JPS5921595B2 - ウロキナ−ゼの精製法 - Google Patents
ウロキナ−ゼの精製法Info
- Publication number
- JPS5921595B2 JPS5921595B2 JP4963477A JP4963477A JPS5921595B2 JP S5921595 B2 JPS5921595 B2 JP S5921595B2 JP 4963477 A JP4963477 A JP 4963477A JP 4963477 A JP4963477 A JP 4963477A JP S5921595 B2 JPS5921595 B2 JP S5921595B2
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- JP
- Japan
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- urokinase
- sulfophenylamino
- sulfo
- hydroxypropylated
- water
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はウロキナーゼの精製法に関し、更に詳しくは粗
製ウロキナーゼより高純度のウロキナーゼを工業的有利
に取得する方法に関する。
製ウロキナーゼより高純度のウロキナーゼを工業的有利
に取得する方法に関する。
ウロキナーゼは血清中に含まれるプラスミノーゲンを活
性化してフィブリン溶解能を有するプラスミンを生成す
る機能があるため、線溶系の賦活剤として有用であり、
末梢動脈血栓症や心筋硬そく症などの治療に広く臨床使
用されている。
性化してフィブリン溶解能を有するプラスミンを生成す
る機能があるため、線溶系の賦活剤として有用であり、
末梢動脈血栓症や心筋硬そく症などの治療に広く臨床使
用されている。
またウロキナーゼは近年抗ガン剤の増強剤としての用途
も開発され、その需要は急速に増大している。
も開発され、その需要は急速に増大している。
人尿よりウロキナーゼを取得する方法としては、例えば
シリカゲル、活性化珪藻土、ガラスピース、寒天、ケイ
酸アルミニウムマグネシウムなどの吸着剤を用いる方法
が知られている。
シリカゲル、活性化珪藻土、ガラスピース、寒天、ケイ
酸アルミニウムマグネシウムなどの吸着剤を用いる方法
が知られている。
しかしながら、このような方法で取得される粗製ウロキ
ナーゼ中には種々の不純物、例えば発熱性物質や血液凝
固性物質などが含まれているため、このままでは到底医
薬品として人体に投与することができない。
ナーゼ中には種々の不純物、例えば発熱性物質や血液凝
固性物質などが含まれているため、このままでは到底医
薬品として人体に投与することができない。
従って、ウロキナーゼを人体に投与するに当っては、こ
れら不純物を除去することが是非とも必要である。
れら不純物を除去することが是非とも必要である。
従来、粗製ウロキナーゼを更に精製する方法としては種
々の方法が知られて、いるが、必ずしも満足しうるもの
ではなかった。
々の方法が知られて、いるが、必ずしも満足しうるもの
ではなかった。
本発明者らは、粗製ウロキナーゼより不純物を除去して
人体に投与可能な高純度ウロキナーゼを取得する方法に
ついて種々検討を重ねた結果、３−スルホ−２−ヒドロ
キシプロピル基モしくハ３−（Ｐ−スルホフェニルアミ
ノ）−２−ヒドロキシプロピル基を有する水に不溶性の
多糖類を用いることにより、所期の目的が達成されるこ
とを見い出し、本発明を完成するに至った。
人体に投与可能な高純度ウロキナーゼを取得する方法に
ついて種々検討を重ねた結果、３−スルホ−２−ヒドロ
キシプロピル基モしくハ３−（Ｐ−スルホフェニルアミ
ノ）−２−ヒドロキシプロピル基を有する水に不溶性の
多糖類を用いることにより、所期の目的が達成されるこ
とを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本゛発明は粗製ウロキナーゼ溶液に３−スル
ホ−２−ヒドロキシプロピル基または３−（Ｐ−スルホ
フェニルアミノ）−２−ヒドロキシプロピル基を有する
水に不溶性の多糖類を接触させてウロキナーゼを該多糖
類に吸着させた後、吸着せるウロキナーゼを溶出するこ
とからなるウロキナーゼの精製法である。
ホ−２−ヒドロキシプロピル基または３−（Ｐ−スルホ
フェニルアミノ）−２−ヒドロキシプロピル基を有する
水に不溶性の多糖類を接触させてウロキナーゼを該多糖
類に吸着させた後、吸着せるウロキナーゼを溶出するこ
とからなるウロキナーゼの精製法である。
本発明に係る３−スルホ−２−ヒドロキシプロピル基ま
たは３−（Ｐ−スルホフェニルアミノ）−２−ヒドロキ
シプロピル基を有する水に不溶性の多糖類（以下、ＳＨ
Ｐ多糖類と略称する）としては、例えば３−スルホ−２
−ヒドロキシプロピル化セルロース、３−スルホ−２−
ヒドロキシプロピル化アガロース、３−スルホ−２−ヒ
ドロキシプロピル化架橋テキストン、３−（Ｐ−スルホ
フェニルアミノ）−２−ヒドロキシプロピル化セ・ルロ
ース、３−（Ｐ−スルホフェニルアミ／）−２−ヒドロ
キシプロピル化アガロース、３−（Ｐ−スルホフェニル
アミノ）−２−ヒドロキシプロピル化架橋デキストラン
などが挙げられる。
たは３−（Ｐ−スルホフェニルアミノ）−２−ヒドロキ
シプロピル基を有する水に不溶性の多糖類（以下、ＳＨ
Ｐ多糖類と略称する）としては、例えば３−スルホ−２
−ヒドロキシプロピル化セルロース、３−スルホ−２−
ヒドロキシプロピル化アガロース、３−スルホ−２−ヒ
ドロキシプロピル化架橋テキストン、３−（Ｐ−スルホ
フェニルアミノ）−２−ヒドロキシプロピル化セ・ルロ
ース、３−（Ｐ−スルホフェニルアミ／）−２−ヒドロ
キシプロピル化アガロース、３−（Ｐ−スルホフェニル
アミノ）−２−ヒドロキシプロピル化架橋デキストラン
などが挙げられる。
これらＳＨＰ多糖類はセルロース、アガロース（ファル
マシア社により製造され、セファロースの商品名で市販
されている）、架橋デキストラン（ファルマシア社によ
り製造され、セファデックスの商品名で市販されている
）の如き水に不溶性の多糖類にアルカリ性物質（例えば
水酸化ナトリウム）の存在下エピクロルヒドリンを作用
させて活性化し、次いでかくして得られたエピクロルヒ
ドリン活性化多糖類に亜硫酸水素ナトリウム（又は亜硫
酸ナトリウム）或いはスルファニル酸を作用させること
により製造することができる。
マシア社により製造され、セファロースの商品名で市販
されている）、架橋デキストラン（ファルマシア社によ
り製造され、セファデックスの商品名で市販されている
）の如き水に不溶性の多糖類にアルカリ性物質（例えば
水酸化ナトリウム）の存在下エピクロルヒドリンを作用
させて活性化し、次いでかくして得られたエピクロルヒ
ドリン活性化多糖類に亜硫酸水素ナトリウム（又は亜硫
酸ナトリウム）或いはスルファニル酸を作用させること
により製造することができる。
上記反応を成因すれば次の通りである。
（但し、上記式中■−ＯＨは水不溶性の多糖類を表わす
） 尚、上記（１）の反応において、アルカリ性物質の濃度
、エピクロルヒドリンの使用量、反応温度、反応時間な
どを適宜選択することにより、種々の置換度（構成単糖
類１個当りの置換基の導入数）をもつエポキシグロビル
化多糖類が得られるが、置換度０．０１〜０．２０程度
のものが好ましい。
） 尚、上記（１）の反応において、アルカリ性物質の濃度
、エピクロルヒドリンの使用量、反応温度、反応時間な
どを適宜選択することにより、種々の置換度（構成単糖
類１個当りの置換基の導入数）をもつエポキシグロビル
化多糖類が得られるが、置換度０．０１〜０．２０程度
のものが好ましい。
また、上記（２−１）及び（２−２）の反応はほぼ定量
的に進行し、エポキシ残基はスルホン化或いはＰ−スル
ホフェニルアミノ化される。
的に進行し、エポキシ残基はスルホン化或いはＰ−スル
ホフェニルアミノ化される。
以下、本発明方法を具体的に説明する。
本発明に係る吸脱着操作はカラム法及びバッチ法のいず
れでも行なうことができる。
れでも行なうことができる。
例えば、カラム法により行なう場合は次の如くして行な
うのが好ましい。
うのが好ましい。
まず、ＳＨＰ多糖類をカラムに充填した後適当な緩衝液
（例えばリン酸緩衝液）で緩衝化する。
（例えばリン酸緩衝液）で緩衝化する。
次いでこのカラムに粗製ウロキナーゼ溶液を流下させて
ウロキナーゼをＳＨＰ多糖類に吸着させる。
ウロキナーゼをＳＨＰ多糖類に吸着させる。
この吸着操作に用いる粗製ウロキナーゼ溶液のＰＨは３
〜８であるのが好ましく、また電気伝導度は１０ｍｍｈ
ｏ／ｃｒｒＬ 以下であるのが好ましい。
〜８であるのが好ましく、また電気伝導度は１０ｍｍｈ
ｏ／ｃｒｒＬ 以下であるのが好ましい。
次いで、カラムをＰＨ３〜８程度の希薄塩類溶液（例え
ば電気伝導度１０ ｍｍｈｏ ７ｃｍ 以下のリン酸緩
衝液）で洗浄する。
ば電気伝導度１０ ｍｍｈｏ ７ｃｍ 以下のリン酸緩
衝液）で洗浄する。
洗浄液の量はカラム容量の２〜３倍量程度で十分である
。
。
この操作により発熱性物質その他の不純物は除去される
が、ウロキナーゼは吸着されたまま残る。
が、ウロキナーゼは吸着されたまま残る。
吸着しているウロキナーゼを溶出するには、ＰＨ６〜１
０程度の濃厚塩類溶液（例えば電気伝導度２０ ｍ ｒ
ｎｈｏ ７０ｍ以上のリン酸緩衝液、食塩溶液）を流下
することにより容易に行なうことができる。
０程度の濃厚塩類溶液（例えば電気伝導度２０ ｍ ｒ
ｎｈｏ ７０ｍ以上のリン酸緩衝液、食塩溶液）を流下
することにより容易に行なうことができる。
この場合、塩類溶液の電気伝導度を段階的に上昇させる
濃度勾配法により行ってもよい。
濃度勾配法により行ってもよい。
か（して得られたウロキナーゼ溶出液からウロキナーゼ
を分離、取得するには、通常の酵素分離法により容易に
行なうことができる。
を分離、取得するには、通常の酵素分離法により容易に
行なうことができる。
例えば、硫安などの塩類を用いてウロキナーゼを塩析し
た後、透析或いはゲル濾過法により脱塩し、次いで凍結
乾燥することにより高純度のウロキナーゼを取得するこ
とができる。
た後、透析或いはゲル濾過法により脱塩し、次いで凍結
乾燥することにより高純度のウロキナーゼを取得するこ
とができる。
以下、参考例及び実施例を挙げて本発明方法を説明する
が、実施例中ウロキナーゼの力価はプロラグらのフィブ
リン平板法（Ｂｉｏｃｈｉｍ。
が、実施例中ウロキナーゼの力価はプロラグらのフィブ
リン平板法（Ｂｉｏｃｈｉｍ。
Ｂ １ｏｐｈｙｓ 、 Ａｃｔａ 、 ２４．２７８
（１９５７））にて測定し、力価表示はジョンソンらに
より定められた国際単位（Ｔｈｒｏｍｂｏｓ 、 Ｂ
１ａｔｈｅｓ 。
（１９５７））にて測定し、力価表示はジョンソンらに
より定められた国際単位（Ｔｈｒｏｍｂｏｓ 、 Ｂ
１ａｔｈｅｓ 。
Ｈａｅｍｏｒｒｈ、 （ｓｔｕｔｔｇ、 ）、旦、２
５９（１９６９））によった。
５９（１９６９））によった。
参考例 １
粉末セルロース（東洋科学産業社製）１０グを２５％水
酸化ナトリウム水溶液８０ｍ１にけん濁し、氷水中３０
分間放置する。
酸化ナトリウム水溶液８０ｍ１にけん濁し、氷水中３０
分間放置する。
次いでげん濁液に水４２０ｍ１を加え、４０°Ｃで更に
３０分間放置した後エピクロルヒドリン１００ＴＬｌを
加え、４０℃で６０分間激しくかく拌反応させる。
３０分間放置した後エピクロルヒドリン１００ＴＬｌを
加え、４０℃で６０分間激しくかく拌反応させる。
反応終了後、固形物を集め、水洗する。
かくして得られたエピクロルヒドリン活性化セルロース
に２Ｍ亜硫酸水素ナトリウム水溶液１００ｍ１を加え、
水酸化ナトリウムでＰＨ７，０とした後、室温で１８時
間静置反応させる。
に２Ｍ亜硫酸水素ナトリウム水溶液１００ｍ１を加え、
水酸化ナトリウムでＰＨ７，０とした後、室温で１８時
間静置反応させる。
反応終了後、固形物を集め、水洗して過剰の亜硫酸水素
ナトリウムを除去する。
ナトリウムを除去する。
かくして３−スルホ−２−ヒドロキシプロピル化セルロ
ース９．５Ｐ（乾燥重量）を得る。
ース９．５Ｐ（乾燥重量）を得る。
置換度：約０．０５参考例 ２
セファロース６Ｂ（ファルマシア社製）３０グをＩＮ水
酸化ナトリウム水溶液１８０ｍ１にけん濁し、これにエ
ピクロルヒドリン１０ｍ１を加え、室温で２４時間激し
くかく拌反応させる。
酸化ナトリウム水溶液１８０ｍ１にけん濁し、これにエ
ピクロルヒドリン１０ｍ１を加え、室温で２４時間激し
くかく拌反応させる。
反応終了後、固形物を集め、水洗する。
かくして得られたエピクロルヒドリン活性化セファロー
ス６Ｂを、スルファニル酸３０Ｐを含む２Ｍ炭酸カリウ
ム緩衝液（ＰＨＩＯ）１００ｍｌ中にげん濁し、室温で
６日間反応させる。
ス６Ｂを、スルファニル酸３０Ｐを含む２Ｍ炭酸カリウ
ム緩衝液（ＰＨＩＯ）１００ｍｌ中にげん濁し、室温で
６日間反応させる。
反応終了後、固形物を集め、水洗して過剰のスルファニ
ル酸を除去する。
ル酸を除去する。
かくして３〜（Ｐ−スルホフェニルアミノ）−２−ヒド
ロキシプロピル化セファロース６Ｂ ２８ｆ（乾燥重
量）を得る。
ロキシプロピル化セファロース６Ｂ ２８ｆ（乾燥重
量）を得る。
置換度：約０．１１
参考例 ３
セファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）１０１を
ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液２００ｍ１にげん濁し、こ
れにエピクロルヒドリン２０ｍ１を加え室温で３時間激
しくかく拌反応させる。
ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液２００ｍ１にげん濁し、こ
れにエピクロルヒドリン２０ｍ１を加え室温で３時間激
しくかく拌反応させる。
反応終了後、固形物を集め、水洗する。
かくして得られたエピクロルヒドリン活性化セファデッ
クスＧ−５０を、スルファニル酸５１を含む２Ｍ炭酸カ
リウム緩衝液（ＰＨＩＯ）２００ｍｌにげん濁し、室温
で５日間反応させる。
クスＧ−５０を、スルファニル酸５１を含む２Ｍ炭酸カ
リウム緩衝液（ＰＨＩＯ）２００ｍｌにげん濁し、室温
で５日間反応させる。
反応終了後、水洗して過剰のスルファニル酸を除去する
。
。
カ＜シて３−（Ｐ−スルホフェニルアミノ）−２−ヒド
ロキシプロピル化セファデックスＧ−５０を９．６？（
乾燥重量）得る。
ロキシプロピル化セファデックスＧ−５０を９．６？（
乾燥重量）得る。
置換度：約０．１５実施例 １
参考例１で調製した３−スルホ−２−ヒドロキシプロピ
ル化セルロース１０ｍ１をカラム（直径１．３ＣｒｒＬ
、高さ７．３ ｃｍ ）に充填し、０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ＰＨ７，０）にて緩衝化する。
ル化セルロース１０ｍ１をカラム（直径１．３ＣｒｒＬ
、高さ７．３ ｃｍ ）に充填し、０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ＰＨ７，０）にて緩衝化する。
このカラムに、予めＰＨ７，０、電気伝導度２．５ ｍ
ｍｈｏ ７ｃｍに調整した粗ウロキナーゼ水溶液５０
ｍ１（５００００単位、５５００単位／ｒｎ９蛋白質）
を流下してウロキナーゼを吸着させる。
ｍｈｏ ７ｃｍに調整した粗ウロキナーゼ水溶液５０
ｍ１（５００００単位、５５００単位／ｒｎ９蛋白質）
を流下してウロキナーゼを吸着させる。
次いでカラムに０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７，０）
３０ｒｎｌを流下して、発熱性物質などの不純物を除
去する。
３０ｒｎｌを流下して、発熱性物質などの不純物を除
去する。
次いでカラムに１Ｍ塩化ナトリウムを含む０，０１Ｍリ
ン酸緩衝液（ＰＨ７，０） ３０ｍｌを流下してウロキ
ナーゼを溶出する。
ン酸緩衝液（ＰＨ７，０） ３０ｍｌを流下してウロキ
ナーゼを溶出する。
かくして得られたウロキナーゼ溶出液の比活性は３００
００単位／４蛋白質であり、活性の回収率は９０％であ
った。
００単位／４蛋白質であり、活性の回収率は９０％であ
った。
実施例 ２
参考例２で調製した３−（Ｐ−スルホフェニルアミノ）
−２−ヒドロキシプロピル化セファロース６Ｂ１０ｍｌ
を用い、実施例１と同様にして粗ウロキナーゼ溶液を処
理する。
−２−ヒドロキシプロピル化セファロース６Ｂ１０ｍｌ
を用い、実施例１と同様にして粗ウロキナーゼ溶液を処
理する。
かくして得られたウロキナーゼ溶出液の比活性は３５０
００単位／ｍ９蛋白質であり、活性の回収率は９０％で
あった。
００単位／ｍ９蛋白質であり、活性の回収率は９０％で
あった。
実施例 ３
参考例３で調製した３−（Ｐ−スルホフェニルアミノ）
−２−ヒドロキシプロピル化セファデックスＧ−５０Ｌ
Ｏｒｕｌを用い、実施例１と同様にして粗ウロキナーゼ
溶液を処理する。
−２−ヒドロキシプロピル化セファデックスＧ−５０Ｌ
Ｏｒｕｌを用い、実施例１と同様にして粗ウロキナーゼ
溶液を処理する。
かくして得られたウロキナーゼ溶出液の比活性は３８０
００単位／ｒｒｂｙ蛋白質であり、活性の回収率は８８
％であった。
００単位／ｒｒｂｙ蛋白質であり、活性の回収率は８８
％であった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 粗製ウロキナーゼ溶液に３−スルホ−２−ヒドロキ
シプロピル基もしくは３−（Ｐ−スルホフェニルアミノ
）−２−ヒドロキシプロピル基を有する水に不溶性の多
糖類を接触させてウロキナーゼを該多糖類に吸着させた
後、吸着せるウロキナーゼを溶出することを特徴とする
ウロキナーゼの精製法。 ２３−スルホ−２−ヒドロキシプロピル基ヲ有する水に
不溶性の多糖類が３−スルホ−２−ヒドロキシプロピル
化セルロース、３−スル＊−２−ヒドロキシグロビル化
アガロース、または３−スルホ−２−ヒドロキシプロピ
ル化架橋デキストランである特許請求の範囲第１項記載
の精製法。 ３３−（Ｐ−スルホフェニルアミノ）−２−ヒドロキシ
プロピル基を有する水に不溶性の多糖類が３−（Ｐ−ス
ルホフェニルアミノ）−２−ヒドロキシプロピル化セル
ロース、３−（Ｐ−スルホフェニルアミノ）−２−ヒド
ロキシプロピル化アガロース、または３−（Ｐ−スルホ
フェニルアミノ）−２−ヒドロキシプロピル化架橋デキ
ストランである特許請求の範囲第１項記載の精製法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4963477A JPS5921595B2 (ja) | 1977-04-28 | 1977-04-28 | ウロキナ−ゼの精製法 |
| DE19782812609 DE2812609A1 (de) | 1977-04-09 | 1978-03-22 | Verfahren zur reinigung roher urokinase |
| US05/889,385 US4160697A (en) | 1977-04-09 | 1978-03-23 | Method for purification of crude urokinase |
| GB11941/78A GB1557545A (en) | 1977-04-09 | 1978-03-28 | Method of putification of crude urokinase |
| FR7810406A FR2386555A1 (fr) | 1977-04-09 | 1978-04-07 | Procede de purification de l'urokinase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4963477A JPS5921595B2 (ja) | 1977-04-28 | 1977-04-28 | ウロキナ−ゼの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS53136581A JPS53136581A (en) | 1978-11-29 |
| JPS5921595B2 true JPS5921595B2 (ja) | 1984-05-21 |
Family
ID=12836639
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4963477A Expired JPS5921595B2 (ja) | 1977-04-09 | 1977-04-28 | ウロキナ−ゼの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5921595B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH031888Y2 (ja) * | 1985-11-05 | 1991-01-21 |
-
1977
- 1977-04-28 JP JP4963477A patent/JPS5921595B2/ja not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH031888Y2 (ja) * | 1985-11-05 | 1991-01-21 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS53136581A (en) | 1978-11-29 |
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