DE4006293A1

DE4006293A1 - Trennmittel, trennvorrichtung und verfahren zum abtrennen von zellen oder viren

Info

Publication number: DE4006293A1
Application number: DE4006293A
Authority: DE
Inventors: Sumiaki Tsuru; Akihiko Yokoo; Takeshi Ichitsuka; Tsuneo Hiraide
Original assignee: Asahi Kogaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: Pentax Corp
Priority date: 1989-02-28
Filing date: 1990-02-28
Publication date: 1990-08-30
Anticipated expiration: 2010-03-01
Also published as: US5085781A; USRE35267E; SE9000650D0; DE4006293C2; SE9000650L

Description

Die Erfindung betrifft das Abtrennen von Tier- oder Pflanzenzellen sowie Viren aus biologischen Flüssigkei ten. Insbesondere befaßt sich die Erfindung mit einem Trennmittel, einer Trennvorrichtung und einem Verfahren zum Abtrennen der Zellen oder Viren.

In der Medizin und der Biochemie ist es erforderlich, eine spezielle Zellgruppe aus einer verschiedene Zellengruppen enthaltenen Suspension zu isolieren oder abzutrennen, um eine Grundauswertung der Substanzen in einem klinischen Test durchzuführen einschließlich einer Immundiagnose oder Immuntherapie. Es gibt jedoch kein Verfahren, um die gesuchten Zellen oder Zielzellen mit geringen Kosten und in kurzer Zeit abzutrennen, ohne die Verteilung der Zielzellen-Untergruppen zu än dern, wenn es beabsichtigt ist, selektiv T-Zellen, B- Zellen, K-Zellen oder NK-Zellen aus Lymphozyten zu ge winnen. Wie im folgenden beschrieben wird, ergeben sich bei der Durchführung der bekannten Verfahren eine Reihe von Problemen.

Die japanischen Offenlegungsschriften 56-1 40 886 und 57-2 04 454 beschreiben jeweils die Verwendung einer eine azide funktionale Gruppe enthaltenden speziellen Sub stanz oder einer hydrophoben und wasserunlöslichen spe ziellen Substanz mit Mikroporen. Nach dem in diesen Offenlegungsschriften beschriebenen Verfahren ist es möglich, T-Zellen in einem einzigen Trennschritt zu er halten. Die Ausbeute der T-Zellen ist jedoch nicht kon stant und sehr niedrig. Darüber hinaus wird die Trenn säule verstopft aufgrund der kleinen Teilchengröße der verwendeten speziellen Substanz.

Natürlich gibt es einige Zelltrennmaterialien und -verfahren, die international als brauchbar auf dem Ge biet der akadamischen oder wissenschaftlichen Studien anerkannt wurde. Alle diese Materialien und Verfahren aber benötigen eine lange Zeit für die Vorbereitung des Trennverfahrens, eine sorgfältige Durchführung des Trennverfahrens und insgesamt ein zeitraubendes und schwieriges Verfahren. Darüber hinaus leiden sie an einer ungenügenden Reproduzierbarkeit, da das Trenn vermögen und das Trennmuster des verwendeten Zell- Trennmaterials in weitem Umfange von der speziellen Produktionscharge des Materials abhängen kann.

Die japanische Offenlegungsschrift 61-2 35 752 be schreibt, daß Hydroxyapatitkörner ein spezielles Adsorptionsvermögen für Zellen haben. Jedoch ist das Wasserrückhaltevermögen und entsprechend die Trenn fähigkeit ziemlich gering, während die Zeit zur Durch führung des Verfahrens verkürzt werden kann. Die japa nische Offenlegungsschrift 63-284 dagegen be schreibt, daß infolge der Verwendung eines faserförmigen Apatits die Trennfähigkeit zusammen mit der Wasserrückhaltefähigkeit verbessert werden kann. Es ist jedoch hier zu bemerken, daß im allgemeinen ein faserförmiges Füllmaterial mit dem faserförmigen Apatit gemäß der japanischen Offenlegungsschrift 63-284 keine gleichförmige Füllung ergibt, wenn es in eine Säule gepackt wird. Ferner liefert es keine stabileren Ergebnisse im Vergleich mit einem granulatartigen Füll material, da die Ergebnisse abhängig von der verwende ten Charge in einem weiten Bereich streuen.

Auf dem Gebiet der Immundiagnose ist unter der Bezeich nung "SEPHADEX G10" ein Verfahren bekannt, das Dextranzellen verwendet. Das Prinzip dieses Verfahrens ist zwar nicht vollständig aufgeklärt. Man geht jedoch davon aus, daß ein bestimmtes Niveau, d. h. Größe oder Kleinheit der Adhäsionseigenschaft der Zellen die füh rende Rolle bei diesem Verfahren spielt. Makrophagen oder adhäsionsfähige zusätzliche Zellen mit großen Ab messungen werden nämlich durch Adsorption abgetrennt, während T-Zellen und B-Zellen die Säule passieren. Bei diesem Verfahren ist es jedoch wesentlich, daß kleine nicht adsorptionsfähige zusätzliche Zellen die Säule passieren und daß die Untergruppen der T-Zellen an dem Füllmaterial haften. Wegen der unerwünschten Haftung der T-Zellen ist es unmöglich, eine vollständige Population oder Verteilung der T-Zellen zu erhalten. Diese Probleme müssen gelöst werden, wenn man das SEPHADEX G10-Verfahren in der Immundiagnose effektiv einsetzen will. Ferner ist auch eine Trennsäule be kannt, die als Füllmaterial Nylonwolle enthält. Diese Trennsäule wird im allgemeinen verwendet, um T-Zellen reiche Zellgruppen getrennt zu erhalten. Die tatsächli che Ausbeute der als Zielzellen gesuchten T-Zellen ist jedoch relativ gering und liegt im Bereich von 12 bis 25%. Während außerdem die T-Zellen mit einer relativ hohen Reinheit erhalten werden, hat sich die Verteilung der T-Zellen-Untergruppen nach dem Durchlaufen der Säule geändert. D. h. die Verteilung der separierten T- Zellen-Untergruppen ist nicht dieselbe wie die Vertei lung der nicht separierten T-Zellen-Untergruppen in der Zellsuspension. Zusätzlich zu der Variation der Zellverteilung ändert sich auch das Trennvermögen und das Trennmuster abhängig von verschiedenen Faktoren wie beispielsweise der speziellen Charge der ausgewählten Nylonwolle, des speziellen Spleißverfahrens für die Wolle, des speziellen Füllverfahrens und des speziellen Waschverfahrens, obwohl die Wolle in die Säule nach dem Wiegen eingefüllt wird.

Wie man aus der obigen Beschreibung erkennt, befinden sich die Zelltrennverfahren, die auf der Adsorptionseigenschaft der Zellen basieren, gegenwärtig noch am Anfang der praktischen Verwendbarkeit. Es ist daher wünschenswert, das Zelltrennmaterial und die Zelltrennverfahren zu verbessern und eine neues Trenn material zu entwickeln, das ein Verfahren mit hoher Ausbeute, hoher Geschwindigkeit und Genauigkeit bei der Trennung von Zellen erlaubt. Wenn sich diese Verbesse rung erreichen läßt, können Zelltrennverfahren im wei teren Umfange und in vorteilhafter Weise auf verschie denen wichtigen Gebieten wie der Biotechnologie und der Medizin, beispielsweise der Immundiagnose und der Immuntherapie verwendet werden.

Neben der Zelltrennung ist auch das Abtrennen von Viren ein wichtiges Problem auf dem Gebiet der Medizin und der Biochemie. Da die Abtrennung von Viren wesentlich für die Prophylaxe und die Behandlung von Virus krankheiten, wie beispeilsweise Influenza ist, und in jüngster Zeit Krankheitserreger wie AIDS-Viren stark zugenommen haben, ist die Verbesserung der Virentrenn verfahren für die medizinische Versorgung besonders dringlich geworden. Derzeit sind insbesondere zur Ab trennung von Hepatitis-B-Viren verschiedene Virustrenn verfahren bekannt, die polymere Membranen, Hohlfasern oder Ionenaustauscherharze verwenden. Diese Trenn verfahren jedoch sind schwierig durchzuführen und benö tigen eine teuere Einrichtung aufgrund des speziellen Trennsystems. Dies ist der Grund, weshalb diese Verfah ren bisher noch nicht in einem praktisch nennenswerten Umfange genutzt wurden.

Wie bereits oben erwähnt wurde, lehren die japanischen Offenlegungsschriften 61-2 35 752 und 63-284 die Verwen dung von Hydroxyapatitkörnern bei der Zelltrennung. Diese Verfahren haben jedoch zahlreiche Nachteile. Diese Schriften sagen auch nichts über die Verwendung dieses Granulats zur Virustrennung aus. Ferner be schreibt auch die japanische Offenlegungsschrift Nr. 63-16 045 die Verwendung eines porösen Calciumphosphatgranulates als Füllmaterial für die Flüssigchromatographie. Calciumphosphatkörner können in einer chromatographischen Säule verwendet werden, um Biopolymere wie Proteine selektiv abzutrennen und zu reinigen. Diese Offenlegungsschrift sagt jedoch nichts aus über ein Adsorptions- und Trennmittel für Zellen oder Viren.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbes sertes Trennmittel anzugeben, das insbesondere bei Zell- oder Virus-Trennverfahren verwendet werden kann und das bei seiner Verwendung in solchen Trennverfahren die Vorbehandlung, die vorbereitenden Maßnahmen oder das Trennverfahren selbst vereinfacht, zu einer raschen Trennung bei niedrigen Kosten führt und mit einer guten Reproduzierbarkeit durchgeführt werden kann und das darüber hinaus eine deutlich erhöhte Trennfähigkeit be sitzt sowie eine einfache Steuerung des resultierenden Trennmusters ermöglicht. Eine weitere Aufgabe der Er findung besteht in der Schaffung einer verbesserten Trennvorrichtung unter Verwendung eines derartigen Trennmittels sowie zur Verbesserung des Trenn verfahrens.

Zur Lösung dieser Aufgabe besteht gemäß einem ersten Merkmal der Erfindung das Trennmittel zum Abtrennen von Zellen oder Viren aus einem Polyvinylacetalharz mit of fener Zellstruktur und einer mittleren Porengröße von 10 bis 1000 µm.

Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wird ein Trennmittel zum Abtrennen von Zellen oder Viren angege ben, das aus porösen Calciumphosphatkörnern mit offener Zellstruktur besteht und in dem die Calciumphosphatkörner zwei Verteilungen von Poren größen aufweisen, wobei eine Verteilung Mikroporen mit einer mittleren Porengröße im Bereich von 20 bis 500 nm und die andere kleine Poren mit einer mittleren Poren größe in einem Bereich von 1 bis 50 µm umfaßt.

Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Trennmittel für Zellen oder Viren vorgeschla gen, umfassend ein erstes Element aus Polyvinylacetalharz mit offenzelliger Struktur und einer mittleren Porengröße von 10 bis 1000 µm und ein mit dem ersten Element verbundenes zweites Element in Form einer Schicht aus porösen Calciumphosphatkörnern mit einer mittleren Korngröße von 50 bis 2000 µm.

Das vorstehend beschriebene Trennmittel kann ferner ein weiteres Element bestehend aus Polyvinylacetalharz mit offenzelliger Struktur und einer mittleren Porengröße von 10 bis 1000 µm umfassen, das auf das zweite Element aufgelegt wird, so daß das erste und das dritte Element das zweite Element zwischen sich einschließen. Das das dritte Element bildende Polyvinylacetalharz ist vor zugsweise dasselbe wie das für die Herstellung des er sten Elementes verwendete Harz, kann jedoch auch von diesem verschieden sein, wenn dies erforderlich sein sollte und gute Resultate erbringt.

Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wird eine Trennvorrichtung für Zellen oder Viren vorgeschlagen, umfassend einen Behälter oder eine Säule, in welche ein Trennmittel der oben beschriebenen Art eingefüllt ist.

Schließlich wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Ab trennen von Zellen oder Viren vorgeschlagen, bei dem eine biologische Flüssigkeit, welche die abzutrennenden Zellen oder Viren enthält, durch eine Säule geleitet wird, die mit dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Trennmittel gefüllt ist.

Weitere Merkmale und Vorteile ergeben sich aus der fol genden Beschreibung, welche in Verbindung mit den Zeichnungen die Erfindung anhand von Aus führungsbeispielen erläutert. Es zeigt

Fig. 1 einen schematischen Querschnitt durch eine Trennvorrichtung für Zellen oder Viren gemäß einer ersten Ausführungs form der vorliegenden Erfindung,

Fig. 2 einen schematischen Querschnitt durch eine Trennvorrichtung für Zellen oder Viren gemäß einer zweiten Aus führungsform der vorliegenden Erfin dung und

Fig. 3 einen schematischen Querschnitt durch eine Trennvorrichtung für Zellen oder Viren gemäß einer dritten Aus führungsform der Erfindung.

Ein erstes erfindungsgemäßes Trennmittel zum Trennen von Zellen oder Viren besteht aus einem Polyvinylacetalharz mit offenzelliger Struktur und einer mittleren Porengröße (Durchmesser) von ca. 10 bis 1000 µm.

Das oben genannte erfindungsgemäße Trennmittel wird aus Polyvinylacetalharz mit speziellen Poren und einer spe ziellen Verteilung derselben hergestellt. Zur Bildung eines Trennmittels geeignete Polyvinylacetalharze sind solche, die teilweise oder vollständig durch die Acetalisierung von Hydroxylgruppen von Polyvinylalkohol mit Aldehyd entstehen. Die Acetalisierung wird durch das folgende Reaktionsschema dargestellt:

Darin ist R eine Alkylgruppe, beispielsweise eine Methyl-, Äthyl- oder Butyl-Gruppe und n eine positive ganze Zahl.

Typische Beispiele des Polyvinylacetalharzes, wie es in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfassen Polyvinylformalharz, Polyvinylbutyralharz und derglei chen. Diese Polyvinylacetalharze können mit den in der Kunststoffindustrie wohlbekannten Methoden hergestellt werden. Sie werden beispielsweise durch gleichzeitige Hydrolysierung und Acetalisierung von Polyvinylacetat oder durch die Hydrolisierung von Polyvinylacetat und die anschließende Acetalisierung des erhaltenen Polyvinylalkohols erhalten. In jedem Falle sollte die Hydrolyse vollständig durchgeführt und die Acetalisierung soweit ausgeführt werden, daß mindestens 50% der Hydroxylgruppen in dem Polyvinylalkohol acetalisiert sind, um das entsprechende Polyvinylacetalharz mit einer Acetalisierungsrate von 50 bis 100% zu erhalten. Die Acetalisierungsrate von weniger als 50% sollte vermieden werden, da sie eine Deformation des Trennmittels und eine Verminderung sei ner Adsorptionseigenschaften bewirkt. Dies wiederum führt zu einer Verminderung der Separationsfähigkeit, wenn eine Kulturlösung oder dergleichen dem Element zu geführt wird. Das Polyvinylacetat, das als Ausgangs material für die Herstellung des Polyvinylacetalharzes verwendet wird, sollte vorzugsweise einen Polymerisationsgrad von ca. 200 bis 2000 haben.

Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Polyvinylacetalharz hat offene Zellen und eine mittlere Porengröße im Bereich von ca. 10 bis 1000 µm. Die Porengröße von weniger als 10 µm kann dazu führen, daß der Fluß der Lösung durch die Säule behindert und die Säule verstopft wird, da die Porengröße zu klein ist im Verhältnis zur Größe der abzutrennenden Zellen, d. h. der Zielzellen. Auf der anderen Seite kann durch eine Porengröße von mehr als 1000 µm das Trennvermögen des Trennmittels durch die verringerte Oberfläche für die Adsorption verringert werden. Die offene Zellstruktur des Polyvinylacetalharzes wird gebildet, wenn die Polymerisation in Anwesenheit eines Treibmittels ausge führt wird. Die Bildung der offenzelligen Struktur kann jedoch auch durch irgendein anderes wohlbekanntes Ver fahren hergestellt werden.

Das in der oben beschriebenen Weise aus Polyvinylacetalharz hergestellte Trennmittel zum Ab trennen von Zellen oder Viren hat vorzugsweise eine po röse, schwammartige Struktur und insbesondere die Form eines schwammähnlichen Tuches oder Blattes. Das blattförmige Trennmittel wird vorzugsweise in der Säule der Trennvorrichtung geschichtet, nachdem es in Form von Scheiben mit einem dem Innendurchmesser der Säule entsprechenden Durchmesser hergestellt wurde. Diese Herstellung kann durch ein Herstellungsverfahren wie Stanzen oder Schneiden erfolgen. Eine ausreichende An zahl der so erhaltenen Scheiben mit einer gewünschten Dicke des Trennmittels oder Füllmittels sind in der Säule übereinander geschichtet. Wenn ein granulat- oder pulverförmiges Harz verwendet wird, kann man gleichzei tig eine Sperre wie beispielsweise ein Sieb oder einen Filter verwenden, um das Ausfließen des eingefüllten Harzes aus der Säule zu verhindern. Es ist zu bemerken, daß sphärisches Harzgranulat bei der Zelltrennung oder Virustrennung leicht verstopfen kann und daß dadurch kein gleichförmiger Durchfluß der Lösung aufrechterhal ten werden kann. Es ist nämlich schwierig, ständig eine gleichförmige Porengröße des Harzes aufrechtzuerhalten. Daher verursacht die Verwendung des sphärischen Harzgranulates Schwierigkeiten bei der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.

Eine Trennvorrichtung zur Trennung von Zellen oder Viren gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt einen Be hälter, in den ein Polyvinylacetalharz mit offener Zellstruktur und einer mittleren Porengröße von ca. 10 bis 1000 µm eingefüllt ist. Das Polyvinylacetalharz, das als Füllmittel für den Behälter verwendet wird, wurde im vorstehenden als Trennmittel beschrieben.

Der in der erfindungsgemäßen Trennvorrichtung verwen dete Behälter kann unterschiedliche Formen haben, wie sie auf dem Gebiet der Zell- oder Virustrennung Verwen dung finden. Er kann beispielsweise als Säule, Rohr, Schlauch, Spritzenkörper oder dergleichen ausgebildet sein. Das Polyvinylacetalharz wird, wie dies oben be schrieben wurde, vorzugsweise in den Behälter in Scheibenform eingefüllt. Die Schichtdicke des ein gefüllten Harzes in dem Behälter kann von verschiedenen Faktoren wie beispielsweise der abzutrennenden speziel len Zell- oder Virusart, einem speziellen Harz oder dergleichen abhängen.

In der Trennvorrichtung enthält ein Behälter oder eine zylindrische Säule 1 das Trennmittel 2 zum Abtrennen von Zellen oder Viren. Obwohl dies im einzelnen nicht dargestellt ist, besteht das Trennmittel 2 aus einem Laminat von blattförmigen Schichten aus Polyvinylacetalharz. Selbstverständlich kann das Trenn mittel 2 auch eine Schicht aus einem Polyvinylacetalgranulat sein. In diesem Fall wird vor zugsweise ein Sieb oder ein Filter in dem Bodenbereich des Trennmittels 2 vorgesehen.

Verwendet man einen Separator gemäß Fig. 1, wird eine biologische Flüssigkeit, welche die abzutrennenden Zel len oder Viren enthält, über eine Einlaßöffnung 3 in die Säule 1 eingeführt. Die Trennung erfolgt, während die biologische Flüssigkeit durch das Trennmittel 2 hindurchfließt. Dabei werden nur die nicht-adsorptiven Zellen oder Viren durch die Auslaßöffnung 4 der Trenn vorrichtung abgeführt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Abtrennen von Zellen oder Viren wird eine biologische Flüssigkeit durch einen Behälter oder eine Säule der Trennvor richtung hindurchgeführt, in welcher das oben beschrie bene Trennmittel als Füllstoff angeordnet ist.

In der Praxis wird zur Durchführung des erfindungs gemäßen Verfahrens vor dem Trennschritt die Säule im allgemeinen mit einer Waschlösung vorbehandelt, um un erwünschte kontaminierende Stoffe oder dergleichen aus der Säule auszuwaschen. Nach dem Waschvorgang wird die biologische Flüssigkeit in die Säule eingefüllt. Die zu verwendende biologische Flüssigkeit ist beliebig. Typi sche Beispiele für eine solche biologische Flüssigkeit sind Blut, Serum, Urin, Speichel und Suspensionen der Zellen und/oder Viren sowie eine verdünnte Lösung des ganzen Blutes, in der das Blut mit einem geeigneten Koagulationsinhibitor vermischt ist. Die Mischung wird mit einer Kulturlösung verdünnt, um das Volumen der Mi schung um den Faktor 1 bis 10 zu vergrößern. Insbeson dere wird eine Zellsuspension hier als biologische Flüssigkeit verwendet. Nachdem die biologische Flüssig keit ausreichend in das Trennmittel eingedrungen ist, erfolgt eine Waschung mit einer Waschlösung, um die nicht adsorptiven Zellen und dergleichen aus der Säule auszuwaschen und aufzufangen.

Die Waschlösung und gegebenenfalls die Grundflüssigkeit für eine Suspension umfassen beispielsweise ein Kulturmedium wie beispielsweise Hank′s Puffer-Salz- Lösung (HBSS), ein Serum Medium (RPMI-1640 und andere), oder ein chemisch definiertes Medium, eine physiologische Salzlösung oder andere herkömmlicher weise als Waschlösung in diesem Gebiet verwendete Lö sungen. Der Trennschritt wird vorzugsweise bei einer Temperatur ausgeführt, die von Raumtemperatur bis unge fähr 37°C betragen kann, um unerwünschte und schädi gende Einflüsse auf die Zellen oder Viren der biologi schen Flüssigkeit zu vermeiden.

Erstaunlicherweise und völlig unerwartet haben die ab getrennten Zellen oder Viren charakterische Merkmale wie Überlebensprozentsatz oder andere Eigenschaften, die im wesentlichen denen der Zielzellen oder Viren in der biologischen Flüssigkeit entsprechen. So zeigen beispielsweise die aus dem Lymphozyten seperierten T- Zellen eine Steuerbarkeit der Antikörperproduktion oder andere charakteristische Merkmale, die im wesentlichen identisch sind mit jenen, die in dem Lymphozyten vor dem Trennschritt bestimmt wurden.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß bei der erfindungsgemäßen Verwendung eines Trennmittels, das aus Polyvinylacetalharz mit offenzelliger Struktur und einer Porengröße von 10 bis 1000 µm besteht, die ge suchten Zellen oder Viren im Vergleich zu den herkömm lichen Trennverfahren in sehr stabiler Weise aus der biologischen Flüssigkeit bei hoher Trennungsausbeute und ohne Änderung einer Zell- oder Virenverteilung vor und nach der Trennung abgetrennt werden können. Da fer ner bei diesem Trennverfahren komplizierte Schritte wie eine Inkubation nicht erforderlich sind, ist es möglich, den Trennvorgang merklich zu vereinfachen und die zur Trennung erforderliche Zeit deutlich zu verkür zen. Darüber hinaus kann ein nur einen Schritt um fassendes Verfahren bei der Trennung verwendet werden. Die biologische Flüssigkeit, welche die abzutrennenden Zellen oder Viren enthält, kann direkt in die mit dem Trennmittel gefüllte Säule gegossen werden.

Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Polyvinylacetalharz im Handel zu geringem Preis erhält lich und kann bei Herstellung in Form eines blattförmigen Trennelementes auf einfache Weise in die Säule eingesetzt werden, indem man das Blatt entspre chend der Größe und Form der Säule zurechtschneidet. Das blattförmige Trennelement kann offensichtlich sehr rasch und einfach zurechtgeschnitten und in die Säule eingesetzt werden, wobei man darüber hinaus keinerlei Stützeinrichtung benötigt, wie sie üblicherweise bei einem pulverförmigen Trennmedium in der Säule erforder lich ist. Schließlich kann die Trennvorrichtung, d. h. eine mit dem Trennmittel gefüllte Säule nach ihrer Sterilisation mit irgendeinem geeigneten Sterilisationsmittel wie beispielsweise Äthylenoxydgas (EO) als sterilisiertes und versiegeltes Produkt ein fach auf den Markt gebracht werden.

Da ferner das Trennmittel gleichförmig in die Säule eingefüllt wird, ist kein Verstopfen während des Trennvorganges zu befürchten. Man kann einen gleichförmigen Durchfluß der biologischen Flüssigkeit und daher auch eine effektive und stabile Trennung der Zellen oder Viren vom Beginn bis zum Ende des Trennvorganges erreichen. Wenn eine große Menge von Zellen in dem Trennverfahren behandelt werden muß, kann man schließlich die Durchflußrate der biologischen Flüssigkeit durch die Säule zur Erreichung der optimalen Resultate frei steuern, indem man die Querschnittsfläche der Polyvinylacetalharz-Schicht, die Porengröße des Harzes, die Schichtdicke oder die Füll höhe in der Säule oder andere Faktoren verändert.

Ein zweites erfindungsgemäßes Trennmittel zum Abtrennen von Zellen oder Viren besteht aus porösen Calciumphosphatkörnern mit offenzelliger Struktur, wobei die Porengröße der Calziumphosphatkörner in zwei Verteilungen vorliegt. Die eine umfaßt Mikroporen mit einer mittleren Porengröße im Bereich von 20 bis 500 nm (0,02 bis 0,5 µm) und die andere umfaßt kleine Poren mit einer mittleren Porengröße im Bereich von 1 bis 50 µm.

Das vorstehend beschriebene Trennmittel umfaßt poröse Calciumphosphatkörner mit zwei offenzelligen Struktu ren. Die Körner haben Mikroporen mit einer Porengröße von 20 bis 500 nm. Der Grund hierfür liegt darin, daß man bei der Adsorption von Viren an Calciumphosphatkörnern als Adsorptions- und Trennmittel die Körner porös machen muß, um den Durchtrittsweg der biologischen Flüssigkeit durch die Säule zu verlängern. Ferner kann die Größe der Viren abhängig von der spezi ellen Art variieren, liegt jedoch im allgemeinen im Be reich von ca. 20 bis 300 nm. Um also einen Durchtritt der Viren durch die Poren der Körner zu gewährleisten, sollte die Porengröße der Körner mindestens 20 nm oder mehr betragen. Eine obere Grenze für die Porengröße dieser Körner liegt bei 500 nm, da die Porengröße von mehr als 500 nm (was merklich größer als die Virusab messungen ist) keine kritische Bedeutung hat mit der Ausnahme, daß die Chance der Adsorption mit der Zunahme der Porengröße abnimmt.

Die Calciumphosphatkörner haben darüber hinaus zusätz lich zu den Mikroporen kleine Poren mit einer Größe von 1 bis 50 µm. Der Grund hierfür liegt darin, den Körnern ein ausreichendes Wasserrückhaltevermögen zu geben. Die Körner sollten kleine offene Zellen mit Abmessungen von 1 bis 50 µm haben, bei der die biologische Flüssigkeit wie beispielsweise eine Suspension von Zellen oder Viren relativ leicht die Säule durchströmen kann. Zu sätzlich zu diesen beiden Verteilungen von Porengrößen haben die Calciumphosphatkörner, die erfindungsgemäß verwendet werden, vorzugsweise eine Porösität von 75%. Die Porösität ist wesentlich, da sie das resultierende Wasserrückhaltevermögen der Säule im weiten Umfange be rühren. Eine Porösität von weniger als 10% liefert kein ausreichendes Wasserrückhaltevermögen, um Zellen oder Viren adsorbieren zu können. Bei einer Porösität von mehr als 75% ist die Haltbarkeit der Körner selbst nicht mehr gegeben.

Ferner werden bei einer bevorzugten Ausführungsform Calciumphosphatkörner mit einer mittleren Korngröße von 10 bis 2000 µm verwendet. Für die Zelltrennung können die Zellen in den Kornzwischenräumen hindurchtreten, wenn die Korngröße 100 µm oder mehr beträgt. Jedoch sollte die Korngröße, wie dies später noch beschrieben wird, mindestens 10 µm oder mehr für die Virustrennung betragen. Eine Korngröße von mehr als 2000 µm ist nicht hinnehmbar, da die Zellen aufgrund einer übermäßigen Zunahme der Kornzwischenräume nicht mehr an dem Trenn material adsorbiert werden. Darüber hinaus ist eine Teilchengröße von 1 µm oder mehr ausreichend, um eine Virustrennung durchzuführen. Für praktische Zwecke je doch ist es vorzuziehen, eine Teilchengröße von 10 µm oder mehr zu wählen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform haben die Calciumphosphatkörner ein CA/P-Verhältnis von 1,4 bis 1,8. Insbesondere beträgt das CA/P-Verhältnis 1,5 bis 1,67 um eine bessere Sinterfähigkeit und Festigkeit der Körner zu erreichen.

Es kann eine breite Vielfalt von Calciumphosphaten ver wendet werden. Typische Beispiele verwendbarer Calciumphosphate umfassen Apatite wie beispielsweise Hydroxyapatite oder Fluoroapatite, α- oder β- Tricalizumphosphate, Tetracalciumphosphate oder Mi schungen dieser Verbindungen.

Die Calciumphosphatkörner werden jeweils mittels übli cher Verfahren hergestellt. Kristalline Calciumphosphatteilchen, die in den wohl bekannten Naß verfahren erzeugt werden, können als Ausgangsmaterial für die Herstellung dieser Körner verwendet werden. Das teilchenförmige Calciumphosphat wird beispielsweise in Wasser suspendiert, um einen Schlamm zu erzeugen. An schließend wird der Schlamm sprühgetrocknet oder in an derer Weise behandelt, um Sekundärteilchen zu erzeugen. Auch kann der Schlamm mit Zusätzen wie beispielsweise viskositätsverändernden Zusätzen, Teilchen oder Fasern einer thermisch auflösbaren organischen Verbindung ver mischt werden. Die Mischung wird anschließend wiederum einem Sprühtrocknungsverfahren oder dergleichen zur Er zeugung der Sekundärpartikel unterworfen. Diese Sekundärpartikel werden wiederum zur Herstellung eines Schlamms suspendiert. Der Schlamm wird anschließend in nassem Zustand geformt, um einen Formblock zu erzeugen. Während des Formprozesses kann eine organische Verbin dung, die auflösbar ist und in dem anschließenden Sinterprozeß kleine Poren in der Größe von 1 bis 50 µm erzeugt, dem Schlamm zugefügt werden, um poröse Calciumphosphatkörner zu erhalten. Natürlich kann auch die resultierende Porengröße durch die Wahl einer ge eigneten Sintertemperatur oder anderer Bedingungen ohne derartige organische Verbindungen eingestellt werden. Nach dem Formen wird der Block bei einer Temperatur von 500 bis 1300°C gesintert. Eine Temperatur von weniger als 500°C ist nicht ausreichend, um eine thermische Verflüchtigung der hinzugefügten organischen Verbindung zu bewirken und den Block zu sintern. Eine Temperatur von mehr als 1300°C dagegen kann zu einer exzessiven Sinterung, d. h. einem exzessiv dicht gesinterten Block oder sogar zu einer Zersetzung des Calciumphosphats führen.

Der gesinterte Körper wird anschließend zerkleinert und gesiebt, um die gewünschten Calciumphosphatkörner mit den beschriebenen Porengrößebereichen zu erhalten. Die Größe der Mikroporen von 20 bis 500 nm wird in der Weise kontrolliert, daß man die Korngröße der kristallinen Partikel, die für den Ausgangsschlamm zur Erzeugung der Sekundärpartikel verwendet, die Viskosität des Schlammes oder ein spezielles Aditiv für den Schlamm in geeigneter Weise auswählt. Wie bereits oben beschrieben wurde, wird die Größe der kleinen Poren von 1 bis 15 µm durch Hinzufügen einer thermisch austreibbaren organischen Verbindung zu dem Schlamm von Sekundärpartikeln erzeugt. Auch kann die genannte Porengröße durch geeignete Auswahl des Formverfahrens und/oder ein Aditiv beim Formen des Blockes aus den Sekundärpartikeln erreicht werden.

Die Calciumphosphatkörner können auch durch Granulieren der Sekundärpartikel unter Verwendung eines Granulators und durch anschließendes Sintern erzeugt werden.

Die porösen Calciumphosphatkörner können mindestens ein teilweise an ihnen adsorbiertes Modifikationsmittel enthalten, um die physikochemischen Eigenschaften oder die immunologischen Eigenschaften der Kornoberfläche zu modifizieren und damit die Adsorptionsaktivität für jede der Zielzellen oder Virusgruppen sorgfältig zu än dern.

Als Ergebnis dieser Änderung der Adsorptionsaktivität kann die Trenncharakteristik der Säule wirksam geändert werden, um auf diese Weise eine Trenncharakteristik zu schaffen, die ein scharfes Ausflußmuster liefert. Auch kann als Ergebnis dieser Änderung der Adsorptionsaktivität das Trennspektrum kontrolliert werden, um optimale Resultate zu erreichen. Da es fer ner möglich ist, die Adsorptionswirkung für jede der Untergruppen von Zellen oder Viren zu ändern oder zu modifizieren, kann eine spezielle Untergruppe oder Unterpopulation selektiv abgetrennt werden. Typische Beispiele für Modifikationsmittel, die an der Korn oberfläche adsorbiert werden, umfassen von einem leben den Körper erzeugte Polysaccharide wie Hyaluronsäure, Chondroitinschwefelsäure, Chitinderivate, Fibronectin oder Osteonectin, Mucopolysaccharide und Proteine sowie deren Derivate.

Eine erfindungsgemäße Trennvorrichtung für Zellen oder Viren umfaßt einen Behälter, in den poröse Calciumphosphatkörner mit offenzelliger Struktur und zwei Porengrößeverteilungen eingefüllt sind, wobei eine dieser Verteilungen Mikroporen mit einer mittleren Porengröße im Bereich von 20 bis 500 nm und die andere kleine Poren mit einer mittleren Porengröße im Bereich von 1 bis 50 µm umfaßt. Die detaillierte Beschreibung dieser Trennvorrichtung wird zur Vermeidung von Wieder holungen weggelassen, da die als Füllmittel für den Be hälter verwendeten porösen Calciumphosphatkörner vor stehend bei der Beschreibung des Trennmittels beschrieben wurden. Der Behälter wurde bereits bei der Behandlung der Trennvorrichtung für Zellen oder Viren unter Verwendung des ersten Trennmittels beschrieben.

Ein typisches Beispiel einer Trennvorrichtung zur Ver wendung des zweiten Trennmittels ist hier nicht darge stellt. Die Trennvorrichtung ist jedoch im wesentlichen die gleiche wie die in Fig. 1 dargestellte Trennvor richtung mit der Ausnahme, daß das Trennmittel 2, d. h. das Laminat aus Polyvinylacetalharzschichten durch das beschriebene zweite Trennmittel bzw. eine Schicht aus porösen Calciumphosphatkörnern ersetzt ist. Die Granulatschicht wird vorzugsweise von einem Sieb oder einem Filter, beispielsweise Glaswolle in der Säule 1 gehalten. Die Arbeitsweise und der Mechanismus der Zell- oder Virustrennung in der Trennvorrichtung ist ebenfalls im wesentlichen gleich der Arbeitsweise der Trennvorrichtung, die anhand der Fig. 1 vorher erläu tert wurde.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Abtrennen von Zellen oder Viren umfaßt den Schritt, eine biologische Flüs sigkeit durch eine Säule hindurchzuleiten, welche das oben beschriebene zweite Trennmittel als Füllung ent hält.

Die Abtrennung von Zellen oder Viren aus der biologi schen Flüssigkeit unter Verwendung des zweiten Trenn mittels, wie es oben beschrieben wurde, kann in ähnli cher Weise durchgeführt werden, wie dies weiter oben im Detail im Hinblick auf ein Trennverfahren unter Verwen dung des ersten Trennmittels beschrieben wurde. Eine die gesuchten Zielzellen oder Viren enthaltende biolo gische Flüssigkeit wird dem Trennverfahren unterworfen. Eine solche Flüssigkeit kann beispielsweise Blut, Serum, Urin, Speichel und eine Suspension von Zellen und/oder Viren sein.

Das erfindungsgemäße Trennverfahren kann vorzugsweise für viele Zwecke verwendet werden wie beispielsweise das Abtrennen von Viren aus biologischen Flüssigkeiten, die Gewinnung einer speziellen Zellgruppe wie bei spielsweise T-Zellen aus dem gesamten Blut oder Lymphozyten oder für andere Zwecke. Insbesondere bei der Abtrennung von Zellen aus dem gesamten Blut ist es wünschenswert, daß nach der Abnahme des Blutes aus dem menschlichen Körper dieses mit einem Blutkoaggulierungsinhibitor wie beispielsweise Heparin oder Zitronensäure vermischt wird. Die Mischung wird mit einer Kulturlösung als einem Verdünnungsmittel ver dünnt, um das Volumen der Mischung um das Ein- bis Zehnfache zu vergrößern. Als Ergebnis der Verdünnung des Blutes wird die Abtrennung der Zellen stärker be schleunigt, da die Viskosität des Blutes abnimmt. Eine Verdünnung des Blutes über das Zehnfache sollte jedoch vermieden werden, da sonst die Menge der zu behandeln den Mischung in nicht akzeptabler Weise vergrößert wird.

In der Praxis wird das erfindungsgemäße Trennverfahren vorzugsweise in der folgenden Weise durchgeführt. Um eine Rückhaltung des Trennmittels in einem Behälter wie beispielsweise einer Säule der Trennvorrichtung zu ge währleisten, wird ein Füllmaterial wie beispielsweise Glaswolle in den Austrittsabschnitt des Behälters ge füllt. Anschließend wird das Trennmittel oder poröses Calciumphosphatgranulat in einen Mittelabschnitt des Behälters eingefüllt. Das eingefüllte Trennmittel kann mit einer geeigneten Waschlösung gewaschen werden, um kontaminierende Stoffe und dergleichen zu entfernen.

Nach Abschluß des Waschvorganges wird eine die gesuchten Zielzellen oder Viren enthaltende biologische Flüssigkeit in den Behälter gegossen. Nachdem die bio logische Flüssigkeit das Trennmittel in dem Behälter ausreichend durchströmt hat, wird das Trennmittel wie derum mit der Waschlösung ausgewaschen, um die nicht adsorptierten Zellen oder Viren zu entfernen und wieder zu gewinnen.

Die Suspension oder Waschlösung, die bei dem erfindungsgemäßen Trennverfahren verwendet wird, kann in geeigneter Weise aus den bekannten Lösungen ausge wählt werden je nach Art der speziellen Zellen oder Viren, die abgetrennt werden sollen. Typische Beispiele solcher Lösungen und der bevorzugte Bereich der Arbeitstemperatur bei dem Trennverfahren wurden oben bereits beschrieben.

Wie sich aus der obigen Beschreibung ergibt und wie noch anhand der folgenden Ausführungsbeispiele erläu tert wird, kann das erfindungsgemäße Adsorptions /Trennmittel eine hohe Adsorptionsfähigkeit im Hinblick auf Viren und Tier- oder Pflanzenzellen zeigen. Daher kann es in wirkungsvoller Weise dazu eingesetzt werden, solche Viren und Zellen aus biologischen Flüssigkeiten abzutrennen.

Das erfindungsgemäße Trennmittel ist insbesondere ge eignet, um nur T-Zellen aus biologischen Flüssigkeiten wie beispielsweise dem gesamten Blut abzutrennen, da es keinen Einfluß auf die T-Zellen hat, während die B- Zellen und Makrophagen selektiv an dem Trennmittel adsorbiert werden. Da ferner insbesondere die T-Zellen mit hoher Reinheit gewonnen werden können, ohne die Verteilung der Untergruppen derselben zu ändern, kann das Trennmittel mit Vorteil bei immunologischen Studien und klinischen Tests eingesetzt werden zusätzlich zur Analyse der T-Zellen. Als Beispiele von klinischen Tests, bei denen das erfindungsgemäße Trennmittel ver wendet werden kann, sind Test zu nennen wie beispiels weise die Bestimmung der Verteilung von T-Zellen und Funktionsteste. Diese Teste werden bei der Behandlung von Krebs, Autoimmunkrankheiten, AIDS und anderen Krankheiten vorgenommen. Bei einem klinischen Test, bei dem nach der Abnahme des Blutes das gesamte Blut unmit telbar anschließend in einer Testvorrichtung geprüft wird, besteht die Möglichkeit, zunächst die B-Zellen und die Makrophagen aus dem ganzen Blut zu entfernen und dadurch die Möglichkeit zu einer sehr genauen Über prüfung der T-Zellen zu schaffen.

Zusätzlich zu diesen Vorzügen ist es erfindungsgemäß möglich, die Zell- oder Virustrennung mit hoher Reproduzierbarkeit und einer kurzen Zeit durchzuführen, da das erfindungsgemäße Trennmittel ein ausreichend verbessertes Wasserrückhaltevermögen hat und darüber hinaus eine hervorragende Mikroporenstruktur besitzt. Da ferner bei dem erfindungsgemäßen Trennverfahren ein Inkubationsschritt entfallen kann, ist es auch möglich, das Trennverfahren erheblich zu vereinfachen.

Das dritte erfindungsgemäße Trennmittel zum Abtrennen von Zellen oder Viren umfaßt als erstes Element ein Polyvinylacetalharz mit offenzelliger Struktur und einer mittleren Porengröße von 10 bis 1000 µm sowie eine Schicht aus porösen Calciumphosphatkörnen mit einer mittleren Korngröße von 10 bis 2000 µm als zwei tes Element, das auf das erste Element aufgebracht wird. Das erste Element und das hier verwendete zweite Element entsprechen dem ersten Trennmittel und dem zweiten Trennmittel, wie sie oben beschrieben wurden. Die Erfindung beruht nämlich auf der Erkenntnis, daß besonders gute Ergebnisse auch erreicht werden, wenn das erste Trennmittel in Verbindung mit dem zweiten Trennmittel in einem Behälter der Trennvorrichtung zum Abtrennen von Zellen oder Viren verwendet wird.

Die porösen Calciumphosphatkörner, die als zweites Trennelement verwendet werden, können zwei Porengröße verteilungen haben, wobei die eine Mikroporen mit einer mittleren Porengröße im Bereich von 20 bis 500 nm (0,02 bis 0,5 µm) und die andere kleine Poren mit einer mitt leren Porengröße im Bereich von 1 bis 50 µm umfaßt. Bei den porösen Calciumphosphatkörnern ist die untere Grenze der Porengröße 20 nm (0,02 µm), da wie bereits oben beschrieben wurde, Viren im allgemeinen eine Größe von ca. 20 bis 300 nm haben.

Bei einer bevorzugten Ausführungform der Erfindung kann das dritte Trennmittel ferner eine weitere Schicht aus Polyvinylacetalharz mit offenzelliger Struktur und einer mittleren Porengröße von 10 bis 1000 µm als drit tes Element haben, wobei diese dritte Schicht das zweite Element überdeckt, so daß das zweite Element zwischen dem ersten und dem dritten Element sandwich artig eingeschlossen ist. Das Polyvinylacetalharz des ersten Elementes und jenes des dritten Elementes können im wesentlichen identisch oder auch verschieden vonein ander sein, wie dies bereits oben festgestellt wurde. Daher kann zur Vermeidung von Wiederholungen die Be schreibung des Polyvinylacetalharzes für das dritte Trennelement entfallen. Es ist jedoch zu bemerken, daß bei dem dritten Trennmittel das Polyvinylacetalharz des ersten Elementes zwei Rollen spielen kann, nämlich er stens als Zell-/Virustrennmittel und zweitens als Fil ter, das verhindern kann, daß die auf ihm angeordneten Calciumphosphatkörner ausfließen. Daher wird das Polyvinylacetalharz vorzugsweise in Form eines Schwamm tuches verwendet.

In der gleichen Weise kann das poröse Calciumphosphatgranulat, das als zweites Element in dem dritten Trennmittel verwendet wird, im wesentlichen mit den porösen Calciumphosphatkörnern des zweiten Trenn mittels übereinstimmen. Zur detaillierten Beschreibung des Calciumphosphatgranulates wird daher auf die obige Beschreibung des zweiten Trennmittels verwiesen.

Eine erfindungsgemäße Trennvorrichtung zum Abtrennen von Zellen oder Viren umfaßt einen Behälter, in den ein Polyvinylacetalharz mit offenstelliger Struktur und einer mittleren Porengröße von 10 bis 1000 µm als er stes Element eingefüllt ist, auf welches eine Schicht aus porösen Calciumphosphatkörnern mit einer mittleren Korngröße von 10 bis 2000 µm als zweites Element aufge tragen wird. Das heißt die erfindungsgemäße Trennvor richtung umfaßt einen Behälter, in den das dritte Trennmittel eingefüllt ist, wobei der Behälter der gleiche sein kann, wie der bei den oben beschriebenen Trennvorrichtungen verwendete Behälter.

Zwei typische Beispiele für Trennvorrichtungen zum Ab trennen von Zellen oder Viren sind in den Fig. 2 und 3 dargestellt.

Bei der Trennvorrichtung gemäß Fig. 2 enthält ein Be hälter oder eine Säule 1 das dritte Trennmittel, das erfindungsgemäß aus einem porösen Blatt 5 aus Polyvinylacetalharz und einer Schicht 6 aus einem porö sen Calciumphoshphatgranulat besteht. Eine biologische Flüssigkeit, welche die gesuchten Zellen oder Viren enthält, wird durch einen Einlaß 3 in die Säule 1 dieser Trennvorrichtung gegossen. Die Trennung der gesuchten Zellen oder Viren erfolgt während des Durchlaufes der biologischen Flüssigkeit durch die poröse Granulatschicht 6 und das poröse Blatt 5. Die behandelte biologische Flüssigkeit strömt durch einen Auslaß 4 der Trennvorrichtung aus. Die Trennvorrichtung gemäß Fig. 3 stimmt mit der Trennvorrichtung gemäß Fig. 2 im wesentlichen überein mit der Ausnahme, daß bei der Darstellung in Fig. 3 das dritte Trennmittel eine Sand wich-Struktur umfaßt, bestehend aus einem porösen Blatt 5 aus Polyvinylacetalharz, einer Schicht 6 aus porösem Calciumphosphatgranulat und einer weiteren porösen Schicht aus Polyvinylacetalharz.

Das erfindungsgemäße Trennverfahren zum Abtrennen von Zellen oder Viren umfaßt den Schritt, eine biologische Flüssigkeit durch eine Säule hindurchzuleiten, die das oben genannte dritte Trennmittel als Füllmaterial ent hält. Dieses Trennverfahren kann in der gleichen Weise mit ähnlich guten Resultaten wie die weiter oben be schriebenen Trennverfahren durchgeführt werden, bei denen das erste bzw. zweite Trennmittel eingesetzt wur den. Daher kann eine detaillierte Beschreibung des Ver fahrens entfallen.

Aus der vorstehenden Beschreibung und aus den noch fol genden Arbeitsbeispielen ergibt sich, daß bei der praktischen Anwendung der vorliegenden Erfindung hervorragende synergistische Wirkungen erzielt werden, da das erste Trennmittel in Verbindung mit dem zweiten Trennmittel in einer Säule der Trennvorrichtung verwendet werden. Im Gegensatz zu einer herkömmlichen Trennvorrichtung hat die erfindungsgemäße Trennvorrichtung beispielsweise eine sehr stabile und hohe Trennleistung und kann auch Zielzellen oder Viren aus biologischen Flüssigkeiten ohne eine Änderung der Verteilung der Zellen oder Viren durchführen. Ferner kann bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Trennvorrichtung die biologische Flüssigkeit direkt in die Trennsäule in einem einstufigen Verfahren eingefüllt werden, da komplexe Vorbereitungen wie beispielsweise eine Inkubation für das Trennverfahren nicht erforderlich sind. Dies bedeutet, daß das Trennverfahren erheblich vereinfacht und die für die Trennung benötigte Zeit außerordentlich verkürzt werden können.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden unter Be zugnahme auf einige Arbeitsbeispiele noch näher erläu tert, wobei jedoch der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht auf diese Ausführungsbeispiele be schränkt ist. Zur Durchführung der folgenden Beispiele wurden Trennvorrichtungen der in den Fig. 1 bis 3 dar gestellten Art verwendet.

Beispiel 1

Eine spritzenkörperartige Säule mit einem Innenvolumen von 5 ml wurde mit einem kleingeschnittenen Blatt aus Polyvinylformalharz ("Sponch Bell - ETA", Produkt von Kanebo) mit einer mittleren Porengröße von 100 µm und einer Formalisierungsrate von 80 bis 86% gefüllt, um einen Zellseparator mit einem Inhalt von 2 ml herzu stellen. Das kleingeschnittene Blatt hatte 13 mm Durch messer und 16 mm Dicke. Das Füllmaterial der Säule wurde gewaschen, zunächst mit destilliertem Wasser und anschließend mit HBSS bei einer Temperatur von 37°C. Nach dem Waschen wurden 0,2 ml von HBSS, in dem mononukleare Zellen suspendiert waren, auf das Füll material gegossen, so daß es das Füllmaterial durch dringen konnte. Die mononuklearen Zellen waren solche, die vorher aus dem normalen peripheren menschlichen Blut durch eine übliche Dichtegradienten- Zentrifugierung isoliert worden waren. Nachdem der Durchlauf durch das Füllmaterial abgeschlossen war, wurden die nichtadsorptiven Zellen aus der Säule wieder entfernt, indem das Füllmaterial mit HBSS gewaschen wurde.

Bei dieser Zelltrennung wurden die folgenden drei Tests durchgeführt, um das Trennvermögen der verwendeten Trenneinrichtung zu bestimmen.

Test 1

Die Anzahl der Zellen wurde in einem Hämozythometer so wohl vor als auch nach dem Durchlauf der Zellsuspension durch die Säule gezählt. Die Ergebnisse dieses Tests sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt.

Test 2

Der Status der Zelltrennung wurde geprüft. Um diese Prüfung durchzuführen, wurden die Zellen in dem Abfluß aus der Säule gefärbt mit Fluorescein konjugierten An tikörpern CD3 (Anti-Leu 4) oder CD19 (Anti-Leu 12). An schließend wurde der Prozentsatz an T-Zellen und B- Zellen mit Hilfe eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACS) bestimmt. Die Ergebnisse dieses Tests sind in der folgenden Tabelle 2 dargestellt.

Test 3

Die Verteilung von T-Zellen-Untergruppen wurde be stimmt. Um diese Bestimmung durchzuführen, wurden die Zellen in der abfließenden Flüssigkeit aus der Säule gefärbt oder markiert mit Fluorescein-konjungierten Antikörpern, CD8 (Anti-Leu 2a) oder CD4 (Anti-Leu 3a). Anschließend wurde der Prozentsatz von Supressor- und Helfer-T-Zellen unter Verwendung des FACS bestimmt. Die Ergebnisse dieses Tests sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt.

Die für die Trennung erforderliche Zeit:

Die Zeit, die von der Vorbereitung der Säule bis zum Abschluß der Trennung erforderlich war, wurde aufge zeichnet. Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle 4 zusammengefaßt.

Beispiel 2

Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß als Füllmaterial ein kleingeschnittenes Blatt aus Polyvinylformalharz mit einer mittleren Porengröße von 500 µm und einem Formalisationsgrad von 80 bis 86% verwendet wurde. Die Ergebnisse der Tests 1, 2 und 3 und die erforderliche Zeit für die Trennung wurden in den folgenden Tabellen 1 bis 4 zusammenge faßt.

Beispiel 3

Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß als Füllmaterial ein kleingeschnittenes Blatt aus Polyvinylbutyralharz mit einer mittleren Porengröße von 100 µm und einem Butyralisationsgrad von 80 bis 86% verwendet wurde.

Die Ergebnisse der Tests 1, 2 und 3 sowie die für die Trennung erforderliche Zeit wurden in den folgenden Ta bellen 1 bis 4 zusammengefaßt.

Vergleichsbeispiel 1

Eine handelsübliche Nylonwolle wurde in ein ausreichendes Volumen einer 0,1N HCl-Lösung über Nacht eingetaucht und anschließend mehrere Male in deionisiertem Wasser unter Ausdrücken ausgewaschen. Die gewaschene Wolle wurde dann bei 30°C für 3 Stunden getrocknet. Auf diese Weise wurde eine vorbehandelte Nylonwolle erhalten.

Eine spritzenkörperartige Säule mit einem Innenvolumen von 5 ml, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde, wurde mit 0,25 g der vorbehandelten Nylonwolle gefüllt, um einen Zellseparator mit einem Füllvolumen von ca. 3 ml zu schaffen. Das Füllmaterial der Säule wurde anschlie ßend mit einer physiologischen Salzlösung sowie einem Hank'schen Medium bei einer Temperatur von 37°C gewa schen. Nach dem Waschen wurden 0,2 ml einer Suspension von Monozyten in dem HBSS mit schwimmenden Monozyten auf das Füllmaterial gegossen, so daß sie in dieses eindringen konnten. Die Monozyten waren solche, die vorher aus normalem menschlichen peripheren Blut durch Zentrifugieren in herkömmlicher Weise isoliert wurden. Nach dem Durchfluß des HBSS wurde die Inkubation bei 37°C für 1 Stunde fortgesetzt. Anschließend wurden die nicht-adsorbierten Zellen aus der Säule wieder durch Waschen des Füllmaterials mit dem Hank'schen Medium ausgewaschen.

Bei dieser Zelltrennung wurden die Tests 1, 2 und 3 gemäß Beispiel 1 durchgeführt, um das Trennvermögen des verwendeten Separators zu bestimmen. Die Ergebnisse der Tests sind zusammen mit der für die Trennung erforderlichen Zeit in den folgenden Tabellen 1 bis 4 zusammengefaßt.

Zellausbeute
Beispiel Nr.
Ausbeute (%)
Beispiel 1
57
Beispiel 2	50
Beispiel 3	49
Vergleichsbeispiel 1	25

Tabelle 2

Status der Zelltrennung (Prozentsatz)

Tabelle 3

Verteilung von T-Zellen-Untergruppen (Prozentsatz)

Für Trennung erforderliche Zeit
Beispiel Nr.
Zeit
Beispiel 1\|30 Min.
Beispiel 2	30 Min.
Beispiel 3	30 Min.
Vergleichsbeispiel 1	2 Tage

Man erkennt aus diesen Ergebnissen, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren die hervorragende Ausbeute und das gute Trennvermögen nicht nur merklich höher als die entsprechenden Werte bei einem herkömmlichen Füll material (Nylonwolle) sondern auch stabil sind und daß die Verteilung der abgetrennten T-Zellen-Untergruppen im wesentlichen dieselbe wie vor der Abtrennung ist. Darüberhinaus ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, eine rasche Trennung durchzuführen, da zeitintensive Waschvorgänge und 1 Stunde Inkubation, die bei dem herkömmlichen Füllmaterial erforderlich waren, entfallen sind. In den Beispielen 1 bis 3 wurde die Erfindung anhand der Trennung und Ausbeute von T- Zellen erläutert. Ähnlich gute Resultate wurden jedoch auch bei der Trennung anderer Zellen oder Viren erhalten.

Beispiel 4

Calciumphosphat (Ca/P-Verhältnis=1,67) wurde durch ein herkömmliches Naßverfahren synthetisiert und an schließend im Sprühtrocknungsverfahren granuliert, um Calciumphosphatpulver zu erhalten. Das Pulver wurde mit destilliertem Wasser gemischt. Die Mischung wurde in einem herkömmlichen Naßformverfahren geformt und an schließend getrocknet. Calciumphosphatkörner wurden durch Zerbrechen des getrockneten Körpers erhalten. Nach dem Sieben wurden die Körner bei 1200°C gesintert, um poröse Hydroxyapatitgranulatkörner mit einer Porosität von 20% und einer Korngröße von c. 300 bis 600 µm zu erhalten. Diese Körner hatten Mikroporen mit einer mittleren Porengröße von 20 nm und kleine Poren mit einer mittleren Porengröße von 2 µm.

Eine spritzenkörperartige Säule mit einem Innenvolumen von 6 ml wurde mit 0,03 g Glaswolle bis zu 1 ml Marke gefüllt. Anschließend wurde die Säule mit 1 g des porö sen Hydroxyapatitgranulates zur Herstellung eines Virusseparators gefüllt.

In die Säule des Separators wurde eine Suspension von PR8 Influenzaviren in einer physiologischen Salzlösung gefüllt. Ein Titer der die Säule durchlaufenden Virussuspension wurde entsprechend der weiter unten beschriebenen Titerbestimmungsmetode bestimmt. Die Ergebnisse dieser Bestimmung sind in der folgenden Ta belle 5 zusammengefaßt.

Bestimmung des Titers

Rote Hühnerblutzellen aggregieren sich, wenn Influenzaviren an den roten Blutzellen haften. Basierend auf dieser Aggregationsreaktion wird der Titer bestimmt. Eine Virussuspension wird nämlich mit einer physiologischen Salzlösung (0,9% wäßrige Lösung von Natriumchlorid) verdünnt, um eine zweifach ver dünnte Suspension herzustellen, d. h. Zweifachsuspension, Vierfachsuspension, Achtfachsuspension, Sechzehnfachsuspension . . . Diese verdünnten Suspensionen werden mit derselben Menge einer 0,4%igen Suspension von roten Hühnerblutzellen gemischt, um einen Verdünnungsgrad zu bestimmen, bei dem die Aggregationsreaktion auftritt. Der Titer der Ausgangssuspension (nicht verdünnten Suspension) wird aus dem bestimmten Verdünnungsgrad ermittelt.

Beispiel 5

Das Verfahren nach Beispiel 4 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die Hydroxyapatitkörner eine Korngröße von 100 bis 300 µm hatten. Die Ergebnisse der Titerbestimmung sind in der folgenden Tabelle 5 zusam mengefaßt.

Beispiel 6

Das Verfahren nach Beispiel 4 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die Hydroxyapatitkörner eine Korngröße von 100 bis 300 µm hatten und die Säule mit 3 g des Granulates gefüllt wurde. Die Ergebnisse der Titerbestimmung sind in der folgenden Tabelle 5 zusam mengefaßt.

Beispiel 7

Hydroxyapatitkörner (Ca/P-Verhältnis=1,67), die durch das im Beispiel 4 beschriebene Verfahren hergestellt wurden, wurden bei 900°C gesintert, um poröse Hydroxyapatitkörner mit einer Porösität von 45% und einer Korngröße von 100 bis 300 µm zu erhalten. Diese Körner hatten Mikroporen mit einer mittleren Porengröße von 50 µm und kleine Poren mit einer mittleren Porengröße von 4 µm.

Unter Verwendung von 1 g des resultierenden Granulates wurde eine Virustrennung durchgeführt entsprechend dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren. Der Titer der die Säule passierenden Virussuspension wurde entspre chend der in Fig. 4 beschriebenen Methode bestimmt. Die Ergebnisse der Bestimmung sind in der folgenden Tabelle 5 zusammengefaßt.

Beispiel 8

Hydroxyapatitkörner (Ca/P-Verhältnis=1,67) wurden durch das im Beispiel 4 beschriebene Verfahren erhalten und anschließend bei 700°C gesintert, um ein poröses Hydroxyapatitgranulat mit einer Porosität von 60% und einer Korngröße von 100 bis 300 µm zu erzeugen. Bei diesen Körnern hatten die Mikroporen eine mittlere Po rengröße von 100 nm und die kleinen Poren eine mittlere Porengröße von 6 µm.

Unter Verwendung von 1 g des resultierenden Granulates wurde eine Virustrennung in der im Beispiel 4 beschriebenen Weise durchgeführt. Der Titer der durch die Säule hindurchgeleiteten Virussuspension wurde nach dem unter Beispiel 4 beschriebenen Verfahren bestimmt.

Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind in der folgenden Tabelle 5 zusammengefaßt.

Beispiel 9

Das Verfahren nach Beispiel 8 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die Säule mit 2 g des Granulates gefüllt wurde. Die Ergebnisse der Titerbestimmung sind in der folgenden Tabelle 5 zusammengefaßt.

Beispiel 10

Calciumphosphatkörner (Ca/P-Verhältnis=1,5), die durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren erhalten wurden, wurden bei 1100°C gesintert, um ein poröses Calciumphosphatgranzulat mit einer Porosität von 30% und einer Korngröße von 100 bis 300 µm zu erzeugen. Diese Körnchen hatten Mikroporen mit einer mittleren Porengröße von 300 nm und kleine Poren mit einer mittleren Porengröße von 8 µm.

Unter Verwendung von 1 g des resultierenden Granulates wurde die Virustrennung nach dem im Beispiel 4 be schriebenen Verfahren durchgeführt. Der Titer der durch die Säule hindurchgeleiteten Virussuspension wurde ent sprechend dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren be stimmt. Die Ergebnisse der Bestimmung sind in der fol genden Tabelle 5 zusammengefaßt.

Beispiel 11

Calciumphosphatkörner (Ca/P-Verhältnis=1,5), die durch das im Beispiel 4 beschriebene Verfahren erhalten wurden, wurden bei 700°C gesintert, um poröse Calciumphosphatkörner mit einer Porosität von 60% und einer Korngröße von 100 bis 300 µm zu erzeugen. In die sen Körnern hatten die Mikroporen eine mittlere Poren größe von 100 nm und die kleinen Poren eine mittlere Porengröße von 10 µm.

Unter Verwendung von 1 g des resultierenden Granulates wurde die Virustrennung entsprechend dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Der Titer der durch die Säule hindurchgeleiteten Virussuspension wurde nach dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse der Bestimmung sind in der folgenden Tabelle 5 zusammengefaßt.

Beispiel 12

Das im Beispiel 11 beschriebene Verfahren wurde wieder holt mit der Ausnahme, daß die Säule mit 2 g des Granulates gefüllt wurde. Die Ergebnisse der Titerbestimmungen sind in der folgenden Tabelle 5 zu sammengefaßt.

Beispiel 13

Calciumphosphatkörner (Ca/P-Verhältnis=1,57), die durch das im Beispiel 4 beschriebene Verfahren erhalten wurden, wurden bei 1100°C gesintert, um ein poröses Calciumphosphatgranulat zu erzeugen mit einer Porosität von 25% und einer Korngröße von 100 bis 300 µm. In die sen Körnern hatten die Mikroporen eine mittlere Poren größe von 50 nm und die kleinen Poren eine mittlere Porengröße von 3 µm.

Unter Verwendung von 1 g des resultierenden Granulates wurde die Virustrennung durchgeführt entsprechend dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren. Der Titer der durch die Säule hindurchgeleiteten Virussuspension wurde nach dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse der Bestimmung sind in der folgenden Tabelle 5 zusammengefaßt.

Vergleichsbeispiel 2

Calciumphosphatpulver (Ca/P-Verhältnis=1,67) wurde durch das im Beispiel 4 beschriebene Verfahren erhal ten. Das Pulver wurde durch ein herkömmliches Trocken preßverfahren geformt, um einen Grünling (ungesinterter Preßling) zu erhalten. Durch Zerbrechen dieses Grünlings wurden Calciumphosphatkörner erhalten. Nach dem Sieben wurden die Körner bei 700°C gesintert, um ein poröses Calciumphosphatgranulat zu erhalten, das nur Mikroporen mit einer mittleren Korngröße von 50 nm enthielt und eine Porosität von 50% sowie eine Korn größe von 100 bis 300 µm hatte. Die Ergebnisse der Titerbestimmung sind in der folgenden Tabelle 5 zusam mengefaßt.

Vergleichsbeispiel 3

Das Verfahren nach Vergleichsbeispiel 2 wurde wieder holt mit der Ausnahme, daß in die Säule 2 g des Granulates gefüllt wurde. Die Ergebnisse der Titerbestimmung sind in der folgenden Tabelle 5 zusammengefaßt.

Tabelle 5

Aus den Ergebnissen der Tabelle 5 erkennt man, daß der Titer proportional der Konzentration der Influenzaviren pro Volumeneinheit des Abflusses ist. Während also Bei spiel 4 den schlechtesten Titer unter den Beispielen 4 bis 13 zeigte, ist der erhaltene Titer noch immer unge fähr die Hälfte des Titers der Vergleichsbeispiele 2 und 3. Die Beispiele 9 und 12 zeigen, daß praktisch alle Viren vollständig an dem Adsorptionsmittel adsorbiert wurden. Dies bedeutet, daß die porösen Calciumphosphatkörner ein exzellentes Adsorptionsvermögen haben. Ferner erkennt man aus den Ergebnissen der Beispiele 8, 9, 11 und 12, daß die erfindungsgemäßen Körner die Menge der an ihnen adsorbierten Viren mit der Erhöhung der Füllmenge eben falls steigern können. Dagegen zeigt das Vergleichs beispiel 3, daß trotz der gegenüber dem Vergleichs beispiel 2 verdoppelten Granulatmenge die Menge der adsorbierten Viren nicht erhöht werden konnte.

Beispiel 14

Eine spritzenkörperartrige Säule mit einem Innenvolumen von 6 ml wurde mit 0,03 g Glaswolle bis zu 1 ml Marke gefüllt. Anschließend wurde die Säule mit 1 g des porö sen Hydroxyapatitgranulates gemäß Beispiel 4 gefüllt, um einen Zellseparator zu erhalten.

Anschließend wurde eine Suspension von 5×10⁶ Lymphozyten in einem Volumen von 0,2 ml HBSS auf das Füllmaterial gegossen, so daß es in das Füllmaterial des Zellseparators eindringen konnte. Die Lymphozyten wurden aus normalem menschlichen peripheren Blut gewon nen. Nachdem die Suspension das Granulat des Füll materials ausreichend durchdrungen hatte, wurde das Füllmaterial mit 3 ml HBSS gewaschen, um die nicht adsorbierten Zellen aus dem Füllmaterial auszuwaschen. Die ausgewaschenen und wiedergewonnenen Zellen wurden mit fluoresceinkonjugierten Antikörpern, CD3 (Anti-Leu 4) oder CD19 (Anti-Leu 12) gefärbt oder markiert. Anschließend wurde der Prozentsatz an T-Zellen und B- Zellen unter Verwendung des FACS bestimmt in der Weise, wie dies anhand des Beispiels 1 beschrieben wurde. Die Ergebnisse dieses Tests sind in der folgenden Tabelle 6 zusammengefaßt.

Beispiel 15

Das Verfahren nach Beispiel 14 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß poröse Hydroxyapatitkörner mit einer Porosität von 45% und einer Korngröße von 300 bis 600 µm als Füllmaterial verwendet wurden. Die Körner wurden durch Sinterung von Hydroxyapatit (Ca/P-Verhältnis= 1,67) bei 900°C gewonnen. In diesen Körnern hatten die Mikroporen eine mittlere Porengröße von 50 nm und die kleinen Poren eine mittlere Porengröße von 4 µm. Die Ergebnisse der Bestimmung des positiven Prozentsatzes sind in der folgenden Tabelle 6 zusammengefaßt.

Beispiel 16

Das Verfahren nach Beispiel 14 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß Hydroxyapatitkörner mit einer Porosität von 60% und einer Korngröße von 300 bis 600 µm als Füllmaterial verwendet wurden. Die Körner wurden durch Sinterung von Hydroxyapatit (Ca/P-Verhältnis=1,67) bei 700°C gewonnen. In diesen Körnern hatten die Mikroporen eine mittlere Porengröße von 100 nm und die kleinen Poren eine mittlere Porengröße von 6 µm. Die Ergebnisse der Bestimmung des positiven Prozentsatzes sind in der folgenden Tabelle 6 zusammengefaßt.

Vergleichsbeispiel 4

Das Verfahren gemäß Beispiel 14 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß poröse Hydroxyapatitkörner, die ent sprechend dem für das Vergleichsbeispiel 2 beschriebe nen Verfahren hergestellt wurden, mit einer Porosität von 50% und einer Korngröße von 300 bis 600 µm als Füllmaterial verwendet wurden. Die Körner wurden durch Sintern von Hydroxyapatit (Ca/P-Verhältnis=1,67) bei 700°C erzeugt. Die resultierenden Körner enthielten nun Mikroporen mit einer mittleren Porengröße von 50 nm. Die Ergebnisse der Bestimmung des positiven Prozentsat zes sind in der folgenden Tabelle 6 zusammengefaßt.

Tabelle 6

Status der Zellentrennung (Prozentsatz)

Bei den Beispielen 14, 15 und 16 wird beobachtet, daß eine allmähliche Zunahme (der Menge der adsorbierten B- Zellen) bewirkt wurde infolge der entsprechenden allmählichen Zunahme des Volumens der verwendeten Kör ner. Es ist jedoch zu bemerken, daß trotz des geringe ren Volumens der Körner die Beispiele 14 und 15 vergli chen mit dem Vergleichsbeispiel 4 eine bessere Adsorbtionsfähigkeit zeigten. Auch das Beispiel 16 zeigte eine höhere Adsorbtion als das Vergleichs beispiel 4.

Beispiel 17

Hydroxyapatitkörner (Ca/P-Verhältnis=1,67), die durch ein Verfahren gemäß Beispiel 4 erhalten wurden, wurden bei 1200°C gesintert, um poröse Hydroxyapatitkörner mit einer Porosität von 20% und einer Korngröße von 300 bis 600 µm zu erzeugen. In diesen Körnern hatten die Mikroporen eine mittlere Porengröße von 20 nm und die kleinen Poren eine mittlere Porengröße von 2 µm.

Eine spritzenkörperähnliche Säule mit einem Innen volumen von 6 ml wurde nacheinander mit 0,03 g Glas wolle bis zu 1 ml und 1 g in dem vorhergehenden Schritt erzeugter poröser Hydroxyapatitkörner gefüllt, um eine Trennsäule herzustellen.

Anschließend wurde 1 ml Blut in die Säule eingefüllt und das aus der Säule austretende Blut aufgefangen. Das getestete Blut enthielt 13% Zitronensäure, die dem Blut als Koagulationsinhibitor zugefügt worden war. Die Zel len in dem aufgefangenen Blut wurden markiert mit fluoresceinkonjugierten Antikörpern, CD3 (Anti-Leu 4) oder CD19 (Anti-Leu 12). Die roten Blutzellen wurden hämolysiert mit NH₄Cl. Anschließend wurde der Prosentzsatz an T-Zellen und B-Zellen in dem FACS nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse dieses Tests sind in der folgenden Tabelle 7 zusammengefaßt.

Beispiel 18

Das Verfahren gemäß Beispiel 17 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß das getestete Blut keine Zitronen säure enthielt. Das Blut wurde jedoch nach der Abnahme mit HBSS auf das zweifache Volumen verdünnt. 2 ml des verdünnten Blutes wurde in die Säule geführt. Die Er gebnisse der Bestimmung des positiven Prozentsatzes sind in der folgenden Tabelle 7 zusammengefaßt.

Beispiel 19

Das Verfahren gemäß Beispiel 17 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß das getestete Blut keine Zitronen säure enthielt. Nach der Abnahme wurde das Blut jedoch mit HBSS auf das vierfache Volumen verdünnt. 4 ml des verdünnten Blutes wurden in die Säule geführt. Die Er gebnisse der Bestimmung des positiven Prozentsatzes wurden in der Tabelle 7 zusammengefaßt.

Tabelle 7

Status der Zellentrennung (Prozentsatz)

Die Beispiele 4 bis 19 wurden im Zusammenhang mit der Trennung von Influenzaviren oder Lymphozytischen Zellen beschrieben. Die erfindungsgemäßen Trennmittel zum Ab trennen von Zellen oder Viren können jedoch in gleicher Weise auch zur Abtrennung anderer Viren und Zellen aus biologischen Flüssigkeiten mit befriedigenden Ergebnis sen verwendet werden. Ferner können die erfindungs gemäßen Trennmittel auch als Adsorbens für Pflanzen zellen wie beispielsweise "sugi(Zeder)"-Pollen verwen det werden, der Heuschnupfen hervorruft.

Beispiel 20

Eine spritzenkörperförmige Säule mit einem Innenvolumen von 5 ml wurde mit einem kleingeschnittenen Blatt aus Polyvinylformalharz ("SPONGE BELL-ETA", Produkt von Kanebo) gefüllt, das eine mittlere Porengröße von 100 µm und eine Formalisationsrate von 80 bis 86% hat, um ein Volumen von 0,2 ml zu bilden. Das kleingeschnittene Blatt hat einen Durchmesser von 13 mm und eine Dicke von 2 mm. Anschließend wurde die Säule mit 1 g von po rösen Hydroxyapatitkörnern (Ca/P-Verhältnis ist gleich 1,67) gefüllt, die durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren erhalten wurden und eine Korngröße von 300 bis 600 µm hatten. Die Körner wurden bei 700°C gesintert. Die Säule wurde schließlich mit demselben eingeschnitten Blatt aus Polyvinylformalharz unter Bil dung eine Volumens von 0,2 ml gefüllt. Auf diese Weise wurde ein Zellseparator hergestellt, der ein Füll material mit einer Sandwich-Struktur enthielt. Das Füllmaterial wurde mit HBSS bei einer Temperatur von 37°C gewaschen. Nach dem Waschen wurden 0,2 ml einer Suspension von mononuklearen Zellen in HBSS auf das Füllmaterial aufgegossen, so daß die Suspension in das Füllmaterial eindringen konnte. Die mononuklearen Zel len waren solche, die aus menschlichem peripheren Blut durch Zentrifugieren in herkömmlicher Weise vorher er halten wurden. Nach dem vollständigen Durchdringen wur den die nicht adsorptiven Zellen aus der Säule wieder durch Waschen des Füllmaterials mit HBSS entfernt. Es ist zu bemerken, daß die Poren der hier verwendeten Hydroxyapatitkörner Mikroporen mit einer mittleren Porengröße von 0,1 µm und kleine Poren mit einer mitt leren Porengröße von 6 µm waren.

Bei dieser Zelltrennung wurden die in Beispiel 1 be schriebenen Tests 1, 2 und 3 ausgeführt, um das Trenn vermögen des Separators zu bestimmen. Die Ergebnisse der Tests 1, 2 und 3 sowie die von der Vorbereitung der Säule bis zum Abschluß der Trennung erforderliche Zeit sind in den folgenden Tabellen 8 bis 11 zusammengefaßt.

Beispiel 21

Das Verfahren nach Beispiel 20 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die verwendeten Hydroxyapatitkörner bei 900°C gesintert wurden und daß die Poren dieser Körner Mikroporen mit einer mittleren Porengröße von 0,05 µm und kleine Poren mit einer mittleren Porengröße von 4 µm waren.

Die Ergebnisse der Tests 1, 2 und 3 sowie die für die Trennung erforderliche Zeit sind in den folgenden Ta bellen 8 bis 11 zusammengefaßt.

Beispiel 22

Das Verfahren nach Beispiel 20 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Hydroxyapatitkörner bei 1200°C gesintert wurden und daß die Poren dieser Körner Mikroporen mit einer mittleren Porengröße von 0,02 µm und kleine Poren mit einer mittleren Porengröße von 2 µm waren.

Beispiel 23

Das Verfahren nach Beispiel 20 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß kleingeschnittene Blätter von Polyvinylbutyralharz (Produkt von Sekisui Chemical) mit einer mittleren Porengröße von 500 µm und ein Butyralisationsgrad von 80 bis 86% anstelle des Polyvinylformalharzes verwendet wurden und daß die Säule mit 2 g poröser Hydroxyapatitkörner (Ca/P- Verhältnis=1,67) mit einer Korngröße von 300 bis 1200 µm gefüllt wurde, die bei 1200°C gesintert wurden. Die Poren dieser Körner waren Mikroporen mit einer mittleren Porengröße von 0,05 µm und kleine Poren mit einer mittleren Porengröße von 20 µm.

Diese Ergebnisse der Tests 1, 2 und 3 sowie die für die Trennung erforderliche Zeit wurden in den folgenden Tabellen 8 bis 11 zusammengefaßt.

Vergleichsbeispiel 5

Feinverteilte Nylonwolle wurde in einem ausreichenden Volumen einer 0,1 N HCl-Lösung über Nacht eingeweicht und anschließend verschiedene Male in deionisertem Wasser unter Ausdrücken gewaschen. Die gewaschene Wolle wurde dann bei 30°C für 3 Stunden getrocknet. Auf diese Weise wurde eine vorbehandelte Nylonwolle erhalten.

Eine spritzenkörperförmige Säule mit einem Innenvolumen von 5 ml wurde mit 0,25 g der vorbehandelten Nylonwolle bis zur 3 ml Marke aufgefüllt, um einen Zellseparator zu schaffen. Das Füllmaterial der Säule wurde gewaschen, und zwar zunächst mit einer physiologischen Salzlösung und anschließend mit HBSS bei einer Temperatur von 37°C. Nach dem Waschen wurden 0,2°ml einer Suspension von Monozyten in HBSS auf das Füllmaterial gegossen, so daß die Suspension in die Nylonwolle eindringen konnte. Die Monozyten wurden vorher aus normalem menschlichen peripheren Blut in herkömmlicher Weise durch Zentrifugieren isoliert. Nach dem Durchdringen des Hank′schen Mediums erfolgte eine Inkubation bei 37°C für 1 Stunde. Anschließend wurden die nicht-adsorbierten Zellen aus der Säule wiederum durch Waschen des Füllmaterials mit Hank'schem Medium entfernt.

Bei dieser Zelltrennung wurden die Tests 1, 2 und 3 gemäß Beispiel 1 durchgeführt, um das Trennvermögen des verwendeten Separators zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Tests sind zusammen mit der für die Trennung erforderlichen Zeit in den folgenden Tabellen 8 bis 11 dargestellt.

Zellenausbeute
Beispiel Nr.
Ausbeute (%)
Beispiel 20
92
Beispiel 21	95
Beispiel 22	89
Beispiel 23	88
Vergleichsbeispiel 5	24

Tabelle 9

Status der Zellentrennung (Prozentsatz)

Tabelle 10

Verteilung von T-Zellen-Untergruppen (Prozentsatz)

Für die Trennung erforderliche Zeit
Beispiel Nr.
Erforderliche Zeit
Beispiel 20\|45 Min.
Beispiel 21	45 Min.
Beispiel 22	45 Min.
Beispiel 23	40 Min.
Vergleichsbeispiel 5	2 Tage

Man erkennt aus diesen Beispielen, daß bei der Erfin dung eine exzellente Ausbeute und hohes Trennvermögen erhalten werden können, die nicht nur erheblich höher als die entsprechenden Werte bei dem herkömmlichen Füllmaterial (Nylonwolle) sondern auch stabil sind. Ferner ist die Verteilung der separierten T-Zellen- Untergruppen im wesentlichen gleich ihrer Verteilung vor dem Trennvorgang. Darüber hinaus ist es mit der vorliegenden Erfindung möglich geworden, eine rasche Trennung durchzuführen, da ein zeitraubender Waschvor gang und eine einstündige Inkubation entfallen können, die bei dem Füllmaterial aus Nylonwolle erforderlich waren.

Beispiel 24

Eine spritzenkörperförmige Säule mit einem Innenvolumen von 5 ml wurde mit kleingeschnittenem blattförmigen Polyvinylformalharz ("SPONGE BELL-ETA", Produkt von Kanebo) gefüllt, das eine mittlere Porengröße von 50 µm und einen Formalisationsgrad von 80 bis 86% hat. Das Füllvolumen betrug 0,2 ml. Das Blatt hatte 13 mm im Durchmesser und 2 mm Dicke. Anschließend wurde die Säule mit 1 g poröser Calciumphosphatkörner (Ca/P- Verhältnis ist gleich 1,67) gefüllt, die durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren gewonnen wurden und eine Korngröße von 100 bis 300 µm hatten. Diese wurden bei 1200°C gesintert. Die Säule wurde schließlich mit demselben kleingeschnittenen Polyvinylformalharzblatt gefüllt, wie dies oben beschrieben wurde, wobei das Füllvolumen wiederum 0,2 ml betrug. Auf diese Weise wurde ein Virusseparator geschaffen, der ein Füllmaterial mit einer Sandwichstruktur enthielt. Die Poren der hier verwendeten Calciumphosphatkörner waren Mikroporen mit einer mittleren Porengröße von 0,02 µm und kleine Poren mit einer mittleren Porengröße 2 µm.

Eine Suspension von PR8-Influenzaviren in einer physiologischen Salzlösung wurde in die Säule des Separators gegossen. Der Titer der durch die Säule hin durchgeleiteten Virussuspension wurde entsprechend der in Beispiel 4 beschriebenen Titerbestimmungsmethode be stimmt. Die Ergebnisse der Bestimmung sind in der fol genden Tabelle 12 zusammengefaßt.

Beispiel 25

Das Verfahren nach Beispiel 24 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die hier verwendeten Calciumphosphatkörner bei 700°C gesintert wurden und eine Porengröße von 100 bis 200 µm, Mikroporen mit einer mittleren Porengröße von 0,1 µm, kleine Poren mit einer mittleren Korngröße von 6 µm und ein Ca/P- Verhältnis von 1,67 hat. Die Ergebnisse der Titerbestimmung sind in der folgenden Tabelle 12 zusammengefaßt.

Beispiel 26

Das Verfahren nach Beispiel 24 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die verwendeten porösen Calciumphosphatkörner bei 700°C gesintert wurden und eine Korngröße von 100 bis 300 µm, Mikroporen mit einer mittleren Porengröße von 0,1 µm, kleine Poren mit einer mittleren Porengröße von 10 µm und ein Capp- Verhältnis von 1,5 hatten. Die Ergebnisse der Titerbestimmung sind in der folgenden Tabelle 12 zusammengefaßt.

Vergleichsbeispiel 6

Das Verfahren nach Beispiel 24 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Säule nacheinander mit 0,03 g (1 ml) Glaswolle und 1 g von Calciumphosphatkörnern gefüllt wurde. Die hier verwendeten Körner wurden durch ein Verfahren gemäß Beispiel 4 erhalten und bei 700°C gesintert. Sie hatten eine Korngröße von 100 bis 200 µm, Mikroporen mit einer mittleren Porengröße von 0,1 µm, kleine Poren mit einer mittleren Porengröße von 6 µm und ein Capp-Verhältnis von 1,67. Die Ergebnisse der Titerbestimmung sind in der folgenden Tabelle 12 zusammengefaßt.

Tabelle 12

Die Ergebnisse der Tabelle 12 zeigen, daß bei der vorliegenden Erfindung Viren wirksam adsorbiert und abgetrennt werden können. Ferner zeigt der Vergleich von Beispiel 25 mit dem Vergleichsbeispiel 6, daß im Beispiel 25 bei derselben Menge von Füllmaterial gute Ergebnisse und folglich eine gute Adsorption der Viren erreicht werden kann. Es ist zu bemerken, daß sich die vorstehend beschriebenen Beispiele auf Influenzaviren und T-Zellen beziehen. Mit der vorliegenden Erfindung lassen sich jedoch auch befriedigende Ergebnisse bei der Trennung anderer Viren und oder Zellen erreichen.

Claims

1. Trennmittel zum Abtrennen von Zellen oder Viren, bestehend aus Polyvinylacetalharz mit einer offenzelligen Struktur und einer mittleren Porengröße von 10 bis 1000 µm.

2. Trennmittel zum Abtrennen von Zellen oder Viren, bestehend aus Calciumphosphatkörnern mit offenzelliger Struktur, wobei die Calciumphosphatkörner zwei Porengrößeverteilungen haben, von denen die eine Mikroporen mit einer mittleren Porengröße im Bereich von 20 bis 500 nm und die andere kleine Poren mit einer mittleren Porengröße im Bereich von 1 bis 50 µm hat.

3. Trennmittel zum Abtrennen von Zellen oder Viren umfassend ein erstes Element aus Polyvinylacetalharz mit offenzelliger Struktur und einer mittleren Porengröße von 10 bis 1000 µm und einem zweiten Element in Form einer Schicht von porösen Calciumphosphatkörnern mit einer mittleren Porengröße von 10 bis 2000 µm, wobei das zweite Element auf das erste aufgebracht wird.

4. Trennmittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es ein drittes Element aus Polyvinylacetalharz mit offenzelliger Struktur und einer mittleren Porengröße von 10 bis 1000 µm umfaßt, das auf das zweite Element aufgebracht wird, um dieses sandwichartig zwischen dem ersten und dem dritten Element einzuschließen.

5. Trennmittel nach Anspruch 1, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyvinylacetalharz einen Acetalisierungsgrad von 50 bis 100% hat.

6. Trennmittel nach einem der Ansprüche 1, 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyvinylacetalharz eine poröse Schwammstruktur hat.

7. Trennmittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyvinylacetalharz in Form eines schwammartigen Blattes vorliegt.

8. Trennmittel nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Calciumphosphatkörner zwei Porengrößeverteilungen haben, von denen eine Mikroporen mit einer mittleren Porengröße von 20 bis 500 nm und die andere kleine Poren mit einer mittleren Porengröße im Bereich von 1 bis 50 µm hat.

9. Trennmittel nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Calciumphosphatkörner eine Porosität von 10 bis 75% haben.

10. Trennmittel nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Ca/P-Verhältnis der Calciumphosphatkörner einen Wert von 1,4 bis 1,8 hat.

11. Trennvorrichtung zum Abtrennen von Zellen oder Viren mit einem Behälter, dadurch gekennzeichnet, daß dieser ein Trennmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 10 enthält.

12. Verfahren zum Abtrennen von Zellen oder Viren, dadurch gekennzeichnet, daß eine biologische Flüssigkeit durch eine Säule hindurchgeleitet wird, die mit einem Trennmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 10 gefüllt ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet daß die biologische Flüssigkeit Blut, Serum, Urin, Speichel oder eine Suspension von Zellen und/oder Viren ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Flüssigkeit eine verdünnte Lösung von Blut ist, in der dem Blut ein Blutkoagulationsinhibitor hinzugefügt wurde und die mit einer Kulturlösung zur Vergrößerung des Volumens um das Ein- bis Zehnfache verdünnt wurde.