CN102732482A

CN102732482A - 骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法

Info

Publication number: CN102732482A
Application number: CN2012101481160A
Authority: CN
Inventors: 张志仁; 杨琴; 杨晓风; 姜曼; 吴玉章
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2012-05-14
Filing date: 2012-05-14
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2032-05-14
Also published as: CN102732482B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及细胞的培养方法，骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法，具体为将骨髓来源单细胞悬液在体外用含M-CSF的PRMI1640完全培养基培养，在加入培养基培养前，还包括骨髓来源单细胞悬液的预处理步骤，具体为：将所述骨髓来源单细胞悬液用滤孔为40～75μm的滤器过滤，取过滤液进行培养；本实施例中培养的巨噬细胞分化成熟所需的时间与原来相比缩短了1～2天；在细胞悬液的处理中，经过滤的细胞与未过滤的细胞相比，骨髓来源祖细胞的纯度提高；未过滤的骨髓来源祖细胞的纯度仅约为17％～20％，经过滤后，骨髓来源祖细胞的纯度提升到30％-40％。

Description

骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及细胞的培养方法。

背景技术

巨噬细胞广泛分布于全身各器官、组织，在保持内环境稳定、机体防御、炎症调控、促进组织损伤修复方面起着重要作用。巨噬细胞在不同微环境下具有不同的表型，使巨噬细胞处于不同的功能状态。这些功能状态迥异的巨噬细胞在不同生理及病理条件下发挥不同的生理功能；与肿瘤、代谢综合症、糖尿病等严重疾病的发生、发展都有密切的联系。

静息巨噬细胞在不同刺激条件下可激活分化为表型和功能迥异的两大类型：M1型和M2型。M1型巨噬细胞主要引起Th1型免疫反应，起着细菌感染防御的作用；加重炎症反应导致组织损伤。M2型巨噬细胞则主要诱导Th2型免疫反应，在防御寄生虫感染，促进组织修复和调节免疫反应方面起着重要作用。

骨髓来源的巨噬细胞具有静息巨噬细胞的特点：即同源性好，通过不同的刺激条件可分别诱导分化为M1型(经典激活型)和M2(选择激活型)。另外，骨髓来源的巨噬细胞还具有产量高，易转染，生长周期长等优点；其他巨噬细胞的体外培养方法，如从血液、腹腔、组织中分离提取获得的巨噬细胞在体外培养。这种获得巨噬细胞的方法虽简单方便，得到的巨噬细胞往往均一性较差，产量低、存活时间短。特别是针对一些较难获得的珍贵血液或组织标本，骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种巨噬细胞的体外诱导培养方法，该培养方法稳定性佳，能提高外诱导培养的骨髓来源的巨噬细胞的纯度。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法，具体为将骨髓来源单个核细胞悬液在体外用培养基培养，在加入培养基培养前，还包括骨髓来源单个核细胞悬液的预处理步骤，具体为：将所述骨髓来源单个核细胞悬液用滤孔为40～75μm的滤器过滤，取过滤液进行培养。

进一步，所述培养基为含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基。

进一步，将所述骨髓来源单个核细胞悬液用滤孔为40～75μm的滤器过滤，将过滤液在1000～1500rmp/min条件下离心不多于10分钟，去上清液，用含M-CSF的PRMI1640完全培养基重悬细胞制备单个核细胞悬液。

进一步，含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基中含M-CSF的浓度为20ng/ml。

所述的骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法的优选方案具体包括以下步骤：

A骨髓来源的细胞混合液的制备

用注射器吸取PBS缓冲液插入离体动物股骨两端的软骨处冲出股骨内的骨髓，收集骨髓来源的细胞混合液；

B单个核细胞悬液的制备

将步骤A所得的收集骨髓来源的细胞混合液混悬，得骨髓来源的单个核细胞悬液，用滤孔为70μm的滤器过滤，将过滤液在1500rmp/min条件下离心10分钟，去上清液，用含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基重悬细胞，制备细胞重悬液；

C第一阶段细胞培养

将步骤B所得细胞重悬液调节调节成浓度为1-2×10⁶个/mL，置于培养箱中37℃、5％孵育24～30小时后，吸弃上清，另加入所述含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基，再培养48小时；

D第二阶段培养

在第一阶段细胞培养完成后，不超过24小时对培养的细胞进行换液，另培养3-4日，得分化成熟的巨噬细胞。

本发明的有益效果在于：在骨髓来源的细胞混合液的制备过程中，不破坏股骨，在保持两端完整的情况下利用压力将单核细胞冲出股骨，然而阻止大量红细胞和骨髓组织混入单细胞悬液。直接剪开股骨两端将骨髓冲出，骨髓组织及凝结的红细胞也都会随之冲出，去除的股骨也含有大量细胞，此方法势必会影响骨髓来源单个核细胞的分离和数量。然而，在保持两端完整的情况下冲洗股骨，大大提高了单核细胞的纯度和数量，降低红细胞的数量，保证了单个核细胞悬液的质量。提高单核细胞的纯度、降低红细胞的数量会大大利于骨髓来源的巨噬细胞的诱导分化。在骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导分化培养过程中，红细胞虽然会逐渐死亡，但是红细胞的多少会大大影响巨噬细胞巨噬细胞的理化环境进而影响骨髓来源的巨噬细胞的分化成熟过程。从本实施例中发现，与剪开股骨两端的情况相比，在保持两端完整的情况下分离提取骨髓来源的单个核细胞后在体外诱导分化的骨髓来源的巨噬细胞的纯度得到了大大提升。从本实施例中实际的培养结果发现，在保持两端完整的情况下分离提取的骨髓来源的单个核细胞在第一阶段的培养过程中，贴附在细胞培养板的巨噬细胞前体细胞数目大大增加，分化成熟所需的时间也缩短了。本实施例中培养的巨噬细胞分化成熟所需的时间与原来相比缩短了1～2天。在细胞悬液的处理中，经过滤的细胞与未过滤的细胞相比，骨髓来源祖细胞的纯度提高；未过滤的骨髓来源祖细胞的纯度仅约为17％，经过滤后，骨髓来源祖细胞的纯度提升到30％-40％。混入组织杂细胞污染的几率也大大降低。未进行过滤处理的细胞悬液常常遭遇组织杂细胞的污染，组织杂细胞的长势会盖过巨噬细胞，从而使巨噬细胞不能分化成熟甚至死亡。进行过滤处理后的细胞悬液从未遭遇组织杂细胞的污染。

附图说明

图1为分化前的细胞照片。

图2为分化成熟的巨噬细胞照片。

图3为采用一次性细胞过滤器后得到的单个核细胞的纯度检测。

图4为未采用一次性细胞过滤器的单个核细胞的纯度检测。

图5为分化成熟的骨髓来源的巨噬细胞纯度检测图，其中，A为空白对照，B为FITC-F4/80单标，C为APC-CD11b单标，D为FITC-F4/80、APC-CD11b双标。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件进行或配置，未注明来源的产品均可通过市场途径获得。

PBS缓冲液：质量分数为0.05％吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS缓冲液)；配制方法为：称取磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)，氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)，吐温-20，加水。PBS缓冲液1L配方pH7.4：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。高温高压灭菌后室温保存。本实施例中采用的PBS缓冲液来自Hyclone SH30031.02AVJ79106。M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)来自RD M-CSF Recombinant mouse M-CSF416-ML-010/CF ME1811071。PRMI1640培养基来自GIBCO C11875500BT。

实施例1 骨髓来源的细胞混合液的制备

取6～8周大小鼠，脱颈致死，浸入体积为70％酒精中。运用镊子夹起腹部上皮，用剪刀在小鼠腹部下方横着剪开一个小口，分别夹住开口两端向不同方向分开，暴露出小鼠腿部，用手拔出小鼠股骨和胫骨，使小鼠股骨与小鼠身体及胫骨从关节处分离，保持两端完整。采用酒精浸润的纱布去除股骨两端关节连接处残留的组织及软骨。

将取出的股骨在体积浓度为70％酒精中漂洗2～3次，再在PBS缓冲液中漂洗；提前准备5～10ml的PBS在离心管内，用1mL的注射器吸取离心管内的PBS缓冲液插入股骨的两端的软骨处，迅速冲出骨髓，重复2～3次，直到股骨变白，得骨髓来源的细胞混合液。

此方法的优势在于：不破坏股骨，在保持两端完整的情况下利用压力将单核细胞冲出股骨，然而阻止大量红细胞和骨髓组织混入单细胞悬液。与以往的方法相比，在保持两端完整的情况下冲洗股骨，大大提高了单核细胞的纯度和数量，降低红细胞的数量，保证了单个核细胞悬液的质量。提高单核细胞的纯度、降低红细胞的数量会大大利于骨髓来源的巨噬细胞的诱导分化。在骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导分化培养过程中，红细胞虽然会逐渐死亡，但是红细胞的多少会大大影响巨噬细胞巨噬细胞的理化环境进而影响骨髓来源的巨噬细胞的分化成熟过程。从本实施例中发现，与剪开股骨两端的情况相比，在保持两端完整的情况下分离提取骨髓来源的细胞后在体外诱导分化的骨髓来源的巨噬细胞的纯度得到了大大提升。采用的方法分离提取的骨髓来源的细胞在体外诱导分化的骨髓来源巨噬细胞纯度达到了90-95％以上，分化前的细胞如图1所示，分化成熟的细胞如图2所示；从图2中可知，F4/80阳性率为90.8％，CD11b阳性率为98.2％；分化成熟的骨髓来源巨噬细胞F4/80、CD11b双阳性率达到了90.6％。本实施例子中采用的方法分离提取的骨髓来源的细胞在体外诱导分化的骨髓来源巨噬细胞纯度达到了90.6％以上。与其他方法相比，纯度得到了大大提升。其中，图3，图4和图5中涉及纯度检测的试验方法参见www.Biolegend.com Cell Surface Immunofluorescence Staining Protocol。

Joachim Weischenfeldt and Bo Porse在实验方法中采用剪刀剔除股骨及两端残留的组织及软骨，且用剪刀直接打开股骨的两端释放骨髓。这个方法的缺点在于股骨上及两端残留的组织不易清除干净而且在清除时极易损伤股骨导致骨髓污染；用剪刀直接打开股骨两端不仅大大增加股骨的污染几率，而且股骨中大块的骨髓组织也会被冲洗出来，这样不利于后续的单个核细胞悬液的制备。

实施例2 细胞悬液的处理

将所述骨髓来源的细胞混合液轻轻用移液器吹打几次制备单个核细胞悬液。吸取细胞悬液经过75μm滤器(经多次试验证明，40μm滤器也可实现)，转入10ml的离心管中，1000～1500rmp/min离心不多于10min。去上清，用含有M-CSF(20ng/ml)的PRMI1640完全培养基轻轻吹打重悬细胞悬液制备单个核细胞悬液。“Ishii M，Wen HT，Corsa CAS，Liu TJ，Coelho AL，Allen RM，et al.Epigenetic regulation of the alternatively activated macrophage phenotype.Blood.2009；114(15)：3244-54”一文中采用的骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法没有这一步；增加了这一步会大大提高骨髓来源祖细胞的纯度，更重要的也减少其他杂细胞污染的机会；如前面所述的操作步骤中股骨及两端残留的组织细胞的污染。本发明中采用了一次性的70μm的过滤器过滤制备好的单核细胞悬液，过滤器会过滤掉骨髓组织和混入的大块组织以及凝集的红细胞。经过滤的细胞与未过滤的细胞相比，骨髓来源祖细胞的纯度提高，混入组织杂细胞污染的几率也大大降低。

实施例3 骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养

对经实施例2过滤处理后的骨髓来源细胞进行细胞计数，确定细胞浓度，稀释细胞悬液并调节细胞浓度至1～2×10⁶个/ml。铺板，将1×10⁶个/ml的细胞悬液接种到6空培养板中，3ml/每孔。放在细胞培养箱中37℃、5％孵育30小时后，吸弃上清，并加入新的含M-CSF(20ng/ml)的PRMI1640完全培养基。吸弃上清的步骤非常关键，此步骤的意义在于纯化巨噬细胞祖细胞，提高诱导分化的巨噬细胞的纯度。未经吸弃上清这个关键步骤而直接将获得的单个细胞悬液在体外诱导培养，部分死细胞或则非巨噬细胞祖细胞没有得到及时清除会影响最后的骨髓来源的巨噬细胞的纯度，在第一阶段培养结束时，大部分细胞贴壁，细胞形态呈梭形、棒状，培养过程中细胞不断增殖和分化，细胞数目不断增加，细胞慢慢由梭形向椭圆形转变。这时更换新的M-CSF(20ng/ml)的PRMI 1640完全培养基，从第4天开始，每隔一天替换一次新的M-CSF(20ng/ml)的1640PRMI完全培养基。一定要及时更换培养基，因为此时细胞大量增殖、分化，对M-CSF的需求量大。在第七天的时候，细胞逐渐变大，形态从梭形变为椭圆形，此时，骨髓来源的细胞已经分化成成熟的巨噬细胞。

本实施例中培养的巨噬细胞分化成熟所需的时间与原来相比缩短了1～2天。在细胞悬液的处理中，经过滤的细胞与未过滤的细胞相比，骨髓来源祖细胞的纯度提高；未过滤的骨髓来源祖细胞的纯度最低仅约为17％；如图4所示，未过滤的骨髓来源祖细胞的纯度最低仅约为19.8％。经过滤后，骨髓来源祖细胞的纯度提升到30％-40％；如图3所示骨髓来源祖细胞的纯度提升到33.3％。混入组织杂细胞污染的几率也大大降低。未进行过滤处理的细胞悬液常常遭遇组织杂细胞的污染，组织杂细胞的长势会盖过巨噬细胞，从而使巨噬细胞不能分化成熟甚至死亡。进行过滤处理后的细胞悬液从未遭遇组织杂细胞的污染。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法，其为将骨髓来源单个核细胞悬液在体外用培养基培养，其特征在于：在加入培养基培养前，还包括骨髓来源单个核细胞悬液的预处理步骤，具体为：将所述骨髓来源单个核细胞悬液用滤孔为40～75μm的滤器过滤，取过滤液进行培养。

2.根据权利要求1所述的骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法，其特征在于：所述培养基为含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基。

3.根据权利要求2所述的骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法，其特征在于：将所述骨髓来源单个核细胞悬液用滤孔为40～75μm的滤器过滤，将过滤液在1000～1500rmp/min条件下离心不多于10分钟，去上清液，用含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基重悬细胞制备单个核细胞悬液。

4.根据权利要求2所述的骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法，其特征在于，含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基中含巨噬细胞集落刺激因子的浓度为20ng/ml。

5.根据权利要求4所述的骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法，具体包括以下步骤：

A骨髓来源的细胞混合液的制备

B单个核细胞悬液的制备

将步骤A所得的收集骨髓来源的细胞混合液混悬，得骨髓来源的单个核细胞悬液，用滤孔为40～70μm的滤器过滤，将过滤液在1000～1500rmp/min条件下离心5～10分钟，去上清液，用含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基重悬细胞，制备细胞重悬液；

C第一阶段细胞培养

D第二阶段培养

在第一阶段细胞培养完成后，不超过24小时对培养的细胞进行换液，另培养3～4日，得分化成熟的巨噬细胞。