CN104087550B - 一种大鼠心肌细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大鼠心肌细胞的培养方法，其包括步骤：(1)将大鼠心肌组织浸于消化酶混合液中进行分次消化至心肌组织松软后弃去消化液，然后加入DMEM培养基，吹打松软的心肌组织，取上清进行离心收获细胞沉淀；(2)以DMEM培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液过180～220目筛后转移至培养瓶中进行差速贴壁2～3次，每次40～50分钟；(3)将心肌细胞以1.5～2.5×105个/mL的密度接种于培养容器中，接种后将培养容器置于培养箱中培养。本发明的方法成本低、耗时短、程序简化且不使用青霉素和Brdu等药物，从而能够避免青霉素和Brdu对后续研究的潜在影响。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种大鼠心肌细胞的培养方法。
背景技术
心肌细胞培养是指在体外适宜条件下，给予心肌细胞生长所需的营养，使之稳定生长，但原代心肌细胞一般易受外界条件因素的影响，存活率往往较低。心肌细胞培养技术已广泛应用于心血管领域分子水平的研究，有助于从细胞水平和分子水平研究心血管系统疾病的发病机制和治疗方法。目前本领域常见的心肌细胞培养方法为采用胰蛋白酶和胶原酶消化心脏细胞后进行接种培养，这样的方法使用的实验材料较多，如胰蛋白酶和II型胶原酶的使用量较多，并且在培养过程中会使用青霉素和Brdu(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)，另外这样的培养方法下心肌细胞达到同步性收缩所需的时间较长，一般至少需要3天，因此现有的培养方法还不能满足实际应用的需求，本领域对成本更低、培养程序更简化、耗时更短的新培养方法的呼声使研究人员致力于开发新的培养方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有的大鼠心肌细胞培养方法培养成本高、耗时长、培养程序复杂，且培养过程中会使用青霉素和Brdu等对后续实验过程可能会产生潜在影响的药物的缺陷，而提供一种成本低、耗时短、程序简化且不使用青霉素和Brdu等药物的新的大鼠心肌细胞培养方法。使用本发明的方法培养大鼠心肌细胞，培养时间明显缩短，心肌细胞在培养24小时后即可达到同步性搏动，且因避免了青霉素和Brdu的使用以及减少了酶的使用量，使得培养成本大大降低。
本发明提供下述技术方案解决上述技术问题。
本发明提供的技术方案之一是：一种大鼠心肌细胞的培养方法，其包括如下步骤：
(1)将大鼠心肌组织浸于消化酶混合液中进行分次消化至心肌组织松软后弃去消化液，然后加入DMEM培养基，吹打松软的心肌组织，取上清进行离心收获细胞沉淀，所述的消化酶混合液包括0.7～1.0g/L胰蛋白酶和0.5～0.8g/L II型胶原酶；
(2)以DMEM培养基重悬步骤(1)所得的细胞沉淀，将细胞悬液过180～220目筛后转移至培养瓶中进行差速贴壁2～3次，每次40～50分钟；
(3)取差速贴壁后培养瓶中的细胞悬液，将心肌细胞以1.5～2.5×105个/mL的密度接种于培养容器中，接种后将培养容器置于培养箱中培养；
其中，步骤(1)和(2)中所述的DMEM培养基为含8～12％FBS(FetalBovine Serum，胎牛血清)的DMEM培养基，所述的百分比为体积百分比。
其中，步骤(1)所述的大鼠心肌组织为本领域常规所述的用于心肌细胞培养的大鼠心肌组织，较佳地为取自1～2天(d)SD大鼠的心肌组织。
步骤(1)所述的分次消化为本领域的常规操作，即以酶液等多次分步消化心肌组织，在本发明中即为以消化酶混合液分次消化心肌组织直至心肌组织松软，分次消化的次数优选10-12次，更优选10次，每次消化的时间优选6～10分钟，更优选8分钟。本发明中所述的分次消化优选在每次消化后弃去消化液，以去除损伤的心肌组织细胞和细胞碎片等杂质。本发明中所使用的消化酶混合液的量为常规，一般根据待消化的大鼠心肌组织的量而定，并没有特别的要求，只要其能够将待消化的大鼠心肌组织浸没即可。本发明中所述的分次消化优选在温度为36.5～37.5℃的环境中进行，更优选37℃。
步骤(1)中所述的消化酶混合液优选包括0.7g/L胰蛋白酶和0.5g/L II型胶原酶。
步骤(1)中所述的离心操作为本领域常规所述，较佳地，所述离心为在吹打松软的心肌组织后，取上清进行800g，5min离心以收获细胞沉淀。
步骤(2)中，所述FBS的浓度较佳地为10％；所述FBS也可以用其他的牛血清替换，比如将FBS替换为小牛血清，同样可以实现本发明的技术效果；所述细胞悬液优选过200目筛后转移至培养瓶中进行差速贴壁；差速贴壁的次数优选2次；差速贴壁的时间优选每次45分钟。所述的差速贴壁为本领域常规所述，即利用不同细胞的贴壁时间的不同而将它们分离，在本发明中，细胞悬液中的成纤维细胞等的贴壁能力较强，可以在较短时间内直接贴壁在未被包被的光滑玻璃平面(如培养瓶)上，而此时心肌细胞则仍停留在细胞悬液之中，从而可以将其分离出来用于后续培养。
步骤(3)中，所述接种优选将心肌细胞以2.0×105个/mL的密度接种于培养容器中；所述培养容器优选电子微量滴定板，更优选96孔电子微量滴定板。所述培养的条件如本领域常规所述，可以是现有技术中现有的培养条件，如将培养容器置于37℃、CO2浓度为50mL/L的培养箱中培养。
步骤(3)中，在所述的培养期间，优选对培养的心肌细胞每天更换培养基，所述的培养基同步骤(1)和(2)中所述。
本发明中，在步骤(1)之前较佳地还包括大鼠心肌组织的分离提取步骤。所述的分离提取步骤为本领域常规所述，可以采用现有技术中已有的任何大鼠心肌组织的分离提取方法；较佳地，所述的分离提取步骤为将1～2d的SD大鼠于无菌条件下镊取心脏心尖部，置于预冷的DMEM培养基中漂洗1～3次去除血管组织，并剪成1～2mm3碎片，弃去上清，即得。
经本发明的培养方法培养大鼠心肌细胞，在步骤(3)接种后将培养容器置于培养箱中培养后，一般能够在培养24小时后即可获得细胞活力达标的、适用于后续研究的心肌细胞，此时心肌细胞的平均搏动频率为100～130次/min，搏动同步，收缩有力；若在24小时后持续培养，在培养期间每天更换培养基，则心肌细胞的活力以及平均搏动频率达标且保持搏动同步状态的持续时间可达10天以上。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)相比传统的大鼠心肌细胞培养方法，本发明的大鼠心肌细胞培养方法无需使用青霉素和Brdu，从而能够避免青霉素和Brdu对后续研究的潜在影响。
(2)使用本发明的培养方法培养大鼠心肌细胞，能够在24小时即获得细胞活力达标的、适用于后续研究的心肌细胞，此时心肌细胞的平均搏动频率为100～130次/min，搏动同步，收缩有力。因此，本发明的培养方法大大缩短了培养时间。
(3)本发明的培养方法操作步骤相对简化、更方便于实际应用，且由于避免使用青霉素和Brdu，以及降低了消化酶的使用量，从而还大大降低了实验成本。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，部分实验材料和试剂的来源如下：
SD大鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司；
胰蛋白酶购自美国Gibco公司；
II型胶原酶购自美国Gibco公司。
其他实验材料和试剂如未作特别说明，均为常规市售可得。
实施例1
1、出生1d的SD大鼠10只，无菌条件下镊取心脏心尖部，置于预冷的DMEM中漂洗3次去除血管组织，并剪成1mm3碎片，弃去上清。
2、加入1.5mL0.7g/L胰蛋白酶和0.5g/L II型胶原酶的消化酶混合溶液，置于37℃培养箱内分次消化(每次8min)10次，弃去消化液。
3、加入含10％FBS的DMEM培养基，吹打残余组织块至组织块基本消失，收集上清置于50mL离心管内。800×g离心5min，弃去上清，加入5mL含有10％FBS的DMEM培养基重悬细胞。将重悬的心肌细胞过200目细胞筛，并收集到新的50mL离心管内，最后把细胞悬液移至培养瓶中进行差速贴壁2次，每次45min。
4、取上清液，细胞计数以2.0×105个/mL的密度接种于96孔电子微量滴定板中，置培养箱中以含10％FBS的DMEM培养基培养，每天换液。观察心肌细胞的搏动图谱，图谱显示培养24h时即可观察到心肌细胞搏动同步，收缩有力，培养24h时测得心肌细胞的平均搏动频率为128±10次/min(n＝6，±s)。
实施例2
1、出生2d的SD大鼠12只，无菌条件下镊取心脏心尖部，置于预冷的DMEM中漂洗2次去除血管组织，并剪成2mm3碎片，弃去上清。
2、加入1.0g/L胰蛋白酶和0.8g/L II型胶原酶的消化酶混合溶液，使浸没心肌组织，置于36.5℃培养箱内分次消化(每次6min)12次，弃去消化液。
3、加入含12％FBS的DMEM培养基，吹打残余组织块至组织块基本消失，收集上清置于50mL离心管内。800×g离心5min，弃去上清，加含有12％FBS的DMEM培养基重悬细胞。将重悬的心肌细胞过180目细胞筛，并收集到新的50mL离心管内，最后把细胞悬液移至培养瓶中进行差速贴壁3次，每次40min。
4、取上清液，细胞计数以1.5×105个/mL的密度接种于96孔电子微量滴定板中，置培养箱中培养，每天换液。观察心肌细胞的搏动图谱，图谱显示培养24h时即可观察到心肌细胞搏动同步，收缩有力，培养24h时测得心肌细胞的平均搏动频率为111±5次/min(n＝6，±s)。
实施例3
1、出生1d的SD大鼠10只，无菌条件下镊取心脏心尖部，置于预冷的DMEM中漂洗1次去除血管组织，并剪成1mm3碎片，弃去上清。
2、加入1.5mL0.7g/L胰蛋白酶和0.5g/L II型胶原酶的消化酶混合溶液，置于37.5℃培养箱内分次消化(每次10min)10次，弃去消化液。
3、加入含8％FBS的DMEM培养基，吹打残余组织块至组织块基本消失，收集上清置于50mL离心管内。800×g离心5min，弃去上清，加入5mL含有8％FBS的DMEM培养基重悬细胞。将重悬的心肌细胞过220目细胞筛，并收集到新的50mL离心管内，最后把细胞悬液移至培养瓶中进行差速贴壁2次，每次50min。
4、取上清液，细胞计数以2.5×105个/mL的密度接种于96孔电子微量滴定板中，置于37.5℃、CO2浓度为50mL/L的培养箱中培养，每天换液。观察心肌细胞的搏动图谱，图谱显示培养24h时即可观察到心肌细胞搏动同步，收缩有力，培养24h时测得心肌细胞的平均搏动频率为125±8次/min(n＝6，±s)。
实施例4
1、出生1d的SD大鼠9只，无菌条件下镊取心脏心尖部，置于预冷的DMEM中漂洗2次去除血管组织，并剪成1mm3碎片，弃去上清。
2、加入0.8g/L胰蛋白酶和0.6g/L II型胶原酶的消化酶混合溶液，使浸没心肌组织，置于37℃培养箱内分次消化(每次8min)10次，弃去消化液。
3、加入含10％FBS的DMEM培养基，吹打残余组织块至组织块基本消失，收集上清置于50mL离心管内。800×g离心5min，弃去上清，加入含有10％FBS的DMEM培养基重悬细胞。将重悬的心肌细胞过200目细胞筛，并收集到新的50mL离心管内，最后把细胞悬液移至培养瓶中进行差速贴壁2次，每次50min。
4、取上清液，细胞计数以2.2×105个/mL的密度接种于96孔电子微量滴定板中，置培养箱中培养，每天换液。观察心肌细胞的搏动图谱，图谱显示培养24h时即可观察到心肌细胞搏动同步，收缩有力，培养24h时测得心肌细胞的平均搏动频率为114±6次/min(n＝6，±s)。
对比例1
采用文献“新生大鼠心肌细胞的原代培养及鉴定”(《心脏杂志》，2013，25(6):654-656)，胡保奎，耿召华，祝善俊，刘玉峰)中披露的方法培养大鼠心肌细胞，条件同实施例1，不同之处主要在于：(1)消化酶的浓度不同；(2)培养基组成不同。
本对比例包括下述步骤：
1、1～2d的SD大鼠，每次取10～20只，无菌操作取出心脏并剪成1mm3组织块，以磷酸盐缓冲液洗1次，弃带血的上清液；
2、用2.5g/L胰蛋白酶和2.0g/L II型胶原酶等量混合液在37℃条件下分次消化(每次10min)，共7次，首次消化液弃去。
3、收集细胞悬液，以1000×g离心10min，吸出上清液，加入含100ml/L小牛血清100μg/ml青霉素的DMEM培养液，吹打均匀后，经200目筛网过滤，于37℃50ml/L CO2孵箱中差速贴壁90min。
4、取上清液，细胞计数以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，加入0.1mmol/L Brdu抑制成纤维细胞生长，置37℃50ml/L CO2孵箱中培养，48h后换液首次换液，以后隔天换液，培养7d。
结果显示，观察心肌细胞的搏动图谱，图谱显示培养72h时才可观察到心肌细胞搏动同步，72小时时心肌细胞的搏动图谱显示培养的心肌细胞收缩有力，其平均搏动频率为80～130次/min(n＝6，±s)。
对比例2
本对比例的所有操作步骤基本同实施例1，不同之处在于：步骤(1)中的消化酶混合液包括1.2g/L胰蛋白酶和0.6g/L II型胶原酶。
结果显示，细胞在培养至39小时后才出现同步搏动，39小时时心肌细胞的搏动图谱显示培养的心肌细胞收缩有力，其平均搏动频率为126±16次/min(n＝6，±s)。
Claims (10)
1.一种大鼠心肌细胞的培养方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)将大鼠心肌组织浸于消化酶混合液中进行分次消化至心肌组织松软后弃去消化液，然后加入DMEM培养基，吹打松软的心肌组织，取上清进行离心收获细胞沉淀，所述的消化酶混合液包括0.7～1.0g/L胰蛋白酶和0.5～0.8g/L II型胶原酶；
(2)以DMEM培养基重悬步骤(1)所得的细胞沉淀，将细胞悬液过180～220目筛后转移至培养瓶中进行差速贴壁2～3次，每次40～50分钟；
(3)取差速贴壁后培养瓶中的细胞悬液，将心肌细胞以1.5～2.5×105个/mL的密度接种于培养容器中，接种后将培养容器置于培养箱中培养；
其中，步骤(1)和(2)中所述的DMEM培养基为含8～12％FBS的DMEM培养基，所述的百分比为体积百分比。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)所述的大鼠心肌组织为取自1～2天SD大鼠的心肌组织。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)所述分次消化的次数为10-12次，每次消化的时间为6～10分钟。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述的消化在温度为36.5～37.5℃的环境中进行。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的消化酶混合液包括0.7g/L胰蛋白酶和0.5g/L II型胶原酶；和/或，
所述离心为在吹打松软的心肌组织后，取上清进行800g，5min离心以收获细胞沉淀。
6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述FBS的浓度为10％；和/或，
所述细胞悬液过200目筛后转移至培养瓶中进行差速贴壁；和/或，
所述差速贴壁的次数为2次；和/或，
所述差速贴壁的时间为每次45分钟。
7.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述接种为将心肌细胞以2.0×105个/mL的密度接种于培养容器中；和/或，
所述培养容器为96孔电子微量滴定板。
8.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述培养的条件为将培养容器置于37℃、CO2浓度为50mL/L的培养箱中培养。
9.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括大鼠心肌组织的分离提取步骤。
10.如权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述的分离提取步骤为将1～2天的SD大鼠于无菌条件下镊取心脏心尖部，置于预冷的DMEM中漂洗1～3次去除血管组织，并剪成1～2mm3碎片，弃去上清，即得。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 201203 Shanghai City, Pudong New Area Zhangjiang hi tech GuoShouJing Road No. 199 Patentee after: Shanghai Yinuosi biotechnology Limited by Share Ltd Address before: 201203 Shanghai City, Pudong New Area Zhangjiang hi tech GuoShouJing Road No. 199 Patentee before: Shanghai Innostar Bio-tech Co., Ltd. |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20180309 Address after: 201203 Shanghai Jing Pudong New Area Free Trade Zone Road No. 199 Co-patentee after: National (Shanghai) Research Center for new drug safety assessment Patentee after: Shanghai Yinuosi biotechnology Limited by Share Ltd Address before: 201203 Shanghai City, Pudong New Area Zhangjiang hi tech GuoShouJing Road No. 199 Patentee before: Shanghai Yinuosi biotechnology Limited by Share Ltd |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CI03 | Correction of invention patent |
Correction item: Patentee Correct: NCDSER False: National (Shanghai) Research Center for new drug safety assessment Number: 13-02 Volume: 34 |
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| CI03 | Correction of invention patent |