CN101705209B - 一种从棕色脂肪分离心脏干细胞及其成心肌细胞分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种属于从棕色脂肪分离心脏干细胞及其成心肌分化的方法。该方法包括：(1)消化液的制备：将胶原酶、dispaseII与胰酶以质量比1∶1∶0.5-1的比例溶于无血清的培养基中；(2)使用加有玻璃珠和转子的消化瓶消化棕色脂肪组织，然后离心收集细胞；(3)原代心脏干细胞的培养与成心肌细胞分化。本发明采用组合的消化酶液及其特殊的消化方法进行细胞分离，与现有的分离方法相比，该分离方法显著的提高了细胞的产率，同时心脏干细胞的含量也明显提高，可通过CD133的表达率与成心肌的能力得以验证，因此心脏干细胞的产率也显著提高。本方法获得的心脏干细胞产率高、操作简单、可实施性强，减少了人为操作。

Description

一种从棕色脂肪分离心脏干细胞及其成心肌细胞分化的方法

技术领域

本发明属于干细胞的分离及其分化成组织细胞的方法，具体涉及一种从棕色脂肪分离心脏干细胞及其成心肌分化的方法。 

背景技术

心脏内在的再生机制非常有限，不足以补偿病理状态下的心肌细胞丢失，如心肌梗死。这使得科学家投入大量的研究去鉴定新的心肌细胞来源，以用于损伤心肌的修复与心脏功能的改善(Wolfram-Hubertus Zimmermann等，Engineeredheart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts，NATUREME DICINE，2006，12(4)：452-458；V.Planat-Bénard等，SpontaneousCardiomyocyte Differentiation From Adipose Tissue Stroma Cells，Circ.Res.2004，94：223-229)。由于干细胞具有多能性，能够分化为其他类型的细胞，包括功能性的心肌细胞，因此受到广泛的研究。至今，已有多种干细胞来源被用于心肌再生研究，包括胚胎干细胞，骨骼肌成肌细胞，骨髓间充质干细胞等。然而，这些细胞在应用中都具有一定的局限性，如胚胎干细胞具有形成畸胎瘤的风险，骨骼成肌细胞存在诱发心律失常的隐患，骨髓来源干细胞向心肌的转分化问题还存在争论(Zongjin Li等，Imaging Survival and Function of TransplantedCardiac Resident Stem Cells，JACC，2009，53(14)：1229-1240)。这些问题使得寻找新的能够产生心肌细胞的成体干细胞源非常迫切。 

近来，人们从心肌组织中分离到心脏干细胞(Antonio P.Beltrami等，AdultCardiac Stem Cells Are Multipotent and Support Myocardial Regeneration，Cell，2003，114，763-776；Alessandro Giacomello Latronico等，Isolation and Expansion of Adult Cardiac Stem Cells From Human and Murine Heart，Circ.Res.，2004，95：911-921)。与其他成体干细胞不同，心脏干细胞是用于心肌再生的一种很适合的种子细胞，因为他们很可能按照自身的内在程序在体外产生心肌组织并在体内增加心肌组织的活力。因此，心脏干细胞在治疗心脏疾病方面为人们开辟了新的前景(Barile L等，Cardiac stem cells：isolation，expansion and experimental usefor myocardial regeneration，Nat Clin Pract Cardiovasc Med.，2007，S9-S14)。然而，目前对这种来源的细胞存在细胞收集上的技术困难，而且收集的细胞数量很小，这使得心肌部位的内源性的心脏干细胞并不适合用于移植(YoshihiroYamada等，Cardiac progenitor cells in brown adipose tissue repaired damagedmyocardium，Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，(342)：662-670；Anke M Smits等，Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate intofunctional mature cardiomyocytes：an in vitro model for studying human cardiacphysiology and pathophysiology，NATUREPROTOCOLS，2009，4(2)：232-243)。因此，寻找一种在细胞治疗中可能利用的心脏干细胞来源就显得十分必要。 

脂肪组织来至胚胎中胚层，包含一种异质的、易于分离的基质细胞群。这一组织在临床应用中丰富易的，一旦被成功开发利用，将可能在再生医学领域产生深远影响。因此，脂肪组织来源的细胞也被作为心肌再生的候选细胞被大量研究。Planat-Benard等(V.Planat-Bénard等，Spontaneous CardiomyocyteDifferentiation From Adipose Tissue Stroma Cells，Circ.Res.2004，94：223-229)首次报道了小鼠来源的脂肪细胞能够自发分化为心肌细胞，尽管分化效率很低(0.02-0.07％)，但是却表明了脂肪组织可能是心脏干/祖细胞的一种新来源。随后，Yamada等(Yoshihiro Yamada等，Cardiac progenitor cells in brown adiposetissue repaired damaged myocardium，Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，(342)：662-670)进一步发现棕色脂肪组织来源的细胞成心肌分化潜能远高于这一水平(超过20％)，这明确表明了棕色脂肪组织是心脏干细胞的丰富来源。 

棕色脂肪组织中心脏干细胞的发现为研究心肌的体外分化提供了新的模型，并为心肌再生提供了新的心肌细胞来源。然而，现有的从棕色脂肪分离心脏干细胞的方法是采用Dispase II消化(Yoshihiro Yamada等，Cardiac progenitorcells in brown adipose tissue repaired damaged myocardium，Biochemical andBiophysical Research Communications，2006，(342)：662-670；YOSHIHIROYAMADA等，“Cardiac Stem Cells in Brown Adipose Tissue Express CD133 andInduce Bone Marrow Nonhematopoietic Cells to Differentiate into Cardiomyocytes”，STEMCELLS，2007，25(5)：1326-1333；Pilgaard L等，“Comparative analysis ofhighlydefined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells”，Regen Med.，2008，3(5)：705-15)，效率较低，而经典的采用I型胶原酶从脂肪组织分离细胞的方法存在同样问题(V.Planat-Bénard等，SpontaneousCardiomyocyte Differentiation From Adipose Tissue Stroma Cells，Circ.Res.2004，94：223-229)，使得这一新的心脏干细胞源在基础与应用中的研究同样陷入困境。 

研究已证明，对于脂肪组织的有效消化，多种酶的共同作用是必要的。但是难题在于找到一种合适的消化酶组合以及适当的消化条件，且能够获得期望的细胞类型与活细胞产量(Pilgaard L等，“Comparative analysis of highlydefinedproteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells”，Regen Med.，2008，3(5)：705-15)。然而这种理想的分离方法至今尚没有报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种从棕色脂肪分离心脏干细胞及其成心肌分化的方法。采用该方法能够获得期望的心脏干细胞数量并用于成心肌细胞分化，分化的心肌细胞具有功能性心肌的节律性搏动、表达心肌细胞特异性标志并能对心肌药物作出反应。 

一种从棕色脂肪分离心脏干细胞及其成心肌分化的方法，具体方法如下： 

(1)消化液的制备 

将胶原酶、dispaseII与胰酶以质量比1∶1∶0.5-1的比例溶于无血清的培养基中，其中，胶原酶、dispaseII和胰酶在无血清的培养基中的浓度均为0.5-2mg/mL，完全溶解后，调解pH至7.2-7.4，获得消化液； 

(2)来源于棕色脂肪的原代心脏干细胞的分离 

将清洗并剪碎的棕色脂肪组织加入到含有上述消化液的消化瓶中，每10毫升消化液加入0.5-1.0克棕色脂肪组织，加盖后放在磁力搅拌器上进行搅动，转速为80-120rpm，在37℃，5％CO₂的孵箱中消化45-60min(消化时间根据消化酶浓度不同适当调节)，然后以血清终止消化反应，其中，血清与消化液的体积比为1-2∶10，将消化液过滤后离心收集细胞，获得原代心脏干细胞；其中，所述消化瓶中装有玻璃珠和磁力搅拌转子； 

(3)原代心脏干细胞的培养与成心肌细胞分化 

使用含血清的α-MEM培养基重悬上述原代心脏干细胞，其中，血清的体积百分比浓度为10％，然后以5×10³-5×10⁴/cm²的密度将上述原代心脏干细胞接种于组织培养基中进行培养分化，隔天换培养基，培养2-4周，心脏干细胞可分化为节律搏动的心肌细胞。 

步骤(1)中所述无血清的培养基为α-MEM或DMEM培养基。 

步骤(3)中所述组织培养基为含体积百分比浓度为10％血清的α-MEM培 养基。其中，α-MEM培养基的配制为：α-MEM培养基干粉一包，NaHCO₃ 2.4g，HEPEs 2.383g，溶解于1L超纯水，PH7.2-7.4。 

所述棕色脂肪组织的优选来源为从出生1-2周的幼年大鼠或出生1-7天的幼年小鼠的肩胛骨部位脂肪组织分离获得。 

所述棕色脂肪组织使用无血清α-MEM培养基或PBS清洗。 

所述血清为胎牛血清(FBS)。 

所述消化瓶为有盖玻璃小瓶也可为其他类似容器，每瓶中加入的玻璃珠的数量优选为5-7粒。 

本发明的有益效果：本发明采用组合的消化酶液进行细胞分离，与现有的分离方法相比，该分离方法显著地提高了细胞的产率，同时心脏干细胞的含量也明显提高，可通过CD133阳性细胞比率与成心肌分化能力得到验证，因此心脏干细胞的产率也显著提高。本方法获得的心脏干细胞产率高、操作简单、可实施性强，减少了人为操作。 

附图说明

图1为不同分离方法的细胞产率比较结果柱型图； 

其中，I为从棕色脂肪组织分离细胞常用的I型胶原酶消化法；D指已报道的分离棕色脂肪来源心脏干细胞的Dispase II消化法；IV/D/T指本发明建立的采用IV型胶原酶、Dispase II与胰酶的联合消化液分离棕色脂肪心脏干细胞的方法 

图2为棕色脂肪来源心脏干细胞在向心肌分化过程中的形态学变化显微图谱； 

其中，图(a)，(b)，(c)为分化1周时显微镜下细胞形态；图(d)，(e)，(f)为分化2周时显微镜下细胞形态；图(g)，(h)，(i)为分化4周时显微 镜下细胞形态；图(a)，(d)，(g)：放大100倍；图(b)，(c)，(h)：放大200倍；图(c)，(f)，(i)：放大400倍。 

图3为免疫荧光染色显示的棕色脂肪心脏干细胞分化的心肌细胞表达心肌特异性标志图谱； 

其中，图(a)为α-sarcomeric actinin的表达(绿色，蓝色为细胞核，400×)；图(b)为a图的局部放大，肌节清晰可见；图(c)：心肌标志cTnT的表达(绿色，蓝色为细胞核，400×)；图(d)为c图的局部放大，肌节清晰可见。 

图4为棕色脂肪心脏干细胞分化的心肌细胞能够对心肌药物异丙肾上腺素、地尔硫卓做出反应表现出的搏动频率变化柱型图。注：图中基值为不加任何药物时心肌细胞的平均搏动频率，作为标准，化作100％，其他组为在相应药物浓度下，搏动频率相对标准值的百分率，图中“异”指异丙肾上腺素，“地”指地尔硫卓； 

具体实施方式

通过以下实施例对本发明做详细描述，但是以下实施例仅仅是作为例证，并不对本发明构成任何限制。 

以下实施例中使用的细胞分离、培养、分化与鉴定所需试剂的配制： 

1)α-MEM细胞培养基：α-MEM干粉培养基一袋，2.4g NaHCO₃，2.383g HEPES，10万单位青霉素，10万单位链霉素，溶解于1000ml超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。用于分离后原代心脏干细胞的培养时需向α-MEM细胞培养基中添加10wt％胎牛血清(FBS)。 

2)消化液的配制：将IV型胶原酶、Dispase II各0.1克、胰酶0.05克，溶解 于100mL无血清的α-MEM细胞培养基，调节pH值为7.2-7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌。使用前现配制，用于组织消化。 

3)消化瓶：100ml有盖柱形玻璃瓶，内置5-7粒玻璃珠，一个的磁力搅拌器用转子(直径×长：6×20mm)，常规高压蒸汽灭菌备用。 

4)PBS：称取8g NaCl，0.2g KCl，3.491g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g KH₂PO₄，溶解于1000ml超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。 

5)4％多聚甲醛固定液：加热0.1M的PB溶液500mL至沸腾，加入20g多聚甲醛，搅拌溶解，调节pH值为7.2-7.4，过滤除杂质，4℃保存。 

6)心肌细胞鉴定所需抗体：α-sarcomeric actinin，cardiac troponin T以及相应的荧光标记的二抗购自Sigma公司，按照厂家说明书进行使用，用于心肌细胞的鉴定。 

7)心肌药物：异丙肾上腺素溶于无血清α-MEM培养基，制备成5×10^-4mol/L的溶液；地尔硫卓溶于无血清α-MEM培养基配制成1×10^-3mol/L溶液，使用前配制。 

实施例1以大鼠棕色脂肪组织为组织样品分离心脏干细胞的方法 

(1)大鼠棕色脂肪组织的取材与处理 

出生后1-2周的幼年SD大鼠，颈椎脱臼处死。去除肩胛骨附近毛发，于75％酒精中浸泡约1分钟消毒。无菌超净台中取出肩胛骨处脂肪组织置于培养皿中，使用大量PBS冲洗去除血污。然后将脂肪组织充分剪碎，以备消化。 

(2)消化脂肪组织和分离心脏干细胞 

将上述剪碎的脂肪组织样品1.0g转移到消化瓶中，加入约10ml消化液，盖上瓶盖后置于磁力搅拌器上以100rpm的转速不断搅动，磁力搅拌器和消化 瓶一同置于37℃孵箱中，连续消化45分钟至1小时后，加入1mL胎牛血清终止消化反应，200目的筛网过滤后，将消化液转移到离心管中，600g离心5分钟，收集细胞。每克脂肪组织样品中可分离得到细胞达10⁷，消化不同时间分离得到的细胞产量见图1。 

对照实验I为从棕色脂肪组织分离细胞常用的I型胶原酶消化法(参见V.Planat-Bénard等，Spontaneous Cardiomyocyte Differentiation From Adipose TissueStroma Cells，Circ.Res.2004，94：223-229)；D指已报道的分离棕色脂肪来源干细胞的Dispase II消化法(参见Yoshihiro Yamada等，Cardiac progenitor cells inbrown adipose tissue repaired damaged myocardium，Biochemical and BiophysicalResearch Communications，2006，(342)：662-670；YOSHIHIRO YAMADA等，“Cardiac Stem Cells in Brown Adipose Tissue Express CD 133and Induce BoneMarrow Nonhematopoietic Cells to Differentiate into Cardiomyocytes”，STEMCELLS，2007，25(5)：1326-1333；Pilgaard L等，“Comparative analysis ofhighlydefined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells”，Regen Med.，2008，3(5)：705-15)。 

分离的细胞富含心脏干细胞，这由CD133阳性细胞的高含量(见表1)与高效的成心肌分化得以证明，心肌分化效率见表2。 

表1棕色脂肪来源原代细胞表面标志表达 

流式细胞术分析分离获得的棕色脂肪来源原代细胞的表面标志表达， CD133阳性细胞可达60.56％，这一细胞群被报道具有较高的成心肌分化潜能。由表1可见，CD133阳性细胞的比率达60.56％，明显高于以前的报道(仅3.5％)，这说明使用本方法分离获得的细胞含有较多的心脏干细胞。 

表2以不同细胞浓度接种本发明方法获得的细胞分化出的cTnT阳性细胞比率结果 

细胞的接种密度是影响棕色脂肪心脏干细胞分化为心肌细胞(cTnT+细胞)的重要因素，本方法分离的细胞在适当的接种密度下心肌分化率可达30％，表明了较高的心脏干细胞含量。 

实施例2以小鼠棕色脂肪组织为组织样品分离心脏干细胞的方法 

棕色脂肪组织的取材选用出生后1-7天的幼年昆明白小鼠，分离心脏干细胞的方法同实施例1，获得的细胞中CD133阳性细胞的比率约达60％，心肌分化率可达30％左右。 

实施例3分离细胞的培养、成心肌分化与心肌细胞的鉴定实验 

(1)分离细胞的培养与成心肌分化 

用含10％胎牛血清的α-MEM细胞培养基重悬实施例1或2收集的细胞，制备成细胞悬液，以5×10³/cm²至5×10⁴/cm²的细胞密度接种于组织培养皿(培养液为含10％胎牛血清的α-MEM培养基)，直径10cm的组织培养皿中含有10-15ml培养液，然后置于37℃，5％CO₂孵箱培养分化，隔天更换培养液，培养2-4周，观察细胞的分化，见图2。以这种密度接种，心肌细胞的分化率可高达30％左右，见实施例1中的表2。 

(2)分化心肌的鉴定实验 

免疫组织化学：细胞在培养板中分化4周后，PBS洗涤细胞，4％多聚甲 醛固定。0.1％Triton X-100透化处理30分钟，然后分别使用cTnT抗体(使用时稀释比例为1∶200，Sigma)和α-sarcomeric actinin(使用时稀释比例为1∶200；Sigma)作为一抗，阴性对照组使用PBS代替一抗，置于4℃，过夜孵育。PBS漂洗3min×3次，加入二抗，即FITC标记的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育20min，PBS漂洗3min×3次；Hoechst33258染核后中性树胶封片，荧光显微镜下观察分化的细胞表达心肌标志cTnT，α-sarcomeric actinin，并在高倍镜下清晰可见肌节纤维，见图3。 

对心肌药物的反应能力：倒置相差显微镜下记录上述生长在培养基中的搏动细胞的波动频率，计数10个细胞。然后以计量依赖性的方式加入5×10^-4mol/L的心肌药物异丙肾上腺素，使培养基中异丙肾上腺素的浓度依次为0.25uM，0.5uM，1uM，2.5uM，5uM，分别纪录每一浓度下的细胞搏动频率；随后加入1×10^-3mol/L地尔硫卓溶液，使培养基中的浓度依次为5uM，10uM，纪录每一浓度下的细胞搏动频率。记录的数据显示分化的心肌细胞具有功能性心肌细胞的节律性搏动，并且能对心肌药物作出反应，表现出搏动频率的加快或减慢，见图4。 

参考文献 

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[3]Zongjin Li，Andrew Lee，Mei Huang，Hyung Chun，Jaehoon Chung，Pauline Chu，Grant Hoyt，Phillip Yang，Jarrett Rosenberg，Robert C.Robbins，Joseph C.Wu.Imaging Survival andFunction of Transplanted Cardiac Resident Stem Cells.JACC 2009；53(14)：1229-1240. 

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[5]Alessandro Giacomello Latronico，Marcello Coletta，Elisabetta Vivarelli，Luigi Frati，GiulioCossu and Chimenti，Fabio Fiordaliso，Monica Salio，Massimo Battaglia，Michael V.G.Isolationand Expansion of Adult Cardiac Stem Cells From Human and Murine Heart.Circ.Res.2004；95；911-921； 

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[9]YOSHIHIRO YAMADA，SHIN-ICHIRO YOKOYAMA，XIANG-DI WANG，NOBORUFUKUDA，NOBUYUKI TAKAKURA，“Cardiac Stem Cells in Brown Adipose Tissue ExpressCD133 and Induce Bone Marrow Nonhematopoietic Cells to Differentiate into Cardiomyocytes”，STEMCELLS 200725(5)：1326-1333. 

[10]Pilgaard L，Lund P，Rasmussen JG，Fink T，Zachar V.，“Comparative analysis ofhighlydefined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells”，Rcgen Med.20083(5)：705-15. 

Claims (3)

1.一种从棕色脂肪分离心脏干细胞及其成心肌细胞分化的方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行：

(1)消化液的制备

将胶原酶、dispaseII与胰酶以质量比1∶1∶0.5-1的比例溶于无血清的培养基中，其中，胶原酶、dispaseII和胰酶在无血清的培养基中的浓度均为0.5-2mg/mL，完全溶解后，调节pH至7.2-7.4，获得消化液；

(2)来源于棕色脂肪的原代心脏干细胞的分离

将清洗并剪碎的棕色脂肪组织加入到含有上述消化液的消化瓶中，每10毫升消化液加入0.5-1.0克棕色脂肪组织，加盖后放在磁力搅拌器上进行搅动，转速为80-120rpm，在37℃，5％CO₂的孵箱中消化45-60min，然后以血清终止消化反应，其中，血清与消化液的体积比为1-2∶10，将消化液过滤后离心收集细胞，即获得原代心脏干细胞；其中，所述消化瓶中装有玻璃珠和磁力搅拌转子；

(3)原代心脏干细胞的培养与成心肌细胞分化

使用含血清的α-MEM培养基重悬上述原代心脏干细胞，其中，血清的体积百分比浓度为10％，然后以5×10³-5×10⁴/cm²的密度将原代心脏干细胞接种于组织培养基中进行培养分化，隔天换组织培养基，培养2-4周，心脏干细胞可分化为节律搏动的心肌细胞。

2.根据权利要求1所述的从棕色脂肪分离心脏干细胞及其成心肌细胞分化的方法，其特征在于，步骤(1)中所述无血清的培养基为α-MEM或DMEM培养基。

3.根据权利要求1所述的从棕色脂肪分离心脏干细胞及其成心肌细胞分化的方法，其特征在于，步骤(3)中所述组织培养基为含体积百分比浓度为10％血清的α-MEM培养基。

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