DE2812609A1 - Verfahren zur reinigung roher urokinase - Google Patents
Verfahren zur reinigung roher urokinaseInfo
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Description
KRAUS & WEISERT
PATENTANWÄLTE 281?"
DR WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-1NG. ANNEKÄTE WElSERT DlPL-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE
IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 - TELEX O5-212156 kpatd
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TANABE SEIYAKQ CO., LTD. Osaka / Japan
Verfahren zur Reinigung roher Urokinase
809842/0637 .^.,.,^ 1h3PSctsd
2817609
Beschreibung
Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Reinigung roher Urikonase, gemäß dem eine wäßrige Lösung aus roher
Urikonase mit einer vernetzten Diäthylaminoäthyl-Agarose zur Adsorption von Pyrogenen daran behandelt wird. Der Abstrom
wird dann mit einem wasserunlöslichen, hydrophilen Polysaccharid,
das eine Gruppe der Formel
-CH2CH(OH)CH2R
enthält, in der R Sulfothio, SuIfο oder p-Sulfophenylamino
bedeutet, behandelt, und die adsorbierte Urokinase wird aus dem Polysaccharid eluiert. Gemäß dem Verfahren wird pyrogenfreie
Urokinase in hoher Reinheit als Eluat erhalten.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung
roher Urokinase. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung pyrogenfreier Urokinase mit hoher Potenz.
Urokinase ist ein Protein, das in Spurenmengen im menschlichen Urin gefunden wird. Es stimuliert die Bildung
im Blut des Blutgerinnsel auflösenden, proteolytischen Enzyms, Plasmin, und ist bei der Behandlung verschiedener Krankheiten
von Kreislaufstörungen nützlich, wie solcher, bei denen Blutgerinnsel bzw. -klümpchen in dem cardiovaskulären oder peripheren
vaskulären System auftreten.
Urikonase wurde aus menschlichem Urin durch Adsorption an Silikagel, aktivierter Diatomeenerde, Glaskügelchen, AIuminiura-magnesiumsilikat
usw. gewonnen. Die bei einer solchen Behandlung gewonnene Urokinase ist jedoch für die medizinische
Verwendung nicht zufriedenstellend, da sie noch Verunreinigungen, wie Pyrogene und Gerinnsel bewirkende Verbindungen
(z.B. Thromboplastin) enthält. Es wurden verschiedene Verfahren zur Reinigung von Urokinase vorgeschlagen. Beispiels-
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weise werden in den US-PSen 3 256 158 und 3 957 582 Verfahren zur Reinigung von Urokinase beschrieben, gemäß denen eine
wäßrige Lösung aus roher Urokinase mit einem vernetzten Dextran oder einem vernetzten Diäthylaminoäthyl-Dextran zur
Adsorption der Urokinase daran behandelt wird und die adsorbierte Urokinase mit einer Phosphatpufferlösung aus dem Dextran
eluiert wird und dann die Urokinase aus dem Eluat gewonnen wird. Es ist weiterhin bekannt, rohe Urokinase durch Behandlung
einer wäßrigen Lösung davon mit Amberlite IRC-50,
DEAE-Cellulose, Sephadex G-50 usw. zu reinigen.
Es wurde nun gefunden, daß ein wasserunlösliches, hydrophiles Polysaccharid mit einer Gruppe der Formel
-CH2CH(OH)CH2R
in der R Sulfothio, SuIfο oder p-Sulfophenylamino bedeutet,
eine spezifische Affinität für Urokinase besitzt und daß rohe Urokinase leicht durch Behandlung mit dem Polysaccharid gereinigt
werden kann. Urokinase kann an dem oben erwähnten 0-(3-subst.-2-Hydroxypropyl)-polysaccharid sehr spezifisch
und reversibel adsorbiert werden, während Pyrogene und andere Verunreinigungen daran nicht adsorbiert werden. Es wurde weiterhin
gefunden, daß eine vernetzte Diäthylaminoäthyl-Agarose Pyrogene, aber nicht Urokinase adsorbiert, und daher ist es
bei der Durchführung der Reinigung roher Urokinase bevorzugt, die rohe Urokinase mit der Agarose zu behandeln, bevor sie
in Kontakt mit dem oben erwähnten 0-(3-substc-2-Hydroxypropyl)-polysaccharid
gebracht wird.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und billiges Verfahren zur Herstellung
von Urokinase mit hoher Potenz, die von Pyrogenen und anderen Verunreinigungen frei ist, zu schaffen. Erfindungsgemäß
soll ein Verfahren zur Erzeugung von Urokinase mit höchster Reinheit aus einer rohen Urokinaselösung zur Verfugung
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:ί5Ο
ι: ;5: i-.·
gestellt v/erden, so daß die Gefahr eines pyrogenen Ansprechens eliminiert ist, wenn solche Urokinase intravenös in
einen lebenden Wirt injiziert wird.
Der Ausdruck "hydrophil", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bedeutet, daß das Polysaccharid in
Wasser benetzbar oder quellbar wird, aber im wesentlichen nicht darin löslich ist.
Erfindungsgemäß kann pyrogenfreie Urokinase in hoher
Ausbeute durch Behandlung einer wäßrigen Lösung aus roher Urokinase mit einem wasserunlöslichen, hydrophilen Polysaccharid,
das eine Gruppe der Formel
-CH2CH(OH)CH2R
enthält, in der R die oben gegebene Bedeutung besitzt, hergestellt
werden, wobei die Urokinase daran adsorbiert wird, und dann wird die adsorbierte Urokinase aus dem O-(3-subst.-2-Hydroxypropyl)-polysaccharid
eluiert.
Beispiele von 0-(3-subst.-2-Hydroxypropyl)-polysacchariden
(d.h. 3-subst.-2-Hydroxypropyläthern von Polysaccharid) , die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden
können, sind:
0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-cellulose,
0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-agarose,
0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-dextran, vernetzt mit Epi-
chlorhydrin,
0-(3-Sulfo-2-hydroxypropyl)-cellulose,
0-(3-Sulfo-2-hydroxypropyl)-agarose,
0-(3-Sulfo-2-hydroxypropyl)-dextran, vernetzt mit Epichlorhydrin,
0-[3-(p-Sulfophenylamino)-2-hydroxypropyl!-cellulose,
0-[3-(p-Sulfophenylamino)-2-hydroxypropyl]-agarose,
0-[3-(p-Sulfophenylamino)-2-hydroxypropyl!-dextran, vernetzt
mit Epichlorhydrin,
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und ähnliche Verbindungen. Geeignete erfindungsgemäße O-(3-subst.-2-Hydroxypropyl)-polysaccharide
sollten 100 bis 800/uMol, insbesondere 300 bis 650/uMol, 3-subst.-2-Hydroxypropylgruppe/g
(in getrockneter Form) Polysaccharid enthalten.
Das oben beschriebene 0-(3-subst.-2-Hydroxypropyl)-polysaccharid kann durch Umsetzung eines wasserunlöslichen,
hydrophilen Polysaccharids mit Epichlorhydrin und Umsetzung
des mit Epichlorhydrin aktivierten Polysaccharids mit Alkalimetallthiosulfat,
Alkalimetallhydrogensulfit, Alkalimetallsulfit oder Sulfanilsäure hergestellt werden. Die oben erwähnten
Reaktionen werden durch das folgende Schema dargestellt:
(1) Aktivierung des Polysaccharids:
(?) OH
ClCH2CH-CH2
J-CH2CH-CH2
(2) Synthese des 0-(3-subst.-2-Hydroxypropyl)-polysaccharids:
P J-O-CH2CH-CH2
M2S2°3 « H2°
(E)-O-CH2
CH(OH)CH
S2O3M
MHSO, (M0SO,) ^Pj-O-CH2CH(OH)CH
3 *- 3 ν
SO M
MPJ-O-CH2CH(OH)CH
worin (v)—OH ein wasserunlösliches, hydrophiles Polysaccharid
und M ein Alkalimetall bedeuten.
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"V
Die Aktivierung des Polysaccharids erfolgt entsprechend
dem in Acta Chimica Scandinavia B29, Nr. 4, Seiten 471-474
(1975)» beschriebenen Verfahren. Die Aktivierung wird bevorzugt durch Umsetzung des Polysaccharide mit Epichlorhydrin
bei einer Temperatur von 20 bis 700C, bevorzugt 40 bis 60°C,
in einem wäßrigen Lösungsmittel (z.B. einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung) durchgeführt. Geeignete Mengen an Epichlorhydrin,
die bei der Aktivierung verwendet werden können, betragen 0,05 bis 15 ml, bevorzugt 0,5 bis 10 ml/g Polysaccharid.
Die bei der oben erwähnten Umsetzung verwendeten Polysaccharide umfassen z.B. Cellulose, Agarose und ein vernetztes Dextran.
Von diesen sind Agarose und vernetztes Dextran im Handel unter dem Warenzeichen "Sepharose" bzw. "Sephadex" (Pharmacia Fine
Chemicals of Uppsla, Schweden) erhältlich. Das wie oben erhaltene,
mit Epichlorhydrin aktivierte Polysaccharid wird dann mit Alkalimetallthiosulfat (z.B. Natriumthiosulfat), Alkalimetallhydrogensulfit
(z.B. Natriumhydrogensulfit), Alkalimetallsulf it (z.B. Natriumsulfit) oder Sulfanilsäure umgesetzt.
Die Umsetzung wird bevorzugt bei einer Temperatur von 10 bis 50°C, bevorzugt 10 bis 300C, in einem wäßrigen Lösungsmittel
(z.B. Wasser, eine Pufferlösung) durchgeführt. Es ist bevorzugt,
die Umsetzung bei einem pH-Wert von 4 bis 10 durchzuführen.
Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Reinigungsstufe
kann die rohe Urokinaselösung gegebenenfalls mit vernetzter
Diäthylaminoäthyl-Agarose unter Entfernung von Pyrogenen daraus behandelt werden, bevor sie mit dem 0-(3~subst.-2-Hydroxypropyl)-polysaccharid
gebracht wird. Die vernetzte, zu diesem Zweck verwendete Diäthylaminoäthyl(d.h.DEAE)-Agarose
kann nach an sich bekannter Diäthylaminoäthylierung einer vernetzten Agarose hergestellt werden [vergl.J.Am.Chem.Soc.,
78, Seiten 751-755 (1956)]. Solche vernetzte DEAE-Agarose ist im Handel unter dem Warenzeichen "DEAE-Sepharose CL-6B"
(Pharmacia Fine Chemicals of Uppsala, Schweden) erhältlich,
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Ao
die gequollene Perlen aus einem basischen Anionenaustauschharz
enthält und eine Austauschkapazität von 13+2 mÄqu./iOO ml [1,54 + 0,24 mÄqu./g (getrocknete Form)] aufweist. Die Adsorption
der Pyrogene an der vernetzten DEAE-Agarose (d.h. vernetzter Diäthylaminoäthyl-Agarose) erfolgt leicht durch Behandeln
der wäßrigen Lösung aus roher Urokinase mit der vernetzten DEAE-Agarose. Beispielsweise wird die vernetzte DEAE-Agarose
in der wäßrigen Lösung aus roher Urokinase suspendiert, und die Suspension wird während einer ausreichenden
Zeit gerührt. Es ist bevorzugt, die vernetzte DEAE-Agarose mit einer geeigneten Pufferlösung (z.B. Phosphatpufferlösung)
vor der Adsorptionsstufe ins Gleichgewicht zu bringen. Eine wäßrige Lösung aus roher Urokinase (pH 6 bis 9), deren spezifische
elektrische Leitfähigkeit auf nicht über 15 m Mho/cm,
insbesondere 2 bis 10 m Mho/cm, eingestellt ist, wird bei dieser Stufe bevorzugt verwendet. Nachdem die Pyrogene an
der vernetzten DEAE-Agarose adsorbiert sind, wird eine wäßrige Urokinaselösung, die im wesentlichen frei von Pyrogenen ist,
durch Filtration, Zentrifugieren oder Dekantieren abgetrennt. Alternativ kann die Adsorption der Pyrogene an der vernetzten
DEAE-Agarose nach einem Säulenverfahren durchgeführt werden. Beispielsweise kann die vernetzte DEAE-Agarose in eine Säule
gepackt werden, und eine wäßrige Lösung aus roher Urokinase (deren spezifische Leitfähigkeit auf nicht über 15 m Mho/cm,
insbesondere 2 bis 10 m Mho/cm, eingestellt wurde) wird durch die Säule geleitet. Eine wäßrige Urokinaselösung, die im wesentlichen
frei von Pyrogenen ist, wird als Abstrom erhalten.
Die Reinigung einer wäßrigen Lösung aus roher Urokinase (oder der Lösung aus roher Urokinase, teilweise gereinigt
mit der vernetzten DEAE-Agarose) kann durch Behandlung der wäßrigen Lösung aus roher Urokinase mit dem 0-(3-subst.-2-Hydroxypropyl)-polysaccharid
zur Adsorption der Urokinase daran durchgeführt werden. Beispielsweise wird das 0-(3-subst,-2-Hydroxypropyl)-polysaccharid
in der wäßrigen Lösung aus roher
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Urokinase suspendiert, und die Suspension wird während einer ausreichenden Zeit gerührt. Es ist bevorzugt , das Polysaccharid
mit einer geeigneten Pufferlösung (z.B. Phosphatpufferlösung) vor der Adsorptionsstufe ins Gleichgewicht zu bringen·
Die wäßrige Lösung aus roher Urokinase (pH 3 bis 9), deren spezifische elektrische Leitfähigkeit auf nicht höher
als 15 m Mho/cm, bevorzugt 2 bis 10 m Mho/cm, eingestellt ist,
wird zu diesem Zweck bevorzugt verwendet. Wenn die wäßrige Lösung aus roher Urokinase eine spezifische elektrische Leitfähigkeit
über 15 π Mho/cm zeigt, ist es bevorzugt, die Lösung mit einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. Wasser) zu verdünnen,
so daß die spezifische elektrische Leitfähigkeit auf nicht über 15m Mho/cm eingestellt wird. Nachdem die
Urokinase an dem 0-(3-subst.-2-Hydroxypropyl)-polysaccharid adsorbiert ist, kann das die Urokinase daran adsorbiert enthaltende
Polysaccharid in an sich bekannter Weise, z.B. durch Filtrieren, Zentrifugieren oder Dekantieren, gewonnen werden,
gegebenenfalls kann es mit einer wäßrigen Lösung (pH 3 bis 9) mit einer spezifischen elektrischen Leitfähigkeit nicht über
15 m Mho/cm, insbesondere einer spezifischen elektrischen Leitfähigkeit von 1 bis 12 m Mho/cm, gewaschen werden. Durch
Waschen des O-(3~subst.-2-Hydroxypropyl)-polysaccharide werden Pyrogene und andere Verunreinigungen aus dem Polysaccharid
entfernt, während Urokinase daran adsorbiert zurückbleibt.
Die nachfolgende Eluierungsstufe wird durch Behandlung
des 0-(3-subst.~2-Hydroxypropyl)-polysaccharids mit einem
Eluierungslösungsmittel durchgeführt. Beispielsweise wird das Polysaccharid in dem Eluierungslösungsmittel suspendiert und
die Suspension wird während einer ausreichenden Zeit gerührt. Eine wäßrige Lösung (pH 3 bis 9) mit einer spezifischen elektrischen
Leitfähigkeit nicht unter 20 m Mho/cm, insbesondere mit einer spezifischen elektrischen Leitfähigkeit von 30 bis
100 m Mho/cm, wird bevorzugt als Eluierungslösungsmittel ver-
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wendet. Weiterhin sind eine Phosphatpufferlösung, eine Carbonatpufferlösung,
eine Tris(Hydroxymethyl)-aminomethan-Pufferlösung,
eine wäßrige Natriumchloridlösung u.a. als Eluierungslösungsmittel
geeignet.
Alternativ können die beiden oben erwähnten Stufen
[d.h. die Adsorption der Urokinase an dem O-(3-subst.-2~
Hydroxypropyl)-polysaccharid und die Eluierung der Urokinase aus dem Polysaccharid] nach einem Säulenverfahren durchgeführt
werden. Zum Beispiel wird das 0-(3-subst.-2-Hydroxypropyl)-polysaccharid
in die Säule gegeben. Eine wäßrige, rohe Lösung (pH 3 bis 9), deren spezifische elektrische Leitfähigkeit
auf nicht über 15 a Mho/cm, insbesondere 2 bis
10 m IOiO/cm, eingestellt ist, wird in die Säule eingeleitet.
Die Säule wird dann mit einer wäßrigen Lösung (pH 3 bis 9) mit einer spezifischen elektrischen Leitfähigkeit nicht über
15 m Mho/cm, insbesondere einer spezifischen elektrischen
Leitfähigkeit von 1 bis 12 m Mho/cm, gewaschen. Nach dem Waschen der Säule wird das oben erwähnte Eluierungslösungsmittel
durch die Säule in einer geeigneten Strömungsrate zur Freisetzung der Urokinase daraus geleitet. Eine wäßrige
Urokinaselösung wird dabei als Eluat erhalten.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigte und wiedergewonnene Urokinase besitzt eine potente Urokinaseaktivitat
und ist im wesentlichen frei von Pyrogenen.
Die folgenden Beispiele erläutern bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen. In den Beispielen wurde die
Urokinaseaktivität als "Internationale Einheiten" bestimmt, wie sie von A.J.Johnson et al, Thromb.Diath.Haemorrh.(Stuttg.),
21, 259 (1969), definiert werden. Diese Aktivität wurde ebenfalls
nach dem von J.Ploug et al, Biochim.Biophys. Acta, 24, 278 (1957), beschriebenen Fibrinplattenverfahren bestimmt.
Andererseits erfolgte die Bestimmung der Pyrogenizität gemäß
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dem in Japanese Pharmacopoeia, 9. Edition, Seiten 681-682
(1976), beschriebenen Pyrogentest. Eine Probenlösung wird über Nacht gegenüber pyrogenfreiem, destilliertem Wasser dialysiert
und die dialysierte Lösung wird dann intravenös in je drei Kaninchen injiziert. Bei diesem Versuch erfüllt
die Probenlösung, wenn kein Kaninchen einen ersten Anstieg in der Temperatur von O,6°C oder mehr über die entsprechende
Kontrolltemperatur zeigt und wenn die Summe der drei Temperaturanstiege 1,4°C nicht überschreitet, die Erfordernisse
für die Abwesenheit von Pyrogenen.
10 g Cellulosepulver werden in 80 ml einer wäßrigen 25%igen Natriumhydroxidlösung suspendiert· Die Suspension
wird 30 min in Eis-Wasser unter Rühren in Intervallen stehengelassen. 420 ml Wasser und 50 ml Epichlorhydrin werden
zu der Suspension zugegeben, und das Gemisch wird 30 min heftig bei 50 bis 600C gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung
wird der Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen»
Die so erhaltene, mit Epichlorhydrin aktivierte Cellulose wird in 200 ml einer wäßrigen 1 M Natriumthiosulfatlösung
suspendiert und die Suspension wird 1 h bei Zimmertemperatur gerührt. Während der Umsetzung wird die Suspension
mit 0,1N Chlorwasserstoffsäure bei einem pH-Wert von 5 bis
gehalten. Nach Beendigung der Reaktion wird der Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhält 9,5 g (in
trockener Form) 0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-cellulose.
Der Gehalt an 3-Sulfothio-2-hydroxypropylgruppen beträgt
320/uMol/g (Trockenform).
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20 g Agarose (hergestellt von Pharmacia Pine Chemicals of Uppsala, Schweden, unter dem Viarenzeichen
"Sepharose 6B") werden in 80 ml einer wäßrigen 1N Natriumhydroxidlösung
suspendiert. 10 ml Epichlorhydrin werden zu der Suspension zugegeben, und das Gemisch wird 24 h bei
Zimmertemperatur heftig gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wird der Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen.
Die so erhaltene, mit Epichlorhydrin aktivierte Agarose wird in 100 ml einer wäßrigen 1 M Natriumthiosulfatlösung
suspendiert, und die Suspension wird 1 h bei Zimmertemperatur gerührt. Die Suspension wird während der Umsetzung
mit 0,1N Chlorwasserstoffsäure bei einem pH-Wert von 5 bis
gehalten. Nach Beendigung der Umsetzung wird der Niederschlag abfiltriert und dann mit Wasser gewaschen. Man erhält 19 g
(Trockenform) 0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-agarose.
Der Gehalt an 3-Sulfothio-2-hydroxypropylgruppen beträgt
550/uMol/g (Trockenform).
10 g mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals of Uppsala, Schweden,
unter dem Warenzeichen "Sephadex G-50") werden in 200 ml einer wäßrigen 1N Natriumhydroxidlösung suspendiert. 20 ml
Epichlorhydrin werden zu der Suspension zugegeben, und das Gemisch wird 5 h heftig bei Zimmertemperatur gerührt. Nach
Beendigung der Reaktion wird der Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen.
Das so erhaltene, vernetzte, mit Epichlorhydrin aktivierte Dextran wird in 200 ml einer wäßrigen 1 M Natriumthiosulfatlösung
suspendiert. Die Suspension wird 1 h bei
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Zimmertemperatur gerührt. Während der Umsetzung wird die Suspension mit O,1N Chlorwasserstoffsäure bei einem pH-¥ert
von 5 bis 7 gehalten. Nach Beendigung der Umsetzung wird der Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man
erhält 9,2 g (Trockenform) vernetztes 0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-dextran.
Der Gehalt an 3-Sulfothio-2-hydroxypropylgruppen beträgt
620/uMol/g (Trockenform).
Beispiel 4
10 g Cellulosepulver werden in 80 ml einer wäßrigen 25?6igen Natriumhydroxidlösung suspendiert. Die Suspension
wird 30 min in Eis-Wasser stehengelassen und 420 ml Wasser
werden zugegeben. Das Gemisch wird 30 min bei 40°C stehengelassen. 100 ml Epichlorhydrin werden zu dem Gemisch zugegeben?
das 60 min heftig bei 400C gerührt wird. Nach Beendigung der
Umsetzung wird der Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen.
Die so erhaltene, mit Epichlorhydrin aktivierte Cellulose wird in 100 ml einer wäßrigen 2 M Natriumhydrogensulfitlösung
suspendiert. Die Suspension wird mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und wird 18 h bei Zimmertemperatur
stehengelassen. Nach Beendigung der Umsetzung wird der Niederschlag abfiltriert und dann mit Wasser gewaschen. Man
erhält 9,5 g -(Trockenform) 0-(3-Sulfo-2-hydroxypropyl)-cellulose.
Der Gehalt an 3-Sulfo-2-hydroxypropylgruppen beträgt 550/uMol/g (Trockenform).
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Beispiel 5
30 g Agarose (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals of Uppsala, Schweden, unter dem Warenzeichen "Sepharose 6B")
werden in 180 ml einer wäßrigen 1N Natriumhydroxidlösung suspendze
rt. 10 ml Epichlorhydrin werden zu der Suspension zugegeben und das Gemisch wird 24 h heftig bei Zimmertemperatur
gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wird der Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen.
Die so erhaltene, mit Epichlorhydrin aktivierte Agarose wird in 100 ml einer 2 M Kaliumcarbonatpufferlösung
(pH 10), die Sulfanilsäure enthält (Sulfanilsäuregehalt = 30 g/100 ml) suspendiert. Die Suspension wird 6 Tage bei
Zimmertemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wird der Niederschlag abfiltriert und dann mit Wasser gewaschen.
Man erhält 28 g (Trockenform) 0-[3-(p-Sulfophenylamino)-2-hydroxypropyl]-agaros
e.
Der Gehalt an 3-(p-Sulfophenylamino)-2-hydroxypropylgruppen beträgt 600/uMol/g (Trockenform).
Beispiel 6
10 g mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals of Uppsala, Schweden,
unter dem Warenzeichen "Sephadex G-50") werden in 200 ml einer
wäßrigen 1N Natriumhydroxidlösung suspendiert. 20 ml Epichlorhydrin
werden zu der Suspension zugegeben, und das Gemisch wird bei Zimmertemperatur 3 h heftig gerührt. Nach Beendigung
der Umsetzung wird der Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen.
Das so erhaltene, vernetzte, mit Epichlorhydrin aktivierte Dextran wird- in 200 ml einer 2 M Kaliumcarbonatpufferlösung
(pH 10), die Sulfanilsäure enthält (Sulfanilsäurege-
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halt = 5 g/200 ml) suspendiert. Die Suspension wird 5 Tage
bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wird der Niederschlag abfiltriert und dann mit Wasser gewaschen.
Man erhält 9»6 g (Trockenform) vernetztes O-[3-(p-SuIfophenylamino)-2-hydroxypropyl!-dextran.
Der Gehalt an 3-(p-Sulfophenylamino)-2-hydroxypropylgruppen
beträgt 450/uMol/g (Trockenform).
(1) 40 ml vernetzte Diäthylaminoäthyl-Agarose (hergestellt
von Pharmacia Fine Chemicals of Uppsala, Schweden, unter dem Warenzeichen "DEAE-Sepharose CL-6B") werden in
eine Säule mit einem Durchmesser von 2,3 cm und einer Höhe von 9,6 cm eingefüllt und mit einer 0,01 M Phosphatpufferlösung
bei pH 8,0 äquilibriert. 300 000 Einheiten rohe Urokinase (6713 Einheiten/mg Protein) werden in 80 ml einer 0,01 M
Phosphatpufferlösung (pH 8,0, spezifische elektrische Leitfähigkeit = 1,3 m Mho/cm) gelöst. Die wäßrige Lösung aus
roher Urokinase (spezifische elektrische Leitfähigkeit = 6,5 m Mho/cm), die so erhalten wurde, wird durch eine Säule
aus DEAE-Sepharose CL-6B geleitet, und die Säule wird mit 80 ml einer 0,01 M Phosphatpufferlösung, die 0,05 M Natriumchlorid
enthält, (pH 8,0, spezifische elektrische Leitfähigkeit = 5 m Mho/cm) gewaschen. Der Abstrom und die Waschlösungen
werden vereinigt. Die vereinigte Lösung (Gesamtvolumen = 160 ml) enthält 291 000 Einheiten"Urokinase und zeigt eine
spezifische Aktivität von 20 500 Einheiten/mg Protein. Ausbeute = 97%.
Die oben erhaltene Urokinaselösung erhöht, wenn sie
an drei Kaninchen in einer Dosis von 300 Einheiten/kg verabreicht wird, deren Temperatur nur um 0,15°, 0,10° und
0,10°. Dies zeigt klar, daß die Urokinaselösung negativ gegenüber dem Pyrogen Test der Japanese Pharmacopoeia ist,
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wohingegen die Lösung aus roher Urokinase (d.h. die als Ausgangsmaterial
verwendete Urokinaselösung) bei 150 Einheiten/ kg die Temperatur der drei Kaninchen um 0,55°, 0,70° bzw.
0,95° erhöht.
(2) 7 ml 0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-cellulose, die auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten
wurde, werden in eine Säule mit einem Durchmesser von 2,0 cm und einer Höhe von 2,3 cm gegeben und mit einer 0,01 H
Phosphatpufferlösung bei pH 8,0 äquilibriert. 160 ml der
in Abschnitt (1) erhaltenen Urokinaselösung (291 000 Einheiten,
spezifische elektrische Leitfähigkeit = 6,2 m Mho/cm,
pH 8,0) werden in die Säule aus 0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-cellulose zur Adsorption der Urokinase daran eingeleitet.
Die Säule wird mit einer 0,01 M Phosphatpufferlösung, die 0,1 M Natriumchlorid enthält, (pH 8,0, spezifische elektrische
Leitfähigkeit = 10 m Mho/cm) gewaschen und dann mit 30 ml einer 0,01 M Phosphatpufferlösung, die 0,5 M Natriumchlorid
enthält, (pH 8,0, spezifische elektrische Leitfähigkeit = 45 m Mho/cm) eluiert. 2 ml-Fraktionen werden nacheinander
als Eluat erhalten, und die Fraktionen 3 bis 7 Werdenvereinigt.
Das so erhaltene Urokinaseeluat enthält 271 000 Einheiten Urokinase und zeigt eine spezifische Aktivität
von 59 000 Einheiten/mg Protein. Ausbeute = 93/5 (bezogen
auf die gemäß Abschnitt (1) erhaltene Urokinaselösung].
Das Urokinaseeluat besteht den Pyrogen Test der Japanese Pharmacopoeia bei 3000 Einheiten/kg mit einem Temperaturansteig
von 0,00°, 0,05° und 0,00°.
(1) 40 ml vernetzte Diäthylaminoäthyl-Agarose (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals of Uppsala, Schweden, unter dem
Warenzeichen "DEAE-Sepharose CL-6B") v/erden in eine Säule
mit einem Durchmesser von 2,3 cm und einer Höhe von 9,6 cm
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gegeben und mit einer 0,01 M Phosphatpufferlösung bei pH 8,0 äquilibriert. 300 000 Einheiten rohe Urokinase (1100 Einheiten/mg
Protein) werden in 80 ml einer 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 8,0, spezifische elektrische Leitfähigkeit =
1,3 m Mho/cm) gelöst. Die wäßrige Lösung aus roher Urokinase
(spezifische elektrische Leitfähigkeit = 7 m Mho/cm), die so erhalten wurde, wird durch die Säule aus DEAE-Sepharose
CL-6B geleitet, und die Säule wird mit 80 ml einer 0,01 M Phosphatpufferlösung, die 0,05 M Natriumchlorid enthält
(pH 8,0, spezifische elektrische Leitfähigkeit = 5 m Mho/cm) gewaschen. Der Abstrom und die Waschlösungen werden vereinigt.
Die vereinigte Lösung (Gesamtvolumen = 160 ml) enthält 285 003 Einheiten Urokinase und zeigt eine spezifische Aktivität
von 3800 Einheiten/mg Protein. Ausbeute = 95%.
Die oben erhaltene Urokinaselösung erhöht, wenn sie an drei Kaninchen in einer Dosis von 3000 Einheiten/kg verabreicht
wird, deren Temperatur um 0,20°, 0,30° und 0,25°. Dies zeigt deutlich, daß diese Urokinaselösung gegenüber
dem Pyrogen Test der Japanese Pharmacopoeia ist, xrohingegen
die Lösung aus roher Urokinase (d.h. die als Ausgangsmaterial verwendete Urokinaselösung) bei 150 Einheiten/kg die Temperatur
der drei Kaninchen um 1,00°, 1,10° bzw. 1,20° erhöht.
(2) 7 ml der auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben erhaltenen 0-(3~Sulfothio-2-hydroxypropyl)-cellulose werden
in eine Säule mit einem Durchmesser von 2,0 cm und einer Hohe von 2,3 cm gepackt und mit einer 0,01 M Phosphatpufferlösung
mit pH 8,0 äquilibriert. 160 ml der gemäß Abschnitt (1) erhaltenen Urokinaselösung (285 000 Einheiten, spezifische
Aktivität = 3800 Einheiten/mg Protein, pH 8,0, spezifische elektrische Leitfähigkeit = 6 m Mho/cm) werden in die
Säule aus 0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-cellulose zur Adsorption
der Urokinase daran eingeleitet. Die Säule wird mit einer 0,1 M Natriumchlorid enthaltenden 0,01 M Phosphatpuffer-
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lösung (pH 8,0, spezifische elektrische Leitfähigkeit = 10m Mho/cm) gewaschen und dann mit 30 ml einer 0,5 M Natriumchlorid
enthaltenden 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 8,0, spezifische elektrische Leitfähigkeit = 45 m Mho/cm) eluiert.
2 ml-Fraktionen werden aufeinanderfolgend als Eluat erhalten
und die Fraktionen 3 bis 7 werden vereinigt. Das so erhaltene Urokinaseeluat enthält 263 000 Einheiten Urokinase und zeigt
eine spezifische Aktivität von 36 000 Einheiten/mg Protein.
Ausbeute =
Das Urokinaseeluat besteht den Pyrogen Test bei 3000 Einheiten/kg mit einem Temperaturanstieg von 0,10°,
0,05° und 0,05°.
10 ml der auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben
erhaltenen 0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-cellulose werden in eine Säule mit einem Durchmesser von 1,3 cm und einer
Höhe von 7,3 cm gepackt und mit einer 0,01 M Phosphatpufferlösung bei pH 7,0 äquilibriert. 50 000 Einheiten rohe Urokinase
(5500 Einheiten/mg Protein) v/erden in 50 ml einer 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0, spezifische elektrische Leitfähigkeit
= 1,3 m Mho/cm) gelöst. Die so erhaltene, wäßrige Lösung aus roher Urokinase (spezifische elektrische Leitfähigkeit
= 2,5 m Mho/cm) wird in eine Säule aus 0-(3-SuIfothio~2-hydroxypropyl)-cellulose
geleitet. Die Säule wird mit einer 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0, spezifische elektrische
Leitfähigkeit = 1,3 m Mho/cm) gewaschen und dann mit 30 ml einer 1 M Natriumchlorid enthaltenden 0,01 M Phosphatpufferlösung
(pH 7,0, spezifische elektrische Leitfähigkeit = 75 m Mho/cm) eluiert. 2 ml-Fraktionen werden aufeinanderfolgend
als Eluat erhalten, und die Fraktionen 3 bis 7 werden vereinigt. Das so erhaltene Urokinaseeluat enthält 44 000 Einheiten
Urokinase und zeigt eine spezifische Aktivität von 40 000 Einheiten/mg Protein. Ausbeute = 88$.
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Das Urokinaseeluat besteht den Pyrogen Test bei 3000 Einheiten/kg mit einem Temperaturanstieg von 0,35°,
0,45°-und. 0,45°*
50 000 Einheiten rohe Urokinase (5500 Einheiten/mg Protein) werden in 50 ml einer 0,01 M Phosphatpufferlösung
(pH 7,0, spezifische elektrische Leitfähigkeit = 1,3 m Mho/cm)
gelöst. Die so erhaltene wäßrige Lösung aus roher Urokinase (spezifische elektrische Leitfähigkeit = 2,5 m Mho/cm) wird
auf gleiche Weise wie in Beispiel 9 beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß auf gleiche Weise wie in Beispiel 2 beschrieben
erhaltene 0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)~agarose anstelle der 0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-cellulose verwendet
wird. Das so erhaltene Urokinaseeluat enthält 41 000 Einheiten Urokinase und zeigt eine spezifische Aktivität
von 32 000 Einheiten/mg Protein. Ausbeute = 82?o.
Das oben erhaltene Urokinaseeluat besteht den Pyrogen
Test bei 3000 Einheiten/kg.
50 000 Einheiten rohe Urokinase (5500 Einheiten/mg Protein) werden in 50 ml einer 0,01 M Phosphatpufferlösung
(pH 7,0, spezifische elektrische Leitfähigkeit = 1,3 m Mho/ cm) gelöst. Die so erhaltene, wäßrige Lösung aus roher Urokinase
(spezifische elektrische Leitfähigkeit = 2,5 m Mho/cm) wird auf gleiche Weise, wie in Beispiel 9 beschrieben, behandelt,
mit der Ausnahme, daß ein auf gleiche Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestelltes, vernetztes 0-(3-SuIfothio-2-hydroxypropyl)-dextran
anstelle der 0-(3-SuIfothio-2-hydroxypropyl)-cellulose
verwendet wird. Das so erhaltene Urokinaseeluat enthält 40 000 Einheiten Urokinase und
zeigt eine spezifische Aktivität von 35 500 Einheiten/mg Protein. Ausbeute = 8O?o.
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Das oben erhaltene Urokinaseeluat besteht den Pyrogen
Test bei 3000 Einheiten/kg.
50 000 Einheiten rohe Urokinase (5500 Einheiten/mg Protein) werden in 50 ml einer 0,01 M Phosphatpufferlösung
(pH 7,0, spezifische elektrische Leitfähigkeit = 1,3 in Mho/
cm) gelöst. Die so erhaltene, wäßrige Lösung aus roher Urokinase (spezifische elektrische Leitfähigkeit = 2,5 m Mho/cm)
wird auf gleiche Weise, wie in Beispiel 9 beschrieben, behandelt, mit der Ausnahme, daß auf gleiche Weise, wie in
Beispiel 4 beschrieben, erhaltene 0-(3-Sulfo-2-hydroxypropyl)-cellulose
anstelle von 0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-cellulose verwendet wird. Das so erhaltene Urokinaseeluat
enthält 45 000 Einheiten Urokinase und zeigt eine spezifische Aktivität von 30 000 Einheiten/mg Protein. Ausbeute =
Das oben erhaltene Urokinaseeluat besteht den Pyrogen Test bei 3000 Einheiten/kg.
50 000 Einheiten rohe Urokinase (5500 Einheiten/mg Protein) werden in 50 ml einer 0,01 M Phosphatpufferlösung
(pH 7,0, spezifische elektrische Leitfähigkeit = 1,3 m Mho/cm) gelöst. Die so erhaltene, wäßrige Lösung aus roher Urokinase
(spezifische elektrische Leitfähigkeit = 2,5 m Mho/cm) wird auf gleiche Weise, wie in Beispiel 9 beschrieben, behandelt,
mit der Ausnahme, daß auf gleiche Weise, wie in Beispiel 5 beschrieben, erhaltene 0-[3-(p-Sulfophenylamino)-2-hydroxypropylj-agarose
anstelle von 0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-cellulose verwendet wird. Das so erhaltene Urokinaseeluat
enthält 45 000 Einheiten Urokinase und zeigt eine spezifische Aktivität von 35 000 Einheiten/mg Proton. Ausbeute =
809842/0637
Das oben erhaltene Urokinaseeluat besteht den Pyrogen
Test bei 3000 Einheiten/kg.
50 000 Einheiten rohe Urokinase (5500 Einheiten/mg Protein) werden in 50 ml einer 0,01 M Phosphatpufferlösung
(pH 7,0, spezifische elektrische Leitfähigkeit = 1,3 m Mho/cin)
gelöst. Die so erhaltene, wäßrige Lösung aus roher Urokinase (spezifische elektrische Leitfähigkeit = 2,5 m Mho/cm) wird
auf gleiche Weise, wie in Beispiel 9 beschrieben, behandelt, mit der Ausnahme, daß ein auf gleiche Weise wie in Beispiel 6
beschrieben erhaltenes, vernetztes 0-[3-(p-Sulfophenylamino)-2-hydroxypropyl]-dextran
anstelle von 0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-cellulose
verwendet wird. Das so erhaltene Urokinaseeluat enthält 44 000 Einheiten Urokinase und zeigt
eine spezifische Aktivität von 38 000 Einheiten/mg Protein. Ausbeute = 88%.
Das oben erhaltene Urokinaseeluat besteht den Pyrogen Test bei 3000 Einheiten/kg.
Ende der Beschreibung.
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Claims (10)
1. Verfahren zur Reinigung roher Urokinase, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine wäßrige Urokinaselösung mit einem wasserunlöslichen, hydrophilen Polysaccharid, das eine Gruppe
der Formel
-CH2CH(OH)CH2R
enthält, in der R Sulfothio, SuIfο oder p-Sulfophenylamino bedeutet,
zur Adsorption der Urokinase daran "behandelt und die adsorbierte Urokinase aus dem Polysaccharid unter Gewinnung
von Urokinase eluiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die wäßrige Urokinaselösung eine spezifische elektrische Leitfähigkeit nicht über 15 m Mho/cm besitzt, und daß die
Eluierung durch Behandeln des Polysaccharids mit einer wäßrigen Lösung mit einer spezifischen elektrischen Leitfähigkeit
nicht unter 20 m Mho/cm durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die zur Eluierung verwendete, wäßrige Lösung aus der Gruppe ausgewählt wird, die enthält: eine Phosphatpufferlösung,
eine Carbonatpufferlösung, eine Tris(hydroxymethyl)-aminomethanpufferlösung
und eine wäßrige Natriumchloridlösung.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3f dadurch
gekennzeichnet, daß das Polysaccharid 100 bis 800 /uMol 3-subst.·
2-Hydroxypropylgruppen/g (Trockenform) Polysaccharid enthält.
809842/0637 0^GIMAL INSPECTED
r 2SXZB
j NACHGEREICHT I
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid ausgewählt wird aus der Gruppe, die
enthält: 0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-cellulose, 0-(3-Sulf othio-2-hydroxypropyl)-agarose,
mit Epichlorhydrin vernetztes 0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-dextran, 0-(3-Sulfo-2-hydroxypropyl)-cellulose,
0-(3-Sulfo-2-hydroxypropyl)-agarose, mit Epichlorhydrin vernetztes 0-(3-Sulfo-2-hydroxypropyl)-dextran,
0-[3-(p-Sulfophenylamino)-2-hydroxypropyl]-cellulose, 0-[3-(p-SuIfophenylamino)-2-hydroxypropyl]-agarose
und mit Epichlorhydrin vernetztes 0-[3-(p-Sulfophenylamino)-2-hydroxypropyl]-dextran.
6. Verfahren zur Reinigung roher Urokinase, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine wäßrige Urokinaselösung mit vernetzter Diäthylaminoäthyl-Agarose behandelt, die Urokinaselösung
aus der Agarose abtrennt, die abgetrennte Urokinaselösung mit einem wasserunlöslichen, hydrophilen Polysaccharid,
d.as eine Gruppe der Formel
-CH2CH(OH)CH2R
enthält, in der R Sulfothio, SuIfο oder ρ-SuIfophenylamino bedeutet,
zur Adsorption der Urokinase daran behandelt und die adsorbierte Urokinase aus dem Polysaccharid zur Gewinnung
der Urokinase eluiert.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Urokinaselösung eine spezifische elektrische
Leitfähigkeit nicht über 15 m Mho/cm besitzt und daß die
Eluierung durch Behandeln des Polysaccharide mit einer wäßrigen Lösung mit einer spezifischen elektrischen Leitfähigkeit
nicht unter 20 m Mho/cm durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Eluierung verwendete, wäßrige Lösung ausgewählt
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wird aus der Gruppe, die enthält: eine Phosphatpufferlösung, eine Carbonatpufferlösung, eine Tris(hydroxymethyl)-aminomethanpufferlösung
und eine wäßrige Natriumchloridlösung.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
daß das Polysaccharid 100 bis 800/uMol der
3-subst.-2-Hydroxypropylgruppe/g (Trockenform) Polysaccharid enthält.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid ausgewählt vri.rd aus der Gruppe, die enthält:
0-(3-3μ1ΐothio-2-hydroxypropyl)-cellulose, 0-(3-Sulfothio-2-hydroxypropyl)-agarose,
mit Epichlorhydrin vernetztes 0-(3-SuIfothio-2-hydroxypropyl)-dextran,
0-(3-Sulfo-2-hydroxypropyl)· cellulose, 0-(3-Sulfo-2-hydroxypropyl)-agarose, mit Epichlorhydrin
vernetztes 0-(3-Sulfo-2-hydroxypropyl)-dextran, 0-[3-(p-SuIfophenylamino)-2-hydroxypropyl]-cellulose,
0-[3-(p-Sulfophenylamino)-2-hydroxypropyl]-agarose und mit Epichlorhydrin
vernetztes 0-[3-(p-Sulfophenylamino)-2-hydroxypropylJ-dextran.
809842/0637
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| JP4068377A JPS53127885A (en) | 1977-04-09 | 1977-04-09 | Purification of urokinase |
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| DE (1) | DE2812609A1 (de) |
| FR (1) | FR2386555A1 (de) |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |