CN104745526B

CN104745526B - 一种斑马鱼原代胚胎细胞体外分化为心肌细胞的新方法

Info

Publication number: CN104745526B
Application number: CN201510193514.8A
Authority: CN
Inventors: 周荣家; 肖遥; 程汉华
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2015-04-22
Filing date: 2015-04-22
Publication date: 2017-11-28
Anticipated expiration: 2035-04-22
Also published as: CN104745526A

Abstract

本发明提供了一种斑马鱼原代胚胎细胞体外分化为心肌细胞的新方法。斑马鱼交配后收集发育至囊胚期的胚胎，经消毒及去绒膜处理后，吹打成单个细胞，再置于明胶包被过的细胞培养容器中用心肌细胞诱导培养液培养24至48小时后得到能自发收缩的心肌细胞。心肌细胞诱导培养液组分为Leibovitz L‑15培养基、Dulbecco改良Eagle培养基、Ham's F12培养基、胎牛血清、鱼血清、斑马鱼胚胎粗提物、胰岛素、青霉素和链霉素。通过本发明每诱导1万个原代胚胎细胞可获得200个以上的心肌细胞团，且能保持自发收缩特性20天。本发明可实现经济、快速且高效地筛选对心肌细胞形成和发育有影响的生物大分子或小分子药物。

Description

一种斑马鱼原代胚胎细胞体外分化为心肌细胞的新方法

技术领域

本发明属于发育生物学与医药技术交叉领域，具体涉及一种斑马鱼原代胚胎细胞体外分化为心肌细胞的新方法。

背景技术

据美国心脏协会和我国国家心血管病中心2014年统计数据均表明，心血管疾病是所有致死因素中所占比例最大的疾病(约占40％)，是近年来人类健康的首要威胁。其中先天性心脏病由胚胎期心脏形成和发育缺陷所致，研究心脏细胞谱系特化与分化过程是探究其发病机制的重要依据。后天性心脏病主要与生活规律和饮食结构等因素有关，发病后造成数亿心肌细胞迅速死亡，而哺乳动物损失的心肌无法有效的自我修复，最终导致心脏丧失功能。

斑马鱼是常用的发育和再生研究的体内模型，特别在心脏发育和再生研究领域具有诸多优势。首先，斑马鱼胚胎早期分裂迅速，受精后24小时即可形成自发跳动的心脏，而小鼠在第8天，人类为第22天。其次，斑马鱼胚胎通体透明，可大量获取且在体外发育，为筛选心脏发育相关的遗传突变和小分子药物提供了高效的模型。最后，斑马鱼的心脏具有异于哺乳动物的再生能力，斑马鱼心脏的发育和再生研究有助于筛选和开发治疗心脏病的新药物和新方法。

目前现有的斑马鱼胚胎筛选诱导心肌细胞形成药物的方法是建立在体内模型上的，是利用斑马鱼整个胚胎筛选影响心肌细胞体内发育的小分子药物(钟涛，用模式生物斑马鱼筛选诱导心肌细胞形成的药物的方法，专利公开号：CN102520130A)。由于生物大分子难以穿透细胞膜和胚胎组织、器官等复杂结构，体内筛选模型不适用于筛选影响心肌细胞形成的细胞因子、多肽、蛋白、脂肪、多糖等物质。此外，体内筛选模型在量化心肌细胞形成表型如心脏大小、心肌细胞数量等方面存在需固定胚胎方向、测量时间长等不便因素，使其难以进行高通量筛选。现虽已建有哺乳动物多能干细胞系分化为心肌细胞的体外模型，但该类方法耗时至少为两周，多能干细胞系长期体外培养和其干性的维持需要较高成本。现有的斑马鱼原代胚胎细胞体外模型是将原肠胚期的胚胎细胞置于含5％胎牛血清的L-15培养液中分化，可用于筛选影响内皮细胞发育和血管发生的药物和因子(Haigen Huang,AnneLindgren,Xinrong Wu,Ning-Ai Liu,Shou Lin.High-throughput screening forbioactive molecules using primary cell culture of transgenic zebrafishembryos.Cell Reports,2012,2:695-704)。但该方法不能有效的分化出心肌细胞(一个384孔培养板的孔仅有6个表达心肌标记基因的细胞，按该文献中1600个胚胎分离的细胞供一个384孔培养板计算，相当于4.2个胚胎分离的细胞仅能分化出6个表达心肌标记基因的细胞，即1个胚胎得到1.4个心肌细胞)，并且于培养开始后第5天丧失心肌标记基因表达，因此无法有效的用于筛选影响心肌细胞形成的因子，尤其是抑制因子和毒理学测试。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种模式动物斑马鱼胚胎细胞体外分化为心肌细胞的方法，通过检测分化后心肌细胞特征基因的转基因荧光标记强度，能够高通量的筛选促进或抑制心肌细胞形成的生物大分子及小分子药物。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种斑马鱼胚胎细胞体外分化为心肌细胞的方法，包括以下步骤：

(1)斑马鱼雌、雄个体交配后收集胚胎，放入水中置于培养箱内培养至囊胚期。

(2)囊胚期的胚胎经次氯酸钠除菌后用E2溶液清洗，再用链霉蛋白酶处理去除绒膜。

(3)去除绒膜的胚胎用E2溶液清洗后，用胚胎细胞培养液吹打成单个细胞。

(4)离心弃去上清，再用胚胎细胞培养液清洗；

(5)离心弃去上清，加入不含胎牛血清和鱼血清的心肌细胞诱导培养液再悬浮细胞，将细胞悬液加入到明胶包被过的细胞培养容器，置于培养箱内培养，0.5～1小时后加入相应体积比的胎牛血清和鱼血清继续培养，24～48h后即可得到能自发收缩的心肌细胞；所述的心肌细胞诱导培养液的组分和配比如下：Leibovitz L-15培养基40.5％(v/v)、Dulbecco改良Eagle培养基28.35％(v/v)、Ham's F12培养基12.15％(v/v)、胎牛血清15％(v/v)、鱼血清1％(v/v)、蛋白浓度5mg/mL的斑马鱼胚胎粗提物1％(v/v)、5mg/mL胰岛素1％(v/v)，青霉素(10000IU/mL)链霉素(10mg/mL)溶液1％(v/v)。

步骤(1)中使用的斑马鱼可为野生型或其他心脏特征基因标记的转基因斑马鱼如Tg(cmlc2:EGFP)、Tg(nkx2.5:EGFP)、Tg(cTnT:EGFP)等，荧光标记也可为DsRed、mCherry、Venus等不同类型和颜色荧光蛋白。

步骤(1)中斑马鱼雌、雄个体数目的比例优选为1:2。

步骤(1)中斑马鱼囊胚期胚胎包括1000-细胞期、high、oblong、sphere、dome和30％外包期。

步骤(2)中所述的次氯酸钠优选浓度为0.003％(w/v)的次氯酸钠，链霉蛋白酶优选浓度为0.001％(w/v)的链霉蛋白酶。

步骤(2)和(3)中所述的E2溶液的组分和浓度如下：7.5mM NaCl、0.25mM KCl、0.5mM MgSO₄、0.075mM KH₂PO₄、0.025mM Na₂HPO₄、0.5mM CaCl₂、0.35mM NaHCO₃，过滤除菌。

步骤(3)和(4)中所述的胚胎细胞培养液的组分和配比如下：Leibovitz L-15培养基42％(v/v)、Dulbecco改良Eagle培养基29.4％(v/v)、Ham's F12培养基12.6％(v/v)、胎牛血清15％(v/v)、青霉素(10000IU/mL)链霉素(10mg/mL)溶液1％(v/v)。

步骤(4)和(5)中所述的离心的条件优选为500g离心5分钟。

步骤(5)中所述的明胶优选浓度为0.1％～0.2％(w/v)的明胶。

步骤(5)中细胞培养容器可为不同规格大小的培养皿、培养瓶以及4孔、6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔培养板。

步骤(5)中所述的斑马鱼胚胎粗提物优选通过包含如下步骤的方法制备：取受精1～3天的斑马鱼幼鱼，用匀浆器研磨后，离心取上清，过滤即得斑马鱼胚胎粗提物。更优选的，其通过包含如下步骤的方法制备：取受精后3天的斑马鱼幼鱼，用匀浆器研磨后，15000g离心30min，取上清，经0.2微米滤器过滤。

步骤(5)中所述的鱼血清优选通过包含如下步骤的方法制备：选取性成熟前的鲤科鱼类，抽取其血液，静止收集血清，离心取上清，过滤即得鱼血清。更优选的，其通过包含如下步骤的方法制备：选取性成熟前的草鱼、鲫鱼或其他鲤科鱼类，抽取其血液后，37℃静置1h，收集血清，1000g离心15min，取上清，经0.2微米滤器过滤。

步骤(1)和(5)中培养箱内培养的温度优选为26～30℃。

本发明是将斑马鱼囊胚期原代胚胎细胞置于心肌细胞诱导培养液中体外分化为心肌细胞，仅需24～48小时，每诱导1万个原代胚胎细胞可获得200个以上自发收缩的心肌细胞团(15～25个囊胚期胚胎可提供1万个胚胎细胞用于培养，相当于1个胚胎可得到8.0～13.3个自发收缩的心肌细胞团)，且能保持自发收缩特性20天。本发明方法心肌细胞的诱导分化效率既不过高也不是太低，可适用于促进或抑制心肌细胞形成的因子筛选。基于本方法，通过转基因技术与多功能酶标仪的使用相结合可实现高通量筛选影响心肌细胞形成的生物大分子和小分子药物。本发明不仅快速、经济，且具有更广泛的适用性和更高的筛选效率。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)与斑马鱼胚胎的体内筛选模型相比，利用本发明可实现更快速和更高通量的筛选，且筛选的对象范围更广。通过多功能酶标仪10分钟内即可读取一块384-孔培养板内每孔细胞的荧光强度从而得知不同处理的影响，而基于整个胚胎的体内筛选模型则需要对每个胚胎进行观察和分析，单位时间内能分析样本量有限。此外，因生物大分子难以穿透细胞膜和胚胎组织、器官等复杂结构，体内筛选模型仅适用于小分子药物的筛选。而本方法基于体外分化模型，即将胚胎细胞直接暴露在处理条件下，可实现对包括细胞因子、多肽、蛋白、脂肪、多糖等在内的生物大分子和小分子药物进行筛选。

(2)与哺乳动物心肌细胞体外分化模型相比，本发明的优势在于更经济、更快速得出筛选结果、更接近体内心肌细胞分化的模式。哺乳动物心肌细胞体外分化模型涉及多能干细胞系的长期培养和维持，需要购买多种维持干性的抑制因子，大幅度提高了筛选成本。此外哺乳动物心肌细胞体外分化需要至少两周时间。本发明利用斑马鱼胚胎易于大量获取的优势，使用原代胚胎细胞进行向心肌细胞的分化，无需长期体外培养和维持胚胎细胞的多能性，且在24至48小时即可形成自发收缩的心肌细胞。

(3)与现有的斑马鱼胚胎细胞体外分化方法相比，本发明的优势在于诱导效率更高且心肌细胞特征维持时间更长。现有的斑马鱼胚胎细胞体外分化方法中分离1个胚胎中的细胞仅能得到1.4个心肌细胞，且其心肌细胞特征仅能维持5天，无法有效的用于筛选影响心肌细胞形成的因子，尤其是抑制因子和毒理学测试。本方法中分离1个胚胎中的细胞可得到8.0～13.3个心肌细胞团，其心肌细胞特征可维持长达20天。本方法的心肌细胞诱导分化效率既不过高、也不过低，促进和抑制因子的筛选均可适用。

附图说明

图1是Tg(cmlc2:EGFP)转基因斑马鱼胚胎细胞分化后2天(A)、4天(B、C)、7天(D)和14天(E)的能自发跳动的GFP阳性心肌细胞形态图。(A-E)为明场观察，(A’-E’)为488nm激发光下的暗场观察，原始放大倍数20×。

图2是体外分化不同天数的心肌细胞自发跳动频率箱线图。每个时间点记录的跳动细胞团数目为100～120个。

图3是添加胰岛素对斑马鱼胚胎细胞体外分化为心肌细胞的影响结果图。(A)未添加胰岛素(INS^-)和添加胰岛素(INS⁺)对Tg(cmlc2:EGFP)转基因胚胎细胞分化为GFP阳性心肌细胞的效果对比，原始放大倍数20×。(B)培养液中添加0、10、25或50μg/mL胰岛素时，分化每10⁴个胚胎细胞得到的自发收缩的细胞团数目，每个收缩的细胞团包含多个细胞。(C)培养液中添加0、10、25或50μg/mL胰岛素时，每组GFP荧光强度相对于0μg/mL胰岛素组荧光强度的比值。(B、C)中数据为每组平均值±标准误，＊表示p<0.05；＊＊表示p<0.01；＊＊＊表示p<0.0001。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1斑马鱼原代胚胎细胞分化为心肌细胞的特征观察

动物：Tg(cmlc2:EGFP)转基因斑马鱼(可向我国国家斑马鱼资源中心购买)。

试剂：次氯酸钠(NaClO)、NaCl、KCl、MgSO4、KH2PO4、Na2HPO4、CaCl2、NaHCO3均购自国药集团。链霉蛋白酶、明胶、胰岛素，均购自sigma公司。Leibovitz L-15培养基、Dulbecco改良Eagle培养基、Ham's F12培养基、胎牛血清、青霉素(10000IU/mL)链霉素(10mg/mL)溶液，均购自Hyclone公司。

斑马鱼胚胎粗提物的制备：取约500条受精后3天的幼鱼，用匀浆器研磨后，15000g离心30min，取上清，经0.2微米滤器过滤后，-70℃下保存。

鱼血清的制备：选取性成熟前的草鱼，抽取其血液后，37℃静置1h，收集血清，1000g离心15min，取上清，经0.2微米滤器过滤后，-70℃下保存。

实验方法：

(1)Tg(cmlc2:EGFP)转基因斑马鱼雌、雄个体(雌雄比例1:2)交配后收集胚胎，放入水中置于26～30℃培养箱内培养至囊胚期。

(2)囊胚期的胚胎经0.003％(w/v)次氯酸钠除菌后用E2溶液清洗5次，再用0.001％(w/v)链霉蛋白酶处理10～20分钟去除绒膜。E2溶液的组分和浓度为：7.5mM NaCl、0.25mM KCl、0.5mM MgSO₄、0.075mM KH₂PO₄、0.025mM Na₂HPO₄、0.5mM CaCl₂、0.35mMNaHCO₃，过滤除菌。

(3)去除绒膜的胚胎转移至E2溶液清洗5次后收集至离心管，移除多余的E2溶液并加入胚胎细胞培养液，然后将胚胎吹打成单个细胞。所述的胚胎细胞培养液的组分和配比如下：Leibovitz L-15培养基42％(v/v)、Dulbecco改良Eagle培养基29.4％(v/v)、Ham'sF12培养基12.6％(v/v)、胎牛血清15％(v/v)、青霉素(10000IU/mL)链霉素(10mg/mL)溶液1％(v/v)。

(4)500g离心5分钟后，弃去上清加入胚胎细胞培养液并重复该步骤两次。

(5)500g离心5分钟弃上清后加入不含胎牛血清和鱼血清的心肌细胞诱导培养液再悬浮细胞，细胞计数后以每孔4万个细胞的密度铺入0.2％(w/v)明胶包被过的细胞12孔细胞培养板，置于26～30℃培养箱内培养，0.5小时后加入相应体积比的胎牛血清和鱼血清继续培养。所述的心肌细胞诱导培养液的组分和配比如下：Leibovitz L-15培养基40.5％(v/v)、Dulbecco改良Eagle培养基28.35％(v/v)、Ham's F12培养基12.15％(v/v)、胎牛血清15％(v/v)、鱼血清1％(v/v)、蛋白浓度5mg/mL的斑马鱼胚胎粗提物1％(v/v)、5mg/mL胰岛素1％(v/v)，青霉素(10000IU/mL)链霉素(10mg/mL)溶液1％(v/v)。

(6)在倒置显微镜明场和488nm激发光下观察分化不同天数时心肌细胞的形态和特征基因cmlc2表达情况，并记录心肌细胞自发收缩频率。

实验结果：培养起始24小时后可开始观察到自发收缩的心肌细胞，48小时后可检测到心肌特征基因cmlc2表达。心肌细胞形成效率为每培养10⁴个原代胚胎细胞(10～15枚胚胎可提供10⁴个胚胎细胞用于分化，因胚胎所处囊胚期的不同阶段而不同)可获得200个以上自发收缩的细胞团。随着培养时间的增加，心肌细胞逐渐贴壁、增殖并发生去分化(图1)。心肌细胞自发收缩频率约为60次/分钟，可维持20天(图2)。实验表明，本发明可有效的在体外将斑马鱼胚胎细胞分化为心肌细胞。

实施例2不同浓度胰岛素对斑马鱼心肌细胞形成的影响。

试剂：胰岛素，购自sigma公司。

实验方法：心肌细胞诱导培养液中添加胰岛素的浓度设置为10、25、50μg/mL，0μg/mL胰岛素作为对照组，每组设置三个重复。按照实施例1中的方法于培养起始后第4天，利用荧光显微镜观察添加胰岛素对生成GFP阳性细胞的影响。倒置显微镜明场下记录并计算各剂量组内每10⁴个胚胎细胞分化后所得的自发收缩心肌细胞团数量。通过多功能酶标仪检测不同组内的GFP荧光强度，将各剂量组荧光强度除以对照组的荧光强度均值即得到相对荧光强度。利用SAS软件，统计分析每组间自发收缩心肌细胞团数量和相对荧光强度差异。

实验结果：添加胰岛素增加了GFP阳性细胞的数量(图3A)，显著增加了自发收缩心肌细胞团的数量(p<0.0001，图3B)，并且显著增加了GFP荧光强度(p<0.001，图3C)，表明胰岛素对斑马鱼心肌细胞形成具有促进作用。因此，本发明可检测出不同浓度胰岛素对心肌细胞形成的影响，表明本发明具有筛选影响心肌细胞形成的不同因子的应用前景。

Claims

1.一种斑马鱼胚胎细胞体外分化为心肌细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)斑马鱼雌、雄个体交配后收集胚胎，放入水中置于培养箱内培养至囊胚期；

(2)囊胚期的胚胎经次氯酸钠除菌后用E2溶液清洗后，再用链霉蛋白酶处理去除绒膜；

(3)去除绒膜的胚胎用E2溶液清洗后，用胚胎细胞培养液吹打成单个细胞；

(4)离心弃去上清，再用胚胎细胞培养液清洗；

(5)离心弃去上清，加入不含胎牛血清和草鱼血清的心肌细胞诱导培养液再悬浮细胞，将细胞悬液加入到明胶包被过的细胞培养容器，置于培养箱内培养，0.5～1小时后加入相应体积比的胎牛血清和草鱼血清继续培养，24～48小时后得到心肌细胞；所述的心肌细胞诱导培养液的组分和配比如下：Leibovitz L-15培养基40.5％(v/v)、Dulbecco改良Eagle培养基28.35％(v/v)、Ham's F12培养基12.15％(v/v)、胎牛血清15％(v/v)、草鱼血清1％(v/v)、蛋白浓度5mg/mL的斑马鱼胚胎粗提物1％(v/v)、5mg/mL胰岛素1％(v/v)，青霉素链霉素溶液1％(v/v)；

所述的E2溶液的组分和浓度如下：7.5mM NaCl、0.25mM KCl、0.5mM MgSO₄、0.075mMKH₂PO₄、0.025mM Na₂HPO₄、0.5mM CaCl₂、0.35mM NaHCO₃；

所述的胚胎细胞培养液的组分和配比如下：Leibovitz L-15培养基42％(v/v)、Dulbecco改良Eagle培养基29.4％(v/v)、Ham's F12培养基12.6％(v/v)、胎牛血清15％(v/v)、青霉素链霉素溶液1％(v/v)，所述的青霉素链霉素溶液中青霉素、链霉素的浓度分别为10000IU/mL、10mg/mL；

所述的斑马鱼胚胎粗提物通过包含如下步骤的方法制备：取受精1～3天的斑马鱼幼鱼，用匀浆器研磨后，离心取上清，过滤；所述的草鱼血清通过包含如下步骤的方法制备：选取性成熟前的草鱼，抽取其血液，静止收集血清，离心取上清，过滤。

2.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎细胞体外分化为心肌细胞的方法，其特征在于：步骤(1)中使用的斑马鱼为野生型或心脏特征基因标记的转基因斑马鱼，所述的心脏特征基因标记的转基因斑马鱼为Tg(cmlc2:EGFP)、Tg(nkx2.5:EGFP)或Tg(cTnT:EGFP)。

3.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎细胞体外分化为心肌细胞的方法，其特征在于：步骤(1)中斑马鱼雌、雄个体数目的比例为1:2。

4.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎细胞体外分化为心肌细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的次氯酸钠为0.003％(w/v)次氯酸钠，链霉蛋白酶为0.001％(w/v)链霉蛋白酶。

5.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎细胞体外分化为心肌细胞的方法，其特征在于：步骤(4)和(5)中所述的离心的条件为500g离心5分钟。

6.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎细胞体外分化为心肌细胞的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的明胶为0.1％～0.2％(w/v)明胶。

7.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎细胞体外分化为心肌细胞的方法，其特征在于：步骤(1)和(5)中培养箱内培养的温度为26～30℃。

8.权利要求1-7任一项所述斑马鱼胚胎细胞体外分化为心肌细胞的方法在筛选促进或抑制心肌细胞形成的生物大分子或小分子药物中的应用。