CN106085953A - 一种临床级脐带间质细胞提取制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种临床级脐带间质细胞提取制备方法，包括下述顺序步骤：取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净，剔去血管，剥离华氏胶组织，将所得组织充分剪碎，加入α‑MEM培养液置于CO2培养箱培养，形成大小不等的细胞集落；取基础培养基DMEM/F12，并向其中添加血清、细胞因子白细胞介素3、粒细胞‑集落刺激因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子1与血小板源性生长因子，然后接种细胞集落于培养基中，进行体外扩增；收集扩增后的脐带间质细胞，加入溶液混合并离心处理，取上样液进行浓缩，提取制得临床级脐带间质细胞。本发明提供的制备方法，能快速有效地增值提取脐带间质细胞，能够满足临床上对脐带间质细胞的需求。

Description

一种临床级脐带间质细胞提取制备方法
技术领域
本发明属于生物提取技术领域，涉及一种细胞提取制备方法，特别是一种临床级脐带间质细胞(脐带间充质干细胞)提取制备方法。
背景技术
脐带间充质干细胞(MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化，它能分化成许多种组织细胞，在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。
脐带是孕妇与胎儿之间的物质交通支，也是分娩后的废弃物，收集脐带对产妇和胎儿均不造成伤害，取材也不受伦理学的困扰。另外从胚胎发育而言，脐带的免疫原性低，可以降低或避免免疫排斥。
有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此脐带作主要来源用于提取临床级间充质干细胞越来越受到研究工作者们的关注。
临床级干细胞的分离与扩增是干细胞产业化过程中的重要环节，而间充质干细胞的临床应用才刚刚起步，因此，开发提取制备脐带间充质干细胞的新方法是进一步推动间充质干细胞临床应用的必然趋势。
目前通过体外分离获取的间充质干细胞数量非常有限，远远无法满足临床的需求，为了保持间充质干细胞的多向化潜能和未分化状态的同时又能快速有效地增值，满足临床级的需求，成了目前急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种临床级脐带间质细胞提取制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种临床级脐带间质细胞提取制备方法，该方法包括下述顺序步骤：
1)取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净，剔去血管，剥离华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1.2-1.5mm3，加入α-MEM培养液置于37℃，5％的CO2培养箱培养5-7天后，形成大小不等的细胞集落；
2)取基础培养基DMEM/F12，并向其中添加血清、细胞因子白细胞介素3、粒细胞-集落刺激因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子1与血小板源性生长因子，然后接种上述步骤1)形成的细胞集落于培养基中，进行体外扩增；
3)收集扩增后的脐带间质细胞，加入溶液混合并离心处理，取上样液进行浓缩，提取制得临床级脐带间质细胞。
所述的α-MEM培养液中含10％FBS、100U/ml青霉素与100U/ml链霉素。
所述的血清为人自体血清、血清衍生物或脐带血清中的一种。
所述的基础培养基DMEM/F12 1L中，添加有12-18mM血清、1-5mM细胞因子白细胞介素3、1-3mM粒细胞-集落刺激因子、1-1.5mM表皮生长因子、1-2mM碱性成纤维细胞生长因子、0.5-0.8mM转化生长因子β、0.2-0.6mM胰岛素样生长因子1与1-3mM血小板源性生长因子。
所述的离心步骤如下：将混合液离心1h，收集上清液，然后再次离心350min，收集上清液，两次上清液混合为上样液。
所述的溶液中，溶剂为20mM、pH 7.4的Tris-HCl溶液，溶质及其浓度如下：2mMMnCl2、2mM CaCl2、500mM NaCl、PMSF 1mM。
本发明的有益效果：本发明提取的临床级脐带间质细胞具有较强的免疫调节作用，可降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率；能促进造血恢复功能，提高疾病的治疗效果；能修复损伤或病变的组织器官；
本发明提供的制备方法，能快速有效地增值提取脐带间质细胞，能够满足临床上对脐带间质细胞的需求。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
提取制备临床级脐带间质细胞(脐带间充质干细胞)，通过下述顺序步骤提取：取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净，剔去血管，剥离华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1.3mm3，加入α-MEM培养液置于37℃，5％的CO2培养箱培养，α-MEM培养液中含10％FBS、100U/ml青霉素与100U/ml链霉素，培养6天后，形成大小不等的细胞集落；
取基础培养基DMEM/F12 1L中，添加有16mM脐带血清、3mM细胞因子白细胞介素3、2mM粒细胞-集落刺激因子、1.2mM表皮生长因子、1.5mM碱性成纤维细胞生长因子、0.6mM转化生长因子β、0.4mM胰岛素样生长因子1与2mM血小板源性生长因子，然后接种上述形成的细胞集落于培养基中，进行体外扩增；
收集扩增后的脐带间质细胞，加入溶液混合，将混合液离心1h，收集上清液，然后再次离心350min，收集上清液，两次上清液混合为上样液，取上样液 进行浓缩，提取制得临床级脐带间质细胞；
溶液中溶剂为20mM、pH 7.4的Tris-HCl溶液，溶质及其浓度如下：2mM MnCl2、2mMCaCl2、500mM NaCl、PMSF 1mM。
实施例2
提取制备临床级脐带间质细胞(脐带间充质干细胞)，通过下述顺序步骤提取：取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净，剔去血管，剥离华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1.2mm3，加入α-MEM培养液置于37℃，5％的CO2培养箱培养，α-MEM培养液中含10％FBS、100U/ml青霉素与100U/ml链霉素，培养7天后，形成大小不等的细胞集落；
取基础培养基DMEM/F12 1L中，添加有12mM人自体血清、5mM细胞因子白细胞介素3、1mM粒细胞-集落刺激因子、1.5mM表皮生长因子、1mM碱性成纤维细胞生长因子、0.8mM转化生长因子β、0.2mM胰岛素样生长因子1与3mM血小板源性生长因子，然后接种上述形成的细胞集落于培养基中，进行体外扩增；收集扩增后的脐带间质细胞，加入溶液混合，溶液中溶剂为20mM、pH 7.4的Tris-HCl溶液，溶质及其浓度如下：2mM MnCl2、2mM CaCl2、500mMNaCl、PMSF 1mM，将混合液离心1h，收集上清液，然后再次离心350min，收集上清液，两次上清液混合为上样液，取上样液进行浓缩，提取制得临床级脐带间质细胞。
实施例3
提取制备临床级脐带间质细胞(脐带间充质干细胞)，通过下述顺序步骤提取：取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净，剔去血管，剥离华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1.5mm3，加入α-MEM培养液置于37℃，5％的CO2培养箱培养，α-MEM培养液中含10％FBS、100U/ml青霉素与100U/ml链霉素，培养5天后，形成大小不等的细胞集落；
取基础培养基DMEM/F12 1L中，添加有18mM血清衍生物、1mM细胞因子白细胞介素3、1mM粒细胞-集落刺激因子、1.5mM表皮生长因子、1mM碱性成纤维细胞生长因子、0.8mM转化生长因子β、0.2mM胰岛素样生长因子1与3mM血小板源性生长因子，然后接种上述形成的细胞集落于培养基中，进行体外扩增；收集扩增后的脐带间质细胞，加入溶液混合，溶液中溶剂为20mM、pH 7.4的Tris-HCl溶液，溶质及其浓度如下：2mM MnCl2、2mM CaCl2、500mMNaCl、PMSF 1mM，将混合液离心1h，收集上清液，然后再次离心350min，收集上清液，两次上清液混合为上样液，取上样液进行浓缩，提取制得临床级脐带间质细胞。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (6)

1.一种临床级脐带间质细胞提取制备方法，其特征在于，该方法包括下述顺序步骤：
1)取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净，剔去血管，剥离华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1.2-1.5mm3，加入α-MEM培养液置于37℃，5％的CO2培养箱培养5-7天后，形成大小不等的细胞集落；
2)取基础培养基DMEM/F12，并向其中添加血清、细胞因子白细胞介素3、粒细胞-集落刺激因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子1与血小板源性生长因子，然后接种上述步骤1)形成的细胞集落于培养基中，进行体外扩增；
3)收集扩增后的脐带间质细胞，加入溶液混合并离心处理，取上样液进行浓缩，提取制得临床级脐带间质细胞。
2.根据权利要求1所述的一种临床级脐带间质细胞提取制备方法，其特征在于，所述的α-MEM培养液中含10％FBS、100U/ml青霉素与100U/ml链霉素。
3.根据权利要求1所述的一种临床级脐带间质细胞提取制备方法，其特征在于，所述的血清为人自体血清、血清衍生物或脐带血清中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种临床级脐带间质细胞提取制备方法，其特征在于，所述的基础培养基DMEM/F121L中，添加有12-18mM血清、1-5mM细胞因子白细胞介素3、1-3mM粒细胞-集落刺激因子、1-1.5mM表皮生长因子、1-2mM碱性成纤维细胞生长因子、0.5-0.8mM转化生长因子β、0.2-0.6mM胰岛素样生长因子1与1-3mM血小板源性生长因子。
5.根据权利要求1所述的一种临床级脐带间质细胞提取制备方法，其特征在于，所述的离心步骤如下：将混合液离心1h，收集上清液，然后再次离心350min，收集上清液，两次上清液混合为上样液。
6.根据权利要求1所述的一种临床级脐带间质细胞提取制备方法，其特征在于，所述的溶液中，溶剂为20mM、pH 7.4的Tris-HCl溶液，溶质及其浓度如下：2mM MnCl2、2mM CaCl2、500mM NaCl、PMSF 1mM。
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