CN112852710A - 一种鱼类血管囊单细胞测序样品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鱼类血管囊单细胞测序样品的制备方法，取分离所得的完整鱼类血管囊经缓冲液润洗后，置于无菌滤网中，滴加缓冲液或培养基包裹血管囊，揉压血管囊，将鱼类血管囊内细胞挤压过筛，所得细胞制成单细胞悬浮液后经过筛孔孔径不大于40μm的筛网过滤，得鱼类血管囊单细胞悬浮液，作为鱼类血管囊单细胞测序样品。本发明可大大降低细胞过筛损伤，减少细胞碎片的产生，同时可分离出完整的血管囊外膜，减少单细胞悬浮液中的结缔组织干扰。而且得到单细胞悬浮液后再经过孔径在40μm以下的网筛过滤，再次去除多余细胞团和结缔组织等杂质，两次过筛后，大大降低单细胞悬浮液中的细胞团块和杂质含量，可得到几乎无细胞团和细胞碎片的完整单细胞悬浮液。

Description

一种鱼类血管囊单细胞测序样品的制备方法

技术领域

本发明涉及鱼类细胞培养方法，具体涉及一种鱼类血管囊单细胞测序样品的制备方法。

技术背景

传统进行测序的DNA来源于组织混合的大量细胞，其结果只是这个细胞群体的平均值。然而，细胞之间存在异质性，即使表型相同，细胞的遗传信息也可能具有显著差异。单细胞测序技术不仅能更加精确地测量细胞内的基因表达水平，而且能检测到罕见非编码RNA和微量基因表达子。同时可通过对多种细胞测序，获得单细胞的转录组图谱，并基于基因表达将细胞分类并定义新的细胞，绘制细胞及其分子的空间组织方式，探索各个器官细胞复杂的基因网络在单个细胞中的运作机制。而单细胞悬浮液制备是单细胞测序的关键，其中制备无细胞团块和杂质的单细胞悬浮液难度大，且细胞成活率低，这大大降低了后续测序所需油包凝胶珠(GEM)的成功率，而开展一个样品的凝胶珠(GEM)制备成本过万元，在低成功率的情况下导致单细胞测序成本很高，因此很有必要建立达到单细胞测序标准的、可复制的鱼类血管囊单细胞测序样品的制备方法，为鱼类分子机制研究提供实验平台。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种鱼类血管囊单细胞测序样品的制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种鱼类血管囊单细胞测序样品的制备方法，取分离所得的完整鱼类血管囊经缓冲液润洗后，置于无菌滤网中，滴加缓冲液或培养基包裹血管囊，揉压血管囊，将鱼类血管囊内细胞挤压过筛，保留完整血管囊外膜在筛网上，而过筛后的细胞制成单细胞悬浮液后经过筛孔孔径不大于40μm的筛网过滤，得鱼类血管囊单细胞悬浮液，作为鱼类血管囊单细胞测序样品。

本发明中，所述无菌滤网为100目滤网。

本发明中，所述单细胞悬浮液经过筛孔孔径20-40μm的筛网过滤。

所述缓冲液为双抗杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)，含有加300-400U/mL青霉素和300-400U/mL链霉素。

本发明的优点在于：

1.本发明提供的方法通过揉压将鱼类血管囊内细胞挤压过筛，与使用研磨棒相比，可大大降低细胞过筛损伤，减少细胞碎片的产生，同时可分离出完整的血管囊外膜，减少单细胞悬浮液中的结缔组织干扰。得到单细胞悬浮液后再经过孔径在40μm以下的网筛过滤，再次去除多余细胞团和结缔组织等杂质，两次过筛后，大大降低单细胞悬浮液中的细胞团块和杂质含量，可得到几乎无细胞团和细胞碎片的完整单细胞悬浮液。

2.本发明所用液体不含钙镁离子，可避免细胞结团。

3.本发明得到的鱼类血管囊单细胞悬浮液细胞总量超过1x10⁵个，活细胞数在90％以上，细胞直径小于40μm，细胞不黏连杂质少且整个操作过程不含有Ca²⁺和Mg²⁺等影响反转录的物质，可达到单细胞测序要求。

附图说明

图1为本发明的花鲈血管囊单细胞悬浮液在血球计数板计数的显微镜照片。

图2为本发明的花鲈血管囊单细胞悬浮液经SYBR和PI染料染色后在荧光显微镜下的照片。

图3为本发明的花鲈血管囊单细胞样品油包水成功图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

以下实施例中DPBS basic(1x)缓冲液、青霉素链霉素双抗抗购于GIBCO，美国；

Propidium Iodide(PI)碘化丙锭染料购于newprobe。

实施例1花鲈血管囊单细胞测序所需单细胞悬浮液制备

1.配制溶液

双抗杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)：在DPBS中，添加青霉素链霉素双抗浓度至400U/mL。

2.无菌取血管囊

选择体质健康，外表无伤，体重2kg-2.5kg的花鲈，按照50mg/m³的浓度在暂养海水中加入MS-222，将花鲈麻醉直至鱼体翻转，腹部朝上对刺激无应激行为为止。用灭菌纱布擦除鱼体表面液体，用75％酒精棉球擦拭整个鱼体表面，在无菌环境下使用灭菌剪刀将花鲈头部剪开，用无菌镊子轻轻的将脑部组织翻转过来，即可观察到白色圆形垂体组织，红色血管囊组织以及一对月牙形的下丘脑组织。小心取出完整的花鲈血管囊组织，放入事先准备好的加有双抗DPBS的培养皿中漂洗2遍。

3.制备血管囊单细胞悬浮液

将润洗后的血管囊组织用胶管或镊子转放在40μm网筛上，在血管囊组织上滴少许DPBS至液体珠包裹住血管囊组织，然后用带有无菌手套的食指指腹在40μm网筛上轻轻揉压，将血管囊内的细胞挤压过筛，而保留完整血管囊外膜在筛网上，再用200μL DPBS轻轻冲洗指腹和滤网两次，将残留在外的血管囊细胞过筛，得到单细胞悬浮液。将单细胞悬浮液过40μm网筛一次，作为鱼类血管囊单细胞测序样品。

4.检测细胞浓度和活性

在血球计数板上计数(图1)，得到的单细胞悬浮液中细胞总量超过1x10⁵个，活细胞数在90％以上，细胞直径小于40μm，细胞不黏连杂质少；取100μL单细胞悬浮液加入10μL浓度为50μg/ml的PI染液和SYBR染液避光常温染色3分钟后用535nm激光波长、615nm发射波长的滤光器的荧光显微镜下观察拍照，绿色为活细胞核(图2)。

5.油包水制备凝胶珠(GEM)

制备好的单细胞悬浮液、10╳barcode凝胶磁珠和油滴分别加入到Chromium ChipB的不同小室，经由微流体“双十字”交叉系统形成GEM(图3)。

以上举例的仅是本发明若干具体实施例中的一种。显然，本发明不局限于以上实施案例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种鱼类血管囊单细胞测序样品的制备方法，其特征是，取分离所得的完整鱼类血管囊经缓冲液润洗后，置于无菌滤网中，滴加缓冲液或培养基包裹血管囊，揉压血管囊，将鱼类血管囊内细胞挤压过筛，保留完整血管囊外膜在筛网上，而过筛后的细胞制成单细胞悬浮液后经过筛孔孔径不大于40μm的筛网过滤，得鱼类血管囊单细胞悬浮液，作为鱼类血管囊单细胞测序样品。

2.根据权利要求1所述的鱼类血管囊单细胞测序样品的制备方法，其特征是，所述无菌滤网为100目滤网。

3.根据权利要求1所述的鱼类血管囊单细胞测序样品的制备方法，其特征是，所述单细胞悬浮液经过筛孔孔径20-40μm的筛网过滤。

4.根据权利要求1或2或3所述的鱼类血管囊单细胞测序样品的制备方法，其特征是，所述缓冲液为双抗杜氏磷酸盐缓冲液，含有加300-400U/mL青霉素和300-400U/mL链霉素。

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