DE1617805A1 - Verfahren zur Herstellung von Lysozym - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Lysozym

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DE1617805A1 DE19671617805 DE1617805A DE1617805A1 DE 1617805 A1 DE1617805 A1 DE 1617805A1 DE 19671617805 DE19671617805 DE 19671617805 DE 1617805 A DE1617805 A DE 1617805A DE 1617805 A1 DE1617805 A1 DE 1617805A1
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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    • Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption

Description

MÜNCHEN, DEN
SPA - Societa Proaotti Antibiotic! S.p.A., Mailand /
Italien
• Verfahren zur- Herstellung von Lysozym
Die Erfindung betrifft ein neues und verbesser-
tes Verfahren zur Herstellung von Lysozym,
Lysοzym wurde zuerst von Fleming 1922 beschrieben und stellt ein Enzym dar, welches gegenüber bestimmten Bakterien, wie Micrococeus lysodeiktieus, und anderen grampositiven und grämnegativen Bakterien hemmende und
lytische Eigenschaften besitzt. lysozym wurde in einer
großen Zafil tierischer Plüssigkeiten gefunden, beiapielsweise in !Üränenflüssigkeit, Pl euraf lus sigkeit,'"Speichel, menschlicher Muttermilch und Blutserum, sowie in vielen
verschiedenen Organen, wie Uiere und Lunge. Ein sehr hoher Gehalt wurde im Eiweiß gefundene
BAD ORIGINAL
1098 15/1539
■ Ly so aym 1st als wirksames immunologisches Mittel bekannt und wurde bereits als "endogenes Antibiotikum" bezeichnet-. Auf Grund dieser Eigenschaft wird es in. weitem Umfang therapeutisch zur Behandlung von Virus- und bakteriellen Infektionen beim Menschen verwendet, Auch andere wichtige therapeutische Anwendungsarten von Ly-sozym wurden in neuerer Zeit gefunden, So- wurde geneigt, daß es eine hervorragende1 änälgötisehe Wirkung "besitzt., wenn es Patienten verabreicht v/irdv die aai Krebs er— krankt siiid^ und außerdem v/ird es als- Fötenzierurigsalt^ tel ;in' der Ahtibiötika-Therapxe verwendet. !"eriier vmr&e. ■·;-·■ ν es zur Prophylaxe und Therapie der IJeukopenie angewendet, die durch antiblastemische Mittel und ionisierende, · ; Strahlen induziert wird. , . r -
Infolge der ständig steigenden Verwendung von . ..-; Lysozym besteht ein Bedarf nach einem Herstellungsverfahren, welches höhere Ausbeuten liefert als die bisher bekannten' Verfahren und'welches ein Produkt mit hoher Aktivität und Reinheit liefert, wie dies für parenterale ,. Verabreichung wesentlich ist, „■ >
IS/153 9
Es ist bekannt, daß Lysozym im Eiweiß in einer Men* ne.von ca* 0,5Gew.i< > zusammen mit zahlreichen anderen hochmolekularen Proteinen vorhanden ist, die bei parenteraler .Verabreichung eine Antikörperreaktion auslösen
können. ~ . · · .
Bei einem bekannten Verfahren zur Herstellung von Lysozym aus Eiweiß wird letzteres mit einer solchen » Menge eines anorganischen Salzes gemischt, als ausreicht, um das Lysozym zu kristallisieren» Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß hierbei verschiedene andere proteinartige Stoffe mit dem Iiysozym mitgerissen werden, welches daher nur beschränkt brauchbar ist oder weitergereinigt werden muß, was die Sesamtherstelluhgskosten erhöht. Außerdem ist die Abtrennung des Lysozyms aus dem Eiweiß hierbei unvollständig.
Bei anderen bekannten Verfahren zur Beinigung von Lyso zym wird das Eiweiß Mt beträchtlichen Mengen Wasser oder Pufferlösungen verdünnt und das Iiysözym daraus" durch Adsorption an verschiedene Stoffe entfernt» Wahlweise wird das Eiweiß mit verdünnten» wässrigen Aufschlämmungen oder Suspensionen verschiedener Adsorbentien gemischt, wobei das Lysözym entfernt wird.
@ÄD-'ORIGINAL
Ein großer Nachteil aller bisher angewendeten Verfahren zur Herstellung von Lyso'zym aus Eiweiß liegt darin, daß das nach der Entfernung des lysozyms verbleibende Eiweiß nur sehr wenig oder überhaupt nicht ausgenutzt oder verwendet werden kann. Hierdurch werden die G-esamtkosten der Herstellungsverfahren offensichtlich weiter erhöht*
Schließlich ist es auch bekannt, daß an Lysozym-Präparaten, die nach den bisher bekannten Herstellungsverfahren gewonnen wurden, Untersuchungen ausgeführt worden sind, bei denen verdünnte, wässrige Lysozyralösungen auf verschiedenen Ionenaustauschern Chromatograph!ert wurden.
Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Gewinnung von Lysozym aus Eiweiß, welches in der Ausführung einfacher ist als die bisher bekannten Verfahren, ein sehr reines Material liefert, welches für die parenterale Verabreichung geeignet ist, und außerdem die Rückgewinnung und Verwendung des Eiweiß nach der Lysozym-Bntfemung, für eine Vielzahl anderer Zwecke, insbesonder als Nahrungsmittel, gestattet.
10381,5/153,9 ,- : BA0 ORIGINAL
Bei der Durchführung von Versuchen, die bei der Gewinnung von Lysozym aus Eiweiß in großem Maßstab ausgeführt wurden, wurde überraschenderweise gefunden, daß, wenn man Eiweiß als solches, d.h. ohne Verdünnen mit Wasser oder Pufferlösung, mit einem schwach sauren Ionenaustauscherharz in Berührung bringt, das Lysozym vollständig land selektiv adsorbiert wird.
Das erfindungsgemäßeVerfahren zur Gewinnung von lysozym aus Eiweiß besteht daher darin, daß das Eiweiß mit einem schwach sauren Ionenaustauscherharζ bei einem pH-Wert zwischen 6 und 7, vorzugsweise 6,4 bis 6,5, und · bei einer Temperatur unter Zimmertemperatur, d*h. unter etwa 250C, vorzugsweise bei 0 bis 50G, in Berührung gebracht wird, das Harz abgetrennt wird, die Fremdproteine vom Harz mit einer Salzlösung, die eine Konzentration von nicht mehr als 0,2 M und «einen pHz-Wert von nicht mehr als 7, vorzugsweise von 6,2; bis 6,8, aufweist, eluiert vrerden, dann das Lysozym mit einer wässrigen Salzlösung eluiert und aus dem Eluat durch Erhöhung der Salzkonzentration ausgefällt wird.
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Die Beendigung der Elution der Fremdproteine kann durch Bestimmung der Ultraviolett-Adsorption festgestellt werden,und die Vollständigkeit der Lysozym— Elution läßt sich mikrobiologisch feststellen, beispielsweise mit Micrococcus lysodeiktieus»
Gegebenenfalls können dem Eiweiß flüchtige Ver- bindungen zugesetzt werden, welche die Gärung hemmen, beispielsweise Chloroform, welches vollständig abgedampft werden kann, und die Qualität und Brauchbarkeit des Eiweißes nach der Entfernung des Lysofcyms daraus nicht beeinträchtigt.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß das Lysozym in hohen Ausbeuten und mit hohem Reinheit sgrad erhalten wird, wie durch immunologische ieste gegen Kaninchenserum, welches gegen Eiweiß empfindlich ' gemacht wurde, gezeigt werden kann. Außerdem ist das nach der Entfernung des LyaoEyms zurückbleibende Eiv/eJL. im Gegensata zu den früher beschriebenen Verfahr en nicht' verdünnt, weist keinen erhöhten Salzgehalt auf und enthält noch im wesentlichen alle ursprünglichen Proteine,
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BAD GRJG3MÄL
- ι - . - ■'■ ■. ..-■■.'
da, abgesehen von Spuren anderer Stoffe, nur LysQzym adsorbiert wirdv Saher fcann das zurückgewonnene Eiweiß für viele..verschiedeneZwecke verwendet werden. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgeiaäßen Verfahrens bestellt darin, dais die Ionenaustauscherharze leicht regeneriert uiiä. wiederverwendet werden können.
Pas Verhältnis von Eiweiß zu IonenaustausGher- Ϊ18.ΤΖ kann offensichtlich in sehr weiten Grenzen variiert werden,.-, es wurde jedoch gefunden, daß ausgezeichnete Ergebnisse bei Verwendung von 1 ral Ionenaustauscherharζ pro 4 ml Eiweiß, aus dem 10 bis 20 mg Ly so sy in gewonnen werden köimen, erhalten werden. -
Zur Ausführung 'des erfindungsgeinäßen Verfalirei,. kann jedes passende schwach saure Ionenaustauscherharz verwendet xirerden, es werden jedoch solche bevorzugt, die Carboxylgruppen enthalten. Beispiele für verwendbare Ionenaustausch erharze sind ."Ämberlite GG-50" und»Ainberlite IRO-50" (beides laethaerylisohe Garbonsäureliarze, die von feohm & Haas erhältlich sind | "AiEberlite"ist ein eingetragenes Warenzeichen).
£/ 15,3 a - BAD
161780b
Zur Elution des verunreinigenden Fremdproteins und des Lysozyms^om Ionenaustauscherharz kann eine wässrige Lösung jedes wasserlöslichen, anorganischen oder organischen Salzes verwendet werden,. Die gleiche Salzlösung kann für beide Elutionen verwendet werden, aus wirtschaftlichen Gründen ist es jedoch vorzuziehen, zur Elution des Lysozyms eine stärker konzentrierte Lösung zu verwenden. Als Beispiele für anorganische Salze können Natriumnitrat, Kaliumnitrat, Ammoniumnitrat., Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumchlorid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumbicarbonat, Natriumsulfat, Kaliumsulfat, Ammoniumsulfat und dergl. und als Beispiele für organische Salze Äthanolamin-hydroChlorid, Mono-, Di- und Triäthylaminhydrochlorid, Pyridin-hydrοChlorid, Natriumacetat, Kaliumacetat und ähnliche angeführt werden.
Die Konzentration der zur Elution des Lysozyms vom Ionenaustauscherharz verwendeten Salzlösung ist nicht kritisch und schwankt je nach dem verwendeten Salz. Die Konzentration darf jedoch nicht so hoch sein, daß dadurch eine Ausfällung des Lysozyms hervorgerufen wird«
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BAD
Allgemein ausgedrückt, steht jedoch die Konzentration der verwendeten Salzlösung in umgekehrtem Verhältnis zu ihrem pH-Wert. Gute Ergebnisse wurden beispielsweise mit 6 bis 10bigen Ammoniumsulfatlösungen, 2 bis 3$igen liatriümchloridlösungen, 7$igen Triäthylamin-hydroehioridlösungen, 10bigen iFatriumacetatl'ösungen und. 5$igen Lösungen von Natriumcarbonat oder liatriumbicarbonat erhalten. -
Das zur Ausfällung des lysozyms aus dem Eluat vex'v/endete Salz kann, muß jedoch nicht, das gleiche sein wie das zur Elution verwendete Salz, Wenn zwei verschiedene Salze verwendet werden* ist es offensichtlich nur notwendig* daß diese miteinander verträglich sind, d.h. miteinander nicht reagieren und selbst einen Hiedersehlag bilden.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Ly so zym kann durch Mischen mit geeigneten festen oder flüssigen pharmazeutischen Irägern oder Verdünnungsmitteln in Formen angemacht werden, die für die orale oder parenterale Verabreichung geeignet sind.
161/BUb
-.10"-
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.
Beispiel 1
52 kg Hühnereiweiß werden mit 15 1 AmberIlte IRC-50 in Berührung gebracht und bei einer Temperatur von 0 bis 50C auf einen pH-Wert iron 6,5 äquilibriert, bis der Lysozymgehalt des EiweJS nur noch 80 bis 100 ug/ml beträgt. .
Das Hars wird dann mit Wasser und danach mit einem 0,2M Natriunphosphatpuffer pH 6,5 gev/aschen, hin kein weiteres proteinhaltiges Material mehr eluiert wird-, worauf das Lysozym mit einer 8>£igen Lösung von Ammoniumsulfat eluiert wird. Dann wird dem Eluat v/eiteres Ammoniumsulfat zugesetzt, bis die Konzentration auf etwa AO°/o gestiegen ist, wobei das Lysozym ausfällt.
Um das Ensym in das önlorid zu überführen und Spuren von Verunreinigungen zu entfernen, wird der Niederschlag in Wasser gelöst, zur Jäntfernung unlöslicher Stoffe filtriert und der -pH-Wert des i'iltrats mit SaIa-
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säure auf 3,3 eingestellt, !Durch. Zugabe eipea? wässrigen Katriumcliloridlösung wird das Lysozym dann als Chlorid gefällt. "
B e i s ρ i e 1 2
Das Verfahren wird analog wie in Belsjiiel 1 beschrieben durchgeführt, Pas verwendete lonenaustauseherharz wird auf einen pH-Wert von 6,4 Ms 6,5 eingestellt und vor der Elution des Ijysozyms wird das protelnhaltige Material init 0,16M Phpsphatpuffer pH 6,4 Ms 6*5 eluiert. Das LysozviH selbst -wird mit einer 10 Gew.^/Föluinen Lösung Ammoniumsulfat eluiert, J)ie iysozyia-r-Terluste übersteigen hierbei 100 bis 120ug/fiil Eiweiß nicht woA die !»ysozyin-Ausbeute beträgt 97 bis 985^, Vezogeii .:;,?* ~;dr* ©ewieht. Wei^ teres Ammoniumsulfat wird dann dem Sluat zugesetzt, um die Konzentration auf etwa 4O5& zu erhölien, wobei das Iyso? zym ausxälltf ' - ;-. .
Um dap Ly?03^;; Ir. Porm der Base zu erhalten.und Spur? ren von Verunreinigungen zu entfernen, wird der Wiederschlag in Wasser gelöst, so daß eine ungefähr 5. Gew,^ige lösung erhalten wird. Der ,pH-¥ert wird dann auf 10,5 ein-
1 0 ί: "ii 1 5 / 1 S 3 9 ■■
161780b
gestellt und die Lösung filtriert. Dem Filtrat wird soviel Ammoniumchlorid zugesetzt, daß sieh eine Lösung von ungefähr 20 Gew.$/Vol. ergibt. Das Lysozym kristallisiert quantitativ in Form von Mikrokristallen aus,
Beispiel 3
Wenn das Verfahren von Beispiel 2 unter Verwendung von 1 bis 10 Gew.#/Vol.Lösungen von Natriumsulfat» Natriumchlorid, Ammoniumchlorid oder Natriumacetat für die Elution des Lysozyms vom Ionenaustauscherharz wiederholt wird, werden gleich gute Ergebnisse erhalten.
Beispiel 4
Das Verfahren von Beispiel 2 wird wiederholt, das erhaltene Lysozym wird jedoch in Wasser gelöst, der pH-Wert der erhaltenen Lösung auf 3»3 (-0,3) mit Salzsäure eingestellt und dann eine 5 Gew.^/VoI.Lösung Na- _ triumchlorid zugesetzt. Hierbei wird ein Niederschlag von reinem Lysozym erhalten.
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Claims (1)

  1. - 13 - ■ , ■■■ .■■■■ . ■ .';■ ■.
    PAfEITA N S P EUCH E"
    1« Verfahren zur Gewinnung von Lysozym aus Eiweiß, dadurch gekennzeichnet» daß das Eiweiß mit einem schwäch sauren lonenaustauscherharz bei einem pH-Wert von 6 "bis
    7 und bei einer Temperatur unter Raumtemperatur in Be-*
    rührmig gebracht, das Harz abgetrennt, Premdprptein vom Harz mit einer Salzlösung, deren Konzentration nicht
    über 0,2M und deren τρΗ-Wert nicht über 7 liegt, eluiert
    und dann das Lysozym mit einer wässrigen Salzlösung eluiert und aus dem Eluat durch Erhöhung der Salzkonzentration ausgefällt wird. ·
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Eiweiß mit dem Ioiienaustausoherharζ bei einem pH-Wert von 6,4 bis 6,5 in Berührung gebracht wird.
    5· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Eiweiß mit dem lonenaustauscherharz bei einer Temperatur von 0 bis "50G in Berülirung
    gebracht wird. .
    109815/1539
    16 V/805
    4. . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Blution des Frefa&proteins und' zur Elutlon des Lysozyias die gleiche Salzlösung verwendet wird.
    5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 Ms 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Elution des Lysozyms verwendete Salzlösung eine höhere Konzentration aufweist , als die zur Elution der Frexadproteine verwendete Balzlösung.
    6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß 1 ml Austaus cherhar s auf je 4 ml Eiweiß verwendet wird. -
    7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Austauscherharz verwendet wird, welches Carboxylgruppen enthält.
    8. Verfahren, nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Ende der Blution der Fremdproteine durch tiltraviolett-Adsorption bestimmt wird.
    Id88ISMS39 a«,
    ■-.15 -
    9· Verfahren nach, einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vollständigkeit der Blution des iysozyms mikrobiologisch bestimmt vard«
    1OS8-15/1S39
DE1617805A 1966-02-28 1967-02-23 Verfahren zur Gewinnung von Lysozym aus Eiweiß Expired DE1617805C3 (de)

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