DE19964015A1 - Verfahren zur Entfernung oder Abtrennung von Viren in potentiell Viren enthaltenden Proben - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Entfernung oder Abtrennung von Viren in potentiell Viren enthaltenden Proben mittels Gelpermeations-Chromatographie an hydrophilen Trägern.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Entfernung oder Abtrennung von Viren in potentiell Viren enthaltenden Proben mit­ tels Gelpermeations-Chromatographie.

Oft können wertvolle Substanzen nur aus Proben oder Quellen isoliert werden, die biologischen Ursprungs sind. Dazu gehören insbesondere auch Arzneimittel, die beispielsweise Faktoren der Blutgerinnungskaskade enthalten. Zwar sind viele wirksame Proteine mittlerweile auch gentech­ nisch erhältlich, jedoch wird auch in diesen Fällen der entsprechende Wirkstoff durch transformierte Zellen gebildet. Der Wirkstoff wird dann durch Isolierungsverfahren aus den transformierten Organismen gewon­ nen. Dabei besteht ein Restrisiko, dass aus den biologischen Quellen in­ fektiöse Partikel verschleppt werden.

Ein erheblich größeres Risiko besteht jedoch bei der Isolierung von Wirk­ stoffen direkt aus biologischen Quellen. So ist beispielsweise ein hohes Infektionsrisiko bei der Aufarbeitung von Blutprodukten, die aus gepool­ ten Spenden stammen, zu verzeichnen. Erinnert sei hier nur an die In­ fektion von Hämophilie-Patienten durch mit HIV kontaminierten Faktor VIII Präparaten.

Es hat in der Vergangenheit nicht an Versuchen gefehlt, das Infektionsri­ siko durch solche Wirkstoffe zu verringern oder gar zu eliminieren. Zur Zeit durchgesetzt hat sich ein Verfahren, bei dem der zu isolierende Wirk­ stoff vor, während oder nach der Abtrennung mit Chemikalien behandelt wird, was zur Inaktivierung von möglicherweise in der Probe enthaltenen Viren führt. Eine diesbezügliche Methode ist in der EP-A-0 131 740 be­ schrieben.

Es ist wünschenswert, ein Verfahren bereitzustellen, welches eine Entfer­ nung oder Abtrennung von Viren in potentiell Viren enthaltenden Proben erlaubt, welche den zu isolierenden Wirkstoff nicht beschädigt. Deswei­ teren ist es wünschenswert, eine Methode zur Verfügung zu stellen, die eine Abtrennung oder Entfernung von Viren auf schnellem Wege erlaubt. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass dies erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Entfernung oder Abtrennung von Viren in poten­ tiell Viren enthaltenden Proben mittels Gelpermeations-Chromatographie an hydrophilen Trägern möglich ist.

Die Gelpermeations-Chromatographie ist eine an sich bekannte Metho­ de, mit deren Hilfe insbesondere Mischungen von Biopolymeren in Frak­ tionen aufgetrennt werden können, in denen in der Mischung enthaltene Moleküle nach ihrer Größe getrennt werden.

Bislang galt die Gelpermeations-Chromatographie als nicht geeignet, infektiöses Material wie Viren aus Biopolymere enthaltenden potentiell mit infektiösem Material kontaminierten Quellen so abzutrennen, dass keine Infizierung durch Verabreichung oder andere Nutzung des aus solchen Quellen erhaltenen Materials mehr erfolgen konnte.

Überraschenderweise hat sich gemäß der Erfindung gezeigt, dass zur Entfernung oder Abtrennung von Viren in potentiell Viren enthaltenden Proben die Gelpermeations-Chromatographie an hydrophilen Trägern eingesetzt werden kann.

Werden Plasmafraktionen zur Gewinnung von Komponenten der Blutge­ rinnungskaskade gemäß Josic et al. J. Chromatogr. A 796 (1998) 289-298 eingesetzt, so erhält man beispielsweise Faktor IX Präparate, die frei von infektiösen Partikeln, insbesondere Viren, die durch Blut oder Blutprodukte übertragbar sind (blood borne virus). Allerdings reagieren die Faktor IX Präparate nach Verlassen der Säule möglicherweise positiv in PCR Kontrollen auf virale DNA. Dies beruht auf Nukleinsäurekontami­ nationen durch virale aber nicht mehr infektiöse DNA/RNA, also Virus­ fragmente, wie sich durch einen DNA/RNA-Abbau zeigen lässt. Bei dem Abbau durch DNAse bzw. RNAse werden nur diese Virusfragmente ab­ gebaut, während die intakten, möglicherweise infektiösen Viren in einer Fraktion noch detektiert werden können, die von Biopolymeren getrennt wurden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Abtrennung von infek­ tiösen Partikeln und Viren in potentiell infektiöse Partikel enthaltenden Proben mittels Gelpermeations-Chromatographie an hydrophilen Trä­ gern. Vorzugsweise werden als hydrophile Träger Polysaccharide, insbe­ sondere Dextrane, Cellulose, Agarose, modifizierte Polysaccharide, hy­ drophile, synthetische Polymere, vorzugsweise sogenannte Tentakel- Chromatographiematerialien, mit hydrophilen Gruppen modifizierte Sili­ cagele oder Kombinationen davon eingesetzt.

Polysaccharide werden beispielsweise als kommerziell erhältliche Trä­ ger, wie Sephadex, Sepharose, Agarose, etc. eingesetzt. Dextrane sind dem Fachmann bereits seit langem zur Trennung von Substanzen be­ kannt. Neben Cellulose, Agarose kommen auch modifizierte Polysaccha­ ride in Betracht. Synthetische Polymere können ebenfalls eingesetzt werden. Bevorzugte synthetische Polymere sind solche auf Polyglyci­ dylmethacrylat-Basis, insbesondere mit hydrophilen Armen (Tentakeln) modifizierte. Zur weiteren Beschreibung wird auf die EP-A-0 337 144 und die EP-A-0 320 023 verwiesen, auf die ausdrücklich Bezug ge­ nommen wird. Als Tentakel-Chromatographiematerialien sind insbeson­ dere für Trennung von Biopolymeren Trägermaterialien verwendet wor­ den, die in der EP-A-0 337 144, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird, näher beschrieben sind. Neben den organischen hy­ drophilen Trägermaterialien kommen auch anorganische Materialien wie mit hydrophilen Gruppen modifizierte Silicagele in Betracht. Hier sind beispielsweise TSK-Gele sowie sogenannte SW-Serie (Silica wide pore, Toso Haas, Stuttgart) zu nennen.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende hydrophile Trä­ germaterial weist insbesondere eine großporige Struktur auf. Partikulä­ res Material weist insbesondere eine Korngröße von 0,5 bis 350 µm auf.

Ebenfalls Verwendung finden können sogenannte kompakte Blockmate­ rialien, wie sie in EP-A-0 320 023, auf die hier ausdrücklich Bezug ge­ nommen wird, beschrieben sind. Das kompakte Blockmaterial besitzt den Vorteil, dass es aufgrund seiner mehr oder weniger monolithischen Struktur druckstabil ist sowie im radialen Fluss betrieben werden kann, was zu einer vorteilhaften Verringerung des Totvolumens führt.

Die Porengröße des hydrophilen Trägers, angegeben als Maximum der Porengrößenverteilung der Poren des Trägers, kann in bestimmten Grenzen in Abhängigkeit des Trennproblems gewählt werden. Die Po­ rengröße ist in gewisser Weise nach oben dadurch begrenzt, dass die abzutrennenden Viren nicht oder nur teilweise in die Poren des hydro­ philen Trägermaterials eindringen können und somit allenfalls eine ver­ nachlässigbare Retardierung erfahren. Dies ist insbesondere abhängig von der aus der potentiell infektiöse Partikel enthaltenden Probe zu iso­ lierenden Substanz. Ist dies eine Substanz, die sich durch ein geringes Molekulargewicht auszeichnet, ist wiederum der Größenabstand zwi­ schen den infektiösen Partikeln und der zu trennenden Substanz groß genug, so dass auch größerporige Chromatographiematerialien verwen­ det werden können. Zwar kann dann das infektiöse Material auch eine gewisse Retardierung erfahren, welche jedoch im Vergleich zu dem ab­ zutrennenden Molekül gering genug ist, um eine hinreichend sichere Abtrennung von infektiösem Material und zu trennender Substanz zu erreichen.

Ebenso ist die Wahl der Porengröße des hydrophilen Trägermaterials nach unten begrenzt. Dies hängt dabei im wesentlichen von der Größe oder dem Molekulargewicht der zu trennenden Substanz ab. Typischer­ weise ist die Porengröße des hydrophilen Trägermaterials größer als 5 nm, insbesondere größer als 50 nm.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Abtrennung von Viren in potentiell Viren enthaltenden Proben, welche Biopolymere wie Proteine, Polypeptide, Oligopeptide, Nucleinsäuren, Polynukleotide, Oligonucleoti­ de und/oder Kohlenhydrate enthält. Es kommen insbesondere Proben wie Blutplasma oder Plasmafraktionen in Frage, welche Substanzen wie Faktor IX, Antithrombin III, Immunoglobuline G und A, Faktor VIII (ohne von Willebrand Faktor), Faktor VII, α₁-Antitrypsin, Prothrombin, Thrombin, Faktor X, Protein C, Protein S und andere Faktoren der Blut­ gerinnungskaskade enthält. Diese Substanzen können auch in einer Probe enthalten sein, die bei der gentechnischen Herstellung dieser Substanzen anfällt.

Die durch Blut oder Blutprodukte übertragbaren Viren, die durch das erfindungsgemäße Verfahren abgetrennt werden können, sind insbe­ sondere von durch Blut übertragbare Viren, wie Parvo Viren, Hepatitis A, B, C Viren, HIV und ähnliche.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden hydrophilen Träger werden insbesondere in konventionellen Chromatographie- Vorrichtungen bzw. -Verfahren eingesetzt. Dazu gehören beispielsweise die Säulenchromatographie in allen ihren Formen als diskontinuierliches oder kontinuierliches Verfahren. Auch die Chromatographie an kom­ pakten Blockmaterialien kann als diskontinuierliches oder kontinuierli­ ches Verfahren eingesetzt werden. Annulare Chromatographie, Simula­ ting-Moving-Bed(SMB)-Chromatographie und/oder Truly-Moving-Bed- Chromatographie kommen als kontinuierliche Verfahrensweisen in Be­ tracht, sowie Kombinationen dieser Chromatographieverfahren. Annu­ lare Chromatographie oder Chromatographie an kompakten Blockmate­ rialien sind insbesondere in den Veröffentlichungen K. Reissner et al., J. of Chromatography A. 763 (1997), 49 bis 56 sowie WO-A-96/06158 näher erläutert. Auf diese Druckschriften wird ausdrücklich Bezug ge­ nommen.

Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt auch in der gleich­ zeitigen Abreicherung von Begleitproteinen zur Herstellung von gerei­ nigten Proteinkonzentraten. Beispielsweise konnte durch die Gelper­ meations-Chromatographie, welche auch Molekularausschlußchromato­ graphie genannt wird, zur Abtrennung von vorher zugesetztem Testvi­ rus in einer Gerinnungsfaktor IX enthaltenden Plasmafraktion aus ge­ pooltem Humanplasma auch die weitere Reinigung des Gerinnungsfak­ tor IX erreicht werden. Überraschenderweise konnte als Verunreinigung Vitronektin quantitativ abgetrennt und identifiziert werden. Vitronektin wird nämlich durch das übliche Verfahren der Ionenaustauschchromato­ graphie oder Affinitätschromatographie an Heparin mit Faktor IX ange­ reichert. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde erstmals ein aus Plasma gewonnener Faktor IX erhalten, der sich nicht nur durch die Abwesenheit von infektiösen Partikeln, sondern auch durch die Abwe­ senheit von viralen Fragmenten und gleichzeitig die Freiheit von Vitro­ nektin kennzeichnet. Dieses humane Material ist damit frei von xenoge­ nen Komponenten, wie murinen Antikörpern und artfremden Nukleinsäuren. Zwar konnte gegebenenfalls im Stand der Technik durch den Einsatz von murinen monoklonalen Antikörpern eine Abreicherung von Vitronektin aus einer Faktor IX enthaltenden Lösung bewirkt wer­ den, jedoch mussten dann auch murine Verunreinigungen des erhalte­ nen Präparates in Kauf genommen werden, also der Gehalt an xenoge­ nen Biopolymeren.

Die Abtrennung von Vitronektin aus der Faktor IX enthaltenden Lösung führt erfindungsgemäß zu einer überraschenden Qualität eines Faktor IX enthaltenden pharmazeutischen Präparates. Es hat sich nämlich heraus­ gestellt, dass das Vitronektin in Faktor IX und PPSB Präparaten, also in Prothrombinkomplexpräparaten auf Basis der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X, in seiner aktiven Form enthalten ist. Diese Präparate ent­ halten gegebenenfalls desweiteren die antikoagulatorischen oder fibri­ nolytisch aktiven Faktoren Protein C und Protein S, welche zumeist als Gerinnungsinhibitoren bezeichnet werden.

Diese aktive Form des Vitronektin bindet den Plasminogen-Aktivator­ Inhibitor-1 (PAI-1) aus dem Spenderplasma. PAI-1 ist bekanntlich ein Inhibitor der Fibrinolyse und wirkt somit als Faktor zur Generierung von Thrombosen.

Nachdem sich überraschenderweise herausgestellt hat, dass PAI-1 ge­ meinsam mit aktivem Vitronektin gleichzeitig mit dem Faktor IX aus Plasma oder Plasmafraktionen gewonnen wird, ist es umso bedeuten­ der, dass das Vitronektin als Träger für PAI-1 abgereichert wird. Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann das Vitronektin aus einem Faktor IX oder aus PPSB Präparat abgetrennt werden, und die Abtrennung des vorhandenen PAI-1 mit Immunblot Analyse elektrophoretisch nachge­ wiesen werden.

Damit ist die unbedenkliche Verabreichung des erfindungsgemäß erhält­ lichen Faktor IX oder PPSB Präparates erstmals auch an Patienten mit erhöhtem Thromboserisiko möglich, wie zum Beispiel an Bettlägrige, Raucher und Patienten mit Hormonbehandlungen zum Beispiel Kontra­ zeptiva.

Die Erfindung wird anhand des nachfolgenden Beispiels näher erläutert.

Abtrennung von Viren in einer Präparation von Faktor IX

Faktor IX enthaltende Proben wurden in 5 ml Laufpuffer, 200 mM NaCl, 20 mM Natrium Citrat Dihydrat, pH 7,4, gelöst und über eine XK-26- Säule der Firma Pharmacia (r = 13 mm, h = 680 mm) gegeben. Bei einer Flussrate von 1 ml/min wurden alle 4 min Fraktionen gesammelt. Die Trennung erfolgte an Fractogel EMD Bio SEC 650 (S) (Merck Darmstadt). Ein typisches Chromatogramm ist in der Figur wiedergegeben. Die gestri­ chelte Linie entspricht dabei Fraktionen, in denen DNA nachweisbar war. Dabei ist die etwa im Bereich der Fraktionen 16 bis 28 eluierende nach­ zuweisende DNA auf intakte Viruspartikel zurückzuführen, wohingegen das scheinbare zweite Maximum im Bereich der Fraktionen 26 bis 44 auf virale Fragmente, die nicht infektiös sind, zurückgeht. Die Viruspartikel selbst eluieren mithin vollständig in den Fraktionen 16 bis 28. Bei den gewählten Parametern erscheint die Faktor IX Fraktion im Bereich der Fraktionen 32 bis 40, so dass eine hinreichende Abtrennung von Vi­ ruspartikeln zu beobachten ist.

Die viralen Fragmente wurden durch den Abbau mit DNAse vollständig entfernt und waren selbst mittels PCR-Verfahren unter der Nachweis­ grenze. Gleichzeitig konnte das Begleitprotein Vitronektin abgetrennt werden, wodurch eine homogene Faktor IX Präparation erhalten wurde.

Claims (14)

1. Verfahren zur Entfernung oder Abtrennung von Viren in potentiell Viren enthaltenden Proben mittels Gelpermeations-Chromatographie an hydrophilen Trägern.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die hy­ drophilen Träger Polysaccharide, insbesondere Dextrane, Cellulose, Agarose, modifizierte Polysaccharide, sogenannte Tentakel- Chromatographiematerialien, mit hydrophilen Gruppen modifizierte Silicagele oder Kombinationen davon ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophilen Träger eine großporige Struktur aufweisen, vorzugs­ weise in Form von partikulärem Material mit einer Korngröße von 0,5 bis 350 µm oder aus kompaktem Blockmaterial bestehen.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Porengröße des hydrophilen Trägers größer als 5 nm, insbesondere größer als 50 nm ist.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Biopolymere wie Proteine, Polypepti­ de, Oligopeptide, Nucleinsäuren, Polynukleotide, Oligonucleotide und/oder Kohlenhydrate enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Substanzen aus Blutplasma wie Faktor IX, Antithrombin III, Im­ munglobuline G und A, Faktor VIII, Faktor VII, α₁-Antitrypsin, Pro­ thrombin, Thrombin, Faktor X, Protein C, Protein S, die genannten Substanzen auch aus Fraktion zu ihrer Herstellung auf gentechni­ schem Weg, enthält.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren aus Blut übertragene Viren (blood borne virus) sind.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass diskontinuierliche oder kontinuierliche Verfah­ ren sowie Kombinationen davon eingesetzt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als konti­ nuierliches Verfahren annulare Chromatographie, Simulating-Moving- Bed(SMB)-Chromatographie und/oder Truly-Moving-Bed- Chromatographie eingesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Chromatographie an kompakten Blockmaterialien und/oder Säulen­ chromatographie als kontinuierliches oder diskontinuierliches Chro­ matographieverfahren eingesetzt wird.

11. Pharmazeutisches Präparat enthaltend Faktor IX, erhältlich aus Blut­ plasma durch ein Verfahren nach Anspruch 6, welches Präparat frei ist von Viren, viralen Fragmenten und Vitronektin.

12. Präparat nach Anspruch 11, welches frei ist von Plasminogen- Aktivator-Inhibitor.

13. Präparat nach Anspruch 11 oder 12, welches weiters die Faktoren II, VII und X, und gegebenenfalls die Gerinnungsinhibitoren Protein C und Protein S enthält.

14. Verwendung eines Präparates, nach einem der Ansprüche 10 bis 13, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung von Blutgerinnungstörungen in Patienten mit erhöhtem Thromboseri­ siko.