CN104818246B - 一种兔脂肪干细胞的分离培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种兔脂肪干细胞的分离培养方法。包括以下步骤：（（1）无菌获取兔脂肪组织；（2）制备脂肪小块组织；（3）采用胰蛋白酶对脂肪组织进行消化，分离得上层溶液及下层沉淀；（4）对上层溶液采用时间递减梯度方法进行消化；（5）收集脂肪干细胞，用脂肪干细胞培养液混匀，接种培养；（6）脂肪干细胞的体外培养；（7）检测、冻存。本发明解决了传统脂肪干细胞细胞分离方法中存在的组织消化不够彻底，细胞分离效率低的问题，优化了脂肪干细胞的分离方法，使脂肪组织消化的更彻底，提高了细胞分离效率，从而提供了更优质的脂肪干细胞来源。
Description
技术领域
本发明属于生物学和医学领域，具体涉及一种兔脂肪干细胞的分离和培养方法。
背景技术
干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是生命的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。干细胞技术是生物治疗的前沿技术，称之为再生医学。干细胞是具有自我复制和多向分化的原始细胞，是具有自我更新能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官。干细胞是指尚未分化的细胞，存在于早期胚胎、胎盘及其附属物、骨髓、外周血和成年组织中，它能够被培养成肌肉、骨骼和神经等200多种人体细胞、组织和器官，是组织工程和再生医学最理想的种子细胞。
脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现脂肪干细胞在特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、神经细胞等，并且ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，可作为理想的种子细胞应用在组织工程和再生医学领域中，逐渐成为近年来新的研究热点之一。
现有的脂肪干细胞分离方法主要是用Ⅰ型胶原酶或者Ⅰ型、II型和Ⅳ胶原酶混合消化，消化产物滤网过滤去除未消化组织块，虽然能够分离出部分脂肪干细胞，但不能够完全去除组织块和得到大量脂肪干细胞，分离效率较低。另外将细胞接种至培养瓶中培养时，使用的培养液保存不太稳定，细胞增殖速度较慢。
发明内容
本发明的目的在于克服目前脂肪干细胞分离提取技术的不足，而提供的一种脂肪干细胞的分离培养方法，其具有操作简便、分离效率高、细胞增殖速度快的特点，应用前景广阔，可为组织工程和再生医学提供大量种子细胞。
本发明的一种兔脂肪干细胞的分离培养方法，包括以下技术步骤：（1）无菌获取兔脂肪组织；（2）制备脂肪小块组织；（3）采用胰蛋白酶对脂肪组织进行消化，分离得上层溶液及下层沉淀；（4）对上层溶液采用时间递减梯度方法进行消化；（5）收集脂肪干细胞，用脂肪干细胞培养液混匀，接种培养；（6）脂肪干细胞的传代培养；（7）检测、冻存。
进一步的，所述步骤1）中所述兔脂肪组织取自新西兰大白兔双侧腹股沟脂肪。
进一步的，所述步骤2）中脂肪小块的粒径为0.8-1.2mm3。
进一步的，所述步骤3）中胰蛋白酶消化过程是在脂肪组织中加入胰蛋白酶溶液混匀，在37℃下消化10-30min，1000r/p离心10min，得上层溶液及下层沉淀；所述胰蛋白酶溶液与脂肪组织等体积。
进一步的，所述胰蛋白酶溶液的配制方法为：在1000ml D-Hanks平衡盐溶液中加入1.5-5g胰蛋白酶粉末，在4℃下保存24h，然后采用0.22μm滤膜过滤除菌。
进一步的，所述步骤4）的操作方法为：向上层溶液中加入与脂肪组织等体积的混合胶原酶，37℃消化1h，1000r/p离心10min，上层转至另一新离心管，加入与脂肪组织等体积的混合胶原酶，37℃消化40min，1000r/p离心10min，上层转至另一新离心管，加入与脂肪组织等体积的混合胶原酶，37℃消化20min，1000r/p离心10min，弃上层，保留下层。
进一步的，所述混合胶原酶的配制方法为：在1000ml D-Hanks平衡盐溶液中加入1-2.5gⅠ型胶原酶和1-2.5gII型胶原酶粉末，4℃保存24h，然后采用0.22μm滤膜过滤除菌。
进一步的，所述Ⅰ型和II型胶原酶的质量比是1.5-2:1。
进一步的，所述步骤5）中脂肪干细胞培养液是指含15FBS-5%脂肪组织浸提液的DMEM/F12培养液。
进一步的，所述脂肪组织浸提液的制备方法是将脂肪组织剪至0.8-1.2mm3的脂肪小块，于离心管中加入与脂肪组织等体积的DMEM/F12培养液混匀，所述DMEM/F12培养液中含15%体积分数的FBS，置于37℃生化培养箱中静置1h，弃上层组织，0.22μm滤膜过滤下层清液，即得到脂肪组织浸提液。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明将脂肪组织制备成1mm3左右脂肪小块，并采用胰蛋白酶联合I 型-II 型混合胶原酶时间梯度消化法对脂肪小块进行消化，使得组织消化更彻底，大大提高脂肪干细胞的分离效率。用含10%-20%胎牛血清的DMEM/F12培养液对分离后的干细胞进行体外培养，细胞增值较快，形态良好。本发明解决了传统脂肪干细胞细胞分离方法中存在的组织消化不够彻底，细胞分离效率低的问题，优化了脂肪干细胞的分离方法，使脂肪组织消化的更彻底，提高了细胞分离效率，从而提供了更优质的脂肪干细胞来源。
附图说明
图1本发明的P1代兔脂肪干细胞；
图2本发明的P2代兔脂肪干细胞；
图3本发明的P3代兔脂肪干细胞；
图4 本发明的P10代兔脂肪干细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
一种兔脂肪干细胞的分离培养方法，包括以下技术步骤：
1）无菌采取新西兰大白兔双侧腹股沟脂肪组织。
2）去除血管及其他组织：超净工作台中去除可见的血管和其它组织，然后使用PBS（磷酸缓冲液）清洗3-5次，直至洗出液清澈透亮。
3）制备脂肪小块：用眼科剪将脂肪组织剪碎至0.8-1.2mm3大小的小块，使用PBS清洗3-5次。
4）胰蛋白酶消化：加入与脂肪组织等体积的胰蛋白酶溶液混匀，所述胰蛋白酶溶液的体积浓度为0.15%-0.5%，在37℃下消化10-30min，1000r/p离心10min，将上层溶液转至另一新离心管中，保留下层。
所述胰蛋白酶溶液采用D-Hanks平衡盐溶液配制而成，配制方法为：在1000ml D-Hanks平衡盐溶液中加入1.5-5g胰蛋白酶粉末，在4℃下保存24h，然后采用0.22μm滤膜过滤除菌。
5）混合胶原酶消化：向上述分离出的上层溶液中加入与脂肪组织等体积的混合胶原酶，37℃消化1h，1000r/p离心10min，保留下层；上层转至另一新离心管，加入与脂肪组织等体积的混合胶原酶，37℃消化40min，1000r/p离心10min，保留下层；上层转至另一新离心管，加入与脂肪组织等体积的混合胶原酶，37℃消化20min，1000r/p离心10min，弃上层，保留下层；所述混合胶原酶的体积浓度为0.1%-0.25%。
本发明采用时间递减梯度消化的方式，即先后消化1h、40min和20min，其优点在于可从外至内逐层消化脂肪组织小块分离细胞，并且即时收集分离到的细胞，避免胶原酶对已分离细胞的伤害，能够在保证细胞活性的情况下最大程度分离脂肪组织中的干细胞。
所述混合胶原酶溶液采用D-Hanks平衡盐溶液配制而成，配制方法为：在1000mlD-Hanks平衡盐溶液中加入1-2.5gⅠ型胶原酶和1-2.5gII型胶原酶粉末，其中所述Ⅰ型和II型胶原酶的质量比是1.5-2:1；4℃保存24h，然后采用0.22μm滤膜过滤除菌。所述Ⅰ型胶原酶用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离；用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞，也可用于哺乳动细胞的分离。所述II型胶原酶对脂肪组织具有消化作用。而现有技术中常用的Ⅳ型胶原酶对本发明中脂肪组织的消化作用不明显。因此本发明中采用Ⅰ型和II型胶原酶混合消化即可达到非常好的效果。
6）脂肪组织浸提液的制备：将脂肪组织剪至0.8-1.2mm3大小的脂肪小块，于离心管中加入与脂肪组织等体积的DMEM/F12培养液混匀，所述DMEM/F12培养液中含15%体积分数的FBS（胎牛血清），置于37℃生化培养箱中静置1h，弃上层组织，0.22μm滤膜过滤下层清液，即得到脂肪组织浸提液。
7）脂肪干细胞的收集：将步骤（4）和（5）中离心得到的下层收集到一起，加入脂肪干细胞培养液混匀，计数。所述脂肪干细胞培养液是指含15FBS-5%脂肪组织浸提液的DMEM/F12培养液（即含有15%体积分数的FBS和5%体积分数的脂肪组织浸提液的DMEM/F12培养液）。
本发明所用的脂肪干细胞培养液中FBS（胎牛血清）中含有丰富的细胞生长所需的营养成分和生长因子；脂肪组织浸提液中含有脂肪干细胞生长所需的各种天然生长因子，两者添加在DMEM/F12培养液中可以为分离培养的脂肪干细胞提供足够的营养和生长因子，有助于促进脂肪干细胞的生长。
8）接种培养：将收集到的脂肪干细胞以5×104个/ml的浓度接种在25cm2培养瓶中，置于37℃生化培养箱中培养；
9）脂肪干细胞传代培养：待细胞长至培养瓶底面积的90%左右时，弃掉旧培养液，用1mlPBS清洗一遍瓶底，弃掉PBS，加入1ml0.15%-0.5%体积浓度的胰蛋白酶溶液，37℃消化1min，用含脂肪干细胞培养液（即15FBS-5%脂肪组织浸提液的DMEM/F12培养液）轻轻将细胞吹下，平均分制两个培养瓶中，置于37℃生化培养箱中培养。
10）脂肪干细胞的冻存：按步骤（9）所述消化细胞的方法，收集6瓶脂肪干细胞，1000r/p离心10min，用脂肪干细胞冻存液混匀，转至冻存管中，将冻存管置于梯度冻存盒中，将冻存盒置于-80℃过夜，最后将冻存管转至液氮中保存。所述脂肪干细胞冻存液中含20%DMSO（二甲基亚砜）-10%FBS-70%DMEM/F12，均为体积分数。
本发明的方法中将收集到的脂肪干细胞接种后2天即可长满培养瓶底，表明分离效率高；在对脂肪干细胞传代培养时，每隔3天即可传一代，表明增值速度快。
实施例1
一种脂肪干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
（1）无菌获取脂肪组织：超净工作台内无菌获取新西兰大白兔双侧腹股沟脂肪组织。
（2）血管等其它组织的去除：超净工作台中去除可见的血管和其它组织，PBS清洗3-5次，直至洗出液清澈透亮；
（3）脂肪小块的制备：用眼科剪将脂肪组织剪碎至1mm3大小的小块，PBS清洗3-5次；
（4）胰蛋白酶消化：加入与脂肪组织等体积的0.15%体积浓度的胰蛋白酶溶液，混匀，37℃消化30min，1000r/p离心10min，将上层转至另一新离心管中；
（5）混合胶原酶消化：向分离出的上层中加入等体积0.25%体积浓度的混合胶原酶，37℃消化1h，1000r/p离心10min，上层转至另一新离心管，加入等体积0.25%体积浓度的混合胶原酶，37℃消化40min，1000r/p离心10min，上层转至另一新离心管，加入等体积0.25%体积浓度的混合胶原酶，37℃消化20min，1000r/p离心10min，弃上层；
（6）脂肪组织浸提液的制备：将脂肪组织剪至1mm3左右大小的脂肪小块，于离心管中加等体积的含15%FBS的DMEM/F12培养液混匀，置于37℃生化培养箱中静置1h，弃上层组织，0.22μm滤膜过滤下层清液，即得到脂肪组织浸提液；
（7）脂肪干细胞的收集：将步骤（4）（5）中离心得到的下层收集到一起，用含15FBS-5%脂肪组织浸提液的DMEM/F12培养液混匀，计数；
（8）接种培养：将收集到的脂肪干细胞以5×104个/ml的浓度接种在25cm2培养瓶中，置于37℃生化培养箱中培养；
（9）脂肪干细胞传代培养：接种培养2天后，待细胞长至培养瓶底面积的90%左右时，弃掉旧培养液，用1mlPBS清洗一遍瓶底，弃掉PBS，加入1ml0.15%胰蛋白酶溶液，37℃消化1min，用含15FBS-5%脂肪组织浸提液的DMEM/F12培养液轻轻将细胞吹下，平均分制两个培养瓶中，置于37℃生化培养箱中培养，每隔3天即可完成一次传代；
（10）脂肪干细胞的冻存：按步骤（9）所述消化细胞的方法，收集6瓶脂肪干细胞，1000r/p离心10min，用含20%DMSO-10%FBS-70%DMEM/F12冻存液混匀，转至冻存管中，将冻存管置于梯度冻存盒中，将冻存盒置于-80℃过夜，最后将冻存管转至液氮中保存。
本实施例中经几代传代培养，得到如图1所示 P1代兔脂肪干细胞，如图2所示P2代兔脂肪干细胞，如图3所示 P3代兔脂肪干细胞，如图4所示 P10代兔脂肪干细胞。从附图中可以看出本方法分离培养的兔脂肪干细胞传代培养至P10时，细胞的形态没有发生明显变化。
实施例2
一种脂肪干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
（1）无菌获取脂肪组织：超净工作台内无菌获取新西兰大白兔双侧腹股沟脂肪组织；
（2）血管及其它组织的去除：超净工作台中去除可见的血管和其它组织，PBS清洗3-5次，直至洗出液清澈透亮；
（3）脂肪小块的制备：用眼科剪将脂肪组织剪碎至1mm3大小的小块，PBS清洗3-5次；
（4）胰蛋白酶消化：加入与脂肪组织等体积的0.5%体积浓度的胰蛋白酶溶液，混匀，37℃消化10min，1000r/p离心10min，将上层转至另一新离心管中；
（5）混合胶原酶消化：向分离出的上层中加入等体积0.1%的混合胶原酶，37℃消化1h，1000r/p离心10min，上层转至另一新离心管，加入等体积0.1%的混合胶原酶，37℃消化40min，1000r/p离心10min，上层转至另一新离心管，加入等体积0.1%的混合胶原酶，37℃消化20min，1000r/p离心10min，弃上层；
（6）脂肪组织浸提液的制备：将脂肪组织剪至1mm3左右大小的脂肪小块，于离心管中加入与脂肪组织等体积的含15%FBS的DMEM/F12培养液混匀，置于37℃生化培养箱中静置1h，弃上层组织，0.22μm滤膜过滤下层清液，即得到脂肪组织浸提液；
（7）脂肪干细胞的收集：将步骤（4）（5）中离心得到的下层收集到一起，用脂肪干细胞培养液混匀，计数；所述脂肪干细胞培养液是含15FBS-5%脂肪组织浸提液的DMEM/F12培养液；
（8）接种培养：将收集到的脂肪干细胞以5×104个/ml的浓度接种在25cm2培养瓶中，置于37℃生化培养箱中培养；
（9）脂肪干细胞传代培养：接种培养2天后，待细胞长至培养瓶底面积的90%左右时，弃掉旧培养液，用1mlPBS清洗一遍瓶底，弃掉PBS，加入1ml0.15%体积分数的胰蛋白酶溶液，37℃消化1min，用脂肪干细胞培养液轻轻将细胞吹下，平均分制两个培养瓶中，置于37℃生化培养箱中培养，每隔3天即可完成一次传代；
（10）脂肪干细胞的冻存：按步骤（9）所述消化细胞的方法，收集6瓶脂肪干细胞，1000r/p离心10min，用含20%DMSO-10%FBS-70%DMEM/F12冻存液混匀，转至冻存管中，将冻存管置于梯度冻存盒中，将冻存盒置于-80℃过夜，最后将冻存管转至液氮中保存。
本发明中所述百分数均为体积浓度。以上实施例仅是本发明若干种优选实施方式中的几种，应当指出，本发明不限于上述实施例；对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (5)
1.一种兔脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下技术步骤：（1）无菌获取兔脂肪组织；（2）制备脂肪小块组织；（3）采用胰蛋白酶对脂肪小块组织进行消化，分离得上层溶液及下层沉淀；（4）对上层溶液采用时间递减梯度方法进行消化；（5）收集脂肪干细胞，用脂肪干细胞培养液混匀，接种培养；（6）脂肪干细胞的传代培养；（7）检测、冻存；
所述步骤（3）中胰蛋白酶消化过程是在脂肪小块组织中加入胰蛋白酶溶液混匀，在37℃下消化10-30min，1000r/p离心10min，得上层溶液及下层沉淀；所述胰蛋白酶溶液与脂肪组织等体积；
所述步骤（4）的操作方法为：向上层溶液中加入与脂肪小块组织等体积的混合胶原酶，37℃消化1h，1000r/p离心10min，上层转至另一新离心管，加入与脂肪小块组织等体积的混合胶原酶，37℃消化40min，1000r/p离心10min，上层转至另一新离心管，加入与脂肪小块组织等体积的混合胶原酶，37℃消化20min，1000r/p离心10min，弃上层，保留下层；所述混合胶原酶的配制方法为：在1000ml D-Hanks平衡盐溶液中加入1-2.5gⅠ型胶原酶和1-2.5gII型胶原酶粉末，4℃保存24h，然后采用0.22μm滤膜过滤除菌；
所述步骤（5）中脂肪干细胞培养液是指含15FBS-5%脂肪组织浸提液的DMEM/F12培养液，含15FBS-5%脂肪组织浸提液的DMEM/F12培养液是指含有15%体积分数的FBS和5%体积分数的脂肪组织浸提液的DMEM/F12培养液，所述脂肪组织浸提液的制备方法是将脂肪组织剪至0.8-1.2mm3的脂肪小块，于离心管中加入与脂肪小块组织等体积的DMEM/F12培养液混匀，所述DMEM/F12培养液中含15%体积分数的FBS，置于37℃生化培养箱中静置1h，弃上层组织，0.22μm滤膜过滤下层清液，即得到脂肪组织浸提液。
2.根据权利要求1所述的一种兔脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述兔脂肪组织取自新西兰大白兔双侧腹股沟脂肪。
3.根据权利要求1所述的一种兔脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中脂肪小块组织的大小为0.8-1.2mm3。
4.根据权利要求1所述的一种兔脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述胰蛋白酶溶液的配制方法为：在1000ml D-Hanks平衡盐溶液中加入1.5-5g胰蛋白酶粉末，在4℃下保存24h，然后采用0.22μm滤膜过滤除菌。
5.根据权利要求1所述的一种兔脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述Ⅰ型和II型胶原酶的质量比是1.5-2:1。
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