CN109652365A - 一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法 - Google Patents
一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109652365A CN109652365A CN201910106196.5A CN201910106196A CN109652365A CN 109652365 A CN109652365 A CN 109652365A CN 201910106196 A CN201910106196 A CN 201910106196A CN 109652365 A CN109652365 A CN 109652365A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- preparation
- zebrafish embryo
- single cell
- cell suspension
- 5min
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title claims abstract description 38
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 title claims abstract description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000001136 chorion Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 3
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 241000283070 Equus zebra Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052564 epsomite Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000008212 organismal development Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229940045998 sodium isethionate Drugs 0.000 description 2
- LADXKQRVAFSPTR-UHFFFAOYSA-M sodium;2-hydroxyethanesulfonate Chemical compound [Na+].OCCS([O-])(=O)=O LADXKQRVAFSPTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- -1 Elastoser Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 239000012574 advanced DMEM Substances 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- ZFXVRMSLJDYJCH-UHFFFAOYSA-N calcium magnesium Chemical compound [Mg].[Ca] ZFXVRMSLJDYJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0604—Whole embryos; Culture medium therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,顺序进行如下步骤:(1)取斑马鱼胚胎,加入Pronase E的水溶液;(2)37℃孵育4~5min;(3)使用2mL一次性滴管轻轻吹吸胚胎使绒毛膜剥落,移入1.5mL无酶离心管中,并快速吸走Pronase E;(4)加入E3培养基洗涤,移除,反复3~5遍;(5)加入冰上预冷的分散酶;(6)37℃孵育2‑5min,孵育期间间歇震荡;(7)加入FBS终止消化;(8)将步骤(7)得到的悬液过70μm筛网,将滤液再过40μm筛网;(9)过筛后的悬液200~500×g离心3~5min;(10)取冰上预冷的含1%的BSA的HBSS重悬细胞;(11)200~500×g离心步骤(10)得到的悬液3~5min;(12)重复步骤(10)和(11)清洗一次;(13)取冰上预冷的IESC重悬细胞,即得。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法。
背景技术
随着测序技术的发展,测序成本不断下降,转录组学与基因组学等生物组学技术在医学、环境、食品等多领域得到越来越多的应用。但传统的转录组学(Bulk RNA Seq)与基因组学测序(Bulk DNA Seq)所获得是生物组织(器官)的整体状态。对组成生物组织(器官)的不同类型细胞进行一个“均一”的分析,并不利于研究复杂的生物过程。尤其是对免疫学,肿瘤学,遗传学的研究来说,传统测序无法获取有效信息。随着MARS-Seq、CytoSeq、Drop-Seq、inDrop等技术的出现,使得对单个细胞内核酸分别测序成为可能,即单细胞测序(Single cell RNA/DNA seq),而制备一份高质量的单细胞悬液是保障测序质量的决定因素。同时,流式细胞术,原代细胞培养等重要技术手段在应用的过程中,首先也需要制备单细胞悬液。
目前单细胞悬液的制备方法主要可以分为酶解法,机械破碎,螯合剂处理以及上述方法组合使用。Farrell等人1通过快速剧烈震荡离心管,将斑马鱼胚胎制成单细胞悬液。机械破碎一般耗时较酶解法短利于提高活力,但细胞分散效果差,多团聚体,并且对细胞造成物理损伤。Raj等人2采用商品化试剂盒制备了斑马鱼脑部组织单细胞悬液,对细胞起分散作用的主要是木瓜蛋白酶。或是多种酶连续配合消解3,常用的酶类有胶原蛋白酶,胰酶,弹性蛋白酶,木瓜蛋白酶以及透明质酸酶等。这类方法制得的细胞分散好,但在每次终止酶消化后均需对细胞进行多次离心洗涤,耗时长,吹吸重悬过程对细胞损伤大。而将机械的方法与酶解或者螯合剂组合使用,能够相对缩短整个悬液制备时间,也较纯机械破碎或酶解法温和。如Spanjaard等人4,采用温和型酶TrypLE孵育,并且每隔5分钟使用移液器对斑马鱼幼鱼、脑部组织以及肝胰腺组织进行吹吸,以制备相应单细胞悬液。Briggs等人5则采用羟乙基磺酸钠(sodium isethionate)、焦磷酸钠以及CAPS配置而成的缓冲液进行孵育,同时辅以机械涡旋制备了非洲爪蛙胚胎单细胞悬液。
悬液的制备方式多种多样,但目前多开发应用于制备人类肿瘤、生物组织(器官)等的单细胞悬液。针对鱼类胚胎制备方法尚且不多,尤其是鱼类胚胎还包被有起保护作用的绒毛膜,需先去除绒毛膜,才能进行后续操作。根据Briggs等人5描述其在分散非洲爪哇胚胎细胞时,尝试了CMFM(calcium magnesium free media),Newport分散液(Newportdissociation media),胰蛋白酶-EDTA,TrypLE,细胞消化液,木瓜蛋白酶和胶原酶等的消解,均未获得较好的结果。可见胚胎细胞分散方法无法全盘借鉴生物组织(器官)分散方法。
斑马鱼是一类实验室常用模式生物,由于其便于实验室养殖、繁殖周期短、产卵量大、体外受精与发育、胚体透明,加之其基因组与人类基因组同源性高达70%,这些都使得其具有其他模式生物无可比拟的优势。而胚胎作为生物体发育的起始,能够帮助研究人员探索生物体发育的全过程,必然会在未来得到更多的应用。因此开发一种快速高效的斑马鱼胚胎单细胞悬液制备方法十分有必要。
1.Farrell,J.A.;Wang,Y.;Riesenfeld,S.J.;Shekhar,K.;Regev,A.;Schier,A.F.,Single-cellreconstruction of developmental trajectories during zebrafishembryogenesis.Science 2018,360,(6392),979-+.
2.Raj,B.;Wagner,D.E.;McKenna,A.;Pandey,S.;Klein,A.M.;Shendure,J.;Gagnon,J.A.;Schier,A.F.,Simultaneous single-cell profiling of lineages andcell types in the vertebrate brain.Nature Biotechnology2018,36,(5),442-+.
3.Magness,S.T.;Puthoff,B.J.;Crissey,M.A.;Dunn,J.;Henning,S.J.;Houchen,C.;
Kaddis,J.S.;Kuo,C.J.;Li,L.;Lynch,J.;Martin,M.G.;May,R.;Niland,J.C.;Olack,B.;
Qian,D.;Stelzner,M.;Swain,J.R.;Wang,F.;Wang,J.;Wang,X.;Yan,K.;Yu,J.;Wong,M.H.,A multicenter study to standardize reporting and analyses offfluorescence-activated cell-sorted murine intestinal epithelialcells.American Journal ofPhysiology-Gastrointestinal and Liver Physiology2013,305,(8),G542-G551.
4.Spanjaard,B.;Hu,B.;Mitic,N.;Olivares-Chauvet,P.;Janjuha,S.;Ninov,N.;Junker,J.P.,Simultaneous lineage tracing and cell-type identificationusing CRISPR-Cas9-induced genetic scars.Nature Biotechnology 2018,36,(5),469-+.
5.Briggs,J.A.;Weinreb,C.;Wagner,D.E.;Megason,S.;Peshkin,L.;Kirschner,M.W.;
Klein,A.M.,The dynamics of gene expression in vertebrateembryogenesis at single-cell resolution.Science 2018,360,(6392),980-+.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,以解决目前未有快速高效的斑马鱼胚胎单细胞悬液制备方法。本发明采用分散酶(Dispase),实现了短时间内消化分散斑马鱼胚胎细胞,制备高质量单细胞悬液。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,顺序进行如下步骤:
(1)取斑马鱼胚胎,加入Pronase E的水溶液;
(2)37℃孵育4~5min;
(3)使用2mL一次性滴管轻轻吹吸胚胎使绒毛膜剥落,移入1.5mL无酶离心管中,并快速吸走Pronase E;
(4)加入E3培养基洗涤,移除,反复3~5遍;
(5)加入冰上预冷的分散酶;
(6)37℃孵育2-5min,孵育期间间歇震荡;
(7)加入FBS终止消化;
(8)将步骤(7)得到的悬液过70μm筛网,将滤液再过40μm筛网;
(9)过筛后的悬液200~500×g离心3~5min;
(10)取冰上预冷的含1%的BSA的HBSS重悬细胞;
(11)200~500×g离心步骤(10)得到的悬液3~5min;
(12)重复步骤(10)和(11)清洗一次;
(13)取冰上预冷的IESC重悬细胞,即得。
步骤(1)中,所述的Pronase E的水溶液,Pronase E的浓度为0.5~2.0mg/mL。
步骤(1)中,Pronase E的水溶液的加入体积为斑马鱼胚胎体积的2~5倍。
步骤(4)中,所述的E3培养基配方为:5Mm NaCl,0.17Mm KCl,0.33Mm CaCl2·H2O,0.33Mm MgSO4·7H2O,溶剂为水。
步骤(4)中,E3培养基每次的使用量是1~2mL。
步骤(5)中,所述的分散酶为Dispase溶于HBSS中,浓度为0.4~1.0U/mL。
步骤(5)中,对于每个斑马鱼胚胎,分散酶的使用体积为10~20μL。
步骤(7)中,FBS的使用体积为步骤(5)中分散酶体积的10~20%。
步骤(10)中,所述的含1%的BSA的HBSS的使用体积为10~20μL/个斑马鱼胚胎。
步骤(13)中,IESC的使用体积视后续实验要求而定,例如,40枚10hpf阶段的胚胎使用500μL IESC重悬可获得浓度为106cell/ml的单细胞悬液。
有益效果:本发明采用在链霉蛋白酶(Pronase E)去除绒毛膜后,使用分散酶分散细胞来制备单细胞悬液。整个过程在20分钟内完成,相对现有文献报道缩短了分散过程,减少了细胞碎片化、团聚体,提高了细胞活力和胚胎单细胞悬液的质量。
附图说明
图1为细胞活力百分比图。
图2为细胞实物图。
图3为细胞悬液粒径分布图。
图4为Hoechst荧光探针染色后的细胞悬液。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例材料来源如下:
Pronase E(MCE,美国);
E3培养基(5MmNaCl,0.17Mm KCl,0.33Mm CaCl2·H2O,0.33Mm MgSO4·7H2O);分散酶(Dispase,源叶生物,中国);
HBSS(STEMCELL,加拿大);
FBS(Gibco,澳大利亚);
IESC培养基(Advanced DMEM/F12(Gibco,美国)中添加N2(1X,LifeTechnologies,美国),B27(不含维生素A,1X,Life Technologies,美国),10mM HEPES(Gibco,美国),10μM Y27632(Sigma,USA),100μg/ml青霉素/链霉素双抗溶液(MRC,中国)和2mM L-谷氨酰胺(Gibco,美国))。
以下实施例所使用的检测设备如下:
TC20全自动细胞计数仪(Bio-RAD,美国);
倒置荧光显微镜(Nikon,日本)。
实施例1:
一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,顺序进行如下步骤:
(1)取40枚斑马鱼胚胎,加入1mg/mL Pronase E的水溶液;Pronase E的水溶液的加入体积为斑马鱼胚胎体积的3倍。
(2)37℃孵育5min。
(3)使用2mL一次性滴管轻轻吹吸胚胎使绒毛膜剥落,移入1.5mL无酶离心管中,并快速吸走Pronase E。
(4)加入1.5mL E3培养基洗涤,移除,反复3~5遍(清洗Pronase E)。
(5)加入500μL冰上预冷的分散酶;所述的分散酶为Dispase溶于HBSS中,浓度为0.6U/mL。
(6)37℃孵育2min,孵育期间间歇震荡(约每隔15sec)。
(7)加入100μL FBS终止消化。
(8)将步骤(7)得到的悬液过70μm筛网,将滤液再过40μm筛网。
(9)过筛后的悬液300×g离心3min。
(10)取500μL冰上预冷的含1%的BSA的HBSS重悬细胞。
(11)300×g离心步骤(10)得到的悬液3min。
(12)重复步骤(10)和(11)清洗一次。
(13)取500μL冰上预冷的IESC重悬细胞,即得。
得到的产品分别进行细胞活力及分散效果检测,结果见图1~4。
图1为细胞活力百分比图,展示的是悬液中的细胞总量(1.7x 106个/ml),活细胞数(1.68x 106个/ml),活细胞的比例为99%。
图2为自动计数仪导出的细胞实物图,可以看出本发明方法得到的重悬细胞碎片少,细胞分散好。
图3为细胞悬液粒径分布图,主要是观察细胞的大小,过小可能是碎片多,过大团聚多。本实施例结果中粒径分布图峰值出现在10μm及13μm(出现两个峰值可能是细胞分化所致,原始卵细胞分裂而成的细胞粒径较大,逐渐分化而体积缩小,数量变多),图3表明绝大部分为单细胞,小粒径碎片,与大粒径团聚体几乎无分布。
图4为单细胞悬液荧光探针照片(Hoechst探针标记活细胞,放大倍数为4),由图4可以看出活细胞数量以及无团聚体,基本都是单个活细胞。
Claims (9)
1.一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,顺序进行如下步骤:
(1)取斑马鱼胚胎,加入Pronase E的水溶液;
(2)37℃孵育4~5min;
(3)使用2mL一次性滴管轻轻吹吸胚胎使绒毛膜剥落,移入1.5mL无酶离心管中,并快速吸走Pronase E;
(4)加入E3培养基洗涤,移除,反复3~5遍;
(5)加入冰上预冷的分散酶;
(6)37℃孵育2~5min,孵育期间间歇震荡;
(7)加入FBS终止消化;
(8)将步骤(7)得到的悬液过70μm筛网,将滤液再过40μm筛网;
(9)过筛后的悬液200~500×g离心3~5min;
(10)取冰上预冷的含1%的BSA的HBSS重悬细胞;
(11)200~500×g离心步骤(10)得到的悬液3~5min;
(12)重复步骤(10)和(11)清洗一次;
(13)取冰上预冷的IESC重悬细胞,即得。
2.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的Pronase E的水溶液,Pronase E的浓度为0.5~2.0mg/mL。
3.根据权利要求2所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,Pronase E的水溶液的加入体积为斑马鱼胚胎体积的2~5倍。
4.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,步骤(4)中,所述的E3培养基配方为:5MmNaCl,0.17MmKCl,0.33Mm CaCl2·H2O,0.33MmMgSO4·7H2O,溶剂为水。
5.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,步骤(4)中,E3培养基每次的使用量是1~2mL。
6.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,步骤(5)中,所述的分散酶为Dispase溶于HBSS中,浓度为0.4~1.0U/mL。
7.根据权利要求6所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,步骤(5)中,对于每个斑马鱼胚胎,分散酶的使用体积为10~20μL。
8.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,步骤(7)中,FBS的使用体积为步骤(5)中分散酶体积的10~20%。
9.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,步骤(10)中,所述的含1%的BSA的HBSS的使用体积为10~20μL/个斑马鱼胚胎。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910106196.5A CN109652365A (zh) | 2019-02-01 | 2019-02-01 | 一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910106196.5A CN109652365A (zh) | 2019-02-01 | 2019-02-01 | 一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109652365A true CN109652365A (zh) | 2019-04-19 |
Family
ID=66122674
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910106196.5A Pending CN109652365A (zh) | 2019-02-01 | 2019-02-01 | 一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109652365A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112852710A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-05-28 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种鱼类血管囊单细胞测序样品的制备方法 |
CN113403255A (zh) * | 2021-06-03 | 2021-09-17 | 上海派森诺生物科技有限公司 | 一种鱼类组织单细胞悬液的制备方法 |
CN114276977A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-04-05 | 中国农业科学院蜜蜂研究所 | 一种制备蜜蜂胚胎单细胞的方法 |
CN117417882A (zh) * | 2023-10-18 | 2024-01-19 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法及设备 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1766092A (zh) * | 2005-09-05 | 2006-05-03 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 鱼类胚胎细胞分离与培养方法 |
CN1932008A (zh) * | 2006-10-09 | 2007-03-21 | 首都医科大学宣武医院 | 免疫磁珠分选去除分化体系中胚胎干细胞的方法 |
TW201522637A (zh) * | 2013-03-15 | 2015-06-16 | Jackson Lab | 非胚胎幹細胞之單離及其用途 |
CN104745526A (zh) * | 2015-04-22 | 2015-07-01 | 武汉大学 | 一种斑马鱼原代胚胎细胞体外分化为心肌细胞的新方法 |
CN105441548A (zh) * | 2015-12-21 | 2016-03-30 | 同济大学 | 斑马鱼胚胎单细胞染色质超敏位点高通量测序实验方法 |
CN107858322A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-30 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种海马原代细胞培养体系的建立方法 |
CN108728413A (zh) * | 2017-06-13 | 2018-11-02 | 中山大学中山眼科中心 | 一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法 |
-
2019
- 2019-02-01 CN CN201910106196.5A patent/CN109652365A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1766092A (zh) * | 2005-09-05 | 2006-05-03 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 鱼类胚胎细胞分离与培养方法 |
CN1932008A (zh) * | 2006-10-09 | 2007-03-21 | 首都医科大学宣武医院 | 免疫磁珠分选去除分化体系中胚胎干细胞的方法 |
TW201522637A (zh) * | 2013-03-15 | 2015-06-16 | Jackson Lab | 非胚胎幹細胞之單離及其用途 |
CN104745526A (zh) * | 2015-04-22 | 2015-07-01 | 武汉大学 | 一种斑马鱼原代胚胎细胞体外分化为心肌细胞的新方法 |
CN105441548A (zh) * | 2015-12-21 | 2016-03-30 | 同济大学 | 斑马鱼胚胎单细胞染色质超敏位点高通量测序实验方法 |
CN108728413A (zh) * | 2017-06-13 | 2018-11-02 | 中山大学中山眼科中心 | 一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法 |
CN107858322A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-30 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种海马原代细胞培养体系的建立方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
FLORANE LE BIHANIC ET AL.: "In vivo micronucleus screening in zebrafish by flow cytometry", 《MUTAGENESIS》 * |
王占洋等: "白藜芦醇对CdCl_2暴露所致斑马鱼胚胎发育毒性干预作用及机制的初步研究", 《石河子大学学报(自然科学版)》 * |
董恺等: "一种新的将神经球分散为单细胞悬液的方法", 《首都医科大学学报》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112852710A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-05-28 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种鱼类血管囊单细胞测序样品的制备方法 |
CN113403255A (zh) * | 2021-06-03 | 2021-09-17 | 上海派森诺生物科技有限公司 | 一种鱼类组织单细胞悬液的制备方法 |
WO2022252752A1 (zh) * | 2021-06-03 | 2022-12-08 | 上海派森诺生物科技有限公司 | 一种鱼类组织单细胞悬液的制备方法 |
CN114276977A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-04-05 | 中国农业科学院蜜蜂研究所 | 一种制备蜜蜂胚胎单细胞的方法 |
CN117417882A (zh) * | 2023-10-18 | 2024-01-19 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法及设备 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109652365A (zh) | 一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法 | |
Geijsen et al. | Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells | |
West et al. | In vitro generation of germ cells from murine embryonic stem cells | |
Zhi et al. | Generation and characterization of stable pig pregastrulation epiblast stem cell lines | |
JPWO2004104184A1 (ja) | 内胚葉系幹細胞の調製 | |
Takata et al. | Stem cells and genome editing: approaches to tissue regeneration and regenerative medicine | |
Alkobtawi et al. | Characterization of Pax3 and Sox10 transgenic Xenopus laevis embryos as tools to study neural crest development | |
Cuesta-Gomez et al. | Suspension culture improves iPSC expansion and pluripotency phenotype | |
US20200056149A1 (en) | Ready-to-use cryopreserved cells | |
Ren et al. | Potential of adipose-derived mesenchymal stem cells and skeletal muscle-derived satellite cells for somatic cell nuclear transfer mediated transgenesis in Arbas Cashmere goats | |
Nakai et al. | Efficient isolation of interstitial fibroblasts directly from mouse kidneys or indirectly after ex vivo expansion | |
Hemberger et al. | The placenta: Epigenetic insights into trophoblast developmental models of a generation-bridging organ with long-lasting impact on lifelong health | |
Conigliaro et al. | Isolation and characterization of a murine resident liver stem cell | |
Oback | Cloning from stem cells: different lineages, different species, same story | |
Huang et al. | Isolation and Functional Characterization of Pluripotent Stem Cell–Derived Cardiac Progenitor Cells | |
Almazloum et al. | Isolation of Adult Mouse Cardiac Fibroblasts | |
CN103305459A (zh) | 小分子诱导猪精原干细胞转变为胚胎干细胞样细胞的方法 | |
Wen et al. | Organoid research on human early development and beyond | |
Mai et al. | Application of hiPSCs in tooth regeneration via cellular modulation | |
CN108624621B (zh) | 非人灵长类的体细胞克隆动物的制备方法 | |
Guenther et al. | The treasury of Wharton's Jelly | |
Rashidian et al. | Isolation and culturing myogenic satellite cells from ovine skeletal muscle | |
CN102533764A (zh) | Figla基因启动子序列及其构建的标记载体和应用 | |
JP2002262716A (ja) | 株化細胞を用いて家畜個体を作出する方法 | |
Liao et al. | Isolation of THY1+ undifferentiated spermatogonia from mouse postnatal testes using magnetic-activated cell sorting (MACS) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190419 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |