DE3402647A1 - Verfahren zur gewinnung von koloniestimulierendem faktor und kallikrein aus menschlichem urin - Google Patents

Verfahren zur gewinnung von koloniestimulierendem faktor und kallikrein aus menschlichem urin

Info

Publication number
DE3402647A1
DE3402647A1 DE19843402647 DE3402647A DE3402647A1 DE 3402647 A1 DE3402647 A1 DE 3402647A1 DE 19843402647 DE19843402647 DE 19843402647 DE 3402647 A DE3402647 A DE 3402647A DE 3402647 A1 DE3402647 A1 DE 3402647A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
kallikrein
buffer solution
csf
stabilizer
human urine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19843402647
Other languages
English (en)
Other versions
DE3402647C2 (de
Inventor
Satoshi Katano Funakoshi
Morio Kuboyama
Kazuo Fukuchiyama Morimoto
Muneo Kawasaki Yamada
Nobuya Tokyo Yanai
Hajime Tokyo Yokota
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Morinaga Milk Industry Co Ltd
Original Assignee
Green Cross Corp Japan
Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Green Cross Corp Japan, Morinaga Milk Industry Co Ltd filed Critical Green Cross Corp Japan
Publication of DE3402647A1 publication Critical patent/DE3402647A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3402647C2 publication Critical patent/DE3402647C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6445—Kallikreins (3.4.21.34; 3.4.21.35)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/22—Urine; Urinary tract, e.g. kidney or bladder; Intraglomerular mesangial cells; Renal mesenchymal cells; Adrenal gland
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/834—Urine; urinary system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

---3-- - - - 34026Α7Π
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von koloniestimulierendem Faktor (CSF) und Kallikrein aus menschlichem Urin.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur gleichzeitigen Gewinnung von kallikreinfreiem CSF und Kallikrein für pharmazeutische Zwecke, durch Isolierung von CSF und Kallikrein in gereinigtem Zustand und hoher Ausbeute aus Urin von gesunden Menschen oder einer Lösung, die CSF und Kallikrein enthält.
15
CSF und Kallikrein sind hochmolekulare, physiologisch aktive Substanzen, die in menschlichem Urin in Spuren vorkommen. CSF ist ein Glykoprotein, das auf granulopoetische Stammzellen im Knochenmark einwirkt und die Proliferation und Differenzierung dieser Zellen unter Bildung von Monocyten-Makrophagen und Granulocyten stimuliert. Die Granulocyten gehören zur Gruppe der Leukocyten; vgl. K. Motöyoshi et al., Blood, Bd. (1978), 1012-1020, und S.K. Das et al., Blood, Bd. 58 (1981), 630-64-1. Es ist ferner bekannt, daß CSF auch die in vivo-Bildung von CSF stimuliert, wenn es einem Krebs-Patienten gegeben wird, der an einer ernstlichen Leukopenie aufgrund einer Behandlung mit carcinostatischen Verbindungen oder Röntgenbestrahlung leidet. CSF fördert die Erholung oder die Zunahme der Zahl der Leukocyten, deren Hauptanteil die Granulocyten sind; vgl. K. Motoyoshi et al., Japanese Journal of Medicine, Bd. 21 (1982), 187-191-
Kallikrein ist ein proteolytisches Enzym, das bei der Bildung von Kinin eine Rolle spielt. Kinin ist ein physiologisch aktives Peptid, das sich vom Kininogen ableitet. Kininogen kommt im Säugerplasma vor. Das aus Kallikrein gebildete Kinin wirkt
L J
erweiternd auf die peripheren Blutgefäße und erhöht die Permeabilität der Blutgefäße. Kallikrein steuert diese Aktivitäten.
Es sind Kallikrein-Präparate bekannt, die aus tierischem Pankreas gewonnen und die in der Klinik zur Verbesserung der Blutzirkulation eingesetzt werden. Kallikrein aus menschlichem Urin hat eine physiologische Wirkung, die derjenigen von Kallikrein tierischen Ursprungs gleichwertig ist. Aufgrund seines menschlichen Ursprungs haben solche Kallikrein-Präparate geringere Nebenwirkungen. Sie können daher wiederholt gegeben werden. Somit sind derartige Präparate erheblich wertvoller als die Kallikrein-Präparate tierischen Ursprungs.
Zur Herstellung von Präparaten durch Isolierung von CSP und Kallikrein aus menschlichem Urin ist die gegenseitige Verunreinigung der beiden Substanzen unerwünscht im Hinblick auf die Qualität und Sicherheit des Präparates. Bei Verwendung von CSP zur Behandlung von Granulocytopenie wird es intravenös gegeben. Deshalb ist eine Verunreinigung von CSP durch Kallikrein untragbar. Wenn Kallikrein selbst in sehr geringen Mengen intravenös gegeben wird, verursacht es eine starke Senkung des Blutdrucks aufgrund seiner erweiternden Wirkung, auf periphere Blutgefäße. Die Verabfolgung größerer' Mengen an Kallikrein zusammen mit CSP auf intravenösem Wege kann aufgrund
des raschen Blutdruckabfalls zum Schock führen. 25
Es liegen nur sehr geringe Informationen über wirksame Verfahren zur Isolierung und Trennung von CSF und'Kallikrein aus menschlichem Urin vor. Der Grund hierfür ist, daß beide Substanzen sehr ähnliche Eigenschaften aufweisen, obwohl ihre physiologischen Wirkungen verschieden sind. Beispielsweise sind sowohl CSP als auch Kallikrein Proteine mit einer Zuckerkette, und ihr isoelektrischer Punkt liegt im Bereich von pH 5,0 bis 4,5- Es ist deshalb schwierig, sie aufgrund ihrer elektrischen Eigenschaften voneinander zu trennen. In mensch-
lichem Urin haben die beiden Substanzen ein sehr ähnliches Molekulargewicht. CSP hat ein Molekulargewicht von 60.000 bis
L J
100.000 Dalton und Kallikrein ein Molekulargewicht von 50.000 bis 80.000 Dalton.
Die bekannten Methoden zur .äbtisnnung und Reinigung von CSI 5 oder Kallikrein aus menschlichem Urin sind für eine wirksame und gleichzeitige Reinigung dieser Substanzen unbrauchbar. Bei der Gewinnung von CSP in gereinigter Porm und frei von Kallikrein ist die Ausbeute an Kallikrein sehr schlecht. Bei der Isolierung von Kallikrein ist die Gewinnung von CSP unmöglieh. Ein Verfahren zur gleichzeitigen Gewinnung von Kallikrein und CSP aus menschlichem Urin in gereinigter Porm und in hoher Ausbeute ist unter Verwendung der Affinitätschromatographie und der Ionenaustauschchromatographie bekannt; vgl. JP-OS 58629/82.
Dieses bekannte Verfahren befriedigt jedoch noch nicht vollständig. Beispielsweise hat die AffinitätsChromatographie zwar eine ausgezeichnete Trennungscharakteristik, jedoch sind die Kosten des Adsorptionsmittels pro Einheitsmenge des zu verarbeitenden Ausgangsmaterials hoch. Der Ionenaustausch andererseits ist zwar sehr wirtschaftlich, hat jedoch verfahrens technische Nachteile, insbesondere bei der Konzentrierung durch Gradienteneluierung zur Erzielung einer genauen Fraktionierung. Diese Maßnahme erfordert größte Sorgfalt und ist zeitaufwendig. Eine
dritte Methode zur gleichzeitigen Isolierung von CSP und Kallikrein in gereinigtem Zustand ist die Gelfiltrationschromatographie, bei der die Praktionierung aufgrund der Unterschiede des Molekulargewichts durchgeführt wird. Die bisher verv/endeten welchen Gele, hauptsächlich Polysaccharide oder verschiedene Kunststoffe, konnten jedoch eine vollständige Trennung von CSP und Kallikrein nicht bewirken, weil ihre Molekulargewichte so nahe beieinander liegen.
Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine
Methode, die erst seit kurzen entwickelt worden ist. Diese Methode gestattet
es, unter hohem Druck und hoher Strömungsgeschwindigkeit L J
3Α02647"1
verschiedene Verbindungen in sehr kurzer Zeit extrem genau chromatographisch zu fraktionieren. Insbesondere auf dem Gebiet der Gelfiltration stellt diese Methode eine bedeutende Verbesserung.der Fraktionierung hochmolekularer Substanzen aufgrund ihres Molekulargewichts dar. Gleichzeitig wurden harte Gele mit ausgezeichneter Druckbeständigkeit entwickelt, die anstelle der bekannten weichen Gele als Adsorptionsmittel verwendet v/erden.
Der Erfindung, liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung von koloniestimulierendem Faktor (CSF) und Kallikrein aus menschlichem Urin unter Verwendung einer Gelfiltration mittels .HP1^ zu entwickeln.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß CSF und Kallikrein ausgezeichnet durch HPLC
unter Verwendung eines druckbeständigen Gels getrennt werden können. Dieses Gel besteht hauptsächlich aus Silicagel. Kommerziell erhältliche Gele für die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie zeigen eine unspezifische Adsorption von CSF und Kallikrein, und ein Teil dieser Substanzen bleibt auf der Geloberfläche. Die unspezifische Adsorption auf der Geloberfläche ist.eine Erscheinung, .die allgemein bei handelsüblichen. Gelen beobachtet wird. Es ist jedoch möglich, diese Erscheinung durch Erhöhung der Ionenstärke des für die Chromatographie verwendeten Lösungsmittels zu unterdrücken. Eine Erhöhung der Ionenstärke andererseits hat zur Folge, daß die biologische Aktivität des CSF instabil wird und sieh die Ausbeute vermindert.
Die Erfinder haben ausgedehnte Untersuchungen über die Bedingungen der Hochleistungs-Flüssigkeitsgelfiltration zur wirksamen Abtrennung und Reinigung von CSF und Kallikrein sowie der unspezifischen Adsorption an dem Gel und der Abnahme der CSF-Aktivität durchgeführt. Die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe beruht auf dem Befund, daß ein Octylphenoxypolyäthoxyäthanol (OPPE) oder ein Polyäthylenglykol, die als Stabilisator
L J
für die CSF-Aktivität bekannt sind, für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet sind.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung von koloniestimulierendem Faktor und Kallikrein aus menschlichem Urin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Urin von gesunden Menschen oder eine koloniestimulierenden Faktor und Kallikrein aus menschlichem Urin enthaltende Lösung hinsichtlich ihres Proteingehalts konzentriert, das erhaltene Konzentrat mit einer einen Stabilisator enthaltenden Pufferlösung äquilibriert, sodann die Flüssigkeit der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unterwirft durch Einleiten der Flüssigkeit in eine Säule, die mit einem Gel mit einer molekularen Ausschlußgrenze - bestimmt mit einem globulären Protein - von 10 bis 5x10 Daltons gefüllt und die mit der Pufferlösung äquilibriert worden ist, und die Fraktionen mit dem koloniestimulierendem Faktor sowie die Kallikrein-Fraktionen fraktioniert und beide Fraktionen auffängt.
Die Fig. 1 und 2 zeigen das Fraktionierungsmuster von C3F und Kallikrein durch Gelfiltration nach dem bekannten Verfahren und durch HPLC nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. In /beiden Figuren ist auf der linken Ordinate die CSF-Aktivität und die optische Dichte bei 280 nm aufgetragen. Auf der rechten Ordinate ist die Kallikrein-Aktivität aufgetragen. Auf der Abszisse ist die Nummer der Fraktion aufgetragen. Die Symbole -, -o- und -»- zeigen die. optische Dichte, die CSF-Aktivität und die Kallikrein-Aktivität.
Menschlicher Urin oder eine koloniestimulierenden Faktor und Kallikrein aus menschlichem Urin enthaltende Lösung wird mit verdünnter Säure oder Alkali auf einen pH-Wert von 6 bis 8 eingestellt und nach einer geeigneten bekannten Methode zum Konzentrieren von Proteinen konzentriert, beispielsweise durch Adsorption an einem anorganischen Adsorptionsmittel, wie
L J
Kieselgel oder an einem Ionenaustauscher, Aussalzen unter Verwendung eines Neutralsalzes, wie Ammoniumsulfat, Ultrafiltration oder einer Korabination derartiger Maßnahmen. Der Proteingehalt in der erhaltenen konzentrierten Lösung beträgt vorzugsweise 2 bis 10 Gewichtsprozent pro Volumen.
Gewichtsprozent pro Volumen bzw. Volumenprozent pro Volumen bedeutet die Gewichtsmenge (g) oder Volumenmenge (ml) an Material in 100 ml der Flüssigkeit.
Zweckmäßig werden im erfindungsgemäßen Verfahren bekannte Methoden bei der Konzentrierungsstufe verwendet, um verunreinigende hochmolekulare Substanzen so gut wie möglich innerhalb eines Bereiches abzutrennen, der sich auf die Gewinnung von CSF und Kallikrein nicht schädlich auswirkt.
Die erhaltene konzentrierte Flüssigkeit wird mit einer Pufferlösung mit einer Ionenstärke von mindestens 0,05 und weniger als 0,5, vorzugsweise von 0,1 bis 0,3 und mit einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0, beispielsweise einer Natriumphosphatpufferlösung äquilibriert. Sodann wird OPPE, z.B. Triton X-IOO--', oder ein Polyäthylenglykol -zugegeben·. Beide Substanzen sollen ein Molekulargewicht von 1000 bis 10.000 haben. Diese Substanzen werden als Stabilisator in einer Konzentration von 0,01 bis 0,1 Gewichtsprozent pro Volumen zur Lösung gegeben. Sodann wird die erhaltene Flüssigkeit einer 'HPLC
• unterworfen. Zu diesem Zweck wird die Flüssigkeit in eine Säule eingeleitet, die mit einem Gel für die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gefüllt ist. Das Gel hat eine molekulare Ausschlußgrenze von 1O-3 bis 5 x 10^ DaIton, bestimmt mit einem globulären Protein. Ein derartiges Gel ist beispielsweise TSK-GeI 3000 SV/, Zorbax® PSM-1000 oder Shim-pack '^HSG-40. Das Gel wird mit'der vorgenannten Pufferlösung äquilibriert, die die gleiche Pienge an Stabilisator enthält. Zu diesem Zweck wird die Lösung vorher durch das Gelbett geleitet. Die Flüssigkeit wird durch die Säule mit einer
L J
—2 1
Geschwindigkeit von 1 bis 5 ml χ cm χ min mittels einer Hochdruckp-umpe geleitet. Der Druck der Pufferlösung, die durch die Säule geleitet wird, hängt vom Durchmesser der Säule ab. Normalerweise beträgt der Druck bei einem Säulendurchmesser von 5 mm vorzugsweise mindestens 10 kg/cm2 (10 bar).
Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren wird aus der Säule CSF als Fraktion mit einem einzigen Elutionspeak bei einem Molekulargewicht von 85-000 Dalton und Kallikrein als eine Fraktion mit einem Elutionspeak bei einem Molekulargewicht von 60.000 Dalton einzeln isoliert. Sowohl CSF als auch Kallikrein können noch der
Dialyse und dem Entsalzen unterworfen werden, sie können.mit einem pharmazeutisch verträglichen, den pH-Wert einstellenden Salz vermischt, einem Hilfsmittel zur Verbesserung der Auflösung oder einem Exzipient versetzt und anschließend zur Sterilisation z.B. der Membranfiltration unterworfen werden. Danach werden die Präparate abgefüllt oder unter aseptischen Bedingungen lyophilisiert. Das auf die vorstehend beschriebene V/eise isolierte CSF und Kallikrein kann einzeln nach an sich bekannten Methoden noch weiter gereinigt werden.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Versuche und Beispiele weiter erläutert.
Versuch 1
Vergleich der HPLC nach dem Verfahren der Erfindung mit einem bekannten Verfahren.
Eine konzentrierte Flüssigkeit aus menschlichem Urin, die auf die nachstehend in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt worden ist, wird der Gelfiltrationschromatographie an Sephacryl S-300 nach dem bekannten Verfahren sowie der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatograph'ie (HPLC) an-TSK-GeI 3000 SW nach dem Verfahren der Erfindung unterworfen, um die Abtrennungscharakteristika der beiden Methoden zu vergleichen. In die Sephacryl S-300-Säule (Durchmesser 20 χ 1200 mm) werden 1,4 ml der
L J
konzentrierten Flüssigkeit gegeben, während in die TSK-GeI 3OOO SW-Säule (Durchmesser 7,5 x 1200 mm) 0,2 ml der gleichen Flüssigkeit gegeben werden. Zur Chromatographie wird die gleiche Pufferlösung wie in Beispiel 1 in einer Strömungsgeschwindig-
keit in der erstgenannten Säule von 5 ml/cm /Stunde mittels einer Perista-Pumpe und in der zweitgenannten Säule in einer
Strömungsgeschwindigkeit von 2,0 ml/cm /Minute mittels einer Hochdruck-Flüssigkeitspumpe LC-3A geleitet. Es werden jeweils 5 ml Fraktionen aus der erstgenannten Säule bzw. 2 ml Fraktionen aus der zweit genannt en Säule aufgefangen und auf ihre CSF- und Kallikrein-Aktivität folgendermaßen untersucht. Die CSF-Aktivität wird nach der Koloniebildungsmethode mit C57BL/6N Mäüseknochenmarkszellen unter Verwendung der Monolayer-Weichagar-Kultur-Technik bestimmt. Jede Fraktionsprobe wird mit destilliertem Wasser verdünnt, das 2 Volumenprozent pro Volumen Rinderserum enthält, und durch Filtration sterilisiert. Es wird ein 0,45 Mikron Filter verwendet. Jeweils 0,1 ml-Anteile des. Filtrats v/erden in drei Petri-Schalen gegeben, die mit 1 ml Mc Coy's 5A Medium (enthaltend 0,3 Gewichtsprozent pro Volumen Agar und 20 Volumprozent pro Volumen fetales Kälberserum) sowie 1 χ 10 ^ C^BL/eN Mäuseknochenmarkzellen versetzt.
S (
Nach gründlichem Mischen wird das Gemisch 7 Tage in einem Inkubator bei 37°C in vollständig angefeuchteter, 7,5 Volumprozent pro Volumen Kohlendioxid enthaltender Atmosphäre inkübiert. Nach dem Inkubieren wird die Anzahl der entstandenen Kolonien unter einem Mikroskop gezählt. Der Ausdruck "Kolonie" bedeutet ein Zellaggregat, das mehr als 50 Zellen enthält. Die CSF-Aktivität wird ausgedrückt durch die Zahl (Einheiten) der gebildeten Kolonien. Eine Einheit bedeutet eine gebildete Kolonie. Die Reinheit der erhaltenen CSF-Probe wird ausgedrückt durch die spezifische Aktivität. Dies zeigt die Zahl der Kolonien die durch 1 mg der Proteinprobe gebildet worden ist.
Die Kallikrein-Aktivität wird enzymatisch mit H-D-Val-Leu-Arg-paranitroanilin (nachstehend als Peptid-PNA bezeichnet),
L J
einem synthetischen Substrat für Kallikrei^ bestimmt. 0,1 ml der Probe wird mit 2 ml einer 0,2 M tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) vermischt, 5 Minuten bei 37°C vorinkubiert, sodann mit 0,2 ml einer 0,2 mM Lösung des Peptid-PNA vermischt und 30 Minuten bei 37°C umgesetzt. Anschließend werden 0,2 ml 50Gewichtsprozent pro Volumen Essigsäurelösung zum Reaktionsgemisch gegeben, um die Reaktion abzubrechen. Hierauf wird die freigesetzte Menge an PNA bei 405 nm bestimmt. Eine Probe, die Aprotinin, einen Kallikrein-Inhibitor, enthält., wird als Kontrolle verwendet. Die Kaliikrein-Aktivitat wird ausgedrückt durch die pro Minute bei 37°C gebildete Menge an PNA. Eine PNA-Einheit bedeutet 1 Mikromol PNA, das in 1 Minute gebildet wird.
Die Trennungsmuster nach dem bekannten Verfahren und nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sind in Fig. 1 bzw. Fig. 2 wiedergegeben.
In beiden Figuren sind auf der linken Ordinate die CSF-Aktivität und die optische Dichte bei 280 um und auf der rechten Ordinate die Kaliikrein-Aktivität aufgetragen. Auf der Abszisse ist die Nummer der Fraktion aufgetragen. Die Symbole -, -o- und -·- zeigen die optische Dichte, die CSF-Aktivität und die
Kallikrein-Aktivität an.
25
Bei der Gelfiltrationschromatographie mit Sephacryl S-300 nach dem bekannten Verfahren lassen sich CSF und Kallikrein nicht vollständig voneinander trennen; die Ausbeute an kallikreinfreier CSF-Fraktion liegt unter 30 %. Bei der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie nach dem Verfahren der Erfindung lassen sich CSF und Kallikrein nahezu vollständig voneinander trennen^ die Ausbeute an kallikreinfreiem CSF beträgt mindestens 90?j. Die Ergebnisse der Ausbeute an CSF und Kallikrein sowie des Gehalts an Kallikrein in CSF nach den beiden vorstehend beschriebenen Methoden sind in Tabelle I zusammengefaßt. . .
Tabelle I
Ausbeuten an CSF und Kallikrein nach, dem bekannten Verfahren und dem erfindungsgemäßen Verfahren.
10
CSF-Fraktion Kallikrein-
Gehalt (PNA-
Einheiten)		 Kallikrein-
■ Ausbeute,^
Ausbeute,$ 0,0019 38
Sephacryl S-3OO 26,5 0,0001 Ξ + ■90
Erfindungegemäßes
Verfahren		 92,5
Anm.
unterhalb der Nachweisgrenze.
20
Versuch 2
Vergleich der Ausbeute unter verschiedenen Bedingungen der Ionenstärke der Pufferlösung und der Konsentration des Stabilisators.
25 30
Zur Untersuchung der Adsorption von CSF und Kallikrein auf dein Gelfiltrationsträger für die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogra-phie sowie des Einflusses der Ionenstärke der Pufferlösung und der Konzentration des Stabilisators wird die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt, und die CSF- und Kallikrein-Aktivität wird in gleicher V/eise wie im Versuch 1 bestimmt, um die Ausbeuten zu vergleichen.
Die bei diesem Versuch verwendete konzentrierte Flüssigkeit aus menschlichem Urin wird in gleicher V/eise hergestellt, wie dies nachstehend in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wird mit einer TSPI-GeI 3000 SW-Säule (Durchmesser 7,5 χ 1200 mm) und einer LC-3A-Pumpe bei Raumtemperatur und einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/Minute durchgeführt.
Als Stabilisator wird ein Polyäthylenglykol mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 6000 DaIton verwendet. Es werden 0,01 bis 0,5 M Natriumphosphat-Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 7,0 verwendet. . Die Ionenstärke beträgt etwa 0,02 bis 1,14. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle II und Tabelle III zusammengefaßt. Bei der Chromatographie mit einer Pufferlösung unterschiedlicher Konzentration, die keinen Stabilisator enthält, ist in jedem Pail die Ausbeute niedrig. Insbesondere bei niedriger lonenstärke ist sowohl die Ausbeute an CSP als auch die von Kallikrein niedrig.
20 25
Tabelle II
Konzentration einer stabilisatorfreien Pufferlösung und Aus beute an CSP und Kallikrein.
Natriumphosphat-
Konzentration, M		 CSP-Ausbeute, % Kallikrein-
Ausbeute, %
0.01 20.6 59.8
0.05 38.3 60.8
0.1 42.9 84.6
0.2 40.3 81.3
0.3 39.5 80.5
0.4 29.6 79.4 :
0.5 28.8 81.8 j
Anm.: Die Ausbeute bezieht sich auf die Aktivität .der. konzentrierten Flüssigkeit vor der Behandlung.
Beim Vergleich der Ausbeuten an CSP bei Verwendung einer 0,1 M Natriumphosphat-Pufferlösung (lonenstärke 0,20), die Polyäthylenglykol oder Triton X-100 in unterschiedlichen Konzentrationen enthält, wie dies in Tabelle III angegeben ist,
3Α02647
zeigte sich, daß die Ausbeute an CSF deutlich verbessert ist, wenn Polvathylenglykol oder Triton X--100 als Stabilisator in einer Konzentration von Ο,ΟΊ bis 0,1# verwendet wird. Der Stabilisator wird vorzugsweise in niedriger Konzentration verv/endet. Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß eine Konzentration von 0,01 Gewichtsprozent pro Volumen des Stabilisators gute Ergebnisse liefert. Bei Erhöhung der Konzentration des Stabilisators über den erforderlichen Wert erfolgt unvollständige Trennung von CSF und Kallikrein und die Viskosität der Probe nimmt zu. Konzentrationen oberhalb 0,1 Gewichtsprozent pro Volumen sind nicht bevorzugt.
Tabelle III
CSF-Ausbeute mit Pufferlösungen unterschiedlicher Stabilisatorkonzentration.
20
30
Anm.
CSF-Ausbeute Triton-X-100
Stabilisator
kon ζ entrat i on,
?ö, Gewicht pro
Volumen		 Polyäthylen-
glykol		 40.3
o - 40.3 68.2
0.005 72.6 90.6
0.01 88.4 ' 91.8
0.05 92.4 93.4
0.1 94.5 _*
0.5 _*
Unvollständige Trennung von CSF und Kallikrein,
Die in Tabelle III zusammengefaßten Ergebnisse wurden mit einer 0,2 M Natriumphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 7 s1*" halten. Selbst wenn die Ionenstärke der Pufferlösung durch Zugabe eines Neutralsalzes, wie Natriumchlorid, %rerändert
wurde, konnte eine ähnliche Verbesserung der Ausbeute in Gegenwart des Stabilisators beobachtet werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt. Hier ist die Ausbeute an CSF und Kallikrein bei Verwendung verschiedener Pufferlösungen in Gegenwart von 0,01$ Polyäthylenglyicol angegeben.
Tabelle IV Ausbeute an CSF und Kallikrein mit verschiedenen Pufferlösungen
10 15
Pufferlösung CSF-Ausbeute 90. 8 Kallikrein-
Ausbeute, %
0.1 M NaCl + 0.02 M
Natriumphosphat
(pH 7.Oj 		91. 2
0.2 M KCl + 0.01 M
tris-HCl (pH 7.0
92.4
92.8
Der pH-Wert der bei der Chromatographie verwendeten Pufferlösung hat keinen Einfluß auf die Trennung von CSP und Kallikrein. Sofern die Pufferlösung alkalisch reagiert und ein im wesentlichen aus Kieselgel bestehendes Gel verwendet wird, erfolgt Auflösung des Gels. Bei Verwendung von Pufferlösungen im sauren pH-Bereich können Korrosionsprobleme auftreten.
Der bevorzugte pH-Bereich liegt im nahezu neutralen pH-Bereich, d.h. von 6,0 bis 8,0.
Beispiel Λ Etwa 20 Liter menschlicher Urin v/erden mit 10 η Natronlauge auf einen pH-Wert von 75O eingestellt und auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule mit den Abmessungen 4·,0 χ 50 cm gegeben. Die Proteine werden an der Füllung adsorbiert. Sodann wird die Säule mit 500 ml 5prozentiger wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat wird mit 1 η Schwefelsäure neutralisiert und danach zur Abtrennung unlöslicher Substanzen 30 Minuten
bei POOO χ g zentrifugiert. Der Überstand wird sodann mit Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt. Es bildet sich eine Fällung, die bei 40C während 30 Minuten bei' 8000 χ g abzentrifügiert wird. Die entstandene Fällung wird in 100 ml einer 0,02 M Phosphatpufferlösung pH 7 gelöst und mit der gleichen Pufferlösung auf das Zehnfache verdünnt. Danach wird die erhaltene Lösung mit 40 g DElE-Cellulose versetzt, die vorher mit dieser Pufferlösung äquilibriert worden ist. Die Lösung und die DEAE-Cellulose werden 1 Stunde bei 40C gemischt. Nach dem Mischen wird die DEAE-Cellulose abfiltriert, gründlich mit 0,02 M Phosphatpufferlösung. pH7, die 0,-1 M an Natriumchlorid ist, gewaschen und danach mit 500 nil einer 0,02 K Phosphatpufferlösung pH 7 eluiert, die 0,4 M an Natriumchlorid ist. Das Eluat v/ird durch ein Glasfilter filtriert und sodann mittels einer Ultrafiltrationsmembrah (HC-I) konzentriert und gleichzeitig mit 0,1 M Phosphatpufferlösung pH 7 äquilibriert. Es v/ird eine konzentrierte Flüssigkeit von menschlichem Urin erhalten.
20 ml der erhaltenen konzentrierten Flüssigkeit (Proteinkonzentration 4,2 Gewichtsprozent pro Volumen) v/erden mit PoIyäthylenglykol 6000 bis zu einer Konzentration von 0,01 Gewichtsprozent pro Volumen versetzt. Das Gemisch wird durch ein 0,4 Mikron Filter filtriert.
Die erhaltene konzentrierte Flüssigkeit (0,2 ml) wird auf eine Säule mit den Abmessungen 7,5 χ 1200 mm gegeben, die mit TSK-GeI 3000 SW gefüllt ist. Die Fügung wird vorher mit 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) äquilibriert, die 0,01 Gewichtsprozent pro Volumen Polyäthylenglykol enthält. Zur Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wird die Pufferlösung durch die Säule in einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/ min mittels einer Hochdruckpumpe geführt. Dabei erfolgt eine Trennung von CSF und Kallikrein. Es v/erden jeweils 10 ml einer Fraktion von CSF und Kallikrein gewonnen, die durch Dialyse entsalzt und sodann unter aseptischen Bedingungen
L J
r -/Tt -
lyophilisiert werden. Auf diese V/eise werden etwa 1 mg CSF und 2,4 mg Kallikrein erhalten. Die Ausbeute an CSi1, bezogen auf die ursprüngliche Aktivität, beträgt etwa ψ\-%. Die spezifische Aktivität des erhaltenen CSF beträgt 4· χ 1O^ Einheiten pro mg Protein. Es konnte keine Verunreinigung durch Kallikrein festgestellt werden. Die Ausbeute an Kallikrein, bezogen auf die ursprüngliche Aktivität, beträgt etwa 78$ und das Präparat hat eine spezifische Aktivität von 0,525 PNA Einheiten pro mg Protein.
10
B e i s ρ i e 1 2
20 Liter Urin von gesunden Menschen werden mit einer 0,02 M Phosphatpufferlösung (pH 7»4·) mittels einer Ultrafiltrationsmembran (HIOPIO) äquilibriert. Sodann werden 40 g DSAE-Cellulose zugegeben, die vorher mit der Pufferlösung äquilibriert worden ist. Nach 1 stündigem Mischen bei 4 0C wird die DEAE-Cellulose abfiltriert, gründlich mit der Pufferlösung gewaschen und sodann mit 1 Liter einer 0,02 M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) eluiert, die 0,4 H an Natriumchlorid ist. Es wird eine konzentrierte Flüssigkeit erhalten. Die konzentrierte Flüssigkeit wird mittels einer Ultrafiltrationsmembran weiter konzentriert, gegen eine 0,i M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) dialysiert, die 0,01 Gewichtsprozent pro Volumen Triton X-100 enthält, und sodann auf eine TSK-GeI 3000 SV/ Säule gegeben, die vorher mit der Pufferlösung äquilibriert worden ist. Die weitere Behandlung und Aufarbeitung erfolgt gemäß Beispiel 1. Es werden etwa 0,9 mg CSF und etwa 2,5 mg Kallikrein erhalten. Die Ausbeute an CSF und Kallikrein, bezogen auf die ursprüngliche Aktivität, beträgt 92 bzw. 94$.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat folgende Vorzüge:
(1) Die Ausbeuten an CSF und Kallikrein sind etwa 3,5 bzw. 2,5 Mal höher als nach den bekannten Verfahren;
(2) CSF und Kallikrein können gleichzeitig gewonnen werden; (5) das CSF kann praktisch kallikreinfrei gewonnen werden;
(4) CSF und Kallikrein können in wesentlich.kürzerer Zeit als. bisher gewonnen v/erden.
L J
Γ - 18 - -,
1 "Verfahren zur Gewinnung von koloniestimulierendem Faktor und ' Kallikrein aus menschlichem Urin"
- Leerseite -

Claims (1)

  1. Ui>. I AU-C-HNE« ; H.E-UNEMANN - RAUH
    PATENTANWÄLTE
    SIEBERTSTRASSE Λ ■ 8OOO MÜNCHEN 86 ■ PHONE: (ΟΒΘ) 47 4Ο75 CABLE: BENZOLPATENT MDNCHEN ■ TELEX 5-29453 VOPAT D
    u.Z.: S 781 (Vo/H)
    Case: A 8157-06 Green Cross 8> °'aa iS
    THE GREEN CROSS CORPORATION
    Osaka, Japan'
    und
    MORINAGA MILK INDUSTRY CO., LTD.
    Tokyo, Japan
    "Verfahren zur Gewinnung von koloniestimulierendem Paktor und Kallikrein aus menschlichem Urin"
    Patentansprüche Γ
    rl.!Verfahren zur Gewinnung von koloniestimulierendem Paktor und Kallikrein aus menschlichem Urin, dadurch gekennzeichnet, daß man Urin von gesunden Menschen oder eine koloniestimulierenden Paktor und Kallikrein aus menschlichem Urin enthaltende Lösung hinsichtlich ihres Proteingehalts konzentriert, das erhaltene Konzentrat mit einer einen Stabilisator enthaltenden Pufferlösung äquilibriert, die Flüssigkeit einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unterwirft durch Einleiten der Flüssigkeit in eine Säule, die mit einem Gel mit einer molekularen Ausschlußgrenze bestimmt mit einem globulären Protein - von 10 bis 5 χ 105 Dalton gefüllt und die mit der Pufferlösung äquilibriert worden ist, und die Fraktionen mit dem koloniestimu-
    lierendem Faktor sowie die Kallikrein-Fraktionen fraktioniert und beide Fraktionen auffängt.
    r .:>-.?:-■ :. :..:'Τ- 34026Α7"1
    1 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Pufferlösung einer Ionenstärke von 0,05 bis 0,5 und einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0 verwendet, die 0,01 bis 0,1 Gewichtsprozent pro Volumen eines Stabilisators enthält. 5
    3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stabilisator ein Octylphenoxypolyäthoxyäthanol oder ein Polyathylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 10.000 DaIton verwendet. 10
    4·. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man. eine Pufferlösung mit einem Stabilisatorgehalt von 0,01 bis 0,1 Gewichtsprozent pro Volumen bezogen auf die Pufferlösung verwendet. 15
    L. J
DE3402647A 1983-01-28 1984-01-26 Verfahren zur Gewinnung von koloniestimulierendem Faktor und Kallikrein aus menschlichem Urin Expired DE3402647C2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP58011317A JPS59137417A (ja) 1983-01-28 1983-01-28 人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3402647A1 true DE3402647A1 (de) 1984-08-02
DE3402647C2 DE3402647C2 (de) 1986-11-27

Family

ID=11774637

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3402647A Expired DE3402647C2 (de) 1983-01-28 1984-01-26 Verfahren zur Gewinnung von koloniestimulierendem Faktor und Kallikrein aus menschlichem Urin

Country Status (7)

Country Link
US (1) US4482485A (de)
JP (1) JPS59137417A (de)
AU (1) AU545411B2 (de)
CA (1) CA1200489A (de)
DE (1) DE3402647C2 (de)
FR (1) FR2540121B1 (de)
GB (1) GB2134528B (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0211684A2 (de) * 1985-08-16 1987-02-25 Immunex Corporation Aktivierung der tumorzerstörenden Aktivität der Makrophagen mittels des Granulozyten-Makrophagen-Kolonien stimulierenden Faktors

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6146851A (en) * 1985-02-05 2000-11-14 Chiron Corporation DNA encoding NV2 (long form) and carboxy truncated fragments thereof
US5792450A (en) * 1985-02-05 1998-08-11 Chiron Corporation Purified human CSF-1
US5422105A (en) * 1985-02-05 1995-06-06 Cetus Oncology Corporation Use of recombinant colony stimulating factor 1
US5104650A (en) * 1985-02-05 1992-04-14 Cetus Corporation Uses of recombinant colony stimulating factor-1
WO1986004607A1 (en) * 1985-02-05 1986-08-14 Cetus Corporation Recombinant colony stimulating factor-1
US5573930A (en) 1985-02-05 1996-11-12 Cetus Oncology Corporation DNA encoding various forms of colony stimulating factor-1
US6156300A (en) * 1985-02-05 2000-12-05 Chiron Corporation Point mutants of N∇2 CSF-1 and carboxy truncated fragments thereof
US5837229A (en) * 1985-02-05 1998-11-17 Chiron Corporation Uses of recombinant colony stimulating factor-1
US4847201A (en) * 1985-02-05 1989-07-11 Cetus Corporation DNA encoding for CSF-1 and accompanying recombinant systems
WO1986004587A1 (en) * 1985-02-05 1986-08-14 Cetus Corporation Purification of native colony stimulating factor-1
US5556620A (en) * 1985-02-05 1996-09-17 Cetus Oncology Corporation Use of recombinant colony stimulating factor-1 to enhance wound healing
JPH0753667B2 (ja) * 1985-08-09 1995-06-07 新技術開発事業団 骨髄移植療法補助剤
JPH0618779B2 (ja) * 1986-01-22 1994-03-16 中外製薬株式会社 造血機能回復促進剤
AU605901B2 (en) * 1987-09-11 1991-01-24 Ares Trading S.A. Purification process
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
JPH05163158A (ja) * 1991-12-13 1993-06-29 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd 人尿性キニノゲナーゼを有効成分とする皮膚潰瘍の予防及び治療剤
US5695928A (en) * 1993-12-10 1997-12-09 Novartis Corporation Rapid immunoassay for detection of antibodies or antigens incorporating simultaneous sample extraction and immunogenic reaction
US20030212021A1 (en) * 2001-01-25 2003-11-13 Frost Gregory I. Myeloid colony stimulating factor and uses thereof
JP3872003B2 (ja) 2002-10-22 2007-01-24 竹内精工株式会社 ボールリニアガイド及びボールリニアガイドの製造方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2874088A (en) * 1952-08-25 1959-02-17 Bayer Ag Recovery of kallikrein
DE1102973B (de) * 1960-03-25 1961-03-23 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von hoch gereinigten Kallikrein-Praeparaten
BE790794A (fr) * 1971-11-03 1973-04-30 Bayer Ag Procede de purification et de cristallisation de kallicreine
US3905870A (en) * 1972-11-03 1975-09-16 Bayer Ag Purification of kallikrein
JPS5544726B2 (de) * 1973-05-17 1980-11-13
JPS6030291B2 (ja) * 1978-03-20 1985-07-16 森永乳業株式会社 人顆粒球の分化増殖を促進するｈｇｉ糖蛋白質、ｈｇｉ糖蛋白質の製造法及びｈｇｉ糖蛋白質を含有する白血球減少症治療剤
JPS5517364A (en) * 1978-07-25 1980-02-06 Toho Yakuhin Kogyo Kk Purification of pancreatic kallikrein
IN150740B (de) * 1978-11-24 1982-12-04 Hoffmann La Roche
US4178285A (en) * 1978-12-20 1979-12-11 Felts James M Separation of active α1 -acid glycoprotein and utilization in the lipoprotein lipase enzyme system
US4342828A (en) * 1979-07-20 1982-08-03 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Method for producing substance capable of stimulating differentiation and proliferation of human granulopoietic stem cells
JPS5758629A (en) * 1980-09-25 1982-04-08 Morinaga Milk Ind Co Ltd Separating and purifying method of colonization stimulating factor and callicrein in human urine
DE3103257A1 (de) * 1981-01-31 1982-08-26 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zur herstellung des hochreinen enzyms kallikrein aus schweinepankreas-extrakten
US4359415A (en) * 1981-06-03 1982-11-16 University Of Tennessee Research Corporation Isolation of an antineoplastic protein fraction and an antineoplastic peptide fraction from human urine

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICHTS-ERMITTELT *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0211684A2 (de) * 1985-08-16 1987-02-25 Immunex Corporation Aktivierung der tumorzerstörenden Aktivität der Makrophagen mittels des Granulozyten-Makrophagen-Kolonien stimulierenden Faktors
EP0211684A3 (en) * 1985-08-16 1988-06-08 Immunex Corporation Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor

Also Published As

Publication number Publication date
GB8334220D0 (en) 1984-02-01
GB2134528A (en) 1984-08-15
AU545411B2 (en) 1985-07-11
GB2134528B (en) 1986-08-20
FR2540121A1 (fr) 1984-08-03
JPS6160049B2 (de) 1986-12-19
US4482485A (en) 1984-11-13
AU2280683A (en) 1984-08-02
DE3402647C2 (de) 1986-11-27
CA1200489A (en) 1986-02-11
JPS59137417A (ja) 1984-08-07
FR2540121B1 (fr) 1987-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3402647C2 (de) Verfahren zur Gewinnung von koloniestimulierendem Faktor und Kallikrein aus menschlichem Urin
DE3027105C2 (de)
DE2655844C3 (de) Verfahren zur Herstellung antitumorwirksamer Substanzen
DE69030553T2 (de) Verfahren zur Herstellung modifizierter Superoxid-Dismutase
EP0457370B1 (de) Verfahren zur Pasteurisierung des Gewebeproteins PP4
DE3687097T2 (de) Therapeutisches mittel zur behandlung haematopoietischer krankheiten.
DE2459915C3 (de) Aktive Verbindung des Plasminogen- Typs, Verfahren zu ihrer Reinigung und ihre Verwendung
DE2441454C3 (de) Antileukämische proteinhaltige Fraktion und ihre Herstellung
DE69411073T2 (de) Medizinisches Bleichmittel
DE69731891T2 (de) Verfahren zur reinigung von gbs-toxin/cm101
EP1326893A2 (de) Bikunin enthaltende plasmafraktion, verfahren zu ihrer herstellung und ihrer verwendung
DE3306944C2 (de)
DE1442134C3 (de) In vivo antikoagulierend wirkendes und defibrinierendes Enzym
DE1617805A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Lysozym
DE2043971C3 (de) Antitumorsubstanz aus haemolytischen Streptococcen
DE2732587C2 (de)
EP0517789B1 (de) Inhibitor der proliferation von endothelzellen
DE2428955C3 (de) Verfahren zur Abtrennung der enzymatischen Komponente mit in vivo antikoagulierender und in vitro koagulierender Wirkung aus dem Gift der Schlange Ancistrodon rhodostoma und daraus hergestellte Mittel
DE3101001A1 (de) Verfahren zur konzentration und reinigung des antihaemophilie-faktors oder faktor viii
DE2605576B2 (de) Verfahren zum Isolieren der Proteasen Papain, Chimopapain, Lysozym und Proteinase X aus dem Milchsaft von Carica papaya und Verwendung der isolierten Proteasen zur Herstellung von sterilisierten und lyophilisierten orthopädischen, neurochirurgischen oder ophthalmologischen Präparaten
AT392003B (de) Verfahren zur herstellung eines insbesondere zur wundheilung oder zur behandlung in der geriatrie verwendbaren wirkstoffes aus saeugetierblut durch papainhydrolyse und ein einen solchen wirkstoff enthaltendes praeparat
CH640865A5 (de) Glykoproteid des menschlichen urins, verfahren zu seiner herstellung und mittel zur bekaempfung von leukozytopenie.
DE1942900C3 (de) Verfahren zur Abtrennung von L-Asparaginase aus Bakterienkulturen, danach hergestellte L-Asparaginase und diese enthaltendes therapeutisches Mittel
EP0892045A2 (de) Verfahren zur Herstellung eines eine Hyaluronidase enthaltenden Präparats
DE69012958T2 (de) Fibrinolytisches Protein und Herstellungsweise dafür.

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8328 Change in the person/name/address of the agent

Free format text: VOSSIUS, V., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT. TAUCHNER, P., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT. HEUNEMANN, D., DIPL.-PHYS. DR.RER.NAT. RAUH, P., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT., PAT.-ANWAELTE, 8000 MUENCHEN

8328 Change in the person/name/address of the agent

Free format text: TAUCHNER, P., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT. HEUNEMANN, D., DIPL.-PHYS. DR.RER.NAT. RAUH, P., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT., PAT.-ANWAELTE, 8000 MUENCHEN

8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: MORINAGA MILK INDUSTRY CO. LTD., TOKIO/TOKYO, JP T

8339 Ceased/non-payment of the annual fee