DE2428248B2

DE2428248B2 - Verfahren zur herstellung von pyrogenfreier urokinase

Info

Publication number: DE2428248B2
Application number: DE19742428248
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: SERNA AG GLARUS (SCHWEIZ)
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1973-07-24
Filing date: 1974-06-12
Publication date: 1978-01-12
Also published as: FR2238712A1; DE2428248C3; JPS5069220A; GB1418286A; DE2428248A1; FR2238712B1; BE818006A; IT1034064B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung ju von pyrogenfreier Urokinase durch Behandlung einer verunreinigten Urokinaselösung mit einem Celluloseanionenaustauscher.

Es ist eine Anzahl von Verfahren zur Isolierung von Urokinase aus menschlichem Harn und zur Reinigung Vi und Konzentration zu einem Produkt von hoher Wirksamkeit bekannt. Es ist jedoch bisher noch kein Verfahren beschrieben, nach dem Urokinase in einfacher, wirksamer und wirtschaftlicher Weise frei von Pyrogenen gewonnen werden kann. -to

Es sind bereits verschiedene Verfahren beschrieben worden, die eine große Zahl umständlicher Reaktionsstufen zur Reinigung von Urokinase umfassen, wodurch nicht nur hochwirksame, sondern auch pyrogenfreie Produkte erhalten worden sind. Im allgemeinen können die eigentlichen Reinigungs- oder Konzentrationsstufen nicht von denjenigen Stufen unterschieden werden, die speziell die Entfernung der pyrogenen Substanzen bewirken sollen. Außerdem ist festzustellen, daß die pyrogene Wirksamkeit in vielen Fällen in keiner Weise mit der Wirksamkeit eines Urokinasepräparates verbunden ist. Es wurde festgestellt, daß häufig eine Urokinase mit hoher Wirksamkeit eine hohe pyrogene Wirksamkeit aufweist. Es besteht daher Bedarf an einer Methode, die speziell auf die Entfernung von Pyrogenen aus Urokinase gerichtet ist.

In der US-PS 32 56 158 ist ein Verfahren zur Reinigung von Urokinase von Pyrogenen und Thromboplastin beschrieben, bei dem unreine Urokinase mit einem neutralen Dextrangel, das mit 6% Epichlorhydrin w) vernetzt ist, behandelt wird.

In der Dt-OS 21 43 815 wird ein Verfahren beschrieben, nach dem Urokinase von Pyrogenen befreit wird. Dieses Verfahren besteht im wesentlichen in der Adsorption an Amberlite-IRC-50-Harz, Elution der ns reinen Urokinase.

Aus der DT-OS 22 46 969 ist bereits die Reinigung einer verunreinigten Urokinaselösung, die einen pH zwischen 6 und 7 und eine Leitfähigkeit von mindestens 1500 Mikrosiemens besitzt, mit einem Celluloseanionenaustauscher bekannt Die nach dieser Druckschrift erfolgende Behandlung mit dem Celtuloseanionenaustauscher liefert aber noch kein pyrogenfreies Produkt. So rufen gereinigte Urokinasepräparate, die nach dem bekannten Verfahren durch Behandlung mit Celluloseanionenaustauscher erhalten worden sind, beim Kaninchen immer noch eine gewisse Hyperthermie hervor. Urokinasepräparate mit einem noch stärker reduzierten Gehalt an pyrogenen Substanzen können nach den Angaben der DT-OS 22 46 969 nur durch eine weitere partielle Sättigung der erhaltenen !lösung mit einem Protein-Präzipitationsmittel erhalten werden.

Demgegenüber liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und wirksames Verfahren zur Herstellung von pyrogenfreier Urokinase zur Verfügung zu stellen, bei dem ein sehr hoher Prozentsatz der anfänglichen Aktivität in dem pyrogenfreien Endprodukt wiedergewonnen wird.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von pyrogenfreier Urokinase durch Behandlung einer verunreinigten Urokinaselösung mit einem Celluloseanionenaustauscher, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein pyrogenhaltiges Urokinasepräparat mit verhältnismäßig hoher Aktivität in einem der nachstehend genannten Phosphatpuffer löst, daß man die Lösung mit einem Celluloseanionenaustauscher nach der Säulenchromatographiemethode behandelt, wobei 0,001 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6 bis 8 als Gleichgewichtspuffer, Trägerflüssigkeit und Elutionsmittel verwendet wird, und daß man die pyrogenfreie Urokinase aus der Lösung gewinnt.

Somit stellen bei speziellen Bedingungen Celluloseanionenaustauscher sehr wirksame Mittel zur Trennung der Urokinase von Pyrogenen dar. Celluloseanionenaustauscher sind Cellulosen, bei denen ein Teil der Hydroxylgruppen durch basische Gruppen ersetzt ist. Geeignete Beispiele sind Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE) und Triäthylaminoäthylcellutose (TEAE).

Im Hinblick auf die Offenbarung der CA-PS 8 80 878 muß das erfindungsgemäße Verfahren als überraschend angesehen werden, da dort festgestellt wird, daß DEAE-Cellulose zur Entfernung von Pyrogenen aus einer rohen L-Asparaginase-Lösung völlig unwirksam ist

Das erfindungsgemäße Verfahren muß auch im Hinblick auf die DT-OS 22 46 969 als überraschend angesehen werden, da nach dieser Druckschrift pyrogenfreie Produkte nur dann erhalten werden können, wenn man die mit dem Celluloseanionenaustauscher behandelte Lösung anschließend noch mit einem Protein- Präzipita tionsmittel behandelt.

Der technische Fortschritt des Gegenstandes der vorliegenden Erfindung ergibt sich daraus, daß durch Auswahl spezieller Bedingungen erfindungsgemäß eine pyrogenfreie Urokinase lediglich durch Behandlung der verunreinigten Urokinaselösung mit einem Celluloseanionenaustauscher erforderlich ist. Eine weitere Behandlung mit einem Protein-Präzipitationsmittel, wie es bei den Verfahren gemäß DT-OS 22 46 969 obgligatorisch ist, ist erfindungsgemäß nicht notwendig, so daß durch das erfindungsgemäße Verfahren die angestrebte pyrogenfreie Urokinase in einer Stufe erhalten werden kann.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung führt man die Behandlung bei einer Temperatur im

Bereich von 0 bis 10⁰C durch.

Für den mit der Chromatographie vertrauten Fachmann sind die anderen Reaktionsbedingungen klar, wie beispielsweise die Wahl der besten Durchflußgeschwindigkeit in Verbindung mit der Teilchengröße des Adsorptionsharzes, die Vorbehandlung zur Aktivierung des Harzes, die Gleichgewichtseinstellung des Harzes und der gepackten Säule mit einer Pufferlösung gemäß dem Anspruch 1 bis zum Gleichgewichsstand und so weiter. ι ο

Die äußere Form der in dem erfindungsgemäßen Verfahren als Adsorbens verwendeten Cellulose ist an sich nicht von entscheidender Bedeutung. Es wird jedoch eine fein zerteilte Form bevorzugt.

Die Celluloseanionenaustauscher werden geeigneterweise durch ihre sogenannten »Kapazitäten« näher gekennzeichnet, d. h. die Austauschkapazitäten, ausgedrückt in Milliäquivalent pro Gramm Harz. Die Kapazität eines bestimmten Celluloseanionenaustauschers wird bestimmt, indem das Harz zuerst mit NaOH in die Hydroxydform übergeführt und dann mit Salzsäure titriert wird. Die Kapazitäten der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Celluloseharz liegen im Bereich von etwa 0,2 bis 1 Milliäquivalente pro Gramm Harz.

Wie oben festgestellt, besteht die Erfindung hauptsächlich in der Entfernung der Pyrogenen aus Urokinase, obwohl ein pyrogenfreies Urokinaseprodukt mit höherer Wirksamkeit als die Ausgangsurokinase ebenfalls erhalten wird. Demgemäß wird das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise angewendet, wenn die Entfernung von Pyrogenen aus Urokinasepräparaten beliebiger Wirksamkeit erforderlich und gewünscht ist, unabhängig vom Grad der Reinheit des Ausgangsurokinasepräparates.

Im folgenden werden an Hand von Beispielen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert Die angegebenen CTA-Einheiten beziehen sich auf die Definition, die von A. J. J ο h η s ο η et al., Thromb. Diath. Haemorrag. 21, 259 (1969) angegeben ao worden ist. Die Pyrogenität wurde dabei nach dem USP-Pyrogentest (3 Kaninchen) bestimmt. Bei diesem Test genügt das untersuchte Material den Erfordernissen für die Abwesenheit von Pyrogenen, wenn kein Kaninchen einen individuellen Temperaturanstieg von 0,6°C oder mehr über die jeweilige Kontrolltemperatur zeigt und wenn die Summe der drei Temperaturanstiege nicht über 1,4° C hinausgeht

Beispiel 1

DEAE-Cellulose mit einer Austauschkapazität von 1 Milliäquivalent pro Gramm wurde in üblicher Weise aktiviert, mit 0,001 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 ins Gleichgewicht gebracht und in eine Chromatographiesäule von 3,2 cm Durchmesser und 45 cm Höhe eingefüllt 510 mg pyrogenhaltige Urokinase mit einer Wirksamkeit von 59 000 CTA/mg wurden in dem oben genannten Puffer gelöst, auf die Säule gegeben und bei 4° C unter Verwendung desselben 0,001 m Phosphatpuffers eluiert. Die Fraktion mit einer Absorption bei 280 πιμ wurde aufgefangen, gefriergetrocknet, und der Gehalt an Pyrogenen und die Wirksamkeit wurden ermittelt. Es wurden 254 mg Urokinase mit einer Wirksamkeit von 110 000 CTA/mg erhalten. Die Bestimmung der Pyrogenwirksamkeit, bestimmt nach dem USP-Pyrogen-Test bei 15 000 CTA-Einheiten/kg, ergab eine Gesamttemperaturerhöhung (3 Kaninchen) von 1,2°; 93% der ursprünglichen Aktivität wurden in dem pyrogenfreien Endprodukt wiedergewonnen.

Beispiel 2

Eine stark pyrogenhaltige Urokinase mit hoher Wirksamkeit wurde bei den Bedingungen des Beispiels 1 durch eine Chromatographiesäule mit den Abmessungen 3,2 χ 45 cm geleitet, die mit DEAE-Cellulose gefüllt war.

Die spezifische Wirksamkeit der Urokinase stieg auf 89 000 CTA/mg an. Der Pyrogentest zeigte einen Gesamttemperaturanstieg von 3,1⁰C.

Die Fraktion, die die Urokinaseaktivität enthielt, wurde sodann durch eine ähnliche Säule geleitet die mit TEAE-Cellulose gefüllt worden war und die eine Austauschkapazität von 0,5 mÄq/g hatte, wobei mit dem gleichen Puffer und bei den gleichen Bedingungen wie oben gearbeitet wurde. Es wurde gefunden, daß die gesammelte Fraktion eine Wirksamkeit von 104 000 CTA/mg hatte. Sie genügte dem US-Pyrogentest bei 15 000 CTA/kg bei einem Gesamttemperaturanstieg (3 Kaninchen) von 0,9° C.

Beispiel 3

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, außer daß der 0,001-m-Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 8 verwendet wurde. 400 mg stark pyrogenhaltige Urokinase mit einer Wirksamkeit von 30 000 CTA/r.ig wurde durch die Säule laufen gelassen, wobei 135 mg Urokinase mit einer Wirksamkeit von 88 000 CTA/mg erhalten wurde. Die aufgefangene Fraktion zeigte in dem oben beschriebenen Pyrogentest eine Gesamttemperaturerhöhung von 0,9°. Praktisch die gesamte ursprüngliche Aktivität wurde in dem pyrogenfreien Urokinaseprodukt wiedergewonnen.

Beispiel 4

Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei die Chromatographiesäule aus DEAE-Cellulose eine Austauschkapazität von 0,7 Milliäquivalent pro Gramm aufwies. Von den ursprünglichen 29 560 000 CTA-Einheiten wurden 25 380 000 Einheiten in der pyrogenfreien Urokinaseendfraktion wiedergewonnen. Die Gesamttemperaturerhöhung bestimmt an drei Kaninchen nach dem USP-Pyrogen-Test bei 15 000 CTA- Einheiten/kg betrug 0,8°.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von pyrogenfreier Urokinase durch Behandlung einer verunreinigten Urokinaselösung mit einem Celluloseanionenaustau- ^r> scher, dadurch gekennzeichnet, daß man ein pyrogenhaltiges Urokinasepräparat mit verhältnismäßig hoher Aktivität in einem der nachstehend genannten Phosphatpuffer löst, daß man die Lösung mit einem Celluloseanionenaustauscher nach der ι ο Säulenchromatographiemethode behandelt, wobei 0,001 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6 bis 8 als Gleichgewichtspuffer, Trägerflüssigkeit und Elutionsmittel verwendet wird, und daß man die pyrogenfreie Urokinase aus der Lösung gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Celluloseanionenaustauscher DEAE-Cellulose verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß man als Celluloseanionenaustauscher TEAE-Cellulose verwendet.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 10°C vornimmt.