CN108949673A - 一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法 - Google Patents

一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法 Download PDF

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赵成诚
黄祥宏
李娜
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    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Abstract

本发明提供的一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法，包括以下步骤：胎鼠心脏剪成约0.5～1.5mm3大小，用0.1％～0.15％的胰酶+0.08％～0.12％Ⅱ型胶原酶重悬，在37℃培养箱中消化，自然沉淀，弃上清液；用0.1％～0.15％的胰酶+0.08％～0.12％Ⅱ型胶原酶重悬，静置，取上清液，分离的上清液，加8％～12％胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液；去未消化组织，离心，在4℃的环境的红细胞裂解液中裂解；用含8％～12％胎牛血清的DMEM重悬，置于CO2培养箱中培养，去除成纤维细胞，吸取细胞重悬液，调整细胞浓度，最后置于CO2培养箱中培养。本发明采用本方法分离出来的心肌细胞纯度高、不易变形，通过显微镜的观察，可以明显的可看出分离出来的细胞在跳动，因此采用本方法分离出来的心肌细胞的活力较强，成活率高。

Description

一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种大鼠胎心肌细胞原代分离方法。
背景技术
心肌细胞是动物生长发育、生理、代谢的重要细胞之一。为了方便研究心肌细胞的生理功能、观察细胞形态，需要排出体内各种限制因素对心肌细胞的影响，采用体外分离的方法进行培养以便观察研究。
现阶段存在一些心肌细胞分离方法，但是这些方法至少存在两个弊端，其一，由于心肌细胞位于心脏的心肌组织内，试验人员分离心肌细胞时，通常需要向离体的心脏中注射消化液，待消化完成后才收集心肌细胞，而由于分离心肌细胞时，心脏已经离体，缺乏保护、长时间的消化作用容易引起心肌细胞变形，降低心肌细胞的存活率；其二现阶段大家常采用大鼠心肌细胞直接进行原代分离，但是由于鼠龄较大，细胞活力较弱，所以分离出来的细胞纯度相对较低，同时活力也相对较差。
发明内容
本发明针对上述问题提供一种方法简单、细胞成活率高、分离纯度高的大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法。
本发明提供的一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法，包括以下步骤：
(1)将孕19～22天的胎鼠心脏剪成约0.5～1.5mm3大小的组织块，用0.1％～0.15％的胰酶+0.08％～0.12％Ⅱ型胶原酶重悬，再在36.5～37.5℃培养箱中消化4～6min，自然沉淀，弃去上清液；
(2)用0.1％～0.15％的胰酶+0.08％～0.12％Ⅱ型胶原酶重悬8～12s，静置，取上清液，重复该步骤3～5次，每次分离的上清液加8％～12％胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液；
(3)将细胞悬液去未消化组织，再以800～1200r/min离心分离8～12min，重复2～4次，之后在4℃的环境的红细胞裂解液中裂解4～6min；
(4)用含8％～12％胎牛血清的DMEM重悬后，置于CO2培养箱中培养150～200min，之后去除成纤维细胞，然后吸取细胞重悬液，调整细胞浓度为4.5～5.5x10^5细胞/ml，再将单细胞悬液接种于培养板中，最后置于CO2培养箱中培养，24h后换液，以后每天隔天换液。
作为本发明的进一步优化，步骤(1)之前将刚取出的心脏立即放入预冷的PBS中，冲洗3次。
作为本发明的进一步优化，步骤(3)中将收集的细胞悬液过180～220目孔径的不锈钢网来去未消化组织。
作为本发明的进一步优化，步骤(4)中采用差速铁壁分离技术去除成纤维细胞。
本发明提供的一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法，采用本方法分离出来的心肌细胞纯度高、不易变形，通过显微镜的观察，可以明显的可看出分离出来的细胞在跳动，因此采用本方法分离出来的心肌细胞的活力较强，成活率高。
附图说明
图1是使用本方法分离出来的心肌细胞图；
图2是成年大鼠细胞与胎鼠细胞存活率对比图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作详细说明。
使用本方法分离出来的心肌细胞图如图1所示。
在以下实施例实施之前，需做准备工作，如下：
PBS配置：在600ml的ddH2O中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4，用HCl调节溶液pH至7.4，定容至1L，滤器过滤后，高压灭菌，室温保存；
2％Ⅱ型胶原酶配置：200mgII型胶原酶+100DMEM培养基溶解，过滤备用。
准备材料：孕19～22天的清洁级SD大鼠，麻醉后处死，取出胎鼠，取出心脏，立即放入预冷的PBS中，冲洗3次；
实施例1
(1)将孕20天的胎鼠心脏剪成约1mm3大小的组织块，用0.125％的胰酶+0.1％Ⅱ型胶原酶重悬，再在37℃培养箱中消化5min，自然沉淀，弃去上清液；
(2)用0.125％的胰酶+0.1％Ⅱ型胶原酶重悬10s，静置，取上清液，重复该步骤4次，每次分离的上清液加10％胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液；
(3)将将收集的细胞悬液过200目孔径的不锈钢网来去未消化组织，再以1000r/min离心分离10min，重复3次，之后在4℃的环境的红细胞裂解液中裂解5min；
(4)用含10％胎牛血清的DMEM重悬后，置于CO2培养箱中培养180min，之后采用差速铁壁分离技术去除成纤维细胞，然后吸取细胞重悬液，调整细胞浓度为5x10^5细胞/ml，再将单细胞悬液接种于培养板中，最后置于CO2培养箱中培养，24h后换液，以后每天隔天换液。
实施例2
(1)将孕22天的胎鼠心脏剪成约0.5mm3大小的组织块，用0.15％的胰酶+0.08％Ⅱ型胶原酶重悬，再在36.5℃培养箱中消化6min，自然沉淀，弃去上清液；
(2)用0.1％的胰酶+0.12％Ⅱ型胶原酶重悬8s，静置，取上清液，重复该步骤5次，每次分离的上清液加8％胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液；
(3)将收集的细胞悬液过180目孔径的不锈钢网来去未消化组织，再以1200r/min离心分离8min，重复4次，之后在4℃的环境的红细胞裂解液中裂解4min；
(4)用含12％胎牛血清的DMEM重悬后，置于CO2培养箱中培养150min，之后去除成纤维细胞，然后吸取细胞重悬液，调整细胞浓度为5.5x10^5细胞/ml，再将单细胞悬液接种于培养板中，最后置于CO2培养箱中培养，24h后换液，以后每天隔天换液。
实施例3
(1)将孕19天的胎鼠心脏剪成约1.5mm3大小的组织块，用0.1％的胰酶+0.12％Ⅱ型胶原酶重悬，再在37.5℃培养箱中消化4min，自然沉淀，弃去上清液；
(2)用0.15％的胰酶+0.08％Ⅱ型胶原酶重悬12s，静置，取上清液，重复该步骤3次，每次分离的上清液加12％胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液；
(3)将收集的细胞悬液过220目孔径的不锈钢网来去未消化组织，再以800r/min离心分离12min，重复2次，之后在4℃的环境的红细胞裂解液中裂解6min；
(4)用含8％胎牛血清的DMEM重悬后，置于CO2培养箱中培养200min，之后去除成纤维细胞，然后吸取细胞重悬液，调整细胞浓度为4.5x10^5细胞/ml，再将单细胞悬液接种于培养板中，最后置于CO2培养箱中培养，24h后换液，以后每天隔天换液。
另外，本发明还提供一种MTT检测方法，步骤如下：
(1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180μL，每种细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔，1～5×103个细胞/孔，以100μL培养液做空白对照，37℃培养过夜；
(2)将两组细胞分别培养12h、24h、48h、72h；
(3)取出不同分组不同时间点的细胞培养板，每孔加20ul MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h；
(4)然后吸掉上清，每孔加入150ul DMSO溶解液，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
采用上述方法，对胎鼠原代心肌细胞组和成年大鼠原代心肌细胞组进行MTT检测，最后通过测量吸光值，得到如图2所示，由图2中的OD值可知，选用胎鼠细胞的存活率要远高于成年大鼠细胞的存活率。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将孕19～22天的胎鼠心脏剪成约0.5～1.5mm3大小的组织块，用0.1％～0.15％的胰酶+0.08％～0.12％Ⅱ型胶原酶重悬，再在36.5～37.5℃培养箱中消化4～6min，自然沉淀，弃去上清液；
(2)用0.1％～0.15％的胰酶+0.08％～0.12％Ⅱ型胶原酶重悬8～12s，静置，取上清液，重复该步骤3～5次，每次分离的上清液加8％～12％胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液；
(3)将细胞悬液去未消化组织，再以800～1200r/min离心分离8～12min，重复2～4次，之后在4℃的环境的红细胞裂解液中裂解4～6min；
(4)用含8％～12％胎牛血清的DMEM重悬后，置于CO2培养箱中培养150～200min，之后去除成纤维细胞，然后吸取细胞重悬液，调整细胞浓度为4.5～5.5x10^5细胞/ml，再将单细胞悬液接种于培养板中，最后置于CO2培养箱中培养，24h后换液，以后每天隔天换液。
2.根据权利要求1所述一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法，其特征在于，步骤(1)之前将刚取出的心脏立即放入预冷的PBS中，冲洗3次。
3.根据权利要求1所述一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法，其特征在于，步骤(3)中将收集的细胞悬液过180～220目孔径的不锈钢网来去未消化组织。
4.根据权利要求1所述一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法，其特征在于，步骤(4)中采用差速铁壁分离技术去除成纤维细胞。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111154715A (zh) * 2019-12-27 2020-05-15 广东博溪生物科技有限公司 心肌细胞分离培养方法
CN114921402A (zh) * 2022-06-22 2022-08-19 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种成年大、小鼠心脏成纤维细胞提取方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005007233A2 (en) * 2003-06-20 2005-01-27 Massachusetts Institute Of Technology Application of electrical stimulation for functional tissue engineering in vitro and in vivo
CN1686566A (zh) * 2005-04-12 2005-10-26 中国医学科学院阜外心血管病医院 Cark基因在制备治疗心肌肥厚药物中的应用及一种抑制心肌肥厚的药物
US20080160553A1 (en) * 2000-06-28 2008-07-03 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method of preparing heart muscle cells and method of searching for remedy for heart diseases
CN104087550A (zh) * 2014-07-10 2014-10-08 上海益诺思生物技术有限公司 一种大鼠心肌细胞的培养方法
CN104830759A (zh) * 2015-05-05 2015-08-12 中国人民解放军第四军医大学 一种大鼠心肌细胞的分离培养方法
CN105238738A (zh) * 2015-09-30 2016-01-13 四川农业大学 一种仔猪心肌成纤维细胞的分离培养方法
CN105385652A (zh) * 2015-12-24 2016-03-09 中南民族大学 一种高纯度心肌细胞原代培养方法
CN105505863A (zh) * 2016-01-05 2016-04-20 中国人民解放军第二军医大学 一种裸鼹鼠心肌细胞的培养方法
CN105907708A (zh) * 2016-04-08 2016-08-31 王晓冰 一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法
CN107841485A (zh) * 2016-09-20 2018-03-27 新乡医学院 一种心肌环的培养方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080160553A1 (en) * 2000-06-28 2008-07-03 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method of preparing heart muscle cells and method of searching for remedy for heart diseases
WO2005007233A2 (en) * 2003-06-20 2005-01-27 Massachusetts Institute Of Technology Application of electrical stimulation for functional tissue engineering in vitro and in vivo
CN1686566A (zh) * 2005-04-12 2005-10-26 中国医学科学院阜外心血管病医院 Cark基因在制备治疗心肌肥厚药物中的应用及一种抑制心肌肥厚的药物
CN104087550A (zh) * 2014-07-10 2014-10-08 上海益诺思生物技术有限公司 一种大鼠心肌细胞的培养方法
CN104830759A (zh) * 2015-05-05 2015-08-12 中国人民解放军第四军医大学 一种大鼠心肌细胞的分离培养方法
CN105238738A (zh) * 2015-09-30 2016-01-13 四川农业大学 一种仔猪心肌成纤维细胞的分离培养方法
CN105385652A (zh) * 2015-12-24 2016-03-09 中南民族大学 一种高纯度心肌细胞原代培养方法
CN105505863A (zh) * 2016-01-05 2016-04-20 中国人民解放军第二军医大学 一种裸鼹鼠心肌细胞的培养方法
CN105907708A (zh) * 2016-04-08 2016-08-31 王晓冰 一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法
CN107841485A (zh) * 2016-09-20 2018-03-27 新乡医学院 一种心肌环的培养方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙凤杰，佟德民，卢小炎等: "体外培养胎鼠心肌细胞方法的优化", 《细胞与分子免疫学杂志》 *
孟云辉，李永新，于慧卿等: "新生SD大鼠心肌细胞的原代培养", 《中西医结合心脑血管病杂志》 *
庞勇军，孙莉，谢文娟等: "新生大鼠心肌细胞分离、纯化及培养方法的改进", 《上海交通大学学报(医学版)》 *
张玲，段明军，魏琴等: "C57胎鼠、乳鼠及成年小鼠心室肌细胞分离、培养及鉴定", 《中国组织工程研究与临床康复》 *
张玲，郭玉君，段明军等: "昆明小鼠胎鼠心室肌细胞的原代培养", 《新疆医科大学学报》 *
汪燕等: "新生大鼠心肌细胞体外原代培养及鉴定", 《今日药学》 *
王佳南，张晓刚，汤为学等: "新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良", 《重庆医科大学学报》 *
王新陆，崔琳，王幼平等: "提高新生大鼠原代心肌细胞纯度方法的探讨", 《世界科学技术—中医药现代化》 *
王硕，马淑梅，杨智勇等: "大鼠乳鼠心房肌细胞的分离和培养", 《中国心脏起搏与心电生理杂志》 *
马芳芳等: "新生大鼠心肌细胞的原代培养", 《心血管康复医学杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111154715A (zh) * 2019-12-27 2020-05-15 广东博溪生物科技有限公司 心肌细胞分离培养方法
CN114921402A (zh) * 2022-06-22 2022-08-19 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种成年大、小鼠心脏成纤维细胞提取方法

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