CN105132287A - 一种体外培养碘泡虫的方法 - Google Patents

Abstract

一种体外培养碘泡虫的方法，属于寄生虫体外培养技术领域，分别采用鲫鱼肌肉匀浆和鲫鱼鳃匀浆作为培养载体进行碘泡虫体外培养，包括以下步骤，步骤一、抗生素的配置，步骤二、鲫鱼鳃组织匀浆上清培养液的配置，步骤三、碘泡虫的体外培养，步骤四、计数及绘制生长曲线。本发明对碘泡虫的培养条件进行优化，使碘泡虫在寄主之外的一个适宜环境中得以繁殖，为之后的药效学或疫苗的研究提供大量的基础材料，并促进碘泡虫引发的疾病或粘孢子虫病的进一步研究。

Description

一种体外培养碘泡虫的方法

技术领域

本发明属于寄生虫体外培养技术领域，特别是涉及到一种碘泡虫实验室培养方法的建立和培养条件的优化。

背景技术

随着水产养殖品种结构调整的升级和名特优新品种的不断引进,渔民获得了较为丰厚的经济效益,但与此同时,来自五湖四海的鱼类新品种也带来了诸多疾病,其中粘孢子虫病尤为突出,其危害程度十分严重,如果防治不及时,常常引起鱼类大批死亡,造成经济损失。粘孢子虫是鱼类专有的寄生虫,淡水鱼类、海产鱼类均有粘抱子虫寄生。

国内外文献中已记载的种类,大约1020种以上,由于大量寄生引起鱼类发生严重的粘孢子虫病。例如，国外流行鲑、鳟鱼的打转病(whirLingdisease),病原体是脑粘体虫(MyxosomacerebraLis),北美、欧洲、亚洲等地广泛流行此病,使鲑、鳟饲养业遭受极大损失；白鲢疯狂病是杭州地区白链的极其严重的粘孢子虫病,病原体是鲢碘泡虫(MyxoboLusdriagini)；广东鲮鱼的埋坎病,病原体是野鲤碘泡虫(MyxoboLusKoi)；广东草鱼的饼形碘泡虫病,病原体是饼形碘泡虫(MyxoboLusartus)；四川鲤鱼的碘泡虫病,病原体是宜宾碘泡虫(新种)(MyxoboLusyibinenesissp.nov.),使鲤鱼苗种大批死亡；四川重庆白鲢粘体虫病,病原体是变异粘体虫(MyxoboLusvaria)；东北哈尔滨地区白链胆囊四极虫病,由于胆汁外溢,白鲢大批死亡。此外，近年来国家现代农业产业技术体系推广的新品种异育银鲫“中科3号”发生的单极虫病、喉孢虫病的危害也是极其严重。

这些突出的例子,构成了中国特点的粘孢子虫病。到目前为止,由于没有有效的防治药物,故还未找到有效的控制方法，已给渔业生产带来了巨大损失。因为孢子虫的生理特性和其它寄生虫不一样,其外层有寄主结缔组织形成的胞囊,虫体在胞囊里面,一般药物很难穿透胞囊,即使穿透,药物也很难达到有效杀灭的浓度而使虫体死亡,大多数情况下只能杀灭一部分虫体,大部分虫体处于休眠状态,待药物失效后,孢子虫又恢复生机,病情又重复发作,很难彻底治愈。

我国生物种类繁多，高等动物的研究早已展开，但对于粘孢子虫学的研究则起步较晚。20世纪中期以来，谢杏人、陈启鎏、马成伦、李连祥等学者开始对我国粘孢子虫学进行研究，并在粘孢子虫分类学、生态学、病原学、免疫学等领域取得了长足的进步，《中国动物志粘体动物门粘孢子纲》等专著的出版是其中重要的成果。近些年来，国内对粘孢子虫系统学的研究已经开展，并取得了一定的成果，但多集中在形态分类及新种鉴定,而对其体外培养报道甚少。粘孢子虫所引起的疾病是养殖鱼类的主要寄生虫病,该病的流行和蔓延常常造成鱼类大量死亡。研究粘孢子虫的体外培养无论对查明粘孢子虫的生活史,还是对粘孢子虫所引发的相关疾病的防治,都具有十分重要的意义。因此现有技术当中亟需要一种新型的技术方案来解决这一问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种体外培养碘泡虫的方法，对其培养条件进行优化，使碘泡虫在寄主之外的一个适宜环境中得以繁殖，为之后的药效学或疫苗的研究提供大量的基础材料，并促进碘泡虫引发的疾病或粘孢子虫病的进一步研究。

一种体外培养碘泡虫的方法，其特征是：采用鲫鱼肌肉匀浆为培养载体进行碘泡虫体外培养的方法，包括以下步骤，

步骤一、抗生素的配置

在无菌操作台上，取青霉素钠0.96g和硫酸链霉素1g溶解于100mL的经过消毒处理的去离子水中混合，采用移液管移取上述溶液8mL置于经消毒处理的玻璃瓶内，且分装为12个玻璃瓶内，采用封口膜将12个玻璃瓶封口，置于-20℃的冰箱内保存备用；

步骤二、鲫鱼肌肉组织匀浆上清培养液的配置

取鲫鱼肌肉组织5g，加入500mL过滤水，采用匀浆机将匀浆打碎后离心10min，取离心后上清液加入5mL抗生素保存备用；将1mL鲫鱼肌肉组织匀浆上清液加入到经0.22μm滤膜过滤的250mL水中，作为试验培养液母液；

步骤三、碘泡虫的体外培养

(1)从体内含有碘泡虫的鱼中取出孢囊，用1.5mL的离心管将孢囊收集，采用试验培养液母液进行冲洗离心至获得孢子；

(2)将孢子置于50mL细胞培养瓶中，向细胞培养瓶中加入1mL试验培养液母液、4mLDMEM细胞培养液、50μL抗生素；

(3)取六孔培养板，向六孔培养板的每个孔中加入100μL的上述培养瓶中取出的碘孢子虫，400μL肌肉组织匀浆上清培养液，1500μLDMEM细胞培养液，400μL的胎牛血清，在26℃的温度条件下连续培养；

步骤四、计数及绘制生长曲线

在所述步骤三的连续培养过程中，每间隔72小时，进行一次计数，计数时将六孔培养板中所培养的碘泡虫混匀，并从每一培养孔中分别吸取10μL的碘泡虫，并用细胞计数板进行计数，根据记录的数据绘制生长曲线。

一种体外培养碘泡虫的方法，其特征是：采用鲫鱼鳃匀浆为培养载体进行碘泡虫体外培养的方法，包括以下步骤，

步骤一、抗生素的配置

在无菌操作台上，取青霉素钠0.96g和硫酸链霉素1g溶解于100mL的经过消毒处理的去离子水中混合，采用移液管移取上述溶液8mL置于经消毒处理的玻璃瓶内，且分装为12个玻璃瓶内，采用封口膜将12个玻璃瓶封口，置于-20℃的冰箱内保存备用；

步骤二、鲫鱼鳃组织匀浆上清培养液的配置

取鲫鱼鳃组织5g，加入500mL过滤水，采用匀浆机将匀浆打碎后离心10min，取离心后上清液加入5mL抗生素保存备用；将1mL鲫鱼鳃组织匀浆上清液加入到经0.22μm滤膜过滤的250mL水中，作为试验培养液母液；

步骤三、碘泡虫的体外培养

(1)从体内含有碘泡虫的鱼中取出孢囊，用1.5mL的离心管将孢囊收集，采用试验培养液母液进行冲洗离心至获得孢子；

(2)将孢子置于50mL细胞培养瓶中，向细胞培养瓶中加入1mL试验培养液母液、4mLDMEM细胞培养液、50μL抗生素；

(3)取六孔培养板，向六孔培养板的每个孔中加入100μL的上述培养瓶中取出的碘孢子虫，400μL肌肉组织匀浆上清培养液，1500μLDMEM细胞培养液，400μL的胎牛血清，在26℃的温度条件下连续培养；

步骤四、计数及绘制生长曲线

在所述步骤三的连续培养过程中，每间隔72小时，进行一次计数，计数时将六孔培养板中所培养的碘泡虫混匀，并从每一培养孔中分别吸取10μL的碘泡虫，并用细胞计数板进行计数，根据记录的数据绘制生长曲线。

所述步骤三中每孔培养板接种鱼类碘孢子虫密度为20ind/mL。

所述步骤三中胎牛血清的浓度为20％。

通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：一种体外培养碘泡虫的方法，对其培养条件进行优化，使碘泡虫在寄主之外的一个适宜环境中得以繁殖，为之后的药效学或疫苗的研究提供大量的基础材料，并促进碘泡虫引发的疾病或粘孢子虫病的进一步研究。

本发明将寄生于鱼体的寄生虫，移到了体外进行培养，可以使碘泡虫方面的研究不再受季节性的限制，而且在适宜的条件下可以对碘泡虫进行长期的培养和保存。

本发明用于培养碘泡虫的培养载体选择的是鲫鱼的肌肉匀浆液和鳃匀浆液，与以细胞为培养载体相比，更加方便，易获得，而且同样可以达到碘泡虫生长的适宜条件。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：

图1为本发明在鲫鱼肌肉匀浆培养基中碘泡虫生长曲线示意图。

图2为本发明在鲫鱼鳃匀浆培养基中碘泡虫生长曲线示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但实施例不限制本发明，且发明中未述及之处适用于现有技术。

1、试剂和材料

材料：病鱼(孢囊)，手术剪镊，平皿，无菌载玻片、盖玻片，75％酒精，加液枪，1.5mL、50mL离心管，封口膜，培养瓶，6孔培养板，1mL、5mL移液枪，废液缸，酒精棉球，酒精灯，记号笔，烧杯，锥形瓶，蒸馏水，0.22μm滤膜，PCR小管，计数板，计数器。

试剂：培养液M199、L-15、DMEM，胎牛血清，抗生素，培养液母液。

抗生素：将一瓶青霉素钠(0.96g)和一瓶硫酸链霉素(1g)完全溶解放入100mL经高压消毒处理过的去离子水中，混匀，用移液管移取8mL放入高压处理过的小玻璃瓶中，共分装成12瓶，用封口膜将小玻璃瓶封口，放入-20℃冰箱中保存备用。本操作必须在无菌操作台中进行。

培养液母液：取新鲜鲫鱼肌肉组织5g，加入500mL过滤水，使用匀浆机打碎匀浆，离心10min，取上清液加入5mL抗生素保存备用。将1mL鱼肌肉组织匀浆上清液加入到经0.22μm滤膜过滤的250mL水中，配成4％的鱼肌肉组织匀浆上清培养液作为试验培养液母液。

2、仪器和设备

光学显微镜(Nikon，D80i)，离心机(1.5mL)，4℃离心机(50mL)，匀浆机，超净台，恒温培养箱(生化培养箱)。

以下，结合实施例以及附图详细说明本发明的试验方法。

实施例1、以鲫鱼肌肉匀浆为培养载体的一种碘泡虫体外培养的最佳条件的筛选。

包括以下试验步骤

(a)从病鱼中取出孢囊，用1.5mL的离心管将孢囊收集起来，用试验培养液母液反复冲洗离心，得到纯净的孢子。

(b)将纯净的孢子装到50mL细胞培养瓶中，向细胞培养瓶中加入1mL试验培养液母液、4mL培养液(M199、L-15、DMEM)、50μL抗生素。

(c)向6孔培养板的每个孔中加入100μL的粘孢子虫(从培养瓶中取出，每孔接种鱼类粘孢子虫密度为20ind/mL)，400μL肌肉组织匀浆上清培养液，1500μL培养液(M199、L-15、DMEM)，400μL的胎牛血清，在26℃温度下连续培养。

(d)每隔72小时进行一次计数，共计数6次(第一次为基础数据)，计数时将六孔培养板中所培养的碘泡虫混匀，并从每一培养孔中分别吸取10μL的碘泡虫，用细胞计数板进行计数。具体计数方法如下：

(1)计数板的处理：用无水乙醇或95％乙醇冲洗计数板后，用干净的绸布擦净，同时擦净计数板特制盖玻片，把盖玻片覆在计数板上面。

(2)加碘泡虫的悬液：用无菌移液枪吸取一滴(10μL)的碘泡虫悬液(碘泡虫悬液也可先进行稀释，在最后计算时应乘以稀释倍数)，从计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板和盖玻片之间的空隙，不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡，否则要重做。

(3)计数：碘泡虫悬液加入到计数池后稍等片刻，将计数板放在低倍镜下(10×10倍)观察计数。计数板有四个大方格(每个大方格又分16个小方格)。计数时，只计数完整的碘泡虫，若聚成团的碘泡虫则按一个碘泡虫进行计数，在一个大方格中，如果有碘泡虫位于线上，一般计上线的碘泡虫就不计下线的碘泡虫，计左线碘泡虫就不计右线的碘泡虫。

(4)计数后的换算：计完数后，需换算出每毫升碘泡虫悬液中的碘泡虫数。由于计数板中每一大方格的面积为0.01cm²，高为0.01cm，这样它的体积为0.0001cm³，即0.1mm³，由于1ml＝1000mm³，所以每一大方格内碘泡虫数×10000＝每毫升的碘泡虫悬液中所含有的碘泡虫数。所用到的计算公式：碘泡虫悬液中碘泡虫数/ml＝四个大格中碘泡虫数/4×10000。如果计数前已稀释，可再乘以稀释倍数。

试验结果如下：

培养条件为鲫鱼的肌肉匀浆、M199培养液、胎牛血清、抗生素1％、温度26℃，其中对血清浓度设置了4个梯度，即为5％、10％、15％、20％，每隔72小时进行一次计数，共计数6次(第一次为基础数据)，碘泡虫在此培养条件下，血清浓度为20％时虫体个数有显著的增长趋势，其它浓度下所培养的碘泡虫虽然其虫体个数有浮动，但是整体并没有明显在增长趋势。从而得出，在此培养条件中，血清浓度为20％是培养碘泡虫的最佳条件。

培养条件为鲫鱼的肌肉匀浆、L-15培养液、胎牛血清、抗生素1％、温度26℃，其中对血清浓度设置了4个梯度，即为5％、10％、15％、20％，每隔72小时进行一次计数，共计数6次(第一次为基础数据)，碘泡虫在此培养条件下，血清浓度15％在前12天虫体个数有明显增长趋势，但是随后并没有继续增长；其它三个浓度整体上在波动式增长，但并不显著。从而得出，此条件不是培养碘泡虫的最佳条件。

如图1所示，培养条件为鲫鱼的肌肉匀浆、DMEM培养液、胎牛血清、抗生素1％、温度26℃，其中对血清浓度设置了4个梯度，即为5％、10％、15％、20％，每隔72小时进行一次计数，共计数6次(第一次为基础数据)，碘泡虫在此培养条件下，血清浓度为20％时虫体个数有显著的增长趋势，其它浓度下所培养的碘泡虫虽然其虫体个数有浮动，但是整体并没有明显在增长趋势。从而得出，在此培养条件中，血清浓度为20％是培养碘泡虫的最佳条件。

实施例2、以鲫鱼鳃匀浆为培养载体的一种碘泡虫体外培养的最佳条件的筛选。

包括以下试验步骤

(a)从病鱼中取出孢囊，用1.5mL的离心管将孢囊收集起来，用试验培养液母液反复冲洗离心，得到纯净的孢子。

(b)将纯净的孢子装到50mL细胞培养瓶中，向细胞培养瓶中加入1mL试验培养液母液、4mL培养液(M199、L-15、DMEM)、50μL抗生素。

(c)向6孔培养板的每个孔中加入100μL的粘孢子虫(从培养瓶中取出，每孔接种鱼类粘孢子虫密度为20ind/mL)，400μL肌肉鳃匀浆上清培养液，1500μL培养液(M199、L-15、DMEM)，400μL的胎牛血清，在26℃温度下连续培养。

(d)每隔72小时进行一次计数，共计数6次(第一次为基础数据)，计数时将六孔培养板中所培养的碘泡虫混匀，并从每一培养孔中分别吸取10μL的碘泡虫，用细胞计数板进行计数。具体计数方法如下：

(1)计数板的处理：用无水乙醇或95％乙醇冲洗计数板后，用干净的绸布擦净，同时擦净计数板特制盖玻片，把盖玻片覆在计数板上面。

(2)加碘泡虫的悬液：用无菌移液枪吸取一滴(10μL)的碘泡虫悬液(碘泡虫悬液也可先进行稀释，在最后计算时应乘以稀释倍数)，从计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板和盖玻片之间的空隙，不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡，否则要重做。

(3)计数：碘泡虫悬液加入到计数池后稍等片刻，将计数板放在低倍镜下(10×10倍)观察计数。计数板有四个大方格(每个大方格又分16个小方格)。计数时，只计数完整的碘泡虫，若聚成团的碘泡虫则按一个碘泡虫进行计数，在一个大方格中，如果有碘泡虫位于线上，一般计上线的碘泡虫就不计下线的碘泡虫，计左线碘泡虫就不计右线的碘泡虫。

(4)计数后的换算：计完数后，需换算出每毫升碘泡虫悬液中的碘泡虫数。由于计数板中每一大方格的面积为0.01cm²，高为0.01cm，这样它的体积为0.0001cm³，即0.1mm³，由于1ml＝1000mm³，所以每一大方格内碘泡虫数×10000＝每毫升的碘泡虫悬液中所含有的碘泡虫数。所用到的计算公式：碘泡虫悬液中碘泡虫数/ml＝四个大格中碘泡虫数/4×10000。如果计数前已稀释，可再乘以稀释倍数。

试验结果如下：

培养条件为鲫鱼鳃匀浆、M199培养液、胎牛血清、抗生素1％、温度26℃，其中对血清浓度设置了4个梯度，即为5％、10％、15％、20％，每隔72小时进行一次计数，共计数6次(第一次为基础数据)，碘泡虫在此培养条件下，基本上没有明显的增长趋势，除了血清浓度为20％这一组在第12天至第15天，虫体个数有增长的趋势外，但是这一组从整体来看碘泡虫数的变化并不是呈递增的趋势。从而得出，此条件不是培养碘泡虫的最佳条件。

培养条件为鲫鱼鳃匀浆、L-15培养液、胎牛血清、抗生素1％、温度26℃，其中对血清浓度设置了4个梯度，即为5％、10％、15％、20％，每隔72小时进行一次计数，共计数6次(第一次为基础数据)，碘泡虫在此培养条件下，虫体个数均无明显的增长，只是波动式的变化。从而得出，此条件不是培养碘泡虫的最佳条件。

如图2所示，培养条件为鲫鱼鳃匀浆、DMEM培养液、胎牛血清、抗生素1％、温度26℃，其中对血清浓度设置了4个梯度，即为5％、10％、15％、20％，每隔72小时进行一次计数，共计数6次(第一次为基础数据)，碘泡虫在此培养条件下，四个血清浓度组中碘泡虫的个数均有增长，血清浓度为5％、10％、15％这三组碘泡虫的个数呈波动式上升，血清浓度为20％这一组，从开始培养到前15天呈现出明显的增长趋势，第15天之后略有下降。从而得出，相对于其它三组来说，在此培养条件中，血清浓度为20％是培养碘泡虫的较为适宜的条件。

由以上试验验证结果可知，培养碘泡虫的适宜条件有三种：(1)鲫鱼的肌肉匀浆、M199培养液、胎牛血清(血清浓度为20％)、抗生素1％、温度26℃；(2)鲫鱼的肌肉匀浆、L-15培养液、鱼血清(血清浓度为10％)、抗生素1％、温度26℃；(3)鲫鱼的肌肉匀浆、DMEM培养液、胎牛血清(血清浓度为20％)、抗生素1％、温度26℃。按照碘泡虫增长的幅度来看，最佳培养条件为第三种，其次是第一种，再次是第二种。

本发明的培养方法重现性好，适用性强。可以为鱼类粘孢子虫病方面的研究提供基础材料，便于今后在鱼类粘孢子虫病药效学和疫苗等方面的进一步探究，从而更好地防治鱼类粘孢子虫病，减少水产养殖业经济上的损失。

Claims (4)

1.一种体外培养碘泡虫的方法，其特征是：采用鲫鱼肌肉匀浆为培养载体进行碘泡虫体外培养的方法，包括以下步骤，

步骤一、抗生素的配置

在无菌操作台上，取青霉素钠0.96g和硫酸链霉素1g溶解于100mL的经过消毒处理的去离子水中混合，采用移液管移取上述溶液8mL置于经消毒处理的玻璃瓶内，且分装为12个玻璃瓶内，采用封口膜将12个玻璃瓶封口，置于-20℃的冰箱内保存备用；

步骤二、鲫鱼肌肉组织匀浆上清培养液的配置

取鲫鱼肌肉组织5g，加入500mL过滤水，采用匀浆机将匀浆打碎后离心10min，取离心后上清液加入5mL抗生素保存备用；将1mL鲫鱼肌肉组织匀浆上清液加入到经0.22μm滤膜过滤的250mL水中，作为试验培养液母液；

步骤三、碘泡虫的体外培养

(1)从体内含有碘泡虫的鱼中取出孢囊，用1.5mL的离心管将孢囊收集，采用试验培养液母液进行冲洗离心至获得孢子；

(2)将孢子置于50mL细胞培养瓶中，向细胞培养瓶中加入1mL试验培养液母液、4mLDMEM细胞培养液、50μL抗生素；

(3)取六孔培养板，向六孔培养板的每个孔中加入100μL的上述培养瓶中取出的碘孢子虫，400μL肌肉组织匀浆上清培养液，1500μLDMEM细胞培养液，400μL的胎牛血清，在26℃的温度条件下连续培养；

步骤四、计数及绘制生长曲线

在所述步骤三的连续培养过程中，每间隔72小时，进行一次计数，计数时将六孔培养板中所培养的碘泡虫混匀，并从每一培养孔中分别吸取10μL的碘泡虫，并用细胞计数板进行计数，根据记录的数据绘制生长曲线。

2.一种体外培养碘泡虫的方法，其特征是：采用鲫鱼鳃匀浆为培养载体进行碘泡虫体外培养的方法，包括以下步骤，

步骤一、抗生素的配置

在无菌操作台上，取青霉素钠0.96g和硫酸链霉素1g溶解于100mL的经过消毒处理的去离子水中混合，采用移液管移取上述溶液8mL置于经消毒处理的玻璃瓶内，且分装为12个玻璃瓶内，采用封口膜将12个玻璃瓶封口，置于-20℃的冰箱内保存备用；

步骤二、鲫鱼鳃组织匀浆上清培养液的配置

取鲫鱼鳃组织5g，加入500mL过滤水，采用匀浆机将匀浆打碎后离心10min，取离心后上清液加入5mL抗生素保存备用；将1mL鲫鱼鳃组织匀浆上清液加入到经0.22μm滤膜过滤的250mL水中，作为试验培养液母液；

步骤三、碘泡虫的体外培养

(1)从体内含有碘泡虫的鱼中取出孢囊，用1.5mL的离心管将孢囊收集，采用试验培养液母液进行冲洗离心至获得孢子；

(2)将孢子置于50mL细胞培养瓶中，向细胞培养瓶中加入1mL试验培养液母液、4mLDMEM细胞培养液、50μL抗生素；

(3)取六孔培养板，向六孔培养板的每个孔中加入100μL的上述培养瓶中取出的碘孢子虫，400μL肌肉组织匀浆上清培养液，1500μLDMEM细胞培养液，400μL的胎牛血清，在26℃的温度条件下连续培养；

步骤四、计数及绘制生长曲线

在所述步骤三的连续培养过程中，每间隔72小时，进行一次计数，计数时将六孔培养板中所培养的碘泡虫混匀，并从每一培养孔中分别吸取10μL的碘泡虫，并用细胞计数板进行计数，根据记录的数据绘制生长曲线。

3.根据权利要求1或2所述的一种体外培养碘泡虫的方法，其特征是：所述步骤三中每孔培养板接种鱼类碘孢子虫密度为20ind/mL。

4.根据权利要求1或2所述的一种体外培养碘泡虫的方法，其特征是：所述步骤三中胎牛血清的浓度为20％。