DE2246969A1 - Verfahren zur herstellung von urokinase - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und zur Reinigung von biologisch aktiven Substanzen, insbesondere, je-, doch nicht ausschließlich betrifft die Erfindung wegen des diesbezüglichen besonderen Interesses ein Verfahren zur Herstellung und zur Reinigung von Urokinasen, die in biologischen Medien enthalten sind, vorzugsweise in Urin tierischen oder noch bevorzugter, menschlichen Ursprungs.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Depyrogenation (d.h. zur Ausscheidung von pyrogenen Substanzen) dieser biologisch aktiven Substanzen, und zwar insbesondere von Urokinase.

Außerdem bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren" zur Stabilisierung von biologischen Substanzen, insbesondere von Urokinase, in Produkten, und zwar vorzugsweise in Komplexen von Urokinase, die man vorzugsweise durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten kann, sowie außerdem in Verbindungen und Medikamenten, in welche die Komplexe der in Frage stehenden Art eingehen.

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Es ist bekannt, daß die Urokinase ein im Urin vorhandenes Enzym ist, das die Umv/andlung des Plasminogens in Plasmin katalysiert, wobei es sich bei letzterem um eine Peptidase handelt, deren physiologische ilufgabe darin besteht, die fibrinösen intravasculären Ausbildungen aufzulösen. Ein Defekt in den Aktivierungsmechanismen des Plasminogens führt im FaIIe der beschleunigten Kinetik des Systems der Koagulation oder der Veränderung der vaskulären Wände dazu, daß intravaskuläres Fibrin aufrechterhalten wird, daß schließlich die verschiedenen thrombo-embolischen Syndrome verursacht (Thrombosen, Embolien, weitläufige bzw. verstreute intravaskuläre Koagulation etc.). Die Anwendung der Urokinase in diesem pathologischen Fall ruft eine Beschleunigung der Plasminbildung hervor, insbesondere auf dem Niveau von fibrinösen Ausbildungen, wie im Schrifttum dargelegt worden ist, '

Die Urokinase bildet infolgedessen ein wahlweises Behandlungsmittel für thrombo-embolische Syndrome, und ihr menschlicher Ursprung beseitigt die Gefahr von anaphylaktischen Schocks.

Es sind bereits eine gewisse Anzahl von Verfahren zur Herstellung von Präparaten gereinigter Urokinase vorgeschlagen worden, diese Verfahren haben Jedoch durchweg erhöhte Ausbeuteverluste an Urokinase zur Folge. Diese Ausbeuteverluste sind deswegen um so schwerwiegender bzw. bedauerlicher, als die Kosten der Herstellung gereinigter Urokinase beträchtlich sind, und, im Falle der aus dem menschlichen Urin extrahierten Urokinase, die Ansammlung derselben in großen Mengen mühsam bzw. schwierig v/ird.

Andererseits ermöglichen es die bekannten Reinigungsverfahren durchweg nicht, Urokinasepraparate herzustellen, deren Gehalt an pyrogenen Substanzen genügend reduziert ist, wodurch ihre therapeutische Anwendung erleichtert würde. Tatsächlich ist dieser Gehalt an pyrogenen Substanzen derart, daß er einen Nachteil darstellt, der noch größer werden kann, wenn man die außerordentliche Empfindlichkeit in Betracht zieht, die man oft bei

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den Kranken beobachten kann, die einer Behandlung auf der Basis von Urokinase unterworfen sind, einer Behandlung, die zu einer Verabreichung von Urokinasedosen auf intravenösem Wege führen, welche erhöht sein können, beispielsweise I50 000 CDA-Einheiten oder mehr bei einer einzigen Injektion erreichen können. Unter CTA-Einheiten sind normalisierte Aktivitätseinheiten an Urokinase zu verstehen, wie sie durch das "Committee on Thrombolytic Agents, National Heart Institute" (USA) angenommen bzw. eingeführt worden sind.

Eine weitere Schwierigkeit besteht schließlich darin, daß es schwierig ist, Urokinasepräpar&te großer Stabilität herzustellen, wodurch die Fragen der Lagerung ebenso wie die Probleme, welche die Verabreichung dieser Präparate an Patienten betreffen kompliziert bzw. erschwert werden.

Es sei darauf hingewiesen, daß diese Verabreichung, die durchweg mittels fortgesetzter venöser Perfusion von Ürokinasepräparaten erfolgt, welche insbesondere durch ein Glukoseserum verdünnt sind, wegen der Tatsache der Instabilität des Enzyms in verdünnter Lösung schwierig gemacht wird, da es dieser Umstand erfordert, die Lösung sehr oft zu erneuern oder mit unterbrochenen Injektionen einer konzentrierten Urokinaselösung in das Röhrensystem einer Perfusion des Glukoseserums zu arbeiten, wenn diese Perfusion an Ort und Stelle ausgeführt wird.

Aufgabe der Erfindung ist es, alle diese'Nachteile zu überwinden. Insbesondere soll durch die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung und/oder Reinigung geschaffen werden, das die Erzeugung von konzentrierten Ürokinasepräparaten gestattet, welche praktisch die gesamte Urokinaseaktivität des Ausgangsmediums enthalten, auf welches das Verfahren der in Frage stehenden Art angewandt wird.

Außerdem soll durch die Erfindung ein Verfahren geschaffen werden, das es gestattet, biologisch aktive Substanzen, insbesondere

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Urokinase, von diese begleitenden pyrogenen Substanzen zu trennen, und zwar wenigstens in einem Ausmaß, das ausreicht, daß die in Betracht stehenden biologisch aktiven Substanzen praktisch apyrogen bei erhöhten Dosen sind.

Darüberhinaus soll durch die Erfindung ein stabilisiertes Präparat mit Urokinaseaktivität geschaffen werden, welches leicht gelagert werden kann und dessen Verabreichung an Patienten durch einfache Perfusion einer Lösung dieses Präparats sowie wahrend mehrerer Stunden erfolgen kann.

In einer seiner verschiedenen Ausführungsformen umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines mit Urokinase angereicherten Präparates aus einer konzentrierten Lösung von Rohurokinase, die in an sich bekannter Weise gewonnen wird, insbesondere aus einem menschlichen Urin, den einen und/oder den anderen der folgenden Verfahrensschritte, wobei der zweite vorzugsweise unmittelbar auf den ersten folgt:

Der erste Schritt umfaßt eine Chromatographie, insbesondere eine Ausschließungschromatographie, indem die vorerwähnte konzentrierte Lösung von Rohurokinase mit einem Diäthylaminoäthylzelluloseharz, das unter der Bezeichnung DEAE-Zellulose bekannt ist, in Berührung gebracht wird, wobei dieser erste Verfahrensschritt dadurch gekennzeichnet ist, daß die Leitfähigkeit der vorerwähnten Lösung zuvor auf einen Wert eingestellt wird, der zwischen etwa 15 000 und etwa 25 000 Mikrosiemens liegt, und ihr pH auf einen Wert, der zwischen ungefähr 4- und ungefähr 6 liegt, vorzugsweise gleich 4,5 ist, und daß man den Abgang bzw. das abströmende Medium auffängt bzw. aufnimmt, sowie vorzugsweise, daß man das Harz mit einer Ammoniumsulfatlösung mit einem pH von 4,5 und einer Leitfähigkeit in der Größenordnung von 15 000 Mikrosiemens wäscht·

Der zweite Verfahrensschritt, der vorzugsweise an einer Ausgangslösung ausgeführt wird, die sich aus der Vereinigung des Abganps

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bzw. des abströmenden Mediums und den am Ausgang des vorerwähnten ersten Verfahrensschrittes erhaltenen Waschlösungen ergibt, · umfaßt eine zweite Chromatographie, insbesondere Ausschließungschromatographie, indem man diese Lösung mit einem Diäthylaminozelluloseharz in Berührung bringt, wobei dieser zweite Verfahrensschritt dadurch gekennzeichnet ist, daß man, bevor diese Lösung in Kontakt mit dem Harz gebracht wird, einerseits die Leitfähigkeit dieser Lösung auf einen Wert von wenigstens gleich 15 000 Mikrosiemens, vorzugsweise auf einen Wert zwischen 15 und 18 000 Mikrosiemens einstellt, und ihren pH auf einen Wert zwischen 6 und 7j vorzugsweise zwischen 6,6 und 6,8₉ sowie andererseits das Gewicht des in dieser zweiten Chromatographie, insbesondere Ausschließungschromatographie, verwendeten Harzes relativ zur Urokinaseaktivität der Lösung auf einen Wert einstellt, der genügend hoch ist, daß man ein Zurückhalten der Proteine auf dem Harz unter den vorstehenden Bedingungen der Leitfähigkeit und des pH wahrnehmen kann, wobei dieser Wert jedoch nicht denjenigen Wert überschreitet, bei dem man ebenfalls ein nicht vernachlässigbares Zurückhalten der Urokinase auf dem Harz beobachtet; und schließlich dadurch^ daß die-Leitfähigkeit der in Kontakt mit dem Harz befindlichen Lösung während der vorerwähnten zweiten Chromatographie, insbesondere Ausschließungschromatographie, in aufeinanderfolgenden Schritten durch Zufügung von apyrogenem destilliertem Wasser bis auf einen Endwert der Größenordnung von 9 000 Mikrosiemens gebracht wird.

Vorteilhafterweise ist jede Zufügung von Wasser so bemessen, daß dadurch eine Herabsetzung der Leitfähigkeit des Mediums um einen Wert in der Größenordnung von 1 000 Mikrosiemens hervorgerufen wird, wobei jede Zufügung durch einen Bewegungsvorgang, insbesondere eine Rühr-, Schütte!- o«dgl₀ -bewegung während einer Zeit von 5 bis 15 Minuten₉ vorzugsweise in der Größenord-. nung von 10 Minuten, unterbrochen wird...

Alle vorstehenden Prozesse werden vorzugsweise bei einer Temperatur der Größenordnung von 4° C ausgeführt _o

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Man sieht, daß die Erfindung auf diese Weise Bedingungen vorschlägt, in denen eine Vorzugsadsorption von proteinischen Verunreinigungen stattfindet, die in der konzentrierten Urokinaselösung enthalten sind, wobei die Urokinase selbst auf dem Harz nicht zurückgehalten wird. Der Hauptparameter, der in der Gesamtheit dieser Bedingungen der differentiellen Adsorptionen wirksam ist bzw. in diese eingreift, ist die Leitfähigkeit der behandelten Lösungen.

Die Berücksichtigung der Leitfähigkeitsgabel bzw. des Leitfähigkeit sbereiches unter den obengenannten Bedingungen des pH ist wichtig.für einen guten Verlauf des erfindungsgemäßen Verfahrens und dafür, daß man erhöhte Urokinaseausbeuten erhält. Es sei insbesondere darauf hingewiesen, daß im Falle der ersten Chromatographie bzw. Ausschließungschromatographie das Harz weder Urokinase noch proteinische Verunreinigungen festhalten kann, wenn die Anfangsleitfähigkeit der konzentrierten Urokinaselösung über 25 000 Mikrosiemens liegt. Umgekehrt absorbiert das Harz gleichzeitig die Urokinase und die proteinischen Verunreinigungen, wenn die Leitfähigkeit der konzentrierten Urokinaselösung auf einen Wert unterhalb von 10 000 Mikrosiemens eingestellt worden ist.

Das ist in gleicher Weise auf dem Niveau der zweiten Chromatographie bzw. Ausschließungschromatographie der Fall. Bei anfänglichen Leitfähigkeiten der behandelten Lösung von 15 000 bis 18 000 Mikrosiemens stellt man eine sehr selektive Adsorption der Proteine fest. Jede der aufeinanderfolgenden Verdünnungen hat eine zusätzliche Adsorption der Proteine auf dem Harz zur Folge. Die progressive Sättigung desselben führt zu einer Herabsetzung seiner Affinität für die Urokinase, derart, daß die vorerwähnten aufeinanderfolgenden Verdünnungen bis auf einen Wert von 9 000 Mikrosiemens betrieben werden können, ohne daß daraus die Gefahr einer gleichzeitigen Urokinaseedsorption erwächst.

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In gleicher Weise ist es wichtig, vor allem bei der zv/eiten Chromatographie bzw. Ausschließungschromatographie, die Vierte bezüglich der Menge des Harzes, welches der Urokinaseaktivität der behandelten Lösung ausgesetzt wird, innerhalb bestimmter " . Grenzen zu halten.

Diese Relation kann in ausreichend großen Grenzen in der ersten Chromatographie bzw. Ausschließungschromatographie variieren.

Es wurde insbesondere beobachtet, daß man ähnliche bzw. gleiche Ergebnisse für alle Werte dieser Relation zwischen 15 S und 40 g trockenen Harzes auf 14- Millionen CTA-Einheiten an Urokinase

erhält.

Die Wahl dieser Relation ist im Falle der zweiten Chromatographie bzw. Ausschließungschromatographie kritischer«, Es soll_s insbesondere für Leitfähigkeitswerte, die um 22 000 Mikrosiemens liegen, zwischen etwa 30 und etwa 60 g trockenen Harzes auf 10 Millionen CTA-Einheiten an Urokinase der behandelten Lösung gehalten werden, wobei die besten Ergebnisse bei Werten zwischen 40 und 53 g trockenen Harzes auf 10 Millionen CTA-Einheiten an Urokinase erhalten wurden.

In gewissen Fällen kann man die konzentrierte Urokinaseiösung direkt der vorerwähnten zweiten Chromatographie bzw«, Ausschließungschromatographie unterwerfen, vor allem in dem FaIl₅ in dem man, in den Schritten der Endreinigung, weitere Spezialschritte der Trennung pyrogener Substanzen, welche die Urokinase im menschlichen Urin stets begleiten, anwendet bzw» auf solche weitere Spezialschritte zurückgreifen möchte» In der Praxis ist es jedoch meistens vorzuziehen, mit der vorerwähnten ersten Chromatographie bzw. Ausschließungschromatographie zu beginnen bzw. zuerst eine solche Chromatographie vorzunehmen. Diese gestattet es, abgesehen von einer ersten Ausscheidung einer kleinen Menge proteinischer Verunreinigungen, eine vollständig klare Lösung zu erhalten sowie eine erste Depyrogenation der Urokinase zu erreichen.

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Das Verfahren nach der Erfindung ermöglicht eine wesentliche Anreicherung der Urokinase relativ zu den sie anfänglich begleitenden Proteinen, wobei 50 bis 60 % der Proteine eliminiert v/erden, in Verbindung mit einer Totalausbeute an Urokinaseaktivität. Man stellt insbesondere fest, daß die am Ende der ersten Chromatographie bzw. Ausschließungschromatographie erhaltene Lösung die gleiche Anzahl von Urokinaseeinheiten enthält wie die Ausgangslösung. Die Anzahl von Urokinaseeinheiten die man am Ende der zweiten Chromatographie bzw. Ausschließungschromatographie aufnimmt, ist sogar etwas größer als diejenige der Lösung, die der zweiten Chromatographie bzw. Ausschließungschromatographie unterworfen worden ist, was man gegebenenfalls so deuten kann, daß eine Adsorption eines Urokinase-Inhibitors auf dem Harz erfolgt. Diese Gesamtausbeute an Urokinaseaktivität stellt infolgedessen einen entscheidenden Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, insbesondere wenn man einerseits die Schwierigkeiten in Betracht zieht, auf die man beim Sammeln von menschlichem Urin in großen Mengen stößt, sowie andererseits die beträchtlichen Herstellungskosten für gereinigte Urokinase.

Man kann die auf diese Weise mit Urokinase angereicherte Lösung noch weiter reinigen, indem man auf im Prinzip bekannte zusätzliche Behandlungen zurückgreift, insbesondere mittels Adsorption der Lösung auf Kaolin_t sodann mittels Adsorptionschromatographie auf Harz vom Amberlittyp oder auch noch mittels Adsorptionschroraatographie auf Carboxymethylzellulose.

Das Verfahren gemäß der Erfindung, gegebenenfalls durch eine der verfügbaren Techniken ergänzt und auf eine Lösung von Rohurokinase angewandt, die aus menschlichem Urin extrahiert worden ist, gestattet es schließlich 80 bis 90 % der Proteine zu eliminieren, welche die Urokinase anfänglich begleiten, und zwar ohne nennenswerte Verluste an Urokinaseaktivität.

Die konzentrierte Lösung der Rohurokinase, die anfänglich ver-

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wendet wird, kann auf jede an sich bekannte Weise gewonnen werden, beispielsweise im Falle der Extraktion der Urokinase aus sehr verdünnten Lösungen, wie es die Urine sind, insbesondere menschlichen Ursprungs, dadurch, daß man diese mit einem Proteinadsorptionsmittel in Kontakt bringt und das Adsorbat eluiert. Im Schrifttum sind verschiedene Verfahren beschrieben, welche die Herstellung von konzentrierten Ausgangslösungen von Rohurokinase gestatten; diese Verfahren verwenden Adsorptionsmittel verschiedenster Art, beispielsweise Silikagel, Kationenaustauschersilikate, Salze, wie beispielsweise Bariumsulfat, Harze, wie beispielsweise Oxycellulose, etc.

Vorteilhafterweise kann man diese Lösungen mit einem Filtratianshilfsmittel in Kontakt bringen, beispielsweise mit einem solchen Mittel, das im Handel unter der Bezeichnung "Hyflosupercel" erhältlich ist, diesem Verfahrensschritt folgt eine Eeextraktion der Urokinase und der Proteine, die auf dem Filtrationshilfsmittel adsorbiert sind, eine Aussalzung der in der Extraktionslösung enthaltenen Urokinase mittels Ammoniumsulfat, eine Auf- · lösung des erhaltenen Niederschlages in einer Glukoselösung und eine Dialyse derselben, um schließlich zu einem Dialysat zu gelangen, das einem der Chromatographie-, bzw. Ausschließungschromatographieschritte, vorzugsweise dem ersten, des Verfahrens gemäß der Erfindung unterworfen wird.

Das Verfahren nach der Erfindung ermöglicht es infolgedessen, konzentrierte. Urokinasepräparate zu erhalten, die einen großen Reinheitsgrad aufweisen sowie einen herabgesetzten Gehalt an pyrogenen Substanzen; diese Präparate haben schon eine große Wirksamkeit bei Behandlungen in der Humanmedizin. Dieser Gehalt an pyrogenen Substanzen ist indessen noch nicht vernachlässigbar. Im Ergebnis rufen die gereinigten Urokinasepräparate, die man mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält, noch eine gewisse Hyperthermie beim Kaninchen hervor, wenn die verabreichten Dosen einen mäßig erhöhten Schwellwert überschreiten. Den Kaninchen unter den Bedingungen in Übereinstimmung mit den all-

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gemeinen Analysenmethoden der Pharmacope'e Francaise, 8. Auflage, Seite 1615, im Verhältnis von 3 000 CTA-EinheitenAg, injiziert,-erzeugten diese gereinigten Urokinasepräparate eine Temperaturerhöhung, die individuell unter den Kaninchen zwischen 0,5 bis 0,9° C variiert.

Um Urokinasepräparate zu erhalten, die einen noch stärker reduzierten Gehalt an pyrogenen Substanzen haben, kann man auf das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren,insbesondere - zur Depyrogenation, für Proteinsubstanzen mit biologischer Aktivität, insbesondere Urokinase, zurückgreifen, welche Substanzen vorzugsweise einer ersten Reinigung unterworfen werden; dieses Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß man eine partielle Sättigung dieser Lösung mit einem Proteinpräzipitationsmittel erzeugt, und zwar gerade bis zu. einem Grad, der eine funktion der Anfangskonzentration der Lösung an Proteinen ist, derart, daß diese partielle Sättigung nur die Präzipitation des einen Teils der in der Ausgangslösung enthaltenen Proteine hervorruft, wobei diener Teil genügend herabgesetzt wird, daß sein Gehalt an Proteinsubstanz mit biologischer Aktivität in geringen vorbestimmten Proportionen bzw. gegebenen Mengen gehalten wird, sofern er nicht praktisch vernachlässigbar ist, und daß man den Rest bzw. Rückstand aufnimmt.

In einer vorzugsweise angewandten Ausführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens, angewandt auf die Urokinase, wird als Präzipitationsmittel Ammoniumsulfat verwendet, wobei die erwähnte partielle Präzipitation mit einer Urokinaselösung durchgeführt wird, die 1,5 bis 3 mg Proteine pro ml enthält, und zwar bei einem pH zwischen 3 und 4,5, vorzugsweise der Größenordnung von 3,8; die Leitfähigkeit dieser Lösung wurde zuvor auf einen Wert eingestellt, der zwischen 15 000 und 25 000 Mikrosiemens liegt; der Sättigungsgrad der Ammoniumsulfatlösung, der zwischen 0,25 und 0,35 liegt, wird nicht über den Grad hinaus ausgedehnt, der zu einer Präzipitation der Proteine führt, bei welcher mehr als 5 % der Urokinaseaktivität fortgeführt bzw. mitgerissen wird

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(es wird davon ausgegangen, daß der Sättigungsgrad der Lösung gleich 1 ist, wenn die Lösung vollständig gesättigt ist: das heißt durch Lösung von 700 g von Ammoniumsulfat in 1 000 ml destilliertem Wasser bei +4·° C). Die praktisch von pyrogenen Substanzen befreite, im Rückstand enthaltene Urokinase kann dann isoliert werden, insbesondere durch Salzen der Lösung mit kristallisiertem Ammoniumsulfat.

Es ist unter Berücksichtigung der vorgenannten bevorzugten Proteinkonzentrationsgabelungen bzw. -bereiche ein-Interessevorhanden,, eine vorherige Reinigung der zu behandelnden Urokinasen durchzuführen, die so ausgedehnt wie möglich ist, um die maximal mögliche Menge an Proteinen auszuscheiden, damit es nicht erforderlich ist, mit Lösungsvolumen zu arbeiten, die zu beträchtlich sind. Mit anderen Worten bedeutet das, daß das erfindungsgemäße Verfahren in einer seiner bevorzugten Anwendungen ein Endreinigungsschritt ist, der dazu bestimmt ist, die Wirkungen eines vorhergehenden Reinigungsverfahrens zu vollenden.

Vorteilhafterweise kann man auf das weiter oben beschriebene erfindungsgemäße Reinigungsverfahren zurückgreifen, das die beiden Chromatographie- bzw. Ausschließungschromatographie-, schritte umfaßt, die oben erwähnt worden sind, und das durch einen dritten Verfahrenssehritt vervollständigt ist, welcher folgende Maßnahmen enthält:

Entweder eine auf Carboxymethylzellulose erfolgende Adsorptionschromatographie der Urokinase, die in der Lösung enthalten ist, welche sich aus der Vereinigung des abströmenden Mittels und der Waschlösungen des Harzes der zweiten Chromatographie bzw. Ausschließungschromatographie ergibt, mit einem pH in der Größenordnung von 5j und eine Herauslösung der auf der Carboxymethylzellulose adsorbierten Urokinase mit einem Phosphatpuffer mit einem pH von 6,8 bis 6,9;

oder eine Adsorption der Lösung, die sich aus der Vereinigung

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des abströmenden Mittels und der Waschlösungen der zweiten Chromatographie bzw. Ausschließungschromatographie ergibt, auf Kaolin bei einem pH von 6,2; eine Herauslösung der auf dem Kaolin zurückgehaltenen Urokinase mit Ammoniumchlorid in Ammoniak von 4 #, eine Ausscheidung mit Ammoniumsulfat, die Wiederaufnahme der Ausscheidung in Wasser und eine Dialyse der Suspension gegen eine Phosphatlösung von 0,05 M, die auf einen pH von 6,2 gepuffert ist, eine Piltrierung des Dialysats auf einer Harzkolonne des Typs Amberlit IRC 50, und eine HerauelÖsung des Harzes zur Rückgewinnung der Urokinase.

Es wurde festgestellt, wie bereits oben ausgeführt, daß sich der Sättigungsgrad der Ammoniumsulfatlösung, welche die Bildung eines Niederschlags von Proteinen (unter diesen die pyrogenen Substanzen) erzeugt, der einen gegebenen minimalen Prozentsatz an Urokinase bindet, in Abhängigkeit, insbesondere inverser, vom Anfangsgehalt der behandelten Lösung an Proteinen ändert.

Die Werte, auf die man diesen Sättigungsgrad zweckentsprechendem bzw. vorteilhafterweise unter Berücksichtigung des Anfangsgehalts der Lösung an Proteinen einstellt, ergeben sich insbesondere aus der Kurvendarstellung der einzigen Figur der Zeichnung. Diese Werte sind experimentell bestimmt worden, insbesondere an Lösungen, die nach einem der weiter unten beschriebenen Reinigungsverfahren gereinigt worden sind, vor allem an solchen Lösungen, die nach den späteren Ausführungsbeispielen beschrieben worden sind. Die Achse A der Figur ist in Proteinkonzentrationen (in mg/ml) der zu behandelnden Lösungen graduiert, die Achse C in Sättigungsgraden (⁰S) der Lösung an Ammoniumsulfat und die Achse B in % an Urokinase, die in dem unter den Bedingungen der Erfindung gebildeten Proteinniederschlag mitgerissen worden ist. Die Relativanordnungen dieser Achsen und die Maßstäbe ihrer Graduierungen sind in der Weise gewählt worden, daß der Prozentsatz der mitgerissenen Urokinase in jedem Fall durch den Schnittpunkt einer Grade mit der Achse B gegeben ist, welche von den die Proteinkonzentratidn darstellenden Punkten auf

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der Achse A au . dem jeweiligen Sättigungsgrad an Ammoniumsulfat auf der Achse C verläuft. Auf diese Weise erhält man beispiels- . weise einen Proteinniederschlag, der 5 % eier Aktivität an Urokinase der Eingan^slösung bindet, sofern man den Sättigungsgrad der Lösung an Ammoniumsulfat auf 0,30 "bringt, wenn der Anfangsgehalt der Ausgangslösung 2 mg/ml ist (die gestrichelte Gerade a) oder bei Einstellung des Sättigungswertes auf 0,25» wenn die Konzentration der Ausgangslösung 3 mg/ml ist (strichpunktierte Gerade b). -

Betrachtet man beispielsweise den Fall einer Urokinase-Ausgangslösung, die 2 mg/ml Proteine enthält, auf genauere Weise, dann kann man die nachstehenden Feststellungen machen.

Bis zu einem Sättigungswert von 0,20 gibt es überhaupt keine Bildung eines Niederschlags. Die erhaltene Lösung behält infolgedessen ihre pyrogenen Substanzen. Bei der gleichen Proteinkonzentration und bei einem Sättigungsgrad von 0,25 wird ein leichter Niederschlag gebildet, der ungefähr 2,5 % der im Medium enthaltenen Urokinase mitreißt. Diese Sättigung reicht nicht aus, um die Gesamtheit der pyrogenen Substanzen zurückzuhalten. Hingegenenthält der Niederschlag, der mit einem Sättigungsgrad von 0,30 gebildet wird und ungefähr 5 # der Urokinase enthält, den großen Teil der pyrogenen Substanzen. Der Rückstand, der noch 95 % der Gesamturokinaseaktivität enthält, welche in der Ausgangslösung enthalten war, ist von pyrogenen Substanzen befreit, und zwar gemäß den bereits erwähnten Normen, die von der Pharmacopee Francaise festgelegt worden sind, bei Dosen, diebis zu 15 000 CTA-EinheitenAg betragen. Bei einer Sättigung oberhalb von 0,30 ist der Rückstand bei den gleichen Dosen ebenfalls apyrogen, jedoch ist die auf dem Präzipitat fest-gehaltene Menge an Urokinase viel beträchtlicher, wie die graphische Darstellung zeigt.

Die Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zur Stabilisierung der Urokinase, das darin besteht, eine Lösung gereinigter

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Urokinase mit einer Lösung von Heparin reagieren zu lassen, vorzugsweise in angesäuertem Medium, mit einem pH zwischen 1 und 5»- vorzugsweise 4-,2, sowie darin, daß man den gebildeten Niederschlag aufnimmt, insbesondere durch Zentrifugieren.

Vorteilhafterweise wird die Ausgangslösung gereinigter Urokinase dadurch erhalten, daß man ein weiter oben beschriebenes Anreicherungßverfahren anwendet, gegebenenfalls ergänzt durch das ebenfalls oben beschriebene Depyrogenisationsverfahren.

Die Erfindung betrifft weiterhin das Produkt, das durch die Reaktion der Urokinaselösung mit einer Heparinlösung erhalten wird; dieses Produkt besteht aus einem Komplex von Urokinase und Heparin, der zweckmäßigerweise als "Urokinase-Heparinat" bezeichnet wird, wobei zu berücksichtigen ist, daß der Ausdruck Urokinase ebenso gut die reine Ursokinase wie auch die als gereinigt bezeichneten Urokinasen, welche bisher in der Therapie benutzt werden, umfassen soll.

Das Urokinaseheparinat ist ein Komplex, der sich in der Form einer Anhäufing bzw. Aggreagation präsentiert, dessen Molekulargewicht eine Funktion desjenigen des verwendeten Heparinsist und der Verunreinigungen proteinischen Ursprungs, die gegebenenfalls die Urokinase begleiten. In diesem Komplex ist die Heparinaktivität im Verhältnis zu derjenigen der Urokinase vernachlässigbar. Im Ergebnis kann das Heparin wegen seiner vielen funktionell saurenGruppierungendie zahlreichen Urokinasemoleküle festlegen bzw. anlagern.

Das Urokinaseheparinat ist bei pH 7 löslich und fällt aus, wenn man die Lösung bis zu einem pH von 4- ansäuert.

Man kann jeden der Bestandteile des Komplexes zurückerhalten, wenn man ihn in einem NaCl/HCl-Medium zerstört. Man erhält so einen Niederschlag, der aus Urokinase besteht, während das Heparin in Lösung bleibt.

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Man erhält das Urokinaseheparinat im trockenen Zustand, insbesondere durch Lyophilisierung seiner Lösungen. Es ist stabil und kann ohne Schwierigkeiten aufbewahrt werden. ^

Im Überschuß behält das Ürokinaseheparinat integrierend alle · Eigenschaften der Urokinase, insbesondere deren pharmakologisehe und therapeutische Eigenschaften, und gibt stabilisierte Lösungen in gebräuchlichen Perfusionsmedien, wie beispielsweise Lösungen des Glukoseserums von 5 $>·

Die vorstehenden sowie weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung lassen sich der nachstehenden Beschreibung der Beispiele entnehmen. Es sei darauf hingewiesen, daß bei dem Folgenden alle Prozesse bei einer [Temperatur der Größenordnung von 4-° 0 ausgeführt worden sind, sofern nicht in dem einen oder anderen Falle ausdrücklich ein unterschiedlicher Temperaturwert festgesetzt bzw. angegeben ist.

Beispiel Λ ; Herstellung einer gereinigten Urokinase Nachstehend wirdein vorteilhaftes Arbeitsprotokoll für die Herstellung einer gereinigten Urokinase wiedergegeben:

(i) Behandlung des menschlichen Urins, der mit Essigsäure auf pH 5)6 eingestellt worden ist, mit einem Filtrierhilfsmittel, wie es im Handel unter der Bezeichnung "Hyflosupercel" erhältlich ist ·

Extraktion der auf dem Hyflosupercel adsorbierten Urokinase bei 4° C, indem man das Filtrierhilfsmittel mit einer auf· pH 7j2 gepufferten Lösung von Dinatriumphosphat 0,32 M und Natriumchlorid 2,2 M behandelt, und Trennung durch Filtration des Hyflosupercel; dieses wird mit einem gleichen Volumen der Pufferlösung gewaschen.

Die Lösungen (Filtrat und Waschwasser) werden vereinigt, mit 0,5 η Phosphorsäure auf pH 6,25 eingestellt; nötigenfalls wer-

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den eventuelle virusale Verunreinigungen entfernt, insbesondere durch Erwärmung auf 60° C während 10 Stunden; man kühlt plötzlich auf 4° C ab und läßt 16 Stunden stehen; man scheidet den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugieren aus.

Zum Rückstand, der zuvor mit 5 η Salzsäure auf pH 4,2 eingestellt worden ist, fügt man Ammoniumsulfat hinzu, um die 2/5 Sättigung an diesem Salz zu erreichen, wobei man die Temperatur zwischen 5° und 8° C aufrecht erhält.

Man nimmt den gebildeten Niederschlag auf, der die Urokinase enthält, und löst ihn in zwei Teilen von im Verhältnis von 18 g Glukose pro Liter mit Glukose versetztem Wasser auf, und man unterwirft die Lösung einer Dialyse bis man eine Leitfähigkeit von 40 000 Mikrosiemens erhält; man trennt das Unlösliche durch Zentrifugieren, und man dialysiert den Rückstand, bis man ein Dialysat mit einem Widerstand von 22 000 Mikrosiemens erhält.

Behandlung des Dialysats mit der DEAE Zellulose (Diäthylaminoäthylzellulose) mit pH 4,5 im Verhältnis von 25 g für 14 Millionen CTA-Einheiten an Urokinase; man bewegt bzw. rührt 50 Minuten, filtert und wäscht das Harz mit einer Ammoniumsulfatlösung eines Widerstandes von 15 000 Mikrosiemens und eines pH von 4,5.

Zufügung von DEAE Zellulose mit pH 7 zum Eluat und zur Waschlösung im Verhältnis von 65 g zu 14 Millionen CTA-Einheiten Urokinase bei 2 bis 4° C; man stellt auf pH 6,6 bis 6,8 ein; man bewegt bzw. rührt 50 Minuten; man fügt Wasser hinzuj um den Widerstand auf 9 000 Mikrosiemens einzustellen, stellt den pH auf 7 ein und filtriert; man wäscht anschließend das Harz mit einer Ammoniumsulfatlösung eines Widerstandes von 9 000 Mikrosiemens bei pH 7·

Nachdem die Lösung wieder auf pH 6,2 eingestellt worden ist, wird sie während einer Stunde bei 4° C im Kontakt mit Kaolin bewegt bzw. gerührt (das Kaolin ist in der Weise hergestellt

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worden, daß gewaschenes Kaolin in der, bezogen auf sein Volumen, dreifachen Menge an destilliertem Wasser suspendiert worden ist,\ diese Suspension wurde in einem Autoklaven während 90 Minuten auf 120° C gehalten, danach dekantiert, und das Kaolin abgetrennt sowie in einem Ofen bei 200° 0 getrocknet)„

Nach dem Kaltzentrifugieren trennt man das Kaolin und suspendiert es in einer Pufferlösung von Phosphat 0,05 M und pH 6,2; man bewegt bzw. rührt während 30 Minuten und trennt das Kaolin durch Zentrifugieren; dieser letztere Vorgang des Waschens kann mehrere Male wiederholt werden. ■

Das Kaolin wird in einer Lösung suspendiert, die 75 g Ammoniumrchlorid pro Liter Ammoniak mit 4 p. 100 enthält, und während 30 Minuten bewegt bzw. gerührt. Das Kaolin, das vom Rückstand durch Zentrifugation abgetrennt worden ist, wird zwei weitere Male bei gleichem Prozeß der Auswaschung unterworfen.

Die Rückstände werden vereinigt und es wird n/10 H2SO4. hinzugefügt, um einen pH von 3,5 zu erhalten, sowie eine Lösung mit^; 350 Gramm Ammoniumsulfat pro Liter..

Der Niederschlag wird durch Kaltzentrifugieren aufgenommen und suspendiert sowie gegen eine Phosphatpufferlösung mit pH 6,2 und 0,05 M während 18 Stunden bei +4⁰O dialysiert.

Diese dialysierte Lösung wird auf einer Harzkolonne filtriert, die im Handel unter der Bezeichnung IRO 50 bekannt ist und die einen Durchmesser von 5 cm sowie eine Höhe von 60 cm besitzt sowie mit dem Pufferphosphat von 0_r05 M und pH 6,2 neutralisiert worden ist;.diese Kolonne wird mit dem gleichen Puffer gewaschen, bis es keinen Niederschlag mehr mit 5 # Tri- . Chloressigsäure gibt.

Die IRC 50 Kolonne wird mit einer Pufferphosphatlösung von 0,2 M bei pH 8,2 eluiert, in welcher 75 g Ammoniumchlorid pro Liter

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gelöst sind; das Eluat wird in einem Fraktionssammelbehälter aufgefangen, der sich in einem umschlossenen Raum auf +4⁰C befindet.

Die Fraktionen, welche die Aktivität enthalten, werden durch das Ammoniumsulfat (350 g/Liter) bei pH 3,5 zum Niederschlag gebracht. Der durch Zentrifugieren aufgenommene Niederschlag wird wieder in Lösung bei pH 7 gebracht und genügend verdünnt, so daß man einen Widerstand in der Größenordnung von 20 000 Mikrosiemens erhält.

Die auf diese Weise erhaltene Urokinaselösung kann noch mehr durch eine Dialyse unter üblichen Bedingungen gereinigt werden, damit man schließlich eine gereinigte Urokinase erhält, die lyophilisiert werden kann.

Beispiel 2: Herstellung; einer gereinigten Urokinase Tausend Liter Urokinase werden auf Phenol aufgenommen. Die Menge des zu diesem Zwecke verwendeten Phenols ist derart, daß am Ende des Sammelns die Phenolkonzentration wenigstens 0,5 % beträgt. Durch Zufügung von Essigsäure wird der pH des auf diese Weise gesammelten Urins auf 5»8 eingestellt.

(2) Adsorption, der im Urin enthaltenen Urokinase, auf dem H.yflosupercel

Man fügt zu der Mischung 5 ^g Hyflosupercel hinzu und unterwirft sie in einem doppelwandigen, auf 4° C gekühlten Grignardbehälter einer Bewegung bzw. einem Rühren während 3 Stunden. Das Hyflosuperceipulver wird durch Filtration auf einen Druckfilter aufgenommen, und man erhält 17 kg einer Masse bzw. Paste, die 12 kg Wasser enthält.

(3) Extraktion der auf dem Hyflosupercel adsorbierten Urokinase Der erhaltenen Masse bzw. Paste werden 960 g kristallisiertes

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Natriumchlorid und 17 Liter einer auf pH 7»2 gepufferten Lösung hinzugefügt, wobei letztere dadurch erhalten worden ist, daß man in 1 000 ml entmineralisiertes Wasser 10,8 g Dinatriumphosphat und 80 g NaCl gegeben hat. Der Widerstand der Pufferlösung ist 84 000 Mikrosiemens bei 15° Q.

Nach 30 Minuten Bewegen bzw. Rühren wird das Hyflosupercelpulver von der Mischung durch Filtrieren getrennt, und zwar auf einein Buchnertrichter von 200 mm Durchmesser, der mit einem Stoff-versehen ist, beispielsweise aus synthetischen Fasern* wie sie etwa unter der Bezeichnung Tergal im Handel sind. Man läßt das Pulver sich absetzen und beendet die Filtrierung, indem man unter einem Unterdruck von 500 mm Quecksilber arbeitet. Bevor das Pulver vollständig trocken ist, wäscht man es mit 10 Litern Waschlösung, man erhält ein Volumen von 30 Litern» Die Urokinaseaktivität der auf diese Weise erhaltenen Lösung beträgt 4 Millionen CIA-Einheiten. _s

(4) Präzipitation der in. der Pufferlösung enthaltenen Urokinase

Der pH der Lösung wird durch 5 n Salzsäure auf 4,2 eingestellt. Man fügt 13»5 kg Aramoniumsulfat (4-50 g pro Liter Lösung) hinzu und bewegt bzw. rührt, bis das Salz vollständig gelöst ist.

Die Mischung wird in Ruhe während 12 Stunden stehen gelassen. Der Niederschlag, der sich ausgebildet hat, wird durch Zentrifugieren aufgenommen. Man verwendet hierzu eine Zentrifuge, die im Handel unter der Bezeichnung Alfa Laval vom Typ B 14-24 F er-

hältlich ist. Man erhält 60 g feuchten Niederschlag und fügt zu dem Niederschlag 60 ml einer wässrigen Lösung hinzu, die 18 g

Glukose pro Liter Wasser enthält.

Die Mischung wird dann dialysiert, bis die Endleitfähigkeit der die Urokinase enthaltenden Lösung 22 000 Mikrosiemens beträgt.

Man aktiviert die Dialyse durch Bewegen bzw. Rühren. Die dialy-

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ßierte Lösung wird durch Zentrifugieren geklärt. Die Aktivität der erhaltenen Lösung beträgt 4 Millionen CTA-Einheiten an Urokinase.

(5) Ausschluß der Urokinase auf DEAE Zellulose

(a) Man fügt 7»1 S an DEAE Zellulose zu der vorher geklärten Lösung hinzu uud stellt, auf pH 4,5 ein. Nach 3°Minuten Bewegen bzw. Rühren trennt man die DEAE Zellulose durch Filtrieren auf einem Buchnertrichter von 150 mm Durchmesser, wobei man unter gemäßigtem Vakuum arbeitet, um die Bildung von Schaum zu verhindern.

Die DEAE Zellulose wird bei zwei Wiederholungen mit einer Ammoniumsulfatlösung mit der Leitfähigkeit von 15 000 Mikrosiemens und dem pH 4,5 gewaschen. Das bei jeder Waschung verwendete Volumen ist gleich dem der DEAE Zellulose und beträgt etwa 250 ml.

Während des Filtrierens der Waschlösung hält man die Phiole luftleer in einem Eisbad.

Die Aktivität des Filtrats beträgt 4 Millionen CTA-Einheiten.

(b) Dem erhaltenen Filtrat von pH 4,5 werden 17_f2 g DEAE Zellulose zugefügt und es wird auf pH 6,7 eingestellt.

Die Leitfähigkeit wird.durch Verdünnung mit Wasser auf 9 000 Mikrosiemens erniedrigt. Nach 30 Minuten Bewegen bzw. Rühren trennt man die DEAE Zellulose durch Filtrieren mittels eines Buchnertrichters von 150 mm Durchmesser aus Porzellan. Entsprechend der Filtrierung stellt man den pH des Filtrate oder des aufgefangenen abströmenden Mediums durch Hinzufügung von 5 a Schwefelsäure auf 5 ein.

Man wäscht die DEAE Zellulose mit einer Ammoniumsulfatlösung der Leitfähigkeit von 9 000 Mikrosiemens und bei pH 7 bis man ein farbloses Filtrat erhält.

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Die Filtrate und Waschlösungen werden vereinigt und auf pH 5 eingestellt. Die Urokinaseaktivität der erhaltenen Lösung beträgt 4.400.000 CTA-Einheiten.

(6) Adsorption der Urokinase auf Kaolin und Trennung durch

Eluieren
Man bereitet das Kaolin wie folgt:

1 kg Kaolin wird gewaschen und in 3 Litern destilliertem Wasser suspendiert. Man läßt die Mischung während 90 Minuten bei 120° im Autoklaven.

Nachdem man die in Suspension befindlichen Stoffe sich hat absetzen lassen, trennt man das Kaolin, danach bringt man es zum Trocknen in einen Ofen bei 200° C.

Die im Verlauf des letzten Verfahrensschrittes erhaltene Lösung von 4.400.000 CTA-Einheiten wird auf einen pH von 6,8 eingestellt, danach, nachdem 65 g des in der vorstehend erwähnten Weise bereiteten Kaolins zugefügt worden sind, auf einen pH von 6,2. Die Mischung wird während einer Stunde bewegt bzw. gerührt. Das Kaolin wird daraufhin durch Kaltzentrifugxeren abgetrennt und in einem Liter einer Phosphatlösung von 0,Q5 M, gepuffert auf pH 6,2, suspendiert.

Nach 30 Minuten Bewegen bzw. Rühren trennt man das Kaolin durch Zentrifugieren.

Die 65 g Kaolin werden in 500 ml einer Lösung suspendiert, die 75 g Ammoniumchlorid pro Liter Ammoniak mit 4p. 100 enthält, und während 30 Minuten bewegt bzw. gerührt. Das vom Rückstand durch Zentrifugieren getrennte Kaolin wird zwei weitere Male dergleichen EluierungsVorgang unterworfen.

Die bei dem Zentrifugieren erhaltenen Rückstände werden vereinigt, und zu ihnen wird 0,1 η Schwefelsäure hinzugefügt, um einen pH

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von 3»5 zu erhalten.

Indem man die während der Zentrifugiervorgänge erhaltenen Rückstände vereinigt, erhält man 1 400 ml Eluat. Der pH des Eluats wird durch Hinzufügen von 0,1 η Schwefelsäure auf 3,5 eingestellt, Man fügt dann 490 g Ammoniumsulfat hinzu (350 B pro Liter Eluat). Der gebildete Niederschlag wird durch Kaltzentrifugieren aufgenommen und in Wasser suspendiert. Man führt dann während 18 Stunden eine Dialyse gegen eine Phosphatlösung von 0,05 M, die auf pH 6,2 gepuffert ist, aus.

Die Urokinaseaktivität der erhaltenen Lösung beträgt 2.800.000 CTA-Einheiten.

(7) Filtrierung des Dialysats auf einer Harzkolonne Die dialysierte Lösung wird filtriert und auf einer Harzkolonne des Typs Amberlit IRC 50 von 4 cm Durchmesser und 60 cm Höhe filtriert, welche zuvor mit einer Phosphatlösung von 0,05 M, die auf pH 6,2 gepuffert worden ist, neutralisiert hat.

Wenn das Eluat aus der Kolonne ausgetreten ist, dann wäscht man das Harz mit der Pufferlösung bis die Hinzufügung von Trichloressigsäure syj 5 # keine Bildung eines Niederschlags in den aufgenommenen Fraktionen hervorruft.

Um die Urokinase herauszulösen, verwendet man eine Phosphatpufferlösung von 0,2 M und pH 8,2, die 75 g Ammoniumchlorid pro Liter Lösung enthält. Das Eluat wird in einem Fraktionssammler aufgenommen. Die Röhren, welche die Aktivität enthalten, werden durch Ammoniumsulfat bei pH 3»5 einer Präzipitation unterworfen, um die vorhandene Urokinase auszufällen und zwar mit einem Verhältnis von 350 g Ammoniumsulfat pro Liter Eluat, oder 158 g für die 450 ml des erhaltenen Eluats.

Beispiel 3· Herstellung einer gereinigten Urokinase In der nachstehenden Weise behandelt man ein Präzipitat mit

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Ammoniumsulfat, das Rohurokinase enthält und unter den Bedingungen des Absatzes 4 des Beispiels 2 erhalten worden ist, · und zwar von einer Lösung, die ihrerseits von menschlichem Urin erhalten worden ist, auf die man zuvor das Konzentrationsver- . fahren nach den Abschnitten 1'. bis ' 3 ' des gleichen Beispiels .2 angewandt hat. . - - , ■ ■

(A) Bedingungen der ersten Ausschließung;

Das Präzipitatmit Ammoniumsulfat wird in ein bis zwei Teilen Glukosewässer gelöst, und zwar im Verhältnis von 18 Gramm Glukose pro Liter, und der pH wird auf einen Wert zwischen 4 und 6, vorzugsweise auf einen Wert von 4,5 eingestellt.

Die erhaltene Losung wird gegen destilliertes Wasser dialysiert, bis man eine Leitfähigkeit zwischen 30 000 und 50 000 Mikrosiemens, vorzugsweise eine solche von 40 000 Mikrosiemens, erhält, v.

Man zentrifugiert die erhaltene Lösung mit 3 000 g, um die ge- · bildeten unlöslichen Stoffe auszuscheiden, die aus den nichtproteinischen Verunreinigungen bestehen.

Man nimmt eine neue Dialyse des Rückstandes vor, bis man ein Dialysat erhält, dessen Leitfähigkeit zwischen 15 000 und 25 Mikrosiemens, vorzugsweise bei 22 000 Mikrosiemens, liegtI

Man fügt DEAE. Zellulose zur erhaltenen Lösung in einem Verhältnis von 25 g trockenen Harzes oder 100 g zentrifugieren Harzes, das vorher mit einer Ammoniumsulfatlösung von 0,11 M mit pH 4,5 (Leitfähigkeit von 15 000 Mikrosiemens bei /j.o c) neutralisiert worden ist, auf 14 Millionen CTA-Einheiten Urokinase.

Man bewegt bzw. rührt das Medium während einer Dauer von 20 bis 40 Minuten, vorzugsweise während 30 Minuten.

Man saugt das Harz ab, vorzugsweise nach Buchner unter leichtem

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Unterdruck, und man wäscht es mit einer Lösung von Ammoniumsulfat von 0,11 M mit pH 4,5 bis man ein farbloses abströmendes Mittel oder Filtrat erhält.

Man vereinigt das FiIbrat mit den Waschlösungen. Die Gesamtaktivität der erhaltenen Lösung an Urokinase ist genau gleich der Aktivität, die am Eingang angegeben worden ist*

(B) Bedingungen der zweiten Ausschließung:

Die obige Lösung wird auf einen pH zwischen 6 und 7, vorzugsweise in der Größenordnung von 6,6 eingestellt.

Man fügt zu dieser Lösung 60 g DEAE Zellulosepulver oder 250 g abgesaugte bzw. zentrifugierte DEAE Zellulose, die zuvor mit einer Ammoniumsulfatlösung von 0,068 M mit pH 7 (Leitfähigkeit 9 000 Mikrosiemens bei 4·° C) neutralisiert worden ist, auf 14 Millionen CTA-Einheiten Urokinase hinzu. Die Leitfähigkeit des Mediums liegt dann zwischen 15 000 und 18 000 Mikrosiemens.

Die Leitfähigkeit des Mediums wird danach durch aufeinanderfolgende Zugaben von apyrogenem destilliertem Wasser auf 9 000 Mikrosiemens eingestellt, und zwar in der Weise, daß bei ^eder Zufügung eine Erniedrigung der Leitfähigkeit des Mediums um 1 000 Mikrosiemens stattfindet, wobei jede Zufügung durch ein Bewegen bzw. Rühren während einer Dauer von 5 bis 15 Minuten, vorzugsweise von 10 Minuten, unterbrochen wird.

Der pH des Mediums wird dann durch . 2' M Soda auf 7 eingestellt, Nach Bewegen bzw. Rühren während einer Dauer von 30 Minuten filtriert man, vorzugsweise nach Buchner, nichtoxydierend, unter leichtem Unterdruck, wobei der aufnehmende Rezipient in einem Bad mit Eisstücken gehalten wird, man wäscht das Harz mit einer Ammoniumsulfatlösung mit 9 000 Mikrosiemens Leitfähigkeit, 0,066 M und pH 7t bis sich ein farbloses Piltrat ergibt.

Die durch Vereinigung des Piltrats und der Waschlösungen erhal-

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tene Lösung kann anschließend zusätzlichen Reinigungsbehandlungen unterworfen werden, insbesondere Behandlungen, bei denen_; eine Adsorption auf Kaolin und eine Chromatographie mit Adsorption auf' Harz vom Typ Amberlit unter den im vorhergehenden Beispiel beschriebenen Bedingungen erfolgt, oder noch durch Adsorptionschromatographie auf Carboxymethylzellulose unter den folgenden Bedingungen:

(0) Adsorptionschromatographie auf Carboxymethylzellulose Der vorerwähnten Lösung, die auf pH 5 eingestellt worden ist, wird Carboxymethylzellulose im Verhältnis von 80 g trockenen Harzes auf 14 Millionen CTA-Einheiten zugefügt, wobei die Carboxymethylzellulose zuvor mit einer Ammoniumsulfatlösung von 0,068 M, 9 000 Mikrosiemens, pH 5 und 4° C neutralisiert worden ist. Die Suspension wird während einer Dauer von 12 bis 14 Stunden bei einer Temperatur zwischen 2 und 4° C in gemäßigter Bewegung gehalten, wobei ihr pH mit 5 ± 0»1 aufrecht erhalten wird.

Die Suspension wird anschließend auf Kreppapier mit einem Büchnerfilter aus Porzellan unter leichtem Unterdruck filtriert. Die abströmenden Medien behalten die anfängliche Färbung.

Die Carboxymetihylzellulose wird dann mit einer Ammoniumsulfatlösung von 9 000 Mikrosiemens bei pH 5 gewaschen, bis.man eine farblose Lösung erhält.

Die Carboxymethylzellulose wird danach abgesaugt bzw. zentrifugiert. Man fügt dann ein gleiches Volumen einer Ammoniumsulfatlösung von 22 000 Mikrosiemens, pH 5 bei 4° C zu.

Die Temperatur wird auf 4° C gehalten, die Suspension wird während 50 Minuten bewegt bzw. gerührt, die Carboxymethylzellulose wird anschließend auf Kreppapier abfgesaugb (nach Büchner) und mit einer Ammoniumsulfatlösung von 22 000 Mikrosiemens gewaschen, bis man eine klare Lösung erhält, die nicht mit Tannin Präzipitat bildet.

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Das Eluat und die Waschlösungen werden vereinigt, um eine gereinigte Urokinaselösung zu ergeben, die 80 bis 90 % der Aktivität der Urokinase der Lösung enthält, die sich aus der Vereinigung des abströmenden Mittels und der Waschlösungen ergibt, welche am Schluß der zweiten vorerwähnten Ausschließungschromatographie erhalten worden sind.

Die in dieser Lösung enthaltene Urokinase wird durch Natriumchlorid ausgefällt. Diese letztere Ausfällung wird'erreicht mit Hilfe von kristallisiertem, streng reinem Natriumchlorid im Verhältnis von 330 g pro "Liter auf eine Lösung, deren pH vorher auf einen Wert zwischen 4 und 5|5 eingestellt worden ist· Nachdem man das Medium während einer Stunde mit einer Temperatur von 4 bis 6° C ruhig stehen gelassen hat, zentrifugiert man mit 9 000 g. Der Rückstand- wird entfernt und das Präzipitat in einer Lösung aufgelöst, die wenigstens 30 g pro Liter an Natriumchlorid enthält, eine Leitfähigkeit von 28 000 Mikrosiemens und einen pH von 6,8 besitzt, die Natriumchloridkonzentration dieser Lösung soll derart sein, daß die schließlich erhaltene Lösung eine Urokinaseaktivität von 200 000 CTA-Einheiten/ml hat. Man filtriert die erhaltene Lösung und läßt sie nach Dosierung in Plasmafläschchen von 250 ml einfrieren.

Beispiel 4; Herstellung einer gereinigten Urokinase

Nachstehend wird ein Beispiel der Extraktion von Urokinase in größerem Maßstab beschrieben, wobei man von 8 700 Litern menschlichem männlichem Urin ausgeht.

Man führt eine Behandlung dieses menschlichen Urins mit einem Filtrierhilfsmittel des Beispiels (1) durch, man reextrahiert die auf dem Filtrierhilfsmittel adsorbierte Urokinase, und man behandelt das erhaltene Eluat und die Waschlösungen des Piltrierhilfsinittels nach den im Beispiel (1) angegebenen Bedingungen, um 500 g eines Ammoniumsulfatniederschlags zu erhalten, der fast die Gesamtaktivität der in der behandelten Urinmasse ent-

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haltenen Urokinaseaktivität aufweist, das sind insgesamt 35 Millionen CTA-Einheiten.

Diese 500 g Präzipitat werden in einer Losung von 18 g Glukose,-welche eine Codexreinheit besitzt, in 500 ml apyrogenem destilliertem Wasser gelost. Man' bewegt b.zw. rührt während 15 Minuten bei einer Temperatur Von 4° C. Man stellt anschließend den pH mit 2 η Schwefelsäure auf einen Viert von 4,5 ein. Die Leitfähigkeit der erhaltenen Lösung beträgt 90 000 Mikrosiemens. Die Lösung wird in Dialysedärme bzw. (lange) -schläuche im Verhältnis von 150ml pro Darm bzw. Schlauch verteilt· Die Dialyse wird in einer kalten Kammer unter leichtem bzw. vorsichtigem Rühren gegen apyrogenes destilliertes Wasser bei 4° C vorgenommen, bis man eine Leitfähigkeit von 40 000 Mikrosiemens im Dialysat erhält. Dieses wird dann in einer abgekühlten Zentrifuge mit 3 000 g zentrifugiert. Die 35 g des erhaltenen unlöslichen Produktes werden beseitigt* "-

Der Rückstand wird dann von Neuem aufeinanderfolgenden Dialysen gegen apyrogenes destilliertes Wasser unterworfen, wobei die Temperatur auf 4° C gehalten wird, und zwar bis man eine Leitfähigkeit von 22 000 Mikrosiemens im Dialysat erhält, und zwar vorzugsweise wie folgt:

(a) eine erste Dialyse gegen 5 Liter destilliertes Wasser während 3 Stunden,

(b) eine zweite Dialyse gegen 5 Liter destilliertes Wasser während 3 Stunden, und

(c) eine dritte Dialyse gegen 3 Liter destilliertes Wasser während 2 Stunden.

Das Volumen des erhaltenen Dialysats ist 1 700 ml. Seine Leitfähigkeit beträgt 22 000 Mikrosiemens bei 4⁰C

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— co —

Sein Gesamtgehalt an Proteinen ißt 27 200 mg, das sind 16 mg Proteine pro ml Dialysat. ·

Seine Urokinaseaktivität ist 30.600.000 OTA-Einheiten, das heißt 18 000 OTA-Einheiten pro ml.

Die.spezifische Aktivität an Urokinase auf ein Milligramm Proteine ist 1 125 CTA-Einheiten.

Dieses. Dialysat wird der vorerwähnten ersten Ausschließungschromatographie in Kontakt mit 218 g abgesaugter bsw» eentrifugierter DEAE Zellulose, die 54,5 g DEAE Zelluloiepulirer der Qualität 0,9 meq/g äquivalent ist, unterworfen. Die Zufügung der DEAE Zellulose erfolgt unter Bewegen bzw. Rühren, und zwar während einer Dauer von 30 Minuten, wobei die Temperatur auf 4° C gehalten wird. Anschließend wird die Trennung des Filtrate nach Büchner unter Einwirkung eines zur Vermeidung von Schaumbildung ausreichenden leichten Unterdrucks durchgeführt. Das Harz wird zweimal nach Büchner gewaschen, und zwar Jedesmal · , mit 250 ml einer Ammoniumsulfatlösung von I5 000 Mikrosiemens mit pH 4,5.

Die Lösung, die man durch Vereinigung des Piltrats und» der Waschlösungen erhält, ist insgesamt 2 280 ml und weist eine Leitfähigkeit von 18 000 Mikrosiemens auf; diese Lösung wird einer zweiten Ausschließungschromatographie auf DEAE Zellulose mit pH 7 unter den folgenden Bedingungen unterworfen:

Man stellt den pH der vorstehenden, auf 4⁰C gehaltenen Lösung mit 2 η Soda auf einen Wert von 6,6 ein. Zu dieser Lösung fügt man 528 g abgesaugte bzw. zentrifugierte DEAE Zellulose hinzu, was einem Äquivalent von 132 g DEAE Zellulosepulver der Qualität 0,9 meq/g entspricht. Das auf 4° C gehaltene Medium wird während 30 Minuten bewegt bzw. gerührt.

Die erhaltene Mischung mit pH 6,6 weist eine Leitfähigkeit von

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16 000 Mikrosiemens auf.

Man nimmt bei 4° 0 eine erste Zufügung von 400 ml apyrogenem destilliertem Wasser vor und bewegt bzw. rührt die Mischung während 10 Minuten. Die Leitfähigkeit der Mischung am Ende dieser Bewegungs- bzw. Rührbehandlung beträgt 15 000 Mikrosiemens.

Dann erfolgt eine zweite Zufügung von 400 ml apyrogenen destillierten Wassers, und man bewegt bzw. rührt das Medium von neuem während 10 Minuten. Am Ende dieser Bewegungs- bzw. Rührbehandlung ist die Leitfähigkeit der Mischung 14 000 Mikrosiemens.

Schließlich erfolgt unter den gleichen Bedingungen eine dritte·, danach eine vierte, danach eine fünfte und schließlich eine sechste Verdünnung, wobei die Leitfähigkeit der Mischung am Ende der sechsten Verdünnung 9 000 Mikrosiemens beträgt.

Der pH des Mediums wird dann mit 2 η Soda auf 7 eingestellt, und die Bewegungs- bzw. Rührbehandlung wird während ,30 Minuten. durchgeführt. · .

Anschließend erfolgt eine Trennung des Harzes durch Filtration nach Büchner unter leichtem Unterdruck. Das Harz wird mit einer AmmoniumsulfatJLösung von 9 000 Mikrosiemens bei pH 7 gewaschen, bis man ein farbloses Piltrat erhält. Nach der Vereinigung des Piltrats und der Waschlösungen (1 500 ml) e,rhält-man ein Lösungsvolumen von 6. 000 ml.

Die an dieser Lösung ausgeführten Gewichtsbestimmungen führten zu folgenden Ergebnissen:

Gesamtgehalt an Proteinen: 14 400 mg, das heißt 2,4 mg pro ml;

Gesamtaktivität an Urokinase: 34.800.000 CTA-Einheiten, das heißt 5 800 CTA-Einheiten pro ml;

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Spezifische Urokinaseaktivität pro mg Proteine: 2 400 CTA-Einheiten. -

Die erhaltene Lösung kann danach ergänzenden Reinigungen gemäß irgendeiner der hierfür bekannten Techniken unterworfen werden, insbesondere aber solchen Techniken, die im Beispiel (1) oder in den vorstehenden Beispielen an entsprechender Stelle beschrieben sind.

In dem vorhergehenden Beispiel sind besonders vorteilhafte Ergebnisse erhalten worden. Der Wert des Verhältnisses der Menge des in der zweiten Ausschließungschromatographieverwendeten Harzes zur Urokinaseaktivität der zu behandelnden* Lösung beträgt 43,5 g Harz pro 10 Millionen Einheiten UrokinaseaktivitätQTA. Dieser Wert liegt in einem sehr' vorteilhaften Bereich, Has die Ergebnisse einer Versuchsreihe zeigen, die an der gleichen Lösung auf dem Niveau der zweiten Ausschließungschromatographie mit veränderlichen Mengen von Harz ausgeführt worden ist, wobei alle anderen Parameter im übrigen identisch waren. Die Ergeb- . nisse, die es gestattet haben, den günstigsten Bereich der Verhältnisse unter den Erfahrungsbedingungen zu bestimmen, sind nachstehend durch die Menge des Harzes (bezeichnet durch die Abkürzung DEAE) in Gramm und bezogen auf 10 Millionen CTA-Einheiten Urokinaseaktivität ausgedrückt:

25 g DEAE: alle Proteine gehen mit der Urokinase in das abströmende Medium

30 g DEAE: " "

40 g DEAE: untere Grenze, bei der zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden, die spezifische Aktivität (Urokinaseaktivifcät relativ zum Gewicht der Proteine) nimmt zu, und die Urokinase geht in ihrer Gesamtheit in das abströmende Mittel.

43,5 g DEAE: " «

48 g DEAE: D° obere Grenze.

53 g DEAE: die spezifische Aktivität nimmt nicht mehr zu, und

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man beginnt eine "bestimmte Menge Urokinaseaktivität zu verlieren, die auf dem Harz adsorbiert ist.

60 g DEAE: die vorgenannten Erscheinungen werden stärker.

Man stellt fest, daß analoge Ergebnisse erhalten werden, wenn man Leitfähigkeitswerte der der zweiten AusschließungsChromatographie unterworfenen· Lösung zugrunde legt, die von 22 000 Mikrosiemens abweichen, jedoch selbstverständlich in dem oben angegebenen Bereich liegen.

Dementsprechend erhält man ein besonders wirkungsvolles Verfahren zur Herstellung gereinigter Urokinasen mit Ausbeuten, die bisher noch niemals erreicht worden sind und gleichzeitig eine außerordentlich beträchtliche Erhöhung ihrer spezifischen Aktivitäten relativ zum Gewicht der die Urokinasen in den Mutterbzw. Ausgangsurinen begleitenden Proteine»

Beispiel ^: Herstellung einer apyrogenen Urokinase

Das Endpräzipitat des Beispiels (2) wird durch Zentrifugieren aufgenommen, nachher in apyrogenem und sterilem destilliertem Wasser gelöst, derart, daß man eine Leitfähigkeit zwischen 15 000 und 25 000 Mikrosiemens erhält. Die Konzentration dieser Lösung an Proteinen ist in der Größenordnung von 2 mg/ml.

Der pH wird auf einen Wert von 3*8 eingestellt und die Temperatur zwischen .0 und 4° 0, man fügt zu diesem Medium eine gesättigte Lösung von Ammoniumsulfat hinzu, bis man eine Sättigung von 0,3 erhält (das sei eine Lösung von 1,22 M Ammoniumsulfat). Das Medium wird während 15 Minuten bewegt bzw. gerührt, danach läßt man es ebenfalls während 15 Minuten ruhig stehen.

Man nimmt den Niederschlag durch Zentrifugieren mit 10 000 g auf (Fraktion A).

Dem Rückstand wird reines Ammoniumsulfat zugefügt, und zwar in

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einem Verhältnis von 250 g/l auf pH 3 bis 3i5i danach wird während 30 Minuten bewegt bzw. gerührt. Das die Urokinase enthaltende Präzipitat wird durch Zentrifugieren mit 10 000 g aufgenommen (Fraktion B). '

(9) Ergebnisse:

Jeder dieser Niederschläge (Fraktionen A und B) wird wieder in apyrogenem und sterilem destilliertem Wasser suspendiert, der pH der Suspension wird auf 7 eingestellt, die Suspension wird abschließend auf einer Membran mit 0,22 λχ in sterilem Medium

filtriert.

Das Filtrat, das von der Fraktion A .stammt, enthält ungefähr 5 % der Urokinaseaktivität. Das von der Fraktion B stammende Filtrat enthält etwa 95 % der Urokinaseaktivität der Ausgangslösung·

Es erweist sich, daß die Fraktion A praktisch alle pyrogenen Substanzen enthält, die anfänglich in der Ausgangslösung ent- ■ halten waren, welche durch Losung des Präzipitats mit Ammoniumsulfat vor der Fraktionierung erhalten worden ist. Die Fraktion B dagegen ist von pyrogenen Substanzen befreit, und zwar gemäß den Normen der Pharmacopee Francaise, die oben zitiert worden sind. Diese Ergebnisse lassen sich der nachstehenden Tabelle I entnehmen, in der die Temperaturerhöhungen wiedergegeben sind, die jeweils in getrennten Serien mit drei Kaninchen für ^ede der getesteten Fraktionen beobachtet wurden, sowie in einer ergänzenden Serie mit acht Kaninchen für die Fraktion B; alle diese Kaninchen hatten die Dosen erhalten, die in der linken Seite der Tabelle angegeben worden sind, und zwar unter den von der Pharmacopee Francais vorgesehenen Bedingungen.

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TABELLE I

Getestete Lösungen Temperaturerhöhung in ⁰C

Mittelwert Mittelwert oder Fraktionen Reihe mit 3 Kaninchen Reihe mit 8 Kaninchen (3 Kaninchen) (8 Kaninchen)

^ο Ausgangslösung: °f 3 000 CTA-Einheiten/ 0,5° 0,8° 0,9°

*- " kg

O,7^C

Fraktion A 3 000 CTA-Einheiten/ 0,9° 0,9°

kg

Fraktion B

15 000 CTA-Einheiten/ 0,1° 0,2° 0° 0°,00,0°,0°,0,1°,0,3°,0,4°,0,1° .0,1°

kg

-34- 22A6969

Beispiel 6: Herstellung einer apyrogenen Urokinase

(A) Herstellung einer gereinigten und konzentrierten Urokinase-

lösung:

Man geht von 2'd OuO Litern menschlichem Urin aus und führt eine Extraktion der Rohurokinase unter Bedingungen durch, die identisch mit denen des Beispiels (3) sind, mit Ausnahme der Bedingungen, welche den Verfahrensschritt der Adsorptionschromatographie auf Carboxymethylzellulose an der Lösung betreffen, die am Ende der zweiten Ausschließung bei Berührung mit dem DEAE Zelluloseharz erhalten wurde, diese Adsorptionschromatographie_# wird wie folgt durchgeführt:

Der vorerwähnten, auf pH 5 eingestellten Lösung wird Carboxymethylzellulose im Verhältnis von 80 g trockenen Harzes auf 14 Millionen CTA-Einheiten Urokinase hinzugefügt, wobei die Carboxymethylzellulose zuvor mit einer Ammoniumsulfatlösung von 9 000 Mikrosiemens, pH 5 und von 0,068 M neutralisiert worden_%ist. Die Suspension wird unter gemäßigter Bewegung bzw. mäßigem Rühren während einer Dauer von 12 bis 14 Stunden auf einer Temperatur zwischen 2 und 4° C gehalten, ihr pH wird auf 5 + 0,1 gehalten.

Die Suspension, wird dann auf Kreppapier filtriert, und zwar mittels eines Buchnerfilters aus Porzellan unter leichtem Unterdruck. Die abströmenden Medien bewahren die anfängliche Färbung.

Die Carboxymethylzellulose wird dann mit einer Ammoniumsulfatlösung von 9 000 Mikrosiemens mit pH 5 gewaschen, danach mit einem Phosphatpuffer von 0,05 M mit pH 6,5» um die Sulfate zu verdrängen, und zwar solange, bis man eine farblose Lösung erhält.

Die Carboxymethylzellulose wird dann abgesaugt bzw. zentrifugiert. Zu dieser wird anschließend ein Volumen von Phosphatpuffer von 0,5 M hinzugefügt, das gleich dem Gewicht des Puf-

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fers von 0,05 M ist, der in der abgesaugten bzw. zentrifugierten Carboxymethylcellulose zurückgehalten worden ist, diese Hinzu- \ fügung erfolgt bei einer Temperatur von 15- bis 20° C unter Bewegen bzw. Rühren. Man fügt weiter ein gleiches Volumen eines . Natriumphosphatpuffers von 0,29 M zu, danach einen Phosphatpuffer von 0,5 M, um eine Endmolarität von 0,29 M und einen tdH in der Größenordnung von' 6,8 bis 6,9 zu erreichen.

Die Temperatur wird dann wieder auf 6° C eingestellt, die Suspension wird während 30 Minuten bewegt bzw. gerührt, die Carboxymethylzellulose wird sodann auf Kreppapier abgesaugt (nach Büchner) und mit einem Phosphatpuffer von 0,29 M gewaschen, bis man eine klare Lösung erhält, die mit Tannin keinen Niederschlag ergibt.

Das Eluat und die Waschlösungen werden vereinigt, so daß sich eine gereinigte Urokinaselösung ergibt, die 80 bis 90 % der Urokinaseaktivität der Lösung enthält, die sich aus der Vereinigung des abströmenden Mediums und der Waschlösungen ergibt«, welche man am Ende der oben erwähnten zweiten Ausschließungschromatographie erhalten hat.

(B) Depyrogenisation;

Die erhaltene "gereinigte Lösung, die 65 Millionen ÖTA-Einheiten Urokinase enthält, wird auf pH 3,5 eingestellt und die Urokinase wird mit Ammoniumsulfat, mit einem Verhältnis von 350 S Ammohiumsulfat pro Liter Eluat, ausgeschieden. Man erhält 35 g eines Niederschlags, der insgesamt 65 Millionen CTA-Einheiten an Urokinase hat. .

Dieser Niederschlag wird in 600 ml destilliertem sterilisiertem apyrogenem Wasser gelöst, die erhaltene Lösung weist bei pH 3»8 eine Leitfähigkeit von 15 000 Mikrosiemens■auf und besitzt einen Proteingehalt von 2 mg/ml.

Diese Lösung ruft bei dem am Kaninchen ausgeführten Pyrogen-

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test eine Hyperthermie von 0,9° G bei einer Dosis von 3 000 CTA-EinheitenAg hervor.

Man fügt unter Bewegung bzw. Rühren langsam 258 ml der gesättigten Ammoniumsulfatlösung hinzu, die zuvor auf pH U- und 4-° C gebracht worden ist. Der pH des Mediums wird auf 3»8 eingestellt, es wird während 15 Minuten bewegt bzw. gerührt, danach wird die Lösung während 15 Minuten ruhig stehen gelassen. Der gebildete leichte Niederschlag wird durch Zentrifugieren mit 10 000 g aufgenommen: man isoliert 5 g Präzipitat (Fraktion*C).

Dem Rückstand wird reines kristallisiertes· Ammoniumsulfat im Verhältnis von 250 g/Liter zugefügt und es wird während 30 Minuten bewegt bzw. gerührt. Der pH des Mediums wird dann durch Hinzufügen einiger Tropfen von 2 η Schwefelsäure auf 3 eingestellt. Der entstandene Niederschlag wird durch Zentrifugieren mit 10 000 g aufgenommen, und der Rückstand wird beseitigt: man erhält 25 g Präzipitat (Fraktion D).

(C) Ergebnisse:

Das Präzipitat der Fraktion C wird in 25 ml destilliertem sterilem apyrogenem Wasser gelöst, und der pH wird mit 0,1 η Soda auf 7 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird steril filtriert; Die Urokinasekonzentration ist 100 000 CTA-Einheiten/ml.

Das Präzipitat der Fraktion D wird in 15Ο ml destilliertem sterilem apyrogenem Wasser gelöst. Der pH wird mit 0,1 η Soda auf 7 eingestellt, und die erhaltene Lösung wird steril filtriert; Ihre Urokinasekonzentration ist 300 000 CTA-Einheiten/ml. Ihre spezifische Aktivität bezogen auf Protein beträgt 43 000 CTA-Einheiten pro mg Proteine.

Auch hier kann man die gleichen Beobachtungen wie im vorhergehenden Falle machen. Man stellt fest, daß der Hauptteil der pyrogenen Substanzen in der Fraktion C zurückgehalten worden ist, während die Fraktion 1) frei von p.yrogencn Substanzen gemäß den

.ni98 U / 1 088

Formen der Pharmacopee Francaise ist; diese Verhältnisse lassen sich auch der Tabelle II entnehmen, die unter Bedingungen erstellt wurde, welche mit denen vergleichbar sind, die der Erstellung der Tabelle I zugrunde lagen.

Bei Kenntnis der Erfindung ist ohne weiteres ersichtlich, daß man an Stelle von Ammoniumsulfat jedes andere Salz verwenden kann, das wegen seiner Fähigkeit, Proteine auszuscheiden, bekannt ist, beispielsweise Magnesiumsulfat, Natriumchlorid etc.; wobei man zu beachten hat, daß es in jedem Fall .-erforderlich ist vorher den Sättigungsgrad der Ausgangslösung an dem in Betracht gezogenen Salz zu bestimmen, der zu einer Präzipitation der Proteine unter den obigen Bedingungen führt.

Dementsprechend erhält man ein Verfahren zur Depyrogenisierung und gleichzeitig zum relativen Konzentrieren der Urokinase gegenüber ihrem Proteingehalt j welches einfach und besonders wirkungsvoll ist, wobei die apyrogene mit erhöhten Dosen erhaltene Urokinase dann Patienten verabreicht werden kann, ohne daß irgendeine Sekundärwirkung bis zu Dosen von 15O 000 CTA-Einheiten oder mehr auftritt, und zwar durch eine einzige intravenöse Injektion, zur Behandlung der hier erwähnten Beschwerden, sei es nun in der vorliegenden Form oder sei es in anderer Form, beispielsweise nach Überführung in Urokinaseheparinät, wie zum Beispiel unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen:

Beispiel 7; Herstellung von Urokinaseheparinät

Man kann Urokinaseheparinät von einer gereinigten und konzentrierten Urokinaselösung herstellen, indem man auf die folgende Verfahrensweise zurückgreift:

Man fügt zu dieser Lösung Heparin hinzu, beispielsweise in einem Verhältnis von 50 000 Heparineinheiten auf 14- Millionen CTA-Einheiten Urokinase; man stellt den pH mit 0,5 η Phosphorsäure auf 4-,2 ein; man läßt das Ganze während einer Stunde bei einer

3Q98U/1088

TABELLE II» Temperaturerhöhungen in ,jedem der getesteten Kaninchen

Getestete Lösungen

oder Fraktionen Reihe von 3 Kaninchen Reihe von 8 Kaninchen

Mittelwert Mittelwert (3 Kanin- ( 8 Kaninchen) chen )

Ausgangslösung

3 000 CTA-Einheiten/ 1,1°, 0,9°, 0,8°

kg 0,9

^ Fraktion C -* 3 000 CTA-Einheiten/ 0,9°, 0,8°, 0,8°

° kg

0,8°

Fraktion D

15 000 CTA-Einheiten/ 0,1°, 0°, 0,1°

kg

JOjI⁰,0,1°, 0,3°,0° 0,07° 0,1°

Fraktion D

20 000 GTA-Einheiten/

kg 0^o,0⁰,0⁰,0O,0,1⁰,0,1°_t0_#3^o»0,3^o

0,1°κ>

co cn co

Temperatur von 4° C in Ruhe stehen; man zentrifugiert, nimmt den Bodensatz der Zentrifugierung mit einer Lösung von 10 g/ Liter Natriumchlorid im Verhältnis von 100 ml Lösung auf 14 Millionen CTA-Einheiten Urokinase auf, und man lyophilisiert, -. um wasserfreies Urokinaseheparinat zu erhalten.

Beispiel 8; Herstellung von Urokinaseheparinat

Die Ausgangslösung gerinigter Urokinase ist durch. Anwendung des in Beispiel (2) beschriebenen Arbeitsverfahrens erhalten worden. Ihre Gesamtaktivität an Urokinase ist 4.950.000 CTA-Einheiten.

Zu dieser Lösung fügt man 50 000 Einheiten apyrogenes Heparin, und man stellt den pH durch Hinzufügung von 0,5 η Phosphorsäure auf 4,2 ein. Man läßt den sich bildenden Niederschlag während 30 Minuten ausflocken, dann nimmt man ihn durch Zentrifugieren auf. Der Rückstand besitzt eine Aktivität unterhalb von 25 CTA-Einheiten/ml.

Der Niederschlag wird in 20 ml einer' Lösung von 30 g Natriumchlorid pro Liter aufgelöst, deren pH auf 7»3 eingestellt worden ist.

Die Urokinaseaktivität der Lösung ist 200 000 CTA-Einheiten/ml, was einer Gesamtaktivität von 4 Millionen CTA-Einheiten entspricht .

Man erhält Urokinaseheparinat in trockenem Zustand, wenn man die erhaltene Lösung einer Lyophilisation unterwirft-.

Indem in gleicher bzw. ähnlicher Weise verfahren wurde, konnte Urokinaseheparinat ferner ausgehend von gereinigter und im vorliegenden Falle weiterhin depyrogenisierter, Urokinase hergestellt werden, insbesondere von gereinigten Fraktionen der anderen obigen Beispiele.

3098U/1088

In den vorherigen Beispielen erfolgte die Reaktion zur Bildung des Urokinaseheparinats bei pH 4,2. Dieser Wert des pH ist nicht kritisch. Jedoch löst sich das gebildete Urokinaseheparinat bei einem zu schwach saurem pH im Reaktionsmedium, was seine Trennung sehr schwierig macht. Bei einem zu saurem pH besteht die Gefahr, daß die Urokinase Zersetzungen ausgesetzt ist. Gute Ergebnisse erhält man in einem Bereich des pH von 1 bis 5·

Man stellt fest, daß die Proteine, welche die Urokinase in den gereinigten Urokinasepräparaten noch begleiten, ebenfalls vom Heparin gebunden werden. Die spezifischen relativen Aktivitäten an Urokinase und an Heparin stellen daher ein gewisses Maß dar, das eine Funktion des Reinheitsgrades des Ausgangsurokinasepräparats ist.

So kann man Urokinaseheparinate herstellen, deren relative Aktivitäten in der Größenordnung von 30 000 bis 100 000 UCTA auf 100 UI Heparin liegen können.

Wenn man hochgereinigte Ausgangsprodukte nimmt, wie beispielsweise eine Urokinase von 100 000 UCTA/mg, ein Heparin von 160 Ul/mg, dann stellt man fest, daß sich -.1 mg Urokinase mit ungefähr 0,6 mg Heparin zu einem Komplex verbindet.

Die spezifische Aktivität eines solchen Heparin-Urokinasekomplexes ist folgende:

Ausgedrückt in Urokinase : 62 600 UCTA/mg Ausgedrückt in Heparin : 100 Ul/mg.

Nachstehend werden in den Beispielen (sowie auch im Rahmen der übrigen Ausführungen) die Urokinaseaktivitaten in UCTA/mg (CTA-Einheiten/mg), und die Heparinaktivitäten in internationalen Heparineinheiten/mg (Ul/mg) angegeben, insbesondere bei den mittels des erfindungsgeraäßen Verfahrens erhaltenen Mengen an Urokinaseheparinat.

309814/1088

224G969

.. 41 -

TABELLE III

Aktivität an Urokinase Aktivität an Heparin (üCTA/mg) . (UI/mg)

A 54 800 60,7

B 32 000 27,1

0 50 500 52

D 62 000 72

E 51 500 57

Nachstehend werden bestimmte Eigenschaften des Urokinaseheparinats beschrieben, sowie an Beispielen gewisse charakteristische klinische Anwendungen desselben.

Stabilität des Urokinas eheparinat s Das Urokinaseheparinat ist bemerkenswert stabil und kann während langer dauernden Zeiträumen aufbewahrt werden. In der nachstehenden Tabelle IY sind die Ergebnisse der Kontrollen wiedergegeben, die an einer Menge ausgeführt worden sind, welche ursprünglich 48 75O UCTA/mg besaß, und zwar wurden die Kontrollen in aufeinanderfolgenden Zeitintervallen durchgeführt (es sei darauf hingewiesen, daß die Präzision der Kontrolle bzw. Messungen plus oder minus 10 % beträgt): . .

TABELLE IV

Zeitpunkt der Messung Aktivität an Urokinase in UCTA/mg

Am Anfang 48 750

3 Wochen danach 46 875 1 Monat danach 50- 000 10 Wochen danach 50 000

4 Monate danach 50 000

5 Monate danach 3 0 9 814/1088 50 000

Diese Ergebnisse zeigen, daß das Urokinaseheparinat vollkommen stabil ist; das ist bei der nicht im Komplex vorhanden Urokinase nicht der Fall, die in lyophilisierter oder gefrorener Form 20 bis 30 % ihrer Aktivität in 24 bis 48 Stunden verliert.

Das Urokinaseheparinat führt zu stabilisierten Lösungen inüblichen Perfusionsmedien, wie in den Lösungen des Glukoseserums von 5 #» wie sich aus Vergleichsversuchen ergibt, die unten aufgeführt sind.

Man vergleicht die Änderungen der Aktivität in Abhängigkeit von der Zeit bei einer Temperatur von 22° C, und zwar einerseits von Uroicinaseheparinatlösungen und andererseits von Urokinase im Glukoseserum von 5 #. ■

1	Urokinase im Glukoseserum von 5 #J Gehalte in CTA- Einheiten	Verlust	Urokinaseheparinat im Glukoseserum von 5 #ϊ Gehalte in CTA- Einheiten	Verlust %
Zu Beginn	250	—	300	_.
Nach 2 h	175	30	250	16,6
Nach 4h30ra	180	30	250	16,6
Nach 5h3Om	. 175	30	250	16,6
Nach 24h	150	40	250	16,6
Nach 48h	120	52	250	16,6

Die Betrachtung der in der vorstehenden Tabelle zusammengefaßten Ergebnisse zeigt deutlich, daß sich die Aktivität des Urokinaseheparinats in einer Lösung, wie sie für intravenöse Perfusionen benutzt wird, sehr schnell stabilisiert, während sich die vergleichbaren Lösungen von Urokinase allein fortlaufend zersetzen.

3098U/108 8-

_ 4-3 - ■

(B) Pharmakologische Eigenschaften des Urokinaseheparinats

(1) Einwirkung auf ffibrinklümpchen

Gemäß der Technik von E. VAIREL und R. COURBIER in "Die Bedeutung der Arterienwand in der Physiologie der Fibrinolyse"* ("R6le de la paroi arterielle dans la Physiologie de la fibrinolyse") in "Die Bedeutung der Arterienwand in der Atherogenese" ("RoIe de la paroi arterielle dans "l'atherogenese"), Edition CNRS, Paris 1967, Teil II, Seiten 561 bis 569, wurde eine Obstruktion mit intraarteriellem Klümpchen bei zwanzig Hunden hervorgerufen.

Nach arteriographischer Kontrolle wurde die Hälfte dieser Tiere mit einer Urokinaseheparinatlösung mit einem Gehalt von 50 000 CTA-Einheiten mittels intravenöser Perfusion während 90 Minuten behandelt4 die nichtbehandelten Tiere dienten zur Kontrolle.

Am Ende der Perfusion wurde eine Kontrollarteriographie durchgeführt, wonach eine Arteriotomie des Abschnitts der verschlossenen Arterie durchgeführt wurde.

Bei den behandelten Tieren stellte man eine vollständige Lyse des Klümpchens fest, welches -die Arterie verschlossen hatte. Dagegen zeigte bei den Kontrolltieren die Kontrollarteriographie, danach die Arteriotomie,die Fortdauer des Arterienverschlusses.

(2) Pyrogene Substanzen

Das Urokinaseheparinat, das ausgehend von der gereinigten und depyrogenisierten Urokinase gemäß der Erfindung erhalten worden war, ist seinerseits innerhalb der Normen, die in den Beispielen 5 und 6 angewendet worden sind, frei von pyrogenen Substanzen.

(3) Vasopressive Substanzen

Das Urokinaseheparinat, insbesondere dasjenige, welches aus den vorerwähnten depyrogenisierten Urokinasen erhalten worden war, ist frei von vasopressiven Substanzen.

30981 W 1Ü88

Die Untersuchung wurde in der Weise durchgeführt, daß man eine Injektion von Urokinaseheparinat bei sechs männlichen Hunden der Rasse Beagle_t die ungefähr 8 Monate alt waren und 9 bis kg Gewicht besaßen, durchführte, und zwar im Verhältnis von 20 000 UCTA/kg; diese Hunde waren einer Anästhesie durch eine Injektion von Penthotal 1 1/4- Stunde vor der Verabreichung des Urokinaseheparinats unterworfen worden. Die Messungen des arteriellen Drucks wurden fortlaufend während einer Dauer von 300 Minuten nach der Injektion durchgeführt. Man fand keine Veränderungen des arteriellen Druckes als diejenigen, die man ebenfalls bei 4 Hunden beobachtete, sofern man diesen selben Hunden die gleiche Dosis Penthotal injizierte, Ohne daß später e'ine Injektion von Urokinaseheparinat stattfand. Der Komplex gemäß der Erfindung wurde daher ausgezeichnet und vollkommen ver-

tragen.

Eine Untersuchung, die am Kaninchen durchgeführt wurde, und sich auf 4 Tiere erstreckte, die 100 000 UCTAAg in fünf Injektionen mit 50 000 Einheiten alle 15 Minuten erhielten, zeigte die gleiche Verträglichkeit des Produkts· ,

Thromboplastine

Mit Hilfe eines Thfombelastogrammes wurde bei mehreren Tieren nachgeprüft, daß die intravenöse Injektion von beträchtlichen Dosen von Heparin-Urokinase beim Kaninchen (100.000 UCTAAg/ Stunde) lediglich eine Hypogerinnbarkeit bzw. Hypocoagulabilität aufgrund des Heparins zur Folge hatte, ohne daß sich ein Rückfall nach der Neutralisierung des Antikoagulierungs- bzw. -gerinnungsmittels durch Prptaminsulfat oder nach seiner spontanen Entfernung manifestierte.

(C) Klinische Untersuchungen

(1) Die Verabreichung der Urokinase im Zustand des Komplexes mit Heparin wird wegen .ihrer viel größeren Stabilität gegenüber der nicht im Komplex befindlichen Urokinase besonders im Perfusionsmedium erleichtert, wie die nachstehenden klinischen

30981 Ul 1 088

-45- ~ 22A6969

Untersuchungen rait Urokinaseheparinatpräparaten in Lösung in einem Glukoseserum zeigen, die an Kranken ausgeführt, worden sind, welche unterschiedliche KreislaufSchwierigkeiten hatten, die zur Bildung von obliteranten Klümpchen führen. Das Urokinaseheparinat wurde durch intravenöse Perfusion·während 24 Stunden mit einer Dosis von 50 000 bis 100 000 CTA-Einheiten/h verabreicht .

Die Beobachtungen und Ergebnisse, die erhalten wurden, sind nachstehend aufgeführt:

(a) Bei einem Kranken, der seit langer Zeit von einer Arterienentzündung befallen war und dessen Aortagabel von einer Dacronprothese gebildet wurde, führte diese Behandlung dazu, daß es möglich war, bei zwei Wiederholungen, in 8 bis 12 Stunden, die Lyse der Klümpchen zu erreichen, welche die Prothese ^ zu-setzen bzw. obstruieren. _N

Cb) Bei dinem Kranken, der mit einer, ihn ans Bett fesselnden . Thrombose befallen war, und der durch Perfusion während einer Stunde behandelt wurde, und zwar mit einer Lösung von Urokinaseheparinat mit einem Gehalt von 100 000 CTA-Einheiten, und danach während der folgenden Stunden mit einer Lösung mit einem Gehalt von 50 000 CTArEinheiten, konnte durch ophtalmoskopische Kontrolle die Lyse der Thrombose 8 Stunden nach Beginn der Behandlung festgestellt werden.

(c) Bei einem Kranken, der sich in einem allgemein mißlichen Zustand befand, dessen phlebographische Untersuchung ein schweres Phlegma alba dolens des unteren Gliedes erkennen ließ, konnte man feststellen, daß durch Verabreichung von 50 000 OTA-Einheiten/h von Urokinaseheparinat eine vollständige Regression bzw. ein vollständiger Rückgang des Phlegma alba dolena in 18 Stunden stattfand.

Eine phlebographische Untersuchung^ die nach 48 Stunden durch-

3098U/1SG3 '

geführt wurde, konnte zu der Peststellung führen« daß der Thrombus, welcher die tiefliegende Schenkelvene von ihrem kniekehlenbezüglichen Ursprung bis zu ihrem zum Darmbein gehörigen Ende verstopfte, lysiert worden war.

Bei der Untersuchung dieser Ergebnisse zeigt sich, daß das Urokinaseheparinat ein bemerkenswertes Thrombosemittel ist, das innerhalb relativ kurzer Fristen zur Befreiung eines arteriellen oder venösen Abschnitts führt, der durch Klümpchen versperrt ist.

In allen hier beschriebenenVersuchen war die Stabilität des in Lösung gebrachten Urokinaseheparinats derart, daß es in keinem Falle erforderlich war, das Urokinaseperfusionsmedium zu regenerieren, und zwar während der gesamten Dauer der Perfusionsvorgänge.

Der Nutzen des erfindungsgemäßen Komplexes wird, noch erhöht durch die Tatsache, daß er vom Organismus gut toleriert wird, daß seine Anwendung·keine Nachwirkungen auf die Gerinnungsfaktoren, des umlaufendes Blutes hat und daß er keinen hämorrhagischen Unfall oder Zwischenfall hervorruft.

(2) Die vorhergehenden Ergebnisse sind mit hochgereinigten Urokinasepräparaten erhalten worden, die jedoch keiner Depyrogenisierungsbehandlung nach der Erfindung unterworfen worden waren.

Die nachfolgende Darstellung betrifft klinische Beobachtungen, die mit Urokinasepräparaten im Zustand gereinigten und gleichzeitig depyrogenisierten Urokinaseheparinats realisiert wurden. Die Verwendung dieser Präparate hat zu den unten aufgeführten beachtlichen Ergebnissen geführt, und zwar unter Abwesenheit jeder unerwünschten Sekundärwirkung.

(a) Die Verabreichung von Urokinaaeheparinat, das frei von pyrogenen Substanzen war, an 10 Kranke, die mehr oder weniger fort-

3Q88U/1ÖS8

geschrittene Syndrome des Herzmuskelinfarkts aufwiesen, mit wiederholten Dosen von 75 000 bis 150 000 CTA-Einheiten hat in allen fällen zu einer schnellen und günstigen Entwicklung der beobachteten Syndrome seit den ersten Tagen der Behandlung geführt.

Nachstehend werden die Grundlinien· einer dieser 10 klinischen Beobachtungen wiedergegeben, die besonders typisch bezüglich der Wirkung von Urokinaseheparinat sind, das frei.von pyrogenen Substanzen ist.

B.... Jean Louis, 44 Jahre, Erzieher nicht angepaßter Kinder, ist wegen eines prämonitorischen Syndroms eines Herzmuskelinfarkts in die Klinik eingewiesen worden. Er leidet seit einer Woche an einer anginösen Krankheit, begleitet von einer Hyperthermie. Das Elektrokardiogramm enthüllt eine umfassende subepikardische Ischämie. v.

Er erhält durch Perfusion eine Behandlung auf der Grundlage von Urokinaseheparinat im Verhältnis von' 75 000 CTA-Einheiten pro Stunde während 24· Stunden, das heißt insgesamt 1.850.000 CTA-Einheiten, Heparin (30 mg alle zwei Stunden) und Corticosteroide, die im Handel unter der Bezeichnung SOLUDECADRON erhältlich sind.

Man beobachtet auf klinischer Ebene eine Regression der Hyperthermie und ein Verschwinden des anginösen Syndroms seit der vierten Stunde der Behandlung. Die Elektrokardiographie läßt eine schnelle günstige Entwicklung im Verlauf von 24- Stunden der Behandlung erkennen. Am Ende von 8 Tagen ist das Elektrokardiogramm zum ersten Mal praktisch normal.

Auf biologischer Ebene beobachtet man parallel eine schnelle Verminderung des Plasminogenspiegels, was eine rasche Umwandlung der Plasminogene in Piasmine bedeutet; außerdem ist eine schnelle Vermehrung der Zersetzungsprodukte des Fibrins zu beobachten, was sachlich die Lysis des Fibrins der pathologischen

3 098U/1G8 8

Klümpchen "bedeutet.

Die Nachwirkungen, die beim Patienten nach seiner Konvaleszenz übrigbleiben, sind so gering, daß er seine Arbeit wieder aufnehmen kann.

Es werden nachstehend noch die Ergebnisse wiedergegeben, welche bei einer Behandlung von 15 an einem Herzmuskelinfarkt leidenden Patienten erhalten worden sind.

Generalien und Verfahren:

Die Untersuchung der therapeutischen Wirkung des Urokinaseheparinats bei einer Gruppe von 1$ Kranken wurde in der folgenden Weise durchgeführt:

(a) Wahl der Kranken: Der Infarkt datiert wenigstens seit

48 Stunden.

(b) Kriterien der Bewertung der therapeutischen Aktivität:

- Klinische Entwicklung: Verschwinden des Schmerzes;

Wiederbeginn bzw. -aufnahme der physischen Aktivität; Ableben in mittlerer Frist (30 Tage).

- Elektrokardiographische Entwicklung

- Entwicklung der Tri-Scintigraphie

- Berechnung bzw. Schätzung der biologischen Aktivität der Urokinase, gehandhabt nach dem festgehaltenen Schema:

Berechnung bzw. Schätzung des Plasminogenspiegels;

Berechnung bzw. Schätzung des Pibrinogenspiegels ;

Berechnung bzw. Schätzung der Produkte der Lyse;

Berechnung bzw. Schätzung der Toleranz:

- Blutdruck

- Temperatur

- klinische und biologische Zeichen, die der

30981 4/1088

Urokinase zugeschrieben werden können, mit Ausnahme derjenigen, die mit ihrer spezifischen Aktivität verknüpft sind.

(c) Therapeutisches Schema;

r Urokinaseheparinat: 75 000 UCTA/Stunde während 24 Stunden, verabreicht durch Perfusion. Das Urokinase- ' heparinat wird in gelöster isotonischer Glukose verdünnt . . -

- Heparin: Verabreicht auf subkutanem Wege mit einer Behandlungsweise bzw. -Vorschrift, die in Abhängigkeit vom Zustand des Kranken passend gewählt war, um eine

wirksame und stabile Hypogerinnbarkeit bzw. -koagulabilität zu erreichen (Howellzeit des Kranken doppelt derjenigen der Kontrollperson ).

Ergebnisse: ^

(a) 15 behandelte Kranke: 14 Männer, 1 Frau.

Alter zwischen 41 und 74- Jahre.

(b) Globale klinische Entwicklung: ■

. Verschwinden des Schmerzes zwischen 1 h und 4 h nach

Anfang der Behandlung, mit Ausnahme von einem Pail. . Zeit des Krankenhausaufenthälts: Zwischen 23 und 36

Tagen.
. Wiederbeginn der Passivaktivität im Bett: Zwischen 3

und 14 Tagen.
.-Mobilisierung und Aufstehen bzw. Erheben: Zwischen 9

und 23 Tagen.

Diese Gruppe der Kranken ist repräsentativ. Die Zeiten des Verschwindens des Schmerzes, der Mobilisierung und des Erhebens. bzw. Aufstehens sind kurzer als diejenigen, die klassischerweise bei einer Gruppe von Herzmuskelinfarktkranken beobachtet wurden, welche nicht mit Urokinase behandelt worden sind.

In dieser Gruppe wurde kein Sterbefall beobachtet? In einer

'309814/1088

Gruppe von vergleichbaren Kranken - nicht mit Urokinase behandelt - beträgt die Sterblichkeit 26 %\ aie ist 18 SIi, wenn man ein anderes thrombolytisches Medikament verabreicht (Streptokinase).

Es wurde kein hämorrhagischer Zwischen- bzw. Unfall beobachtet, die Verträglichkeit der Urokinase ist vollkommen; es wurde keine Veränderung der Temperatur, keine Veränderung des Blutdrucks, keinerlei klinische oder biologische Verändexuag,.die'dieseit Medikament zuzuschreiben ist, beobachtet, abgesehen von denjenigen, die unmittelbar seiner spezifischen Aktivität zuzuschreiben sind.

- Globale elektrokardiORraphische Entwicklung;

Normale oder praktisch normale elektrokardiographische Aufzeichnung in 6 Fällen. Mittlere Zeit: 22 Tage. Nachwirkungszustand der Ischämie-Läsion in 3 fällen (aber in 2 Fällen liegt eine kammerbezügliche bzw. ventrikuläre Hohlorganerweiterung bzw, Elctasie voi»_f" die bereits vor der Behandlung vorhanden war)·

. 6 Fälle von Nekrose und Ischämie-Syndromi

ΜΜΜΜΟΙΜΒΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΗΗΠΙΒΙΜΙ-Μ«·-·*··«« I HUIJ I ■ HlKj(MMIiI ■■ "ΊΙΙΙ

Normale oder praktisch normale elektrokardiographische Aufzeichnung mit vollständiger Regression der Nekrose in 3 Fällen. Mittlere Zeit: 26 Tage. Beachtliche Regression der Nekrose in 3 Fällen (in einem Fall war die kammerbezügliche Hohlgefäßerweiterung bzw. ventrikuläre Ektasie vorher bereits vorhanden).

Diese elektrokardiographische Entwicklung verläuft schneller als diejenige, die man üblicherweise in einer gleichartigen Gruppe von nicht mit Urokinase behandelten Herzmuskelinfarktkranken beobachtet.

3093U/1088

- Scintigraphische Entwicklung:

• Jedesmal wenn die Herzscintigraphie (Seintigraphie des Herzmuskels, Hohlraumscintigraphie und Coronarscintigraphie^ das heißt also eine dreifache oder TRI-Scintigraphie ausgeführt worden ist - vor und nach der Behandlung - beispielsweise 21 Tage nach der ersten Untersuchung, war sie genau parallel zum Elektrokardiogramm (insbesondere wurden die vor der Behandlung vorliegenden ventrikulären Ektasien objektiviert, desgleichen die Regression oder das Verschwinden der Nekrose, wie auch die Regression oder das Verschwinden des Ischämie-Syndroms).

- Biologische Berechnung bzw. Schätzung:

Anfänglicher Spiegel bzw. Gehalt zwischen 90 und

120 #.

Maximaler beobachteter Sturz bzw«, Abfall: Zwischen

4-3 und 11 #.

Der S-fcurz bzw. Abfall ist bedeutsam bzw«, prägnant.

Anfänglicher Spiegel bzw. Gehalt zwischen 10,80 g/l und 1,96 g/l.

Minimaler Gehalt, der unter der Behandlung beobachtet worden ist: Zwischen 6,36 g/l und 1,85 g/l· Die beobachteten Veränderungen sind nicht bedeutend bzw. kennzeichnend.

- Anfänglicher Spiegel bzw. Gehalt zwischen 0,4yu und 12,80/u.

- Gehalt, der- unter der Behandlung beobachtet worden ist: zwischen 320/u und 2 660/u^

Die beobachteten Veränderungen sind bedeutend bzw. kennzeichnend.

Folgerung:

In dieser Gruppe der 15 Herzmuskelinfarktkranken₉ die mit Uroki

309814/1088

naseheparinat mit einer Dosis von 75 000 UCTA/Stunde während 24 Stunden behandelt worden sind, kann man unter Vergleich mit einer Gruppe von vergleichbaren, nicht behandelten Kranken feststellen, daß folgendes erreicht worden ist:

- In 14 unter 15 Fällen eine schnelle Regression des Schmerzes ohne Wiederbeginn des anginösen Syndroms;

- eine frühzeitigere Wiederkehr sowohl der passiven als auch der aktiven physischen Aktivität;

- keinen Todesfall, keinen hämorrhagisehen Zwischen- bzw. Unfall, die Verträglichkeit war vollkommen;

- die elektrokardiographische Entwicklung, bestätigt durch die scintigraphische Entwicklung, ist viel kurzer als diejenige die in der Vergleichsgruppe beobachtet worden ist.

Wie sich aus den vorstehenden klinischen Beobachtungen ergibt, ist das Urokinaseheparinat also ein fibrinolytisches und thrombolytisches Medikament von großem Wert, und zwar für den Menschen wie auch für die Tiere.

Wenn auch in den vorstehenden Beispielen das Urokinaseheparinat durch endovenöse Perfusion verabreicht worden ist, kann man auch auf andere Perfusionsarten zurückgreifen, wie beispielsweise auf Perfusionen in situ, insbesondere solche intrapleuraler Art.

Die Behandlungs- bzw. Verabreichungsvorschriften sollen dem Fall Jedes Patienten angepaßt sein. Sie sehen im allgemeinen Dosen vor, die in einem Bereich von 50 000 bis 150 000, vorzugsweise 50 000 bis 100 000 UCTA/Stunde, während 24 Stunden liegen.

Das Urokinaseheparinat kann in Lösung in jedem für den Organismus annehmbaren Perfusionsmedium vorabreicht werden, das mit

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der Urokinase verträglich ist, mit dem Heparin keinen Niederschlag bildet und frei von mineralischen Salzen ist.. Ein bevorzugtes Perfusionsmedium ist das isotonische Glukoseserum.

Das Urokinaseheparinat ist in diesem Medium in allen Verdünnungen stabil. An den Beendigungen der Behandlung wird man solche Verdünnungen wählen, welche die Verabreichung der genannten Dosen erlauben, ohne daß die Perfusionsvolumina die vom Organismus vertragenen Werte überschreiten, jedoch sollen diese Volumina ausreichend sein, daß man eine fortlaufende Perfusion "Tropfen auf Tropfen" verwirklichen kann. Wenn das Perfusionsmedium von einem isotonischen Glukoseserura gebildet wird, dann wählt man vorteilhafterweise eine Verdünnung, welche die Verabreichung der gewählten Urokinaseheparinatdosen in einem Verhältnis von etwa 250 ml Lösung/6 Stunden gestattet, beispielsweise Verdünnungen von etwa 300 000 bis 900 000, vorzugsweise 300 000 bis 600 000 UCTA an Urokinase/250 ml. -

Die in Mikrosiemens im Rahmen der Beschreibung und der Ansprüche angegebenen Werte beziehen sich auf den Zentimeter., sind also als Mikrosiemens/cm zu lesen. ^;

3 098U/1088

Claims (28)

1. PATENTANSPRÜCHE

   /Iy Verfahren zur Herstellung einer mit Urokinase angereicherten Lösung aus einer Ausgangslösung von Rohurokinase, insbesondere menschlichen Ursprungs, bei dem man eine Chromatographie, insbesondere eine Ausschließungschromatographie, vornimmt, indem die Ausgangslösung mit einem Diäthylaminoäthylzelluloseharz in Kontakt gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß man, bevor die Lösung in Kontakt mit dem Harz gebracht wird, ihren pH auf einen Wert zwischen 4- und 6 und ihre Leitfähigkeit auf einen Wert zwischen 15 000 und 25 000 Mikrosiemens einstellt und daß man das abströmende Mittel bzw. den Abgang auffängt.
2. 2. Verfahren zur Herstellung einer mit Urokinase angereicherten Lösung aus einer Ausgangslösung von Rohurokinase, insbesondere menschlichen Ursprungs, bei dem man eine Chromatographie, insbesondere eine Ausschließungschromatographie, vornimmt, indem die Ausgangslösung mit einem Diäthylaminoäthylzelluloseharz in Kontakt gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß man, bevor die Lösung mit dem Harz in Kontakt gebracht wird, ihren pH auf einen Wert zwischen 6 und 7 und ihre Leitfähigkeit auf einen Wert von wenigstens 15 000 Mikrosieraens einstellt; daß das Gewicht des in der Chromatographie, insbesondere Ausschließungschromätographie, verwendeten Harzes relativ zur Urokinaseaktivität der Lösung auf einen Wert eingestellt wird, der genügend hoch ist, daß man ein Zurückhalten der Eiweißstoffe auf dem Harz unter den vorstehenden Bedingungen der Leitfähigkeit und des pH wahrnehmen kann, wobei dieser Wert jedoch nicht denjenigen Wert überschreitet, bei dem man außerdem ein nicht vernachlässigbares Zurückhalten der Urokinase auf dem Harz wahrnimmt; und daß man den Abgang bzw. das abströmende Mittel auffängt.

   3098U/1Q88
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Leitfähigkeit der Lösung, bevor man diese mit dem Harz in Kontakt bringt, auf einen Wert zwischen 15 000 und 18 000 Mi· krosiemens eingestellt wird; und daß man, nachdem man ^l . diese Lösung mit dem Harz in Kontakt gebracht hat, ihre Verdünnung in aufeinanderfolgenden Schritten vornimmt, bis man eine Suspension erhält, deren Leitfähigkeit in der Größenordnung von 9 COO Mikrosiemens ist.
4. 4·. Verfahren zur Herstellung einer mit Urokinase angereicherten Lösung aus einer Ausgangslösung von Rohurokinase, insbesondere menschlichen Ursprungs, bei dem man eine Chromatographie, insbesondere eine Ausschließungschromatographie, vornimmt, indem die Ausgangslösung mit einem Diäthylaminoäthylzelluloseharz in Kontakt gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß . bevor die Lösung in Kontakt mit dem Harz gebracht wird, ihr pH auf einen Wert zwischen 4 und 6 und ihre Leitfähigkeit auf einen Wert zwischen 15 000 und 25 000 Mikrosiemens eingestellt wird und daß man den Abgang auffängt und das Harz wäscht; daß man eine zweite Chromatographie, insbesondere Ausschließungschromatographie, durchführt, indem man den Abgang bzw. das abströmende Mittel und die vereinigten Waschungen bzw. Waschlösungen, die man am Schluß der ersten- Chromatographie, insbesondere Ausschließungschromatographie, erhalten hat, nach einer Einstellung des pH der erhaltenen Lösung auf einen Wert zwischen 6 und 7 und ihrer·Leitfähigkeit auf einen Wert von wenigstens 15 000 Mikrosiemens mit einem Diäthylaminozelluloseharz in Kontakt bringt, wobei das Gewicht des in der zweiten Chromatographie, insbesondere Ausschließungschromatographie, verwendeten Harzes vorher relativ zur Urokinaseaktivität der Lösung auf einen Wert eingestellt worden ist, der genügend hoch ist, daß man ein Zurückhalten der Eiweißstoffe auf dem Harz unter den vorstehenden Bedingungen der Leitfähigkeit und des pH wahrnehmen kann, wobei dieser Wert jedoch nicht denjenigen Wert überschreitet, bei dem man außerdem ein nicht vernach-

   3098U/.1088

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   lässigbares Zurückhalten der Urokinase auf dem Harz wahrnimmt ; und daß man eine Verdünnung des Mediums in aufeinanderfolgenden Schritten vornimmt, bis man eine Suspension erhält, deren Leitfähigkeit in der Größenordnung von 9 000 Mikrosiemens liegt; und daß man den Abgang bzw. das abströmende Mittel auffängt.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4_t dadurch gekennzeichnet, daß jede der aufeinanderfolgenden Verdünnungen mit einer Wassermenge durchgeführt wird, die geeignet ist, eine Herabsetzung der Leitfähigkeit des Mediums um einen Wert in der Größenordnung von 1. 000 Mikrosiemens hervorzurufen.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5». dadurch gekennzeichnet, daß in der zweiten Chromatographie, insbesondere Ausschließungschromatographie, das Verhältnis des Gewichts des verwendeten Harzes zur Urokinaseaktivxtat der benutzten Lösung zwischen etwa 30 und etwa 60 g trockenen Harzes pro 10 Millionen CTA-Einheiten liegt. ' ·
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verhältnis zwischen etwa 40 und etwa 53 6 trockenen Harzes pro*10 Millionen CTA-Einheiten liegt.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4j 5i 6 und 7i dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des trockenen Harzes, die in der ersten Chromatographie, insbesondere Ausschließungschromatographie, verwendet wird, zwischen etwa 15 g und etwa 40 g pro 14 Millionen CTA-Einheiten der Urokinase liegt.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die anfänglich behandelten Lösungen Ammoniurnsulfat enthalten und daß man ihre Leitfähigkeit auf den geforderten Wert einstellt, indem man auf die Konzentration dieses Salzes dieser Lösungen einwirkt.

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10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4- bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Chromatographie, insbesondere Aus- _ Schließungschromatographie, mit der Lösung vorgenommen wird, die sich aus der Vereinigung des Abgangs bzw. des abströmenden Mediums und der Waschungen bzw. Waschlösungen ergibt, die man am Schluß der ersten Chromatographie, insbesondere

    . Ausschließungschromatographie, erhalt, deren pH vorher auf einen Wert zwischen 6,6 und 6,8 eingestellt worden ist.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man einerseits sowie vor der ersten Chromatographie, insbeson-, dere Ausschließungschromatographie, den pH der Ausgangslösung auf einen Wert in der Größenordnung von 4·, 5 und ihre Leitfähigkeit auf einen Wert in der Größenordnung von 22 Mikrosiemens einstellt; und daß man andererseits sowie vor der zweiten Chromatographie, insbesondere Ausschließungschromatographie, den pH der Lösung, die ihr unterworfen wird und die sich aus dem Abgang bzw. dem abströmenden Medium und den Waschungen des Harzes bzw. den Waschlösungen, auf · dem die erste Chromatographie, insbesondere Ausschließungschromatographie, durchgeführt worden ist, ergibt, auf einen Wert in der Größenordnung von 6,7 bis 7 und ihre Leitfähigkeit auf einen Wert in der Größenordnung von'15 000 Mikrosiemens einstellt, wobei diese Leitfähigkeit nachher im Verlauf des Kontaktes der Lösung jnit dem Harz während der zweiten Chromatographie, insbesondere Ausschließungschromatographie., mit Wasser bis auf 9 000 Mikrosiemens herabgesetzt wird; und daß man den Abgang auffängt.
12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangslösung der Rohurokinase, welche diesen Chromatographieschritten, insbesondere Ausschließungschromatographieschritten, unterworfen wird, aus menschlichem Urin durch Adsorption derselben bei einem pH von etwa 5,6 auf einemPiltrierhilfsnittelvorzugsweise einer Kieselgurbaw. Infusorienerde, insbesondere einer solchen_s die komraer-

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    ziell durch die Gesellschaft bzw. Societe John Mansville unter der Bezeichnung "Hyflosupercel" vertrieben wird, extrahiert und in gepuffertem Medium bei einem pH von etwa 7,2 eluiert wird, letzteres durch Rückgewinnung des Filtrats, eventuelle Ausscheidung von virusalen Verunreinigungen in leicht saurem Medium bei einem pH von etwa 6,25 und unter Erwärmung auf 60°· C, Abkühlung und Abtrennung des festen Restes bzw. Rückstandes durch Zentrifugieren, Bückgewinnung der Lösung, Ansäuerung derselben auf einen pH .von etwa 4,2 und durch Bildung eines Niederschlags durch Zufügung von Ammoniumsulfat, Lösung des Niederschlags in Glucoselösung und Dialyse zur Herstellung der Ausgangslösung von Rohurokinase.
13. 13. Verfahren zur Reinigung von Eiweißsubstanz mit biologischer Aktivität, wie Urokinase, die mit Fremdproteinen, insbesondere Pyrogenen, vermischt ist, dadurch gekennzeichnet, daß man eine partielle Sättigung einer wässrigen Lösung dieser _%Eiweißsubstanz mit einem Proteinpräzipitationsaiittel erzeugt, und zwar bis zu einem Grade, der eine Funktion der Anfangskonzentration der Proteinlösung ist, derart, daß diese partielle Sättigung nur die Ausscheidung des einen Teils der in der Ausgangslösung enthaltenen Proteine hervorruft, wobei dieser Teil genügend herabgesetzt wird, daß sein Gehalt an der Eiweißsubstanz mit biologischer Aktivität in geringen vorbestimmten Proportionen bzw. gegebenen Mengen gehalten wird, sofern er nicht praktisch vernachlässigbar ist; und daß man den Rest bzw. Rückstand aufnimmt.
14. 14. Verfahren zur Reinigung von Urokinase nach Anspruch 13, wobei als Prazipitationsmittel Ammoniumsulfat verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Sättigung der Losung, welche die zu reinigende Urokinase enthält, nicht einen Wert überschreitet, bei dem der gebildete Niederschlag mehr als 5 % der Urokinase-Gesamtaktivität der Ausgangslösung mitreißt-

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15. 15- Verfahren zur Reinigung nach Anspruch 14-, wobei die Proteinkonzentration der Lösung, welche die zu reinigende Urokinase' enthalt, zwischen 1,5 und 3 mg/ml beträgt, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH der Lösung auf einen Wert zwischen 5 und 4,5 und die Leitfähigkeit dieser Lösung auf einen Wert zwischen 15 000 und 25 OQO Mikrosiemens einstellt; daß man den Betrag der Ammoniumsulfatkonzentration bestimmt, der unter Berücksichtigung der Proteinlösung zur Bildung eines Niederschlags in dieser Lösung erforderlich ist, welcher 2 bis 5 # der Urokinaseaktivität enthält;- daß man zu dieser Lösung die Menge an Ammoniumsulfat zugibt, die erforderlich ist, um die so bestimmte Konzentration zu erhalten; und daß man den Rest bzw. Rückstand aufnimmt.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration der Lösung an Ammoniumsulfat auf einen Betrag einstellt, der einem Sättigungsgrad der Lösung von 0,5 entspricht.
17. 17- Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangsurokinase ausgehend vom menschlichen Urin durch Anwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche Λ bis 12 gewonnen worden ist.
18. 18. Verfahren zur Herstellung von Ürokinaseheparinatγ dadurch gekennzeichnet, daß man eine Urokinaselösung mit einer Heparinlösung zur Reaktion bringt.
19. 19- Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einem pH zwischen 1 und 5 bewirkt wird.
20. 20. Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einem pH der Größenordnung 4·,2 bewirkt wird.
21. 21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Urokinase, welche in die Reaktion einge-

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    bracht wird, eine durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 gereinigte Urokinase ist.
22. 22. Komplex von Heparin und Urokinase.
23. 23. Komplex nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß er Relativaktivitäteh von 50 000 bis 100 000 OTA-Einheiten an Urokinase auf 100 U.I von Heparin aufweist.
24. 24. Komplex nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß er

    spezifische Aktivitäten an Urokinase und an Heparin aufweist, die 32 000 bis 62 000 CTA-Einheiten pro mg bzw. 27,1 bis 60,7U;I/mg betragen.
25. 25. Komplex nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß er spezifische Aktivitäten an Urokinase und an Heparin in der Größenordnung von 62 500 CTA-Einheiten pro mg bzw. 100 Ü.I/mg aufweist.
26. 26. Lösung für die Perfusion, dadurch gekennzeichnet, daß sie Urokinaseheparinat in Verbindung mit einer isotonischen Perfusionslösung enthält, die für den Organismus annehmbar und mit der Urokinase verträglich ist bzw. zusammen besteht sowie nicht bei bzw. mit dem Heparin ausfällt und von mineralischen Salzen frei ist·
27. 27* Lösung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die isotonische Lösung von einem isotonischen Glukoseserum gebildet wird.
28. 28. Lösung nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Verdünnung in der Größenordnung von 300 000 bis 900 000 CTA-Einheiten an Urokinase pro 250 ml liegt.

    29· Lösung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Verdünnung in der Größenordnung von 300 000 bis 600 000 0ΪΑ-Einheiten an Urokinase pro 250 ml liegt.

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