DE4006293C2

DE4006293C2 - Verfahren zum Abtrennen von Zellen oder Viren

Info

Publication number: DE4006293C2
Application number: DE4006293A
Authority: DE
Inventors: Sumiaki Tsuru; Akihiko Yokoo; Takeshi Ichitsuka; Tsuneo Hiraide
Original assignee: Asahi Kogaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: Pentax Corp
Priority date: 1989-02-28
Filing date: 1990-02-28
Publication date: 1995-03-23
Anticipated expiration: 2010-03-01
Also published as: DE4006293A1; SE9000650L; SE9000650D0; US5085781A; USRE35267E

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen von Tier- oder Pflanzenzellen sowie Viren aus biologischen Flüssigkei ten.

In der Medizin und der Biochemie ist es erforderlich, eine spezielle Zellgruppe aus einer verschiedene Zellengruppen enthaltenen Suspension zu isolieren oder abzutrennen, um eine Grundauswertung der Substanzen in einem klinischen Test durchzuführen einschließlich einer Immundiagnose oder Immuntherapie. Es gibt jedoch kein Verfahren, um die gesuchten Zellen oder Zielzellen mit geringen Kosten und in kurzer Zeit abzutrennen, ohne die Verteilung der Zielzellen-Untergruppen zu än dern, wenn es beabsichtigt ist, selektiv T-Zellen, B- Zellen, K-Zellen oder NK-Zellen aus Lymphozyten zu ge winnen. Wie im folgenden beschrieben wird, ergeben sich bei der Durchführung der bekannten Verfahren eine Reihe von Problemen.

Die japanischen Offenlegungsschriften Nr. 56-140886 und 57-204454 beschreiben jeweils die Verwendung einer eine azide funktionale Gruppe enthaltenden speziellen Sub stanz oder einer hydrophoben und wasserunlöslichen spe ziellen Substanz mit Mikroporen. Nach dem in diesen Offenlegungsschriften beschriebenen Verfahren ist es möglich, T-Zellen in einem einzigen Trennschritt zu er halten. Die Ausbeute der T-Zellen ist jedoch nicht kon stant und sehr niedrig. Darüber hinaus wird die Trenn säule aufgrund der kleinen Teilchengröße der verwendeten speziellen Substanz verstopft.

Natürlich gibt es einige Zelltrennmaterialien und -verfahren, die international als brauchbar auf dem Ge biet der akademischen oder wissenschaftlichen Studien anerkannt wurden. Alle diese Materialien und Verfahren aber benötigen eine lange Zeit für die Vorbereitung des Trennverfahrens, eine sorgfältige Durchführung des Trennverfahrens und insgesamt ein zeitraubendes und schwieriges Verfahren. Darüber hinaus leiden sie an einer ungenügenden Reproduzierbarkeit, da das Trenn vermögen und das Trennmuster des verwendeten Zell- Trennmaterials in weitem Umfange von der speziellen Produktionscharge des Materials abhängen kann.

Die japanische Offenlegungsschrift Nr. 61-235752 be schreibt, daß Hydroxyapatitkörner ein spezielles Adsorptionsvermögen für Zellen haben. Jedoch ist das Wasserrückhaltevermögen und entsprechend die Trenn fähigkeit ziemlich gering, während die Zeit zur Durch führung des Verfahrens verkürzt werden kann. Die japa nische Offenlegungsschrift Nr. 63-284 dagegen be schreibt, daß infolge der Verwendung eines faserförmigen Apatits die Trennfähigkeit zusammen mit der Wasserrückhaltefähigkeit verbessert werden kann. Es ist jedoch hier zu bemerken, daß im allgemeinen ein faserförmiges Füllmaterial mit dem faserförmigen Apatit gemäß der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 63-284 keine gleichförmige Füllung ergibt, wenn es in eine Säule gepackt wird. Ferner liefert es keine stabileren Ergebnisse im Vergleich mit einem granulatartigen Füll material, da die Ergebnisse abhängig von der verwende ten Charge in einem weiten Bereich streuen.

Auf dem Gebiet der Immundiagnose ist unter der Bezeich nung "SEPHADEX G10" ein Verfahren bekannt, das Dextranzellen verwendet. Das Prinzip dieses Verfahrens ist zwar nicht vollständig aufgeklärt. Man geht jedoch davon aus, daß ein bestimmtes Niveau, d. h. Größe oder Kleinheit der Adhäsionseigenschaft der Zellen die füh rende Rolle bei diesem Verfahren spielt. Makrophagen oder adhäsionsfähige zusätzliche Zellen mit großen Ab messungen werden nämlich durch Adsorption abgetrennt, während T-Zellen und B-Zellen die Säule passieren. Bei diesem Verfahren ist es jedoch wesentlich, daß kleine nicht adsorptionsfähige zusätzliche Zellen die Säule passieren und daß die Untergruppen der T-Zellen an dem Füllmaterial haften. Wegen der unerwünschten Haftung der T-Zellen ist es unmöglich, eine vollständige Population oder Verteilung der T-Zellen zu erhalten. Diese Probleme müssen gelöst werden, wenn man das SEPHADEX G10-Verfahren in der Immundiagnose effektiv einsetzen will. Ferner ist auch eine Trennsäule be kannt, die als Füllmaterial Nylonwolle enthält. Diese Trennsäule wird im allgemeinen verwendet, um T-Zellen reiche Zellgruppen getrennt zu erhalten. Die tatsächli che Ausbeute der als Zielzellen gesuchten T-Zellen ist jedoch relativ gering und liegt im Bereich von 12 bis 25%. Während außerdem die T-Zellen mit einer relativ hohen Reinheit erhalten werden, hat sich die Verteilung der T-Zellen-Untergruppen nach dem Durchlaufen der Säule geändert. D.h. die Verteilung der separierten T- Zellen-Untergruppen ist nicht dieselbe wie die Vertei lung der nicht separierten T-Zellen-Untergruppen in der Zellsuspension. Zusätzlich zu der Variation der Zellverteilung ändert sich auch das Trennvermögen und das Trennmuster abhängig von verschiedenen Faktoren wie beispielsweise der speziellen Charge der ausgewählten Nylonwolle, des speziellen Spleißverfahrens für die Wolle, des speziellen Füllverfahrens und des speziellen Waschverfahrens, obwohl die Wolle nach dem Wiegen in die Säule eingefüllt wird.

Wie man aus der obigen Beschreibung erkennt, befinden sich die Zelltrennverfahren, die auf der Adsorptionseigenschaft der Zellen basieren, gegenwärtig noch am Anfang der praktischen Verwendbarkeit. Es ist daher wünschenswert, das Zelltrennverfahren zu verbessern und ein neues Verfahren zu schaffen, das eine hohe Ausbeute, hohe Geschwindigkeit und Genauigkeit bei der Trennung von Zellen erlaubt. Wenn sich diese Verbesse rung erreichen läßt, können Zelltrennverfahren im wei teren Umfange und in vorteilhafter Weise auf verschie denen wichtigen Gebieten wie der Biotechnologie und der Medizin, beispielsweise der Immundiagnose und der Immuntherapie verwendet werden.

Neben der Zelltrennung ist auch das Abtrennen von Viren ein wichtiges Problem auf dem Gebiet der Medizin und der Biochemie. Da die Abtrennung von Viren wesentlich für die Prophylaxe und die Behandlung von Virus krankheiten, wie beispielsweise Influenza ist, und in jüngster Zeit Krankheitserreger wie AIDS-Viren stark zugenommen haben, ist die Verbesserung der Virentrenn verfahren für die medizinische Versorgung besonders dringlich geworden. Derzeit sind insbesondere zur Ab trennung von Hepatitis-B-Viren verschiedene Virustrenn verfahren bekannt, die polymere Membranen, Hohlfasern oder Ionenaustauscherharze verwenden. Diese Trenn verfahren sind jedoch schwierig durchzuführen und benö tigen aufgrund des speziellen Trennsystems eine teuere Einrichtung. Dies ist der Grund, weshalb diese Verfah ren bisher noch nicht in einem praktisch nennenswerten Umfange genutzt wurden.

Wie bereits oben erwähnt wurde, lehren die japanischen Offenlegungsschriften 61-235752 und 63-284 die Verwen dung von Hydroxyapatitkörnern bei der Zelltrennung. Diese Verfahren haben jedoch zahlreiche Nachteile. Diese Schriften sagen auch nichts über die Verwendung dieses Granulats zur Virustrennung aus. Ferner be schreibt auch die japanische Offenlegungsschrift Nr. 63-16045 die Verwendung eines porösen Calciumphosphatgranulates als Füllmaterial für die Flüssigchromatographie. Calciumphosphatkörner können in einer chromatographischen Säule verwendet werden, um Biopolymere wie Proteine selektiv abzutrennen und zu reinigen. Diese Offenlegungsschrift sagt jedoch nichts aus über ein Adsorptions- und Trennmittel für Zellen oder Viren.

Aus der DE-OS 24 10 848 ist ein Verfahren zur Herstellung poröser Polyvinylacetylgebilde bekannt. Die Porengröße bei diesem Material liegt zwischen 0,02 mm und 2 mm. Derartige Polyvinylacetylgebilde können gemäß der DE-OS 20 27 843 als Filtermaterial verwendet werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Trennverfahren anzugeben, das als Zell- oder Virus- Trennverfahren verwendet werden kann, das bei seiner derartigen Verwendung die Vorbehandlung, die vorbereitenden Maßnahmen oder das Trennverfahren selbst vereinfacht, zu einer raschen Trennung bei niedrigen Kosten führt und mit einer guten Reproduzierbarkeit durchgeführt werden kann, und das darüber hinaus eine deutlich erhöhte Trennfähigkeit aufweist sowie eine einfache Steuerung des resultierenden Trennmusters ermöglicht.

Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst, wobei insbesondere ein Trennmittel zum Abtrennen von Zellen oder Viren aus einem Polyvinylacetalharz mit offener Zellstruktur und einer mittleren Porengröße von 10 bis 1000 µm verwendet wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Abtrennen von Zellen oder Viren wird eine biologische Flüssigkeit, welche die abzutrennenden Zellen oder Viren enthält, durch eine Säule geleitet, die mit dem oben beschriebenen Trennmittel gefüllt ist.

Weitere Merkmale und Vorteile ergeben sich aus den Unteransprüchen und der fol genden Beschreibung, welche in Verbindung mit der bei gefügten Zeichnung die Erfindung anhand von Aus führungsbeispielen erläutert. Es zeigt

Fig. 1 einen schematischen Querschnitt durch eine Trennvorrichtung für Zellen oder Viren zur Durchführung eines Trennverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung,

Das erfindungsgemäß zu verwendende Trennmittel zum Trennen von Zellen oder Viren besteht aus einem Polyvinylacetalharz mit offenzelliger Struktur und einer mittlerer Porengröße (Durchmesser) von ca. 10 bis 1000 µm.

Das oben genannte Trennmittel wird aus Polyvinylacetalharz mit speziellen Poren und einer spe ziellen Verteilung derselben hergestellt. Zur Bildung eines Trennmittels geeignete Polyvinylacetalharze sind solche, die teilweise oder vollständig durch die Acetalisierung von Hydroxylgruppen von Polyvinylalkohol mit Aldehyd entstehen. Die Acetalisierung wird durch das folgende Reaktionsschema dargestellt:

Darin ist R eine Alkylgruppe, beispielsweise eine Methyl-, Äthyl- oder Butyl-Gruppe und n eine positive ganze Zahl.

Typische Beispiele des Polyvinylacetalharzes, wie es bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfassen Polyvinylformalharz, Polyvinylbutyralharz und derglei chen. Diese Polyvinylacetalharze können mit den in der Kunststoffindustrie wohlbekannten Methoden hergestellt werden. Sie werden beispielsweise durch gleichzeitige Hydrolysierung und Acetalisierung von Polyvinylacetat oder durch die Hydrolysierung von Polyvinylacetat und die anschließende Acetalisierung des erhaltenen Polyvinylalkohols erhalten. In jedem Falle sollte die Hydrolyse vollständig durchgeführt und die Acetalisierung soweit ausgeführt werden, daß mindestens 50% der Hydroxylgruppen in dem Polyvinylalkohol acetalisiert sind, um das entsprechende Polyvinylacetalharz mit einer Acetalisierungsrate von 50 bis 100% zu erhalten. Die Acetalisierungsrate von weniger als 50% sollte vermieden werden, da sie eine Deformation des Trennmittels und eine Verminderung sei ner Adsorptionseigenschaften bewirkt. Dies wiederum führt zu einer Verminderung der Separationsfähigkeit, wenn eine Kulturlösung oder dergleichen dem Element zu geführt wird. Das Polyvinylacetat, das als Ausgangs material für die Herstellung des Polyvinylacetalharzes verwendet wird, sollte vorzugsweise einen Polymerisationsgrad von ca. 200 bis 2000 haben.

Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Polyvinylacetalharz hat offene Zellen und eine mittlere Porengröße im Bereich von ca. 10 bis 1000 µm. Die Porengröße von weniger als 10 µm kann dazu führen, daß der Fluß der Lösung durch die Säule behindert und die Säule verstopft wird, da die Porengröße im Verhältnis zur Größe der abzutrennenden Zellen, d. h. der Zielzellen, zu klein ist. Auf der anderen Seite kann durch eine Porengröße von mehr als 1000 µm das Trennvermögen des Trennmittels durch die verringerte Oberfläche für die Adsorption verringert werden. Die offene Zellstruktur des Polyvinylacetalharzes wird gebildet, wenn die Polymerisation in Anwesenheit eines Treibmittels ausge führt wird. Die Bildung der offenzelligen Struktur kann jedoch auch durch irgendein anderes wohlbekanntes Ver fahren hergestellt werden.

Das in der oben beschriebenen Weise aus Polyvinylacetalharz hergestellte Trennmittel zum Ab trennen von Zellen oder Viren hat vorzugsweise eine po röse, schwammartige Struktur und insbesondere die Form eines schwammähnlichen Tuches oder Blattes. Das blattförmige Trennmittel wird vorzugsweise in der Säule der Trennvorrichtung geschichtet, nachdem es in Form von Scheiben mit einem dem Innendurchmesser der Säule entsprechenden Durchmesser hergestellt wurde. Diese Herstellung kann durch ein Herstellungsverfahren wie Stanzen oder Schneiden erfolgen. Eine ausreichende An zahl der so erhaltenen Scheiben mit einer gewünschten Dicke des Trennmittels oder Füllmittels sind in der Säule übereinander geschichtet. Wenn ein granulat- oder pulverförmiges Harz verwendet wird, kann man gleichzei tig eine Sperre wie beispielsweise ein Sieb oder einen Filter verwenden, um das Ausfließen des eingefüllten Harzes aus der Säule zu verhindern. Es ist zu bemerken, daß sphärisches Harzgranulat bei der Zelltrennung oder Virustrennung leicht verstopfen kann und daß dadurch kein gleichförmiger Durchfluß der Lösung aufrechterhal ten werden kann. Es ist nämlich schwierig, ständig eine gleichförmige Porengröße des Harzes aufrechtzuerhalten. Daher verursacht die Verwendung des sphärischen Harzgranulates Schwierigkeiten bei der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.

Eine Trennvorrichtung zur Trennung von Zellen oder Viren für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt einen Be hälter, in den ein Polyvinylacetalharz mit offener Zellstruktur und einer mittleren Porengröße von ca. 10 bis 1000 µm eingefüllt ist. Das Polyvinylacetalharz, das als Füllmittel für den Behälter verwendet wird, wurde im vorstehenden als Trennmittel beschrieben.

Der in der Trennvorrichtung verwen dete Behälter kann unterschiedliche Formen haben, wie sie auf dem Gebiet der Zell- oder Virustrennung Verwen dung finden. Er kann beispielsweise als Säule, Rohr, Schlauch, Spritzenkörper oder dergleichen ausgebildet sein. Das Polyvinylacetalharz wird, wie dies oben be schrieben wurde, vorzugsweise in den Behälter in Scheibenform eingefüllt. Die Schichtdicke des ein gefüllten Harzes in dem Behälter kann von verschiedenen Faktoren wie beispielsweise der abzutrennenden speziel len Zell- oder Virusart, einem speziellen Harz oder dergleichen abhängen.

In der Trennvorrichtung nach Fig. 1 enthält ein Behälter oder eine zylindrische Säule 1 das Trennmittel 2 zum Abtrennen von Zellen oder Viren. Obwohl dies im einzelnen nicht dargestellt ist, besteht das Trennmittel 2 aus einem Laminat von blattförmigen Schichten aus Polyvinylacetalharz Selbstverständlich kann das Trenn mittel 2 auch eine Schicht aus einem Polyvinylacetalgranulat sein. In diesem Fall wird vor zugsweise ein Sieb oder ein Filter in dem Bodenbereich des Trennmittels 2 vorgesehen.

Verwendet man einen Separator gemäß Fig. 1, wird eine biologische Flüssigkeit, welche die abzutrennenden Zel len oder Viren enthält, über eine Einlaßöffnung 3 in die Säule 1 eingeführt. Die Trennung erfolgt, während die biologische Flüssigkeit durch das Trennmittel 2 hindurchfließt. Dabei werden nur die nicht-adsorptiven Zellen oder Viren durch die Auslaßöffnung 4 der Trenn vorrichtung abgeführt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Abtrennen von Zellen oder Viren wird eine biologische Flüssigkeit durch einen Behälter oder eine Säule der Trennvor richtung hindurchgeführt, in welcher das oben beschrie bene Trennmittel als Füllstoff angeordnet ist.

In der Praxis wird die Säule zur Durchführung des erfindungs gemäßen Verfahrens vor dem Trennschritt im allgemeinen mit einer Waschlösung vorbehandelt, um un erwünschte kontaminierende Stoffe oder dergleichen aus der Säule auszuwaschen. Nach dem Waschvorgang wird die biologische Flüssigkeit in die Säule eingefüllt. Die zu verwendende biologische Flüssigkeit ist beliebig. Typi sche Beispiele für eine solche biologische Flüssigkeit sind Blut, Serum, Urin, Speichel und Suspensionen von Zellen und/oder Viren sowie eine verdünnte Lösung des ganzen Blutes, in der das Blut mit einem geeigneten Koagulationsinhibitor vermischt ist. Die Mischung wird mit einer Kulturlösung verdünnt, um das Volumen der Mi schung um den Faktor 1 bis 10 zu vergrößern. Insbeson dere wird hier eine Zellsuspension als biologische Flüssigkeit verwendet. Nachdem die biologische Flüssig keit ausreichend in das Trennmittel eingedrungen ist, erfolgt eine Waschung mit einer Waschlösung, um die nicht adsorptiven Zellen und dergleichen aus der Säule auszuwaschen und aufzufangen.

Die Waschlösung und gegebenenfalls die Grundflüssigkeit für eine Suspension umfassen beispielsweise ein Kulturmedium, wie beispielsweise Hank′s Puffer-Salz- Lösung (HBSS), ein Serum-Medium (RPMI-1640 und andere) oder ein chemisch definiertes Medium, eine physiologische Salzlösung oder andere herkömmlicher weise als Waschlösung in diesem Gebiet verwendete Lö sungen. Der Trennschritt wird vorzugsweise bei einer Temperatur ausgeführt, die von Raumtemperatur bis unge fähr 370°C betragen kann, um unerwünschte und schädi gende Einflüsse auf die Zellen oder Viren der biologi schen Flüssigkeit zu vermeiden.

Erstaunlicherweise und völlig unerwartet haben die ab getrennten Zellen oder Viren charakterische Merkmale, wie Überlebensprozentsatz oder andere Eigenschaften, die im wesentlichen denen der Zielzellen oder Viren in der biologischen Flüssigkeit entsprechen. So zeigen beispielsweise die aus dem Lymphozyten separierten T- Zellen eine Steuerbarkeit der Antikörperproduktion oder andere charakteristische Merkmale, die im wesentlichen identisch sind mit jenen, die in dem Lymphozyten vor dem Trennschritt bestimmt wurden.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß bei der erfindungsgemäßen Verwendung eines Trennmittels das aus Polyvinylacetalharz mit offenzelliger Struktur und einer Porengröße von 10 bis 1000 µm besteht, die ge suchten Zellen oder Viren im Vergleich zu den herkömm lichen Trennverfahren bei hoher Trennungsausbeute und ohne Änderung einer Zell- oder Virenverteilung vor und nach der Trennung in sehr stabiler Weise aus der biologischen Flüssigkeit abgetrennt werden können. Da fer ner bei diesem Trennverfahren komplizierte Schritte, wie eine Inkubation, nicht erforderlich sind, ist es möglich, den Trennvorgang deutlich zu vereinfachen und die zur Trennung erforderliche Zeit bemerkenswert zu verkür zen. Darüber hinaus kann ein nur einen Schritt um fassendes Verfahren bei der Trennung verwendet werden. Die biologische Flüssigkeit, welche die abzutrennenden Zellen oder Viren enthält, kann direkt in die mit dem Trennmittel gefüllte Säule gegossen werden.

Darüber hinaus ist das Polyvinylacetalharz im Handel zu geringem Preis erhält lich und kann bei Herstellung in Form eines blattförmigen Trennelementes auf einfache Weise in die Säule eingesetzt werden, indem man das Blatt entspre chend der Größe und Form der Säule zurechtschneidet. Das blattförmige Trennelement kann offensichtlich sehr rasch und einfach zurechtgeschnitten und in die Säule eingesetzt werden, wobei man darüber hinaus keinerlei Stützeinrichtung benötigt, wie sie üblicherweise bei einem pulverförmigen Trennmedium in der Säule erforder lich ist. Schließlich kann die Trennvorrichtung, d. h. eine mit dem Trennmittel gefüllte Säule nach ihrer Sterilisation mit irgendeinem geeigneten Sterilisationsmittel wie beispielsweise Äthylenoxydgas (EO) problemlos als sterilisiertes und versiegeltes Produkt auf den Markt gebracht werden.

Da ferner das Trennmittel gleichförmig in die Säule eingefüllt wird, ist kein Verstopfen während des Trennvorganges zu befürchten. Man kann einen gleichförmigen Durchfluß der biologischen Flüssigkeit und daher auch eine effektive und stabile Trennung der Zellen oder Viren vom Beginn bis zum Ende des Trennvorganges erreichen. Wenn eine große Menge von Zellen in dem Trennverfahren behandelt werden muß, kann man schließlich die Durchflußrate der biologischen Flüssigkeit durch die Säule zur Erreichung der optimalen Resulate frei steuern, indem man die Querschnittsfläche der Polyvinylacetalharzschicht, die Porengröße des Harzes, die Schichtdicke oder die Füll höhe in der Säule oder andere Faktoren verändert.

Das erfindungsgemäße Trennverfahren kann vorzugsweise für viele Zwecke verwendet werden wie beispielsweise das Abtrennen von Viren aus biologischen Flüssigkeiten, die Gewinnung einer speziellen Zellgruppe wie bei spielsweise T-Zellen aus dem gesamten Blut oder Lymphozyten oder für andere Zwecke. Insbesondere bei der Abtrennung von Zellen aus dem gesamten Blut ist es wünschenswert, daß nach der Abnahme des Blutes aus dem menschlichen Körper dieses mit einem Blutkoagulationsinhibitor wie beispielsweise Heparin oder Zitronensäure vermischt wird. Die Mischung wird mit einer Kulturlösung als einem Verdünnungsmittel ver dünnt, um das Volumen der Mischung um das Ein- bis Zehnfache zu vergrößern. Als Ergebnis der Verdünnung des Blutes wird die Abtrennung der Zellen stärker be schleunigt, da die Viskosität des Blutes abnimmt. Eine Verdünnung des Blutes über das Zehnfache sollte jedoch vermieden werden, da sonst die Menge der zu behandeln den Mischung in nicht akzeptabler Weise vergrößert wird.

In der Praxis wird das erfindungsgemäße Trennverfahren bei einem granulat- oder pulverförmigen Harz als Trennmittel vorzugsweise in der folgenden Weise durchgeführt. Um eine Rückhaltung des Trennmittels in einem Behälter wie beispielsweise einer Säule der Trennvorrichtung zu ge währleisten, wird ein Füllmaterial wie beispielsweise Glaswolle in den Austrittsabschnitt des Behälters ge füllt. Anschließend wird das Trennmittel in einen Mittelabschnitt des Behälters eingefüllt. Das eingefüllte Trennmittel kann mit einer geeigneten Waschlösung gewaschen werden, um kontaminierende Stoffe und dergleichen zu entfernen. Nach Abschluß des Waschvorganges wird eine die gesuchten Zielzellen oder Viren enthaltende biologische Flüssigkeit in den Behälter gegossen. Nachdem die bio logische Flüssigkeit das Trennmittel in dem Behälter ausreichend durchströmt hat, wird das Trennmittel wie derum mit der Waschlösung ausgewaschen, um die nicht adsorptierten Zellen oder Viren zu entfernen und wieder zu gewinnen.

Die Suspension oder Waschlösung, die bei dem erfindungsgemäßen Trennverfahren verwendet wird, kann in geeigneter Weise aus den bekannten Lösungen ausge wählt werden je nach Art der speziellen Zellen oder Viren, die abgetrennt werden sollen. Typische Beispiele solcher Lösungen und der bevorzugte Bereich der Arbeitstemperatur bei dem Trennverfahren wurden oben bereits beschrieben.

Wie sich aus der obigen Beschreibung ergibt und wie noch anhand der folgenden Ausführungsbeispiele erläu tert wird, kann das Adsorptions-/Trennmittel eine hohe Adsorptionsfähigkeit im Hinblick auf Viren und Tier- oder Pflanzenzellen zeigen. Daher kann es in wirkungsvoller Weise dazu eingesetzt werden, solche Viren und Zellen aus- biologischen Flüssigkeiten abzutrennen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere ge eignet, um nur T-Zellen aus biologischen Flüssigkeiten wie beispielsweise dem gesamten Blut abzutrennen, da es keinen Einfluß auf die T-Zellen hat, während die B- Zellen und Makrophagen selektiv an dem Trennmittel adsorbiert werden. Da ferner insbesondere die T-Zellen mit hoher Reinheit gewonnen werden können, ohne die Verteilung der Untergruppen derselben zu ändern, kann das Trennmittel zusätzlich zur Analyse der T-Zellen mit Vorteil bei immunologischen Studien und klinischen Tests eingesetzt werden. Als Beispiele von klinischen Tests, bei denen das erfindungsgemäße Trennverfahren ver wendet werden kann, sind Test zu nennen, wie beispiels weise die Bestimmung der Verteilung von T-Zellen und Funktionstests. Diese Tests werden bei der Behandlung von Krebs, Autoimmunkrankheiten, AIDS und anderen Krankheiten vorgenommen. Bei einem klinischen Test, bei dem nach der Abnahme des Blutes das gesamte Blut unmit telbar anschließend in einer Testvorrichtung geprüft wird, besteht die Möglichkeit, zunächst die B-Zellen und die Makrophagen aus dem ganzen Blut zu entfernen, und dadurch die Möglichkeit zu einer sehr genauen Über prüfung der T-Zellen zu schaffen.

Zusätzlich zu diesen Vorzügen ist es erfindungsgemäß möglich, die Zell- oder Virustrennung mit hoher Reproduzierbarkeit und einer kurzen Zeit durchzuführen, da das Trennmittel ein ausreichend verbessertes Wasserrückhaltevermögen hat und darüber hinaus eine hervorragende Mikroporenstruktur besitzt. Da ferner bei dem erfindungsgemäßen Trennverfahren ein Inkubationsschritt entfallen kann, ist es auch möglich, das Trennverfahren erheblich zu vereinfachen.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden unter Be zugnahme auf einige Arbeitsbeispiele noch näher erläu tert, wobei jedoch der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht auf diese Ausführungsbeispiele be schränkt ist. Zur Durchführung der folgenden Beispiele wurden Trennvorrichtungen der in Fig. 1 dar gestellten Art verwendet.

Beispiel 1

Eine spritzenkörperartige Säule mit einem Innenvolumen von 5 ml wurde mit einem kleingeschnittenen Blatt aus Polyvinylformalharz ("Sponch Bell - ETA", Produkt von Kanebo) mit einer mittleren Porengröße von 100 µm und einer Formalisierungsrate von 80 bis 86% gefüllt, um einen Zellseparator mit einem Inhalt von 2 ml herzu stellen. Das kleingeschnittene Blatt hatte 13 mm Durch messer und 16 mm Dicke. Das Füllmaterial der Säule wurde gewaschen, zunächst mit destilliertem Wasser und anschließend mit HBSS bei einer Temperatur von 37°C. Nach dem Waschen wurden 0,2 ml von HBSS, in dem mononukleare Zellen suspendiert waren, auf das Füll material gegossen, so daß es das Füllmaterial durch dringen koste. Die mononuklearen Zellen waren solche, die vorher durch eine übliche Dichtegradienten- Zentrifugierung aus dem normalen peripheren menschlichen Blut isoliert worden waren. Nachdem der Durchlauf durch das Füllmaterial abgeschlossen war, wurden die nichtadsorptiven Zellen aus der Säule entfernt, indem das Füllmaterial wieder mit HBSS gewaschen wurde.

Bei dieser Zelltrennung wurden die folgenden drei Tests durchgeführt, um das Trennvermögen der verwendeten Trenneinrichtung zu bestimmen.

Test 1

Die Anzahl der Zellen wurde in einem Hämozythometer so wohl vor als auch nach dem Durchlauf der Zellsuspension durch die Säule gezählt. Die Ergebnisse dieses Tests sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt.

Test 2

Der Status der Zelltrennung wurde geprüft. Um diese Prüfung durchzuführen, wurden die Zellen in dem Abfluß aus der Säule mit Fluorescein konjugierten An tikörpern CD3 (Anti-Leu 4) oder CD19 (Anti-Leu 12 gefärbt. An schließend wurde der Prozentsatz an T-Zellen und B- Zellen mit Hilfe eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACS) bestimmt. Die Ergebnisse dieses Tests sind in der folgenden Tabelle 2 dargestellt.

Test 3

Die Verteilung von T-Zellen-Untergruppen wurde be stimmt. Um diese Bestimmung durchzuführen, wurden die Zellen in der abfließenden Flüssigkeit aus der Säule mit Fluorescein konjungierten Antikörpern, CD8 (Anti-Leu 2a) oder CD4 (Anti-Leu 3a (gefärbt oder markiert). Anschließend wurde der Prozentsatz von Supressor- und Helfer-T-Zellen unter Verwendung des FACS bestimmt. Die Ergebnisse dieses Tests sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt.

Die für die Trennung erforderliche Zeit:

Die Zeit, die von der Vorbereitung der Säule bis zum Abschluß der Trennung erforderlich war, wurde aufge zeichnet. Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle 4 zusammengefaßt.

Beispiel 2

Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß als Füllmaterial ein kleingeschnittenes Blatt aus Polyvinylformalharz mit einer mittleren Porengröße von 500 µm und einem Formalisationsgrad von 80 bis 86% verwendet wurde. Die Ergebnisse der Tests 1, 2 und 3 und die erforderliche Zeit für die Trennung wurden in den folgenden Tabellen 1 bis 4 zusammenge faßt.

Beispiel 3

Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß als Füllmaterial ein kleingeschnittenes Blatt aus Polyvinylbutyralharz mit einer mittleren Porengröße von 100 µm und einem Butyralisationsgrad von 80 bis 86% verwendet wurde.

Die Ergebnisse der Test 1, 2 und 3 sowie die für die Trennung erforderliche Zeit wurden in den folgenden Ta bellen 1 bis 4 zusammengefaßt.

Vergleichsbeispiel 1

Eine handelsübliche Nylonwolle wurde über Nacht in ein ausreichendes Volumen einer 0,1 N HCl-Lösung eingetaucht und anschließend mehrere Male unter Ausdrücken in deionisiertem Wasser ausgewaschen. Die gewaschene Wolle wurde dann bei 30°C für 3 Stunden getrocknet. Auf diese Weise wurde eine vorbehandelte Nylonwolle erhalten.

Eine spritzenkörperartige Säule mit einem Innenvolumen von 5 ml, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde, wurde mit 0,25 g der vorbehandelten Nylonwolle gefüllt, um einen Zellseparator mit einem Füllvolumen von ca. 3 ml zu schaffen. Das Füllmaterial der Säule wurde anschlie ßend mit einer physiologischen Salzlösung sowie einem Hank′schen Medium bei einer Temperatur von 37°C gewa schen. Nach dem Waschen wurden 0,2 ml einer Suspension von Monozyten in dem HBSS mit schwimmenden Monozyten auf das Füllmaterial gegossen, so daß sie in dieses eindringen konnten. Die Monozyten waren solche, die vorher durch Zentrifugieren in herkömmlicher Weise aus normalem menschlichen peripheren Blut isoliert wurden. Nach dem Durchfluß des HBSS wurde die Inkubation bei 37°C für 1 Stunde fortgesetzt. Anschließend wurden die nicht-adsorbierten Zellen aus der Säule durch Waschen des Füllmaterials mit dem Hank′schen Medium wieder ausgewaschen.

Bei dieser Zelltrennung wurden die Tests 1, 2 und 3 gemäß Beispiel 1 durchgeführt, um das Trennvermögen des verwendeten Separators zu bestimmen. Die Ergebnisse der Tests sind zusammen mit der für die Trennung erforderlichen Zeit in den folgenden Tabellen 1 bis 4 zusammengefaßt.

Zellausbeute
Beispiel Nr.
Ausbeute (%)
Beispiel 1
57
Beispiel 2	50
Beispiel 3	49
Vergleichsbeispiel 1	25

Tabelle 2

Status der Zelltrennung

(Prozentsatz)

Tabelle 3

Verteilung von T-Zellen-Untergruppen

(Prozentsatz)

Für Trennung erforderliche Zeit
Beispiel Nr.
Zeit
Beispiel 1\|30 Min.
Beispiel 2	30 Min.
Beispiel 3	30 Min.
Vergleichsbeispiel 1	2 Tage

Man erkennt aus diesen Ergebnissen, daß die hervorragende Ausbeute und das gute Trennvermögen beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht nur merklich höher als die entsprechenden Werte bei einem herkömmlichen Füll material (Nylonwolle) sondern auch stabil sind, und daß die Verteilung der abgetrennten T-Zellen-Untergruppen im wesentlichen dieselbe wie vor der Abtrennung ist. Darüber hinaus ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, eine rasche Trennung durchzuführen, da zeitintensive Waschvorgänge und 1 Stunde Inkubation, die bei dem herkömmlichen Füllmaterial erforderlich waren, entfallen sind. In den Beispielen 1 bis 3 wurde die Erfindung anhand der Trennung und Ausbeute von T-Zellen erläutert. Ähnlich gute Resultate wurden jedoch auch bei der Trennung anderer Zellen oder Viren erhalten.

Claims

1. Verfahren zum Abtrennen von Zellen und/oder Viren, dadurch gekennzeichnet, daß eine die Zellen oder Viren enthaltende Flüssigkeit durch ein Trennmittel hindurchgeleitet wird, das aus Polyvinylacetalharz mit einer offenzelligen Struktur und einer mittle ren Porengröße von 10 bis 1000 µm besteht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyvinylacetalharz einen Acetalisierungs grad von 50 bis 100% hat.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß das Polyvinylacetalharz eine poröse Schwammstruktur hat.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyvinylacetalharz in Form eines schwamm artigen Blattes vorliegt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, da durch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit Blut, Serum, Urin, Speichel oder eine Suspension von Zellen und/oder Viren ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da durch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit eine verdünnte Lösung von Blut ist, in der dem Blut ein Blutkoagulationsinhibitor hinzugefügt wurde und die mit einer Kulturlösung zur Vergrößerung des Volumens um das Ein- bis Zehnfache verdünnt wurde.