CN110408590B - 一种诱导人间充质干细胞向成骨细胞分化的方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导人间充质干细胞向成骨细胞分化的方法与应用，采用本发明所述方法，可显著促进人间充质干细胞向成骨细胞分化，细胞形态变成卵圆形至多边形，并使其高表达成骨相关基因蛋白以及成骨细胞标志物碱性磷酸酶，显著提高碱性磷酸酶活性，最终形成大量矿化钙结节，利用其成骨诱导方法所形成的成骨细胞应用于骨相关疾病细胞移植和骨组织工程的种子细胞，对骨病损替代成骨细胞，而且能够避免体外获取成骨细胞难和细胞移植后高免疫原性问题。

Description

一种诱导人间充质干细胞向成骨细胞分化的方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体来说是一种诱导人间充质干细胞向成骨细胞分化的方法与应用。
背景技术
骨缺损、骨质疏松症、股骨头缺血性坏死等骨病发病率高，甚至超过心脑血管疾病，因骨病引起失能而严重影响患者生活质量。而且传统疗法效果甚微，是医学领域的一大难题，并给国家和社会带来沉重的负担，成为公共卫生领域的一大挑战 (Dimitriou R, etal. Bone regeneration: current concepts and future directions. BMC Med. 2011,9: 66；Wang Y， et al. Small molecules and their controlled release that inducethe osteogenic/chondrogenic commitment of stem cells. Biotechnology Advances,2015, 33(8):1626-40.)。
干细胞是一类具有自我更新及分化潜能的细胞，在一定条件下，能分化成不同类型功能细胞，而对组织器官创伤起到修复作用。近年来，以干细胞为核心的再生医学与组织工程的飞速发展，间充质干细胞在治愈骨缺损、骨质疏松症等骨损疾病方面展示了巨大潜力(Xiao N. Application of bone marrow stem cell based therapy in bone lossdiseases. Curr Pharm Des 2017; 23(41):6288-97; Phetfong J, et al.Osteoporosis: the current status of mesenchymal stem cell-based therapy. CellMol Biol Lett. 2016; 21:12.)。
间充质干细胞是中胚层发育而来的一种主要成体干细胞，具有自我更新和多向分化能力的干细胞。间充质干细胞在人体中分布较广，主要存在于结缔组织和器官间质中，包括骨髓、脂肪、滑膜、骨骼（骨外膜和骨小梁）、肌肉等。作为干细胞治疗的主要种子细胞，间充质干细胞在许多国家已开展了治疗骨损等难治性疾病的临床试验研究，并取得了令人鼓舞的进展（Jin YZ and Lee JH. Mesenchymal stem cell therapy for boneregeneration. Clin Orthop Surg. 2018;10(3):271-8）。通常，在干细胞移植治疗前，需要将干细胞诱导分化为特定的细胞类型，规避干细胞直接注入宿主可能致瘤风险。因此，找到安全、高效调控干细胞定向分化的诱导剂成为干细胞领域的重要课题。
在干细胞移植治疗骨病损及骨组织工程领域，提高间充质干细胞的体外成骨分化能力，是确保其用于移植治疗骨病损的关键技术。目前，在干细胞成骨分化的体系中，常加入地塞米松、转化生长因子-β、骨形态蛋白、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子、血小板源生长因子、β-甘油磷酸钠等因子构成的组合诱导体系。存在诱导体系较复杂、成骨分化效率低等劣势，再有地塞米松是激素类药物，对骨组织严重副作用，严重制约其临床应用。因此，发掘高效、安全成骨分化诱导剂有重要意义。
近些年来，许多研究发现天然小分子化合物在调控干细胞命运过程扮演了重要角色 (Lyssiotis CA, et al. Chemical control of stem cell fate and developmentalpotential. Angew.Chem. Int. Ed., 2011, 50(1): 200-242;《科技导报》2016年，第20期，25-33页)。而且，采用天然小分子化合物诱导获得的功能性细胞被认为更符合临床应用要求，譬如纯度高、受外界污染少，可控性较好，且无免疫原性。因此，在天然小分子化合物发掘干细胞成骨诱导剂既有可行性更有必要性。现有的研究提示，天然小分子化合物骆驼蓬碱（Yonezawa T, et al. Harmine promotes osteoblast differentiation throughbone morphogenetic protein signaling. Biochem Biophys Res Commun 409(2): 260-265, 2011）、枸橘苷（Yoon HY, et al. Poncirin promotes osteoblastdifferentiation but inhibits adipocyte differentiation in mesenchymal stemcells. Eur J Pharmacol 664(1-3): 54-59, 2011）等均有促进干细胞成骨分化效应。
因此，以我国名贵中药材灵芝、虫草等真菌来源的天然小分子化合物为筛选对象，在国际上首次发现三萜化合物Ganoderal A (中文译为灵芝醛A, 简称GD-A) 能显著诱导人间充质干细胞向成骨细胞分化，具有巨大临床应用潜力。本发明所述灵芝醛A具有制备治疗骨疾病药物潜力，其亦可联合人间充质干细胞移植治疗相关骨疾病潜力。
发明内容
针对背景技术中所存在的问题，基于在治疗相关骨疾病中的重要科学意义及临床价值，本发明的目的一是提供一种具有安全、高效，具有诱导人间充质干细胞向成骨细胞分化的化合物，二是利用该化合物用于成骨诱导方法，三是利用成骨诱导方法所形成的成骨细胞应用于种子细胞中，用于治疗骨疾病具有重要意义，具体地说是一种诱导人间充质干细胞向成骨细胞分化的方法与应用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种诱导人间充质干细胞向成骨细胞分化的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)人间充质干细胞的分离培养；
(2)制备具有诱导作用的化合物；
(3)将所制备的化合物稀释到安全剂量后，添加到人间充质干细胞中进行诱导培养，诱导培养至形成矿化钙结节后，即得到成骨细胞。
进一步地，本发明所述的方法，其中步骤(3)中所述化合物的分子式为C30H44O2，分子量为436，其结构式如通式(I)所示：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
其中所述化合物的制备方法为：取灵芝子实体经干燥后，通过超微破壁粉碎为800-1000目细粉，然后在细粉中加入10倍量的体积百分浓度为90～95%甲醇提取三次，每次提取的时间为2小时，合并三次提取液，并将收集的提取液经减压浓缩干燥后获得浸膏；对所得的浸膏先用温水使浸膏混悬后，经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取部位采用硅胶柱层析，经过层析后，再用二氯甲烷-甲醇（1:0→0:1）梯度洗脱，获得的洗脱馏分再次通过硅胶柱层析，最后再用石油醚-乙酸乙酯（1:0→0:1）梯度洗脱，获得的洗脱馏分经中压液相色谱和反相半制备色谱分离后，即获得所述化合物。
进一步地，本发明所述的方法，其中步骤(3)中所述化合物安全剂量为0.001～10µM(微摩尔浓度)，所述诱导培养的时间为5～20天。
进一步地，本发明所述的方法，其中所述化合物安全剂量为0.01µM，所述诱导培养的时间为17天。
本发明还公开了利用上述方法制备的成骨细胞可应用于骨组织工程和细胞移植的种子细胞。
本发明的有益效果在于：从灵芝子实体中提取的化合物，具有诱导人间充质干细胞向成骨细胞分化，可显著促进人间充质干细胞向成骨细胞分化，细胞形态变成卵圆形至多边形，并使其高表达成骨细胞标志物碱性磷酸酶，最终形成矿化钙结节，利用其成骨诱导方法所形成的成骨细胞应用于种子细胞中，用于治疗骨疾病具有重要意义，可作为骨相关疾病细胞移植和骨组织工程的种子细胞，并作为种子细胞替代成骨细胞，能够避免体外获取成骨细胞难和细胞移植后高免疫原性问题。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步详细说明。
图1为人间充质干细胞鉴定结果图：其中A表示流式细胞术鉴定细胞表面分子；B表示免疫细胞化学染色法鉴定细胞特征标志物；
图2为GD-A化合物的纯度及结构鉴定图；
图3为GD-A化合物的质谱分析图；
图4为GD-A化合物的NMR氢谱图；
图5为GD-A化合物的NMR碳谱图；
图6为不同浓度的GD-A对人间充质干细胞的细胞毒性作用分析结果图；
图7为GD-A诱导人间充质干细胞向成骨细胞分化过程成骨细胞标志物碱性磷酸酶的检测结果图：其中A表示成骨细胞标志物碱性磷酸酶的表达；B表示成骨细胞标志物碱性磷酸酶的酶活；
图8为GD-A诱导人间充质干细胞向成骨细胞分化过程细胞形态变化图；
图9为GD-A诱导人间充质干细胞形成成骨细胞标志物矿化钙结节的结果图；
图10为GD-A诱导人间充质干细胞表达特异性成骨相关蛋白的结果图。
具体实施方式
为了更充分的解释本发明的实施，使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明的实施，并不用于限定本发明。
实施例1：人间充质干细胞分离培养与鉴定
利用健康孕妇足月剖宫产新鲜胎盘，采用机械法联用两酶（胰蛋白酶和II型胶原酶）消化法从羊膜中分离得到间充质干细胞。用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬细胞，种于T25细胞培养瓶，在37℃，含5% CO2及95%以上空气饱和湿度恒温培养，待细胞融合度达80%以上进行传代培养，第2-5代细胞用于后续实验。当第2代细胞培养到融合度80%时，收集细胞采用流式细胞术鉴定细胞表面分子，该细胞高表达CD90、CD105、CD73、CD44和CD29等细胞间充质细胞表面分子，不表达CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR等造血干细胞标志以及MHC II类细胞表面分子，如图1中A所示。免疫细胞化学染色法检测结果提示，该细胞高表达间充质细胞标志物波形蛋白，不表达上皮细胞标志物角蛋白CK19，如图1中B所示。因此该细胞具有典型的间充质细胞表型。
实施例2：GD-A天然化合物的分离与鉴定
取干燥的灵芝子实体经超微破壁粉碎，经10倍体积的90-95%甲醇回流提取3次，每次2小时，提取液经减压浓缩干燥后获得浸膏。温水混悬后经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取部位采用硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇（1:0→0:1）梯度洗脱，获得的洗脱馏分再次硅胶柱层次，用石油醚-乙酸乙酯（1:0→0:1）梯度洗脱，该洗脱馏分经中压液相色谱和反相半制备色谱分离，获得化合物GD-A。该化合物经HPLC分析纯度为95%，如图2所示，其质谱检测结果见图3所示，其分子量为436，分子式为C30H44O2。经NMR氢谱分析如图4所示，其高场区主要结果为δ0.83（3H,s）, δ1.13（3H,s）,δ0.94（3H,d,J=6.0Hz），δ1.75（3H,s）,δ1.13（3H,s）,δ1.03（3H,s）,δ0.83（3H,s）分别为18、19、21、27、28、29和30位的甲基氢信号，可判断该化合物为四环三萜类；低场区δ6.48（1H,s），δ7.28（1H,m）和δ9.40（1H,s）分别是乙烯基甲基、烯烃基、甲酰基上的氢信号；NMR碳谱分析结果，如图5所示，其低场区为3和26位δ195.4、δ216.8为羰基碳信号，δ142.7、δ139.1、δ144.6、δ155.4、δ117.1、δ120.1分别为7、8、9、11、24、25位的双键碳信号。根据这些主要的波谱学特征并结合文献结果对照，鉴定该化合物为ganoderal A(译成灵芝醛A，简称GD-A)，其结构式如通式I所示。
Figure 213085DEST_PATH_IMAGE001
实施例3：GD-A对人间充质干细胞的细胞毒性分析
为了说明采用本发明所述化合物使用安全性问题，即对人间充质干细胞是否安全，进行相应测试：
采用MTT法，测定不同剂量（0.001μM, 0.01μM, 0.1μM, 1.0μM, 10 μM和100 μM）GD-A，分别连续作用人间充质干细胞24小时、48小时和72小时。结果如图6所示，与对照组相比，GD-A作用24h、48h和72h后，在0.001μM-10μM剂量范围内，GD-A对人间充质干细胞无细胞毒性，甚至呈促进细胞增殖作用，尤其是作用24时呈明显促细胞增殖作用。但GD-A在100μM剂量时，三个时间点均呈抑制细胞增殖作用，有较明显的细胞毒性。
实施例4：GD-A诱导人间充质干细胞高表达碱性磷酸酶
为了说明采用本发明所述化合物用于诱导人间充质干细胞在成骨细胞中的情况，进行相应测试：
用不同安全剂量（0.001μM, 0.01μM, 0.1μM, 1.0μM和10 μM）GD-A添加到人间充质干细胞中。在加药后第5天采用BCIP/NBT染色法测定成骨细胞的标志物碱性磷酸酶。如图7中A所示，在剂量0.001μM～0.1μM范围内，有较多紫色阳性细胞，尤其是0.01μM剂量的效果最好。进一步的碱性磷酸酶酶活力测定结果提示，其表达情况与酶活的结果基本一致，如见图7中B所示，浓度为0.01μM剂量时GD-A的诱导分化效果最佳。
实施例5：GD-A诱导人间充质干细胞生成矿化钙结节
为了说明采用本发明所述化合物用于诱导人间充质干细胞在成骨细胞中的情况，进行相应测试：
用不同剂量GD-A（0.001μM，0.01μM，0.1μM，1.0μM和10μM）添加到人间充质干细胞中，在加药后第17天，采用茜素红染色，检测成骨细胞的另一标志特征形成钙化结节。如图8所示，对照组染色前的细胞仍然呈梭形，细胞没有形成不透明矿化钙结节，而阳性对照组及GD-A给药组染色前细胞已变成卵圆形到多边形，细胞汇合成鹅卵石状，形成了不透明的矿化钙结节。最后采用茜素红染色的结果如图9所示，并与类似常规成骨诱导阳性对照组，GD-A给药组形成了数量不等的红色矿化钙结节，尤其是0.01μM剂量GD-A组，有大量红色的矿化钙化结节。
实施例6：GD-A诱导人间充质干细胞表达特异性成骨相关蛋白
为了说明采用本发明所述化合物用于诱导人间充质干细胞在成骨细胞中的情况，进行相应测试：
用最佳剂量0.01μM GD-A添加到人间充质干细胞中，在加药后第5天和第17天，采用Western blotting检测特异性成骨相关蛋白的表达情况。结果如图10所示。与对照组相比，GD-A类似成骨阳性诱导组，能显著促进OPN、RUNX2、OSX、ALP和CoL1α1等特异性成骨相关蛋白的表达。
实施例7. GD-A诱导人间充质干细胞向成骨细胞分化的用途
人间充质干细胞在体外用GD-A诱导向成骨细胞分化，可作为骨组织工程和细胞移植的种子细胞的用途。对骨病损及骨代谢性疾病均有防治作用。采用本发明所述化合物GD-A用于诱导分化人间充质干细胞作为种子细胞替代成骨细胞，可避免成骨细胞体外较难获取和高免疫原性的问题。
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种诱导人间充质干细胞向成骨细胞分化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)人间充质干细胞的分离培养；
(2)制备具有诱导作用的化合物，所述化合物的分子式为C30H44O2，分子量为436，其结构式如通式I所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
(3)将所制备的化合物稀释到安全剂量后，添加到人间充质干细胞中进行诱导培养，诱导培养至形成矿化钙结节后，即得到成骨细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述化合物安全剂量为0.001～10μM，所述诱导培养的时间为5～20天。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述化合物安全剂量为0.01μM，所述诱导培养的时间为17天。
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