48小时后加入诱导组合物，每2～3天换一次应用基质和诱导组合物，在35～37℃，含1～10% CO2及85～100%空气饱和湿度恒温培养箱内培养14～21天，诱导分化终止。
2.根据权利要求1所述提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的方法，其特征在于：用于诱导分化的人羊膜间充质干细胞为2～5代。
3.根据权利要求1所述提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的方法，其特征在于：用于诱导分化的人羊膜间充质干细胞初始种子密度，按5×105 ～5×106个/瓶的细胞接种密度种于25cm2培养瓶。
4.根据权利要求1所述提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的方法，其特征在于：所述诱导组合物中透明质酸的分子量为20～2200KD。
5.根据权利要求1所述提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率可应用于骨组织工程和细胞移植的种子细胞。
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