CN108707624A - 一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法及应用。该方法包括如下步骤：S1、培养无菌组培苗；S2、制备发根农杆菌浸染液；S3、真空介导法浸染；S4、浸染后的外植体通过共培养、筛选培养、扩大培养得到博落回毛状根菌株。本发明首先利用发根农杆菌浸染博落回外植体来建立博落回毛状根体系，然后通过建立的毛状根体系获取博落回毛状根材料。经检测分析，获取的博落回毛状根材料中的血根碱和血根碱的重要合成前体物质二氢血根碱的含量显著高于野生型博落回根部材料，且原阿片碱6位羟基化酶和二氢血根碱氧化酶的表达量要远高于野生型博落回根部材料。该方法重复性好，不会受到环境的限制，为血根碱药源获取提供一种新途径。

Description

一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种博落回毛状根的培养方法，尤其涉及一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法及应用。

背景技术

血根碱是一种苄基异喹啉类生物碱，目前主要作为一种天然生长促进剂广泛用于畜牧业养殖中来替代抗生素生长促进剂。除此以外，血根碱还是一种潜在的抗癌药物，具有良好的抗癌活性。目前获取血根碱的主要来源是罂粟科大型多年草本植物博落回，由于博落回目前多还是野生品种、种源单一且生长受到环境因素影响较大，因此其来源有限，从而导致血根碱的药源也有限。

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性好氧细菌，属于根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属。其浸染性十分广泛，能浸染大部分的双子叶植物和少部分的单子叶植物甚至个别裸子植物。发根农杆菌浸染植物宿主后会产生大量毛絮状不定根，这些不定根不断分枝呈毛状我们称之为毛状根或发根。发根农杆菌诱导毛状根的主要机制是发根农杆菌所含的Ri质粒。Ri质粒是存在于发根农杆菌的染色体以外的大质粒，大小在180～ 250kb之间，有合成冠瘿碱酶的基因。Ri质粒上存在2个与转化有关的功能区：T-DNA区(转移区)和Vir区(致病区)。T-DNA区中共包括左边界序列TL-DNA区和右边界序列TR-DNA 区。其中T-DNA区的主要功能是在转化时整合到宿主植物基因组并表达决定毛状根形成。 TL-DNA区中有rolA、rolB、rolC、rolD(称core T-DNA)等与毛状根表型性状产生有关的基因群，其中rolB基因是毛状根形成最关键的基因。而在TR-DNA区上有能指导吲哚乙酸合成的tms1和tms2基因，同时能促进毛状根的生成。Vir区的作用是协助T-DNA区完成转化，浸染时，通过植物宿主伤口分泌的酚类物质(如乙酰丁香酮)来激活农杆菌Vir区的基因，使其产生大量的限制性核酸内切酶切割Ri质粒产生T-DNA链，诱导其与农杆菌细胞膜上的特定位点相结合，然后向植物细胞核内转移并最终整合进植物细胞的基因组产生相应的性状。在转化过程中vir区并不会转入植物宿主细胞。毛状根(hairy roots)是发根农杆菌浸染植株后，在植株创伤表面一种特殊的表现型。毛状根具有以下优点：快速生长，在培养过程中会高速增殖；与根癌农杆菌相比，毛状根的遗传性能稳定，继代与扩大培养后生化特性不易改变；与其他植物培养相比，毛状根显示出更高的生化稳定性；可获得可观的生物量。

近年来，各种生物活性化合物，包括长春花，莨菪烷类生物碱，人参皂苷，蒽醌类，花生烯和青蒿素等都已经由毛状根获得；产次生代谢产物的能力强。可把目的基因导入植物细胞中，如：将罂粟中的可卡因还原酶基因(CodR基因)在植物表达载体中过表达后再通过发根农杆菌转移到罂粟中，可以使使毛状根中的吗啡含量显著提高。例如：

对比文件1：CN106497971A公开一种快速高效的甘蓝型油菜毛状根诱导及培养方法，该方法使用农杆菌重悬液重悬活化后的发根农杆菌；在生长2周的无菌甘蓝型油菜幼苗的近子叶端下胚轴处制造伤口；用发根农杆菌重悬液侵染伤口处；继续无菌培养侵染后的幼苗，在伤口处产生毛状根；将带有毛状根的下胚轴切下后，培养获得无菌的毛状根；将毛状根的根尖切下在继代培养基中培养可获得大量毛状根。

对比文件2：CN106399353A公开一种头花蓼毛状根培养体系建立的方法，其步骤具体包括：1、菌种活化；2、毛状根诱导；3、毛状根离体培养体系的建立；4、毛状根的PCR检测。能为实现黄酮化合物的工业化大规模生产奠定基础。

对比文件3：CN105420271A公开一种转基因枸杞毛状根、基因转化方法及液体培养方法，转基因枸杞毛状根的基因转化方法，包括以下步骤：(1)制备枸杞无菌叶片；(2)发根农杆菌 A4活化；(3)侵染外植体、共培养；(4)发根培养；(5)荧光检测；检测步骤(4)获得的毛状根中的RFP基因的红色荧光的存在与否；具有红色荧光的毛状根即为转基因枸杞毛状根。

目前暂未见利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根，以获得多目标博落回品种的相关报道。本发明拟提供一种利用发根农杆菌浸染博落回外植体来建立博落回毛状根体系，然后通过建立的博落回毛状根体获取博落回毛状根材料的方法及其应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法及应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种利用发根农杆菌诱导博落回毛状根的方法，其包括如下步骤：

S1、培养无菌组培苗；

S2、制备发根农杆菌浸染液；

S3、真空介导法浸染：取步骤S1培养的无菌组培苗的外植体浸没在步骤S2制得的发根农杆菌浸染液中，置25～30℃摇床上80～120rpm慢摇8～12min，然后置于真空冷冻干燥机中连续抽真空8～12min；

S4、将步骤S3浸染后的无菌组培苗外植体依次通过共培养、筛选培养、扩大培养得到博落回毛状根材料。

进一步地，

步骤S1的方法具体为：将采摘的博落回外植体进行消毒灭菌处理；然后在无菌工作台中，在博落回外植体上轻划伤口后接种到MS固体培养基(市场上直接购买的MS加水调节成4.42g/L，加30g/L蔗糖，调节pH＝5.8，加入0.3％植物凝胶调成固体培养基)上，置于25℃暗培养箱中培养；待长出愈伤，置于25℃光暗结合培养长出无菌组培苗。

进一步地，

步骤S1还包括对获得的无菌组培苗通过继代培养或植株再生或外植体引发愈伤的手段进行扩繁。

进一步地，

步骤S1中消毒灭菌处理具体包括：博落回外植体包括叶片、茎段，将采摘的叶片或茎段先用75％酒精浸泡，再用0.1％升汞进行消毒处理，然后用无菌水漂洗叶片或茎段杂质，完成消毒灭菌处理。

进一步地，

步骤S1还包括在无菌工作台中，用无菌剪刀将叶片剪至5mm×5mm大小，将茎段斜切成长度0.4～0.6cm的小段，然后用无菌解剖刀在叶片或茎段上轻划2-3道伤口，最后接种到 MS固体培养基上(市场上直接购买的MS加水调节成4.42g/L，加30g/L蔗糖，调节pH＝5.8，加入0.3％植物凝胶调成固体培养基)，置25℃暗培养箱中培养，待长出愈伤，置25℃，16 小时光培养和8小时暗培养后长出无菌组培苗。

进一步地，

步骤S2制备发根农杆菌浸染液的方法具体包括：

S201将保存的发根农杆菌ACCC10060，融化后，将菌液接种到选择培养基上培养直到菌种复苏并形成单菌落；所述选择培养基为含有45～55mg/L卡那霉素与45～55mg/L利福平的固体LB或YEB培养基；

S202将单菌落接种至含45～55mg/L卡那霉素与45～55mg/L利福平的液体LB或YEB培养基的试管中，于摇床25～30℃，160～200rpm条件下振荡培养22-23h，培养至 1<OD600<1.5，得到活化菌液；

S203将活化菌液置于新鲜YEB液体培养基中，于摇床25～30℃，160～200rpm条件下振荡培养6～8h，培养至0.6<OD600<0.8；然后转速4500～5500rpm离心8～12min，除去上清液，后用无菌水重悬再离心去上清，再用等体积MS液体培养基(市场上直接购买的MS 加水调节成4.42g/L，加30g/L蔗糖，调节pH＝5.8)重悬至0.6<OD600<0.8，即得发根农杆菌浸染液。

进一步地，

步骤S4中共培养的方法如下：

将浸染后的外植体用无菌滤纸去除其表面水分和过量发根农杆菌菌液，用灭菌的镊子夹取外植体至共培养基上，置于25℃暗培养箱中，共培养3天；所述共培养基由MS固体培养基(市场上直接购买的MS加水调节成4.42g/L，加30g/L蔗糖，调节pH＝5.8，加入0.3％植物凝胶调成固体培养基)和乙酰丁香酮激素400uL/L母液组成，pH为5.8。

进一步地，

步骤S4中筛选培养的方法如下：

将共培养3天后的外植体转移至筛选培养基上，置25℃暗培养箱中，筛选培养，直至外植体的伤口部位出现分枝状不定根；所述筛选培养基由MS固体培养基(市场上直接购买的 MS加水调节成4.42g/L，加30g/L蔗糖，调节pH＝5.8，加入0.3％植物凝胶调成固体培养基) 和2mL/L的特美汀母液组成；每15天更换新的含特美汀的MS固体培养基。

进一步地，

步骤S4中扩大培养的方法如下：

筛选培养5～6周后，从外植体上分离出单根不定根至1/2MS筛选固体培养基上培养，所述1/2MS筛选固体培养基由1/2MS固体培养基(市场上直接购买的MS加水调节成2.21g/L 1/2MS，加30g/L蔗糖，调节pH＝5.8，加入0.3％植物凝胶调成固体培养基)和2mL/L特美汀母液组成，培养条件为：25℃，16小时光培养和8小时暗培养，每2周继代培养，即得；在此期间，逐渐降低特美汀母液的浓度，待残留在外植体表面的发根农杆菌完全被消除，则不再添加特美汀。

进一步地，

所述方法还包括步骤S5、对步骤S4获得的毛状根菌株进行鉴定，确定发根农杆菌是否成功导入博落回外植体中。

进一步地，所述方法还包括步骤S6、对步骤S5通过鉴定后的毛状根菌株的毛状根材料进行PCR检测分析。

本发明中使用的发根农杆菌可为野生型发根农杆菌，也可以为转入带有目的基因的发根农杆菌。野生型发根农杆菌诱导产生的毛状根可以用于根生理研究或次级代谢物的生产，而带有目的基因的农杆菌诱导产生的毛状根可以用于特定基因或启动子等组件的功能研究。

本发明还提供上述利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法在制备血根碱或二氢血根碱或原阿片碱中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供的方法首先利用发根农杆菌浸染博落回外植体来建立博落回毛状根体系，然后通过建立的博落回毛状根体系获取博落回毛状根材料。获取的博落回毛状根材料中的血根碱和血根碱的重要合成前体物质二氢血根碱的含量显著高于野生型博落回根部材料，且原阿片碱6位羟基化酶和二氢血根碱氧化酶的表达量要远高于野生型博落回根部材料。该方法重复性好，不会受到环境的限制，为血根碱药源获取提供一种新途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A、1B为浸染毛状根组(HR)感染15-30天后茎段的伤口上引发毛状根的状态图；

图1C、1D为浸染毛状根组(HR)感染15-30天后叶片的伤口上引发毛状根的状态图；

图1E为浸染毛状根组(HR)获得的博落回毛状根培养材料；

图1F、1G为野生型组(WT)未侵染发根农杆菌15-30天后茎段的伤口上生出胚性愈伤组织的状态图；

图1H、1I为野生型组(WT)未侵染发根农杆菌15-30天后叶片的伤口上生出胚性愈伤组织的状态图；

图1J为野生型组(WT)未侵染发根农杆菌70天后组培苗根部组织状态图；

图2A为阳性对照组(发根农杆菌ACCC10060)的PCR产物电泳分析图；

图2B为本发明博落回毛状根根系的PCR产物电泳分析图；

图2C为阴性对照(博落回的野生型根)的PCR产物电泳分析图；

图2A、2B、2C中从左到右分别：M为DL 2000DNA Marker基因；1为rolB(670bp) 基因；2为rolC(534bp)基因；3为virD(438bp)基因。

图3A为HR和WT中合成SAN(PRO，DHSAN，SAN)的分支路径；

图3B为HR和WT中合成CHE(ALL，DHCHE，CHE)的分支路径；

图3C为HR和WT中合成SAN与CHE的P6H和DBOX基因的荧光定量PCR结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对发明进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

本发明提供一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法，该方法首先利用发根农杆菌浸染博落回外植体来建立博落回毛状根体系，然后通过建立的博落回毛状根体系获取博落回毛状根材料，之后对获得毛状根材料进行鉴定，并对其进行PCR检测分析，具体如下：

1、实验材料

(1)发根农杆菌菌株材料

野生型发根农杆菌ACCC10060。

(2)外植体材料

本实验组培材料均采自浙江开化博落回健壮植株叶片和茎段。

将采摘的叶片、茎段先用75％酒精浸泡，再用0.1％的升汞(HgCl2)进行消毒处理，然后用无菌水漂洗叶片、茎段杂质，完成消毒灭菌处理。然后在无菌工作台中，用无菌剪刀将叶片剪至5mm×5mm大小，将茎段斜切成长度0.4～0.6cm的小段，用无菌解剖刀在叶片、茎段上轻划2-3道伤口，最后接种到MS固体培养基上(4.42g/LMS+30g/L蔗糖，pH＝5.8)，置25℃暗培养箱中培养，待长出愈伤，置25℃，16/8光培养(16小时光培养和8小时暗培养)，长出无菌组培苗。通过继代培养、植株再生、引发愈伤等手段对组培苗进行扩繁。本实验材料均选自浙江开化博落回的2月龄无菌博落回组培苗。

(3)培养基

LB培养基(含10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母浸出物和10g/L NaCl)，LB固体培养基加入15％琼脂；

MS培养基(市场上直接购买的MS加水调节成4.42g/L，加30g/L蔗糖，调节pH＝5.8)，固体培养基加入0.3％植物凝胶；

1/2MS培养基(市场上直接购买的MS加水调节成2.21g/L 1/2MS，加30g/L蔗糖，调节 pH＝5.8)，固体培养基加入0.3％植物凝胶。

(4)主要试剂与激素

利福平(Rif)母液浓度为50mg/mL(溶剂为二甲基亚砜)，乙酰丁香酮(AS)母液浓度为400uL/L(溶剂为二甲基亚砜)、卡那霉素(KM)母液浓度为100mg/mL、特美汀(TIC)母液浓度为400mg/L，均购于Solarbio公司。

注：未标明溶剂的激素，溶剂为水，配置后需用0.22μm无菌滤膜过滤后分装保存于-20℃。而溶剂为二甲基亚砜的激素配置后，不需要过膜。

(5)仪器

PCR扩增仪(Applied Biosystems，2720 Thermal Cycler)；

超净工作台(天津市泰斯特仪器有限公司，CJ-1D)；

立式高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂，LDZF-75KB-Ⅱ)；

电泳仪(美国Bio-RAD)；旋涡混合器(上海青浦沪西仪器厂，XM-80A)；

凝胶成像系统(东胜创新生物科技有限公司，Bio-Imaging Systems 910)；

电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司，DK-S12)；

高速冷冻离心机(LaboGene，1730R)；

台式恒温振荡仪(江苏太仓市实验设备厂，THZ-D)；

恒温培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司，DNP-9162BS-Ⅲ)；

电子天平(Mettler Toledo，PL203)；移液枪(德国Eppendorf公司)；

紫外可见分光光度计(日立，U-3310)。

Milli-Q纯水仪(贝徕美生物科技有限公司，Milli-Q Advantage A10)。

2、真空介导法浸染无菌组培苗外植体

预实验初期，选用不同菌种分别浸染博落回不同外植体均褐化死亡，可能原因是抗性基因未成功导入。之后，我们使用了真空介导法：将外植体浸泡在活化的菌液中，置于28℃摇床上100rpm,10min，再在真空冷冻干燥机中连续抽真空10分钟，培养一段时间后，观察到部分外植体长出毛状物，证明真空介导法能极大提高博落回遗传转化率。

2.1博落回毛状根诱导

(1)浸染液的制备

①转化前将-80℃条件下取出保存的发根农杆菌ACCC10060，融化后，用接种环蘸取少许菌液于选择培养基(含有50mg/L卡那霉素与50mg/L利福平的固体LB培养基)平板上划线 (“Z”字形)。然后将培养皿倒置于28℃恒温培养箱中暗培养40h以上(2d左右)直到菌种复苏并形成单菌落。

②在超净工作台上用接种环挑取单菌落接种至4mL含50mg/L卡那霉素与50mg/L利福平YEB液体培养基的试管中中，于摇床28℃，180rpm振荡培养至1<OD600<1.5(大约 22-23h)。

③取活化的菌液1ml至50ml新鲜YEB液体培养基中，于摇床28℃，180rpm振荡培养至所需浓度时(大约7h，0.6<OD600<0.8)。

④5000rpm离心10min，除去上清液，后用无菌水重悬再离心去上清，再用MS(等体积)重悬后0.6<OD600<0.8即可用于浸染。

(2)不同发根农杆菌分别侵染不同的外植体

取无菌组培苗，将叶片剪成约5mm×5mm大小，用无菌解剖刀在叶片上轻划2-3道伤口；茎段剪成1cm左右，将外植体分别浸没在活化的不同的发根农杆菌浸染液中，置28℃摇床上100rpm慢摇10min，然后置真空冷冻干燥机中连续抽真空10分钟。

(3)共培养

我们把浸染后的外植体用无菌滤纸去除其表面水分和过量发根农杆菌菌液，用灭菌的镊子夹取外植体至共培养基(MS固体培养基加激素乙酰丁香酮400uL/L母液)上，置于25℃暗培养箱中，共培养3天。

(4)筛选培养

共培养3天后，将外植体转移至筛选培养基(MS固体培养基+2mL/L特美汀母液)上，置25℃暗培养箱中，筛选培养。每15天更换新的含特美汀的固体培养基。

(5)扩大培养

筛选培养15-18天后，我们可以看到少数外植体的伤口部位出现分枝状白茸茸的不定根 (见图2A,2C)。待筛选培养5-6周之后，我们从外植体上分离出单根至1/2MS筛选固体培养基(1/2MS固体培养基+2mL/L特美汀母液)上培养，培养条件为：25℃，16小时光培养和8小时暗培养，每2周继代培养。在此期间，逐渐降低特美汀的浓度，待残留在外植体表面的发根农杆菌完全被消除，则不再添加特美汀。

3、野生型组胚性愈伤组织诱导

(1)外植体处理

取无菌组培苗，将叶片剪成约5mm×5mm大小，将茎段斜切成长度0.4～0.6cm的小段，用无菌解剖刀在叶片、茎段上轻划2-3道伤口；用灭菌的镊子夹取外植体至普通MS固体培养基上，置25℃暗培养箱中培养。每15天更换新的普通的不含激素的MS固体培养基。

(2)扩大培养

野生型培养15-18天后，我们可以看到少数外植体的伤口部位出现愈伤(见图1F、1G)，待培养5-6周之后，我们从外植体上分离出愈伤，让其在25℃,16小时光照和8小时黑暗中培养，每2周继代培养。待愈伤组织转移到光照培养10周之后，可以看到组培苗产生的根部组织(见图1J)。

4、实验结果

(1)形态学鉴定结果

1)茎段组：浸染毛状根组(Hair Root，简称HR)茎段从伤口处长出细长根状根，且根上附有很多细茸毛(见图1A，1B)，相比较而言，野生型组(Wild Type，简称WT)，野生型组是相对突变型来说的。在目前大量研究中均把从大自然中获得的个体，即非人工诱变的，都称为野生型组，它所携带的基因为野生型基因组。)茎段从伤口处长出的组织无细茸毛(见图1F、1G，我们还可以观察到图1F组织上冒出绿色叶，我们推测其为胚性愈伤组织而非根。

2)叶片组：HR组叶片从伤口处发出大量絮状绒毛且具有较高的侧支分支(见图1C，1D)，而WT组叶片直接从伤口处发出大量愈伤(见图1H，1I)。

(2)不同外植体诱导率结果

毛状根诱导率＝(出愈外植体数/外植体总数)*100％

HR叶片除ACCC10060发根农杆菌菌种诱导产生了毛状根外，其他菌种诱导率均为零，诱导失败，故只对ACCC10060发根农杆菌浸染的叶片做数据分析。总体而言，博落回的叶、茎两种外植体均可以通过菌株诱导形成毛状根(见图1A、1B、1C，1D)，分别以4.11±1.01％和38.06±3.84％(见表1)的比率在叶和茎中诱导产生。结果表明博落回外植体茎段更适宜于诱导产生毛状根。

表1 不同外植体对毛状根的诱导率的影响

**表示叶片和茎诱导之间的显着结果(P<0.05)。数据代表一式三份培养物的平均值±标准偏差。

5、毛状根菌株鉴定

(1)PCR引物设计

引物序列(见表2)，根据infusion引物的设计原则分别设计rolB、rolC和virD基因的引物，由上海生物工程股份有限公司合成。

表2 用于PCR分析的引物

(2)发根农杆菌ACCC10060质粒提取

取1支经高压灭菌后的10mL离心管，加入4mL含利福平50mg·mL-1的LB液体培养基(100mLLB+100uLRif母液)，再加入100μL发根农杆菌ACCC-10060菌液，放于台式恒温振荡仪中28℃，200rpm过夜培养。

使用TIANprep mini plasmid kit试剂盒提取质粒，步骤如下：

①向CP3吸附柱中(收集管中放入吸附柱)加500μL Buffer BL平衡液，使用常规离心机，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，目的是使吸附柱平衡。

②取4mL过夜培养的菌液加入EP离心管中，12,000rpm离心1min，尽量去除离心管中的上清液。

③向含菌体沉淀的EP离心管中加250μL含RNase A的Buffer P1溶液，用涡旋振荡器将菌体沉淀彻底悬浮。

④在EP离心管中加250μL Buffer P2溶液，温和地上下翻转EP离心管6-8次，使菌体充分裂解。

⑤向EP离心管中加入350μL Buffer P3溶液，立即温和地上下翻转EP离心管6-8次，使菌体和溶液充分混匀，出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min。

⑥将收集的上一步上清液转移到CP3吸附柱中，尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心1 min，去掉收集管废液，并将CP3吸附柱放回收集管。

⑦加600μL含无水乙醇的Buffer PW漂洗液，12,000rpm离心1min，去掉收集管废液，将CP3吸附柱放回收集管。

⑧重复上一步。

⑨将CP3吸附柱放回收集管，12,000rpm离心2min，去除CP3吸附柱中残留的BufferPW 漂洗液。

⑩最后把CP3吸附柱放置在干净的EP离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μLBuffer EB洗脱缓冲液，室温放置2min，12,000rpm离心2min，使质粒溶液收集到EP离心管中。

(3)DNA提取

从无菌的博落回的毛状根和普通根中分别提取出DNA使用天根新型植物基因组DNA提取试剂盒(中国，天根)。处理材料：

①取毛状根和普通植株根新鲜组织100mg,加入液氮充分研磨。加入400μL缓冲液LP1 和6μL RNA(10mg·mL-1),涡旋震荡10min。

②加入130μL缓冲液LP2，充分混匀，涡旋震荡1min。

③12,000rpm离心5min，将上清液移至新的离心管中。

④加入1.5倍体积的缓冲液LP3(使用前检查是否加入无水乙醇)，立即充分振荡混匀 15sec,此时可能会出现絮状沉淀。

⑤将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3吸附柱中(收集管中放入吸附柱)，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

⑥向吸附柱CB3中加600μL含无水乙醇的Buffer PW漂洗液，12,000rpm离心1min，去掉收集管废液，将CB3吸附柱放回收集管。

⑦重复上一步。

⑧将CB3吸附柱放回收集管，12,000rpm离心2min，去除CP3吸附柱中残留的BufferPW 漂洗液。

⑨最后把CB3吸附柱放置在干净的EP离心管中，向吸附膜的中间部位滴加30μLBuffer EB洗脱缓冲液，室温放置2min，12,000rpm离心2min，使质粒溶液收集到EP离心管中。

(3)PCR扩增

PCR扩增体系(见表3)，PCR扩增条件(见表4)。

表3 Taq酶PCR扩增目的基因、启动子和终止子体系

表4 Taq酶PCR扩增循环反应

(4)所得PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件为：120v，400mA，20min。

(5)实验结果

所得PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如下：我们可以看到发根农杆菌ACCC10060质粒跑出了三个条带rolB(670bp)rolC(534bp)和virD(438bp)(见图2A)；博落回浸染组提的DNA跑出了两个条带rolB(670bp)rolC(534bp)(见图2B)；未跑出 virD(438bp)条带，排除了发根农杆菌污染。从空白组提的DNA扩增后并未跑出条带(见图2C)。验证博落回浸染组为阳性植株，发根农杆菌成功导入博落回外植体，浸染成功。

6、博落回毛状根代谢产物分析和基因表达变化

(1)实验试剂

多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit)购自天根生物有限公司，Qubit 2.0试剂盒，反转录试剂盒(PrimeScript^TM 1st Strand cDNASynthesis Kit)。

(2)实验材料

博落回外植体无菌培养30天后，取HR和WT组织。

(3)实验方法

1)总RNA提取方法

用TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit提取，操作如下：

①提前配置好DNasel储存液(用RNase-Free ddH2O 550μL将其干粉(1500U)溶解，混匀后分装，-20℃保存，备用。

②取所需样品放入液氮，快速且充分将样品研磨成粉末，用无RNA酶的EP管装入适量的样品粉末，往其中加入Buffer SL裂解液500μL和50μL的β-巯基乙醇，马上涡旋，使其充分剧烈混匀。

③使用常规离心机，12,000rpm离心2min后，把上清液用移液枪移至CS过滤柱上(过滤柱放在收集管中)，12,000rpm离心2min，将收集管中的液体全部移至新的无RNA酶的EP管中。

④往EP管中加入液体中0.4倍的无水乙醇，混匀后全部转入CR3吸附柱中，12,000rpm 离心1min，倒掉废液后把CR3吸附柱重新放回收集管中。

⑤往吸附柱中加350μL的RW1去蛋白液，12,000rpm离心1min，倒掉废液后再次把CR3 吸附柱重新放回收集管中。

⑥从-20℃冰箱中取出DNasel储存液，融化后取10μL放入新的无RNA酶的EP管中，再加入RDD溶液70μL，将其全部轻柔混匀。

⑦将上述配置好的工作液DNasel全部加入CR3吸附柱中，室温下放15min。再往柱中加入350μL RW1去蛋白液，12,000rpm离心1min，倒掉废液后把CR3吸附柱重新放回收集管中。

⑧往吸附柱中加RW漂洗液500μL，每次12,000rpm离心1min，倒掉废液后把CR3吸附柱重新放回收集管中。

⑨重复上一步骤。

⑩12,000rpm空离心2min后把吸附柱放入新的无RNA酶的EP管中，往莫中间悬空加RNase-Free ddH2O 30～50μL，室温处理2min，12,000rpm离心1min即可得到RNA。

2)琼脂糖凝胶电泳检查RNA的质量。

3)RNA含量测定

由2.0 Fluorometer测定RNA含量。具体操作步骤如下：

①先准备五个assay tubes管，分别记作a、b、1、2。

②每管加入199μldsDNA HS Buffer和1μLdsDNA HS Reagent，用涡旋仪涡旋混匀，离心10s。

③将a、b用移液枪各去掉10μL，a加入dsDNA HS Standard #1 10μL，b加入dsDNA HS Standard#2 10μL，用涡旋仪涡旋混匀，备用。

④将1、2用移液枪各去掉1μL，分别加入待检测的RNA1μL，用涡旋仪涡旋混匀。

⑤最后将混匀后的a、b、1、2，离心10s，暗处理2min。

⑥打开2.0 Fluorometer，取出暗处理的待测液。先用a、b溶液先制作标准曲线，再基于标准曲线分别检测1、2的含量，(若某一含量过高使得超过检测范围，则需要重新检测，先将待测液稀释后再按上述步骤操作)。

4)总RNA反转录成cDNA

总RNA使用反转录试剂盒转录成cDNA。得到的cDNA产物稀释至100μL用作后续实验的模板。使用PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒

加入反应体系I(见表5)：

表5 反应体系I

65℃热激5min后，放于冰上迅速冷却。

加入反应体系II(见表6)：

表6 反应体系II

混匀后短暂离心，放于PCR仪上，30℃10min，42℃30-60min，95℃5min，4℃保持。反应完成后冰上冷却，放于-20℃保存，备用。

5)RT-PCR检测

①q-PCR引物设计，序列(见表7)

表7 q-PCR引物序列

②分样(见表8)

表8 q-PCR分样

a、将反转录的单链cDNA模板稀释5-10倍，混匀，离心收集，放于四度待用。将3uM的正向和方向引物混匀，离心收集，放于四度待用。

b、配制水和RT-PCR Buffer(2×)的混合物

做3次重复：35μL(水10μL、RT-PCR Buffer 25μL×检测基因数×模板数

做2次重复：24.5μL(水7μL、RT-PCR Buffer 17.5μL×检测基因数×模板数

计算出理论值，实际需要多配一些，下一步分样过程中，枪头会损失一些。

例如：做3个重复，检测基因数目是6个，模板数目是2个，理论需要时35×6×2＝420μL 但是实际实验中要配制12.3左右的量，也就是437.5μL。

c、第一次分样

根据模板数目将上述液体分成几份，做3次重复按35μL×基因数来分。做2次重复按 24.5×基因数来分。

例如：检测基因数目是6个，模板数目是2个，做3次重复，则需要分成两份，每份的量为35×6＝210μL。

注意：分样前样品要充分混匀，离心收集。

d、加入稀释后的模板

把不同的模板加入上述分好的样品中。做3次重复，加入量为5μL×基因数目。做两次重复，加入量为3.5μL×基因数目。

例如：检测数目为6个，做3次重复，加入模板量为5μL×6＝30μL

e、第二次分样

将已加入模板的样品，根据基因数目分成相应的数目，做3次重复，按照每个分39ul。做两次重复，按照每个分26μL。

例如：做3次重复，有6个基因，则分成6份，每份39μL。

注意：分样前样品需要充分混匀，离心收集。

f、加入引物

将混好的引物加入上一次的分好的样品中。如果做3次重复，加入量为10μL。如果做2 次重复，加入量为7μL。

g、最后一次分样

取出96孔板和膜，注意带手套，不要说话，避免污染。按每个孔15μL加入，记住加样的顺序。加完后封好膜，注意分样前样品需要充分混匀，不要用手去碰膜的中央，瞬时离心，上机操作。

(4)实验结果分析

对HR和WT组中6种生物碱(PRO(英文全称protopine，原阿片碱)，DHSAN(英文全称dyhydrosanguinarine，二氢血根碱)，SAN(英文全称sanguinarine，血根碱)，ALL(英文全称allocryptopine，别隐品碱)，DHCHE(英文全称dihydrochelerythrine，二氢白屈菜红碱)，CHE(英文全称chelerythrine，白屈菜红碱)的含量。总的来说，其中的3种生物碱(PRO，DHSAN，SAN)含量显著提高(见图3A)。PRO，DHSAN和SAN的HR组含量比WT组分别高1.4倍，11.3倍和2.3倍。但是，其他三种生物碱(ALL，DHCHE，CHE)含量HR 和WT组间无明显差异(见图3B)。因此可以采用本发明提供的方法培育博落回，然后提取制备血根碱或二氢血根碱或原阿片碱，尤其是血根碱，因为HR组血根碱的含量高达WT组血根碱含量的2.3倍。

通过RT-PCR结果显示博落回毛状根中McP6H和McDBOX基因表达提高到2倍以上水平(见图3C)。结合质谱数据，毛状根中PRO，DHSAN和SAN的含量均提高数倍，故我们推测毛状根中生物碱含量的提高主要归因于毛状根中McP6H和McDBOX基因的过表达，基因的上升引起了下游代谢产物的上升。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (10)

1.一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1、培养无菌组培苗；

S2、制备发根农杆菌浸染液；

S3、真空介导法浸染：取步骤S1培养的无菌组培苗的外植体浸没在步骤S2制得的发根农杆菌浸染液中，置25～30℃摇床上80～120rpm慢摇8～12min，然后置于真空冷冻干燥机中连续抽真空8～12min；

S4、将步骤S3浸染后的无菌组培苗外植体依次通过共培养、筛选培养、扩大培养得到博落回毛状根菌株。

2.根据权利要求1所述的一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法，其特征在于，

步骤S1的方法具体为：将采摘的博落回外植体进行消毒灭菌处理；然后在无菌工作台中，在博落回外植体上轻划伤口后接种到MS固体培养基上，置于25℃暗培养箱中培养；待长出愈伤，置于25℃光暗结合培养长出无菌组培苗。

3.根据权利要求2所述的一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法，其特征在于，

步骤S1还包括对获得的无菌组培苗通过继代培养或植株再生或外植体引发愈伤的手段进行扩繁。

4.根据权利要求2所述的一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法，其特征在于，

步骤S1具体包括：

所述博落回外植体包括叶片、茎段，将采摘的叶片或茎段先用75％酒精浸泡，再用0.1％升汞进行消毒处理，然后用无菌水漂洗叶片或茎段杂质，完成消毒灭菌处理；

然后在无菌工作台中，用无菌剪刀将叶片剪至5mm×5mm大小，将茎段斜切成长度0.4～0.6cm的小段，然后用无菌解剖刀在叶片或茎段上轻划2-3道伤口，最后接种到MS固体培养基上，置25℃暗培养箱中培养，待长出愈伤，置25℃，16小时光培养和8小时暗培养后长出无菌组培苗。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法，其特征在于，

步骤S2制备发根农杆菌浸染液的方法具体包括：

S201将保存的发根农杆菌ACCC10060，融化后，将菌液接种到选择培养基上培养直到菌种复苏并形成单菌落；所述选择培养基为含有45～55mg/L卡那霉素与45～55mg/L利福平的固体LB或YEB培养基；

S202将单菌落接种至含45～55mg/L卡那霉素与45～55mg/L利福平的液体LB或YEB培养基的试管中，于摇床25～30℃，160～200rpm条件下振荡培养22-23h，培养至1<OD600<1.5，得到活化菌液；

S203将活化菌液置于新鲜LB或YEB液体培养基中，于摇床25～30℃，160～200rpm条件下振荡培养6～8h，培养至0.6<OD600<0.8；然后转速4500～5500rpm离心8～12min，除去上清液，后用无菌水重悬再离心去上清，再用等体积MS液体培养基重悬至0.6<OD600<0.8，即得发根农杆菌浸染液。

6.根据权利要求1-4任意一项所述的一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法，其特征在于，

步骤S4中共培养的方法如下：

将浸染后的外植体用无菌滤纸去除其表面水分和过量发根农杆菌菌液，用灭菌的镊子夹取外植体至共培养基上，置于25℃暗培养箱中，共培养3天；所述共培养基由MS固体培养基和激素乙酰丁香酮400uL/L母液组成，pH为5.8。

7.根据权利要求6所述的一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法，其特征在于，

步骤S4中筛选培养的方法如下：

将共培养3天后的外植体转移至筛选培养基上，置25℃暗培养箱中，筛选培养，直至外植体的伤口部位出现分枝状不定根；所述筛选培养基由MS固体培养基上和2mL/L的特美汀母液组成；每15天更换新的含特美汀的固体培养基。

8.根据权利要求7所述的一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法，其特征在于，

步骤S4中扩大培养的方法如下：

筛选培养5～6周后，从外植体上分离出单根不定根至1/2MS筛选固体培养基上培养，所述1/2MS筛选固体培养基由1/2MS固体培养基和2mL/L特美汀母液组成，培养条件为：25℃，16小时光培养和8小时暗培养，每2周继代培养，即得；在此期间，逐渐降低特美汀母液的浓度，待残留在外植体表面的发根农杆菌完全被消除，则不再添加特美汀。

9.根据权利要求1所述的一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法，其特征在于，

所述方法还包括步骤S5、对步骤S4获得的毛状根菌株进行鉴定，确定发根农杆菌是否成功导入博落回外植体中；

所述方法还包括步骤S6、对步骤S5通过鉴定后的毛状根菌株的毛状根材料进行PCR检测分析。

10.权利要求1-4任意一项所述的一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法在制备血根碱或二氢血根碱或原阿片碱中的应用。