KR790001376B1 - 우로키나제의 정제 및 회수법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

우로키나제의 정제 및 회수법

본 발명은 우로키나제의 정제법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 본, 발명은 인뇨(人尿)를 함유하는 조제(粗製) 우로키나제 수용액으로부터 고수율 및 고순도로 정제된 우로키나제를 얻는 간단한 방법에 관한 것이다.

인뇨 중에 존재하는 우로키나제는 플라스미노겐(plasminogen)을 플라스민(pl asmin)으로 전환시켜서, 피브린(fibrin)을 용해시킬 수 있는 플라스민을 생성시키는 기능이 있다. 정제된 우로키나제는 혈관내 피브린 응고 형성에 기인하는 말초동정맥혈전증 및 심근경색증(心筋硬塞症)의 치료에 널리 임상 사용되어 있다.

인뇨로부터 우로키나제를 정제하기 위하여 종래에는 중금속, 황산바륨, 규산 및 그의 염류와 이온교환체와 같은 각종 흡착제를 사용하여 왔다(예컨대. 미합중국 특허 제3,542,646호 및 2,983,647호 참조). 그리하여 이들 흡수제를 혼합하여 사용하는 종래법은 지루할 뿐만 아니라 회수율도 빈약하였다.

본 발명자 등은 주성분으로서 아가로즈(agarose)와 아가로펙틴(agaropectin)을 함유하는 수불용성 폴리사카라이드가 우로키나제에 대해서 선택성이 우수한 흡착제임을 발견하였다. 본 발명자 등은 이 발견에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 간단한 방법에 의하여 양호한 수율로 고순도의 우로키나제를 회수하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기의 목적은 본 발명에 의한 방법에 의하여 성취될 수 있는데, 이 방법은 주성분으로서 아가로즈와 아가로펙틴을 함유하는 수불용성 폴리사카라이드를 사용하여 약산성 내지 중성 범위 내의 pH에서 조제 우로키나제 용액으로부터 우로키나제를 흡착시킨 다음 이 흡수된 우로키나제를 약알칼리 수용액 또는 고염농도(高鹽濃度) 용액으로 전개시키는 것이다.

인뇨의 그 자체 그대로 또는 본 발명 또는 상술한 종래법에 의해 일부 정제한 제제(製劑)를 본 발명에서 우로키나제의 출처로 사용한다.

주성분으로서 아가로즈 및 아가로펙틴을 함유하는 수불용성 폴리사카라이드는 적어도 50%이 아가로즈를 함유한다. 실질적으로는 염가의 한천과 또 주로 아가로즈로 구성되어 있고 종래 몰레큘라 시이브(molecular sieve)로서 사용되어 왔던 시판용 세파로오즈류(Sepharoses)(스웨덴국 웁살라시 소재, 파마시아 컴페니, 리미티드제)를 사용하는 것이 유익하다.

한천은 약 70%의 아가로즈와 약 30%의 아가로펙틴으로 구성되었으며 극히 안정되고 저렴하다는 것이 잘 알려져 있다. 한천은 우로키나제를 정제함에 있어서 유익한 결과를 가져오므로, 본 발명에서는 한천 사용이 권장된다. 한천은 분말 그대로를 사용하지만, 한천의 흡착능(吸着能)을 증대시키려면 세편상(細片狀)의 해면상 한천도 역시 사용된다.

세파로오즈는 아가로오즈 부분의 망상구조에 따라 세파로오즈 2B,4B 및 6B로 분류되며, 이들 중 어느 것이나 본 발명에 사용될 수 있다. 종래, 세파로오즈는 분자량의 크기와 형태에 따라 서로 상이한 분자량을 갖는 혼합물로부터 물질들을 분리하기 위한 소위 겔 여과제로서 사용되어 왔다. 본 발명은 전술한 몰레큘라 시이브의 효과와 전혀 상이한 세파로오즈의 특별한 흡착 효과를 발견함으로써 성취되었다는 것이 주목할만한 사실이다.

본 발명자 등은 한천과 세파로오즈가 선택적으로 약산 내지 중성 pH에서 우로키나제를 흡착한다는 사실을 발견하였다. 즉 우로키나제는 pH 약 4.0 내지 7.0 적합하기로는 pH 5.0 내지 6.0의 범위에서 전술한 수불용성 폴리사카라이드에 선택적으로 흡착된다.

본 발명에 따르면, 인뇨를 함유하는 우로키나제 수용액을 적합하기로는 완충염을 사용하여 상기 pH 범위로 조정한 다음, 한천, 세파로오즈 또는 주성분으로서 아가로즈와 아가로펙틴을 함유하며 적합하기로는 상기 pH 범위를 갖는 완충용액을 사용하여 미리 전술한 pH 범위에서 평형을 이룬 수불용성 폴리사카라이드와 접촉시킨다. 이 접촉은 우로키나제 용액을 폴리사카라이드의 컬럼을 통과시키든가 또는 폴리사카라이드와 우로키나제 용액과의 혼합물을 단지 교반시킴으로써 일으킬 수 있다. 사용한 염의 농도는 약 0.03 내지 0.15M 정도로 낮다. 이와 같은 저농도에서 우로키나제의 사용에 따라 고염용액에 의한 후속의 용리단계가 수월해진다.

그 다음에 우로키나제 함유가 폴리사카라이드를 알칼리 수용액 또는 중성염이나 중성 아미노산의 농액(濃液)과 접촉시킴으로써 우로키나제는 선택적으로 용리될 수 있다. 이 경우에 사용한 알칼리 수용액은 약 pH 8.0 내지 11.0, 적합하기로는 pH 8.0 내지 10.5이며, 약 2내지 4%의 암모니아 수용액이나 또는 황산암모늄, 인산나트륨 또는 염화나트륨과 같은 무기염을 약 0.01 내지 0.15M 함유하는 알칼리 수용액이나 또는 글리신 알기닌 또는 히스티딘과 같은 아미노산 약 0.05 내지 2% (W/V)알칼리 용액이 바람직하다. 사용한 고염용액은 약 0.2 내지 2M의 무기염 용액, 예를 들면 약 1M의 염화나트륨, 약 0.5M의 황산암모늄이나 약 5내지 10% (W/V)의 중성아미노산 용액을 함유하는 수용액이다.

본 발명에 의한 우로키나제의 정제 및 농축효과는 우로키나제에 흡착된 흡착물로부터 불순물들을 세척제거함으로써 고양(高揚)된다. 세척 용액은 pH 7 이하의 물이 사용될 수 있으나, 통상 우로키나제의 흡착을 위하여 사용한 것과 원래 동일한 중성 또는 약산성 용액이다. 예를들면, 0.05M 염화나트륨 용액이나 pH 5.5∼6.5의 인산나트륨 용액이 사용될 수 있다. 불순물의 선택적 제거는 어떤 아미노산이나 그의 염을 세척 용액에 첨가함으로써 더욱 증대될 수 있음을 발견하였다. 즉 0.05∼0.1M의 리신, 엡실론－아미노카프로산, 글리신, 세린, 시스테인, 히스티딘 또는 알기닌이 용해된 pH 5.5∼6.5의 전술한 무기염 용액을 사용하는 것이 효과적이다. 이들 아미노산 중에서 리신이 특히 적합한데, 이 이유는 비록 저농도에서도 효과를 발휘할 수 있기 때문이다. 본 발명에 있어서, 흡착, 용리 및 세척은 통상의 방법으로 행할 수 있는데, 피처리 수용액이 컬럼 내에 충전시킨 흡착제와 접촉되는 그러한 방법을 채택하는 것이 좋지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명 방법에 의해 용출된 우로키나제 용액은 필요에 따라 물 또는 등장 용액(isotonic solution)으로 투석하여 농축시킨 다음, 적당한 정도로 살균여과하여 생리학적으로 허용되는 우로키나제 제제를 얻는다. 이 제제는 동결 건조 하에 저장할 수 있다. 이것은 사용시 용액을 형성할 수 있다.

본 발명에 있어서, 우로키나제의 순도는 플로우그법(ploug's method)에 의해 용출된 우로키나제 용액의 효소활성도를 측정하여 산출하는데(Ploug: Biochem. Biophys. Acta, 제24권, 제278페이지(1957년) 참조), 이것은 단백질 mg당 플로우그 단위로 나타낸다(이 단위는 이하 "비활성도"로 칭한다). 정제된 우로키나제와 출발물질과의 비활성도의 비율은 달성된 정제도를 나타낸다. 수율은 또한 전체 단위에 기초해서 상기와 같이 동일한 방법으로 산출될 수 있다.

본 발명 방법에 의하여, 1단계 정제법에 의하여 인뇨로부터 7,000∼10,000단위/mg의 비활성도를 갖는 우로키나제가 수득되며, 출발 우로키나제 용액의 순도에 대하여 30배 이상의 순도를 갖는 일부 정제된 우로키나제(300∼500단위/mg)로부터 주사용에 사용할 수 있는 20,000∼30,000단위/mg의 바활성도를 갖는 고순도 우로키나제를 수득했다.

본 발명방법은 인뇨에 연속적으로 사용될 수 있으므로, 주사용에 사용할 수 있는 정제된 우로키나제 제제는 간단하게 수득될 수 있다.

주성분으로서 아가로즈와 아가로펙틴을 함유하며 본 발명 방법에 사용된 수불용성 폴리사카라이드는 pH 7.2에서 0.05M 염화나트륨 용액과 같은 묽은 약알칼리성 또는 중성 용액으로 세척함으로써 흡착력을 상실하는 일이 없이 반복해서 사용될 수 있다.

본 명세서에 있어서, "% W/V"란 용어는 용액의 용적 100부 중의 용질의 중량부이다.

본 발명을 실시예로서 상술하면 아래와 같다. 각 실시예에서 우로키나제의 단위는 플로우그 피브린 평판법에 따라 측정하였다(Ploug's fibrin plate method) (Ploug: Biochem. Biophys. Acta, 제24권, 제278페이지 (1957년) 참조).

[실시예 1]

냉수 1,000ml에 한천분말(나까라이가가구사제) 10g을 현탁시킨 현탁액을 30분간 정치한 다음에 상징액을 경사법으로 제거하였다. 침전물을 컬럼(3cm×15cm)에 충전시켰다. 이 컬럼에 0.15M 인산염 완충용액(pH 5.0) 200ml를 통과시켰다. 이어서, 전술한 바와 동일한 인산염 완충용액 층의 새로운 인뇨(550 단위/mg, 250 단위 /mg)로부터 일부 정제시킨 우로키나제 50ml를 이 컬럼에 유하시키면, 그에 따라 우로키나제는 컬럼에 흡착되고 다른 불순물들은 컬럼에 흡착됨이 없이 통과되었다. 이 컬럼을 약 100ml의 물로 세척하여 불순물을 제거시켰다. 이어서, 우로키나제를 1M 염화나트륨 용액 100ml로 용출시켰다. 우로키나제를 함유하는 분획을 수집하여 생리 식염수로 하룻밤 투석시켰다.

이와 같이 하여 얻은 우로키나제는 17,000 단위/mg의 비활성도를 가지며 출발원료의 31배 만큼 정제되었다. 그의 회수율은 82%이었다.

[실시예 2]

온수 250ml에 한천 분말(디프코사제) 5g을 현탁시킨 현탁액을 20분간 적당히 가열하여 용액으로 되게하였다. 여과지(도요 필터 페이퍼사제)를 사용하여 불용물질을 여과시킨 다음, 그 여액을 다른 용기 내에서 냉각하여 방치한 다음 －30℃로 완전히 냉동시켰다. 동결시킨 한천을 상수 중에서 서서히 용해시켜 다공성 해면상 한천을 얻고 이것을 약 0.1∼1cm³의 크기로 절단하였다.

신선한 인뇨를 pH 9.0으로 수정하고 석출되는 불용물을 원심분리하여 제거하였다. 그 다음에 정화시킨 인뇨 1,000ml에 상술한 해면상 한천을 투입하였다. 혼합물을 적당량의 염산을 사용하여 pH 6.0으로 조정한 다음. 약 1시간 동안 실온에서 완만하게 교반하여 인뇨중의 우로키나제를 해면상 한천에 흡착시켰다. 이 때에 해면상 한천을 수시로 압축시켜 우로키나제의 흡착을 증대시켰다. 흡착된 해면상 한천을 가아제를 사용하여 여과수집하고, 0.1M 리신을 함유하는 0.05M 염화나트륨 용액(pH 5.0) 약 50ml로 세척한 다음에 냉증류수 약 1,000ml로세척하였다. 이어서 흡착된 우로키나제를 0.5M 황산암모늄 용액 200ml로 용출시켜 용출물을 수집한 다음, 0.1M 인산염 완충용액(pH 7.0)으로 투석시킨 우로키나제 용액 200ml를 얻었다. 이와 같이하여 얻은 우로키나제의 비활성도는 9,000 단위/mg이었다.

[실시예 3]

실시예 2에서 사용한 해면상 한천을 컬럼(3cm×15cm)에 충전시키고, 0.05M 염화나트륨 용액(pH 7.2) 약 1,000ml로 세척한 다음, 0.03M 인산염 완충용액(pH 6.0) 약 100ml로 세척하였다. 냉수 20ml 중의 인뇨로부터 추출한 조제 우로키나제(비활성도 370 단위/mg) 55mg을 컬럼에 통과시켜 우로키나제를 한천에 흡착시켰다. 컬럼을 0.05M 엡실론－아미노 카프로산(pH 6.0)을 함유하는 0.1M 인산염 완충용액 약 500ml로 세척한 뒤 0.1M 인산염 완충액 500ml로 세척하여 컬럼으로부터 불순물을 완전히 제거시켰다. 그 다음에 0.1M 인산나트륨 용액(pH 9.0)을 사용하여 컬럼으로부터 우로키나제를 용출시켜서 우로키나제 활성도를 함유하는 분획을 수집하였다. 이와 같이 하여 얻은 우로키나제는 24,000 단위/mg의 바활성도를 가졌고 출발 물질의 65배로 정제되었으며, 그의 회수율은 82% 이었다.

[실시예 4]

냉수에 현탁시킨 세파로오즈 4B (스웨덴국, 파마시아사제) 100ml의 현탁액을 1시간 동안 방치하여 상징액을 경사법에 의하여 아직까지 현탁상태로 있는 미세한 세파로오즈 4B와 함께 제거시켰다. 이 침전물을 컬럼(3cm×15cm)에 충전시키고, 이어서 0.1M 인산염 완충액(pH 6.0)을 사용하여 유지하였다. 이어서, 0.5N HCl로 pH 6.0으로 조정한 후에 성인 남자로부터 수집한 새로운 인뇨 3ℓ를 컬럼에 통과시키면, 이에 따라 우로키나제는 컬럼에 선택적으로 흡착되는 대부분의 불순물들은 흡착되지 않은 채 컬럼을 통과하였다. 컬럼내에 잔존하는 불순물들은 0.05M리신 염산염을 함유하는 0.05M 염화나트륨 용액 200ml로 컬럼을 세척시켜 실질적으로 제거할 수 있다. 이어서, 우로키나제를 2% 암모니아(pH 10.5) 100ml로 용출시켰다. 생성되는 우로키나제 분획을 동결 건조시켜 9,400 단위/mg의 비활성도를 갖는 우로키나제 0.5mg을 얻었다.

[실시예 5]

세파로오즈 6B (스웨덴, 파마시아자제) 700ml를 냉증류수 2,000ml로 세척하였다. 이와 별도로 성인 남자로부터 수집한 새로운 인뇨 30ℓ를 냉수(거의중성) 10ℓ로 희석하였다. 희석시킨 이 인뇨를 상기의 세파로오즈 6B와 혼합하여 30분간 실온에서 교반하여 혼합물 중의 우로키나제를 세파로오즈 6B에 흡착시켰다. 다음에 우로키나제를 흡착한 세파로오즈 6B를 여과하고 여과지에 수집하였다. 흡착된 이 세파로오즈 6B를 약 1,000ml의 냉증류수로 세척한 다음, 0.1M 글리신을 함유하는 0.1M 염화나트륨 용액(pH 6) 약 1,000ml로 세척하였다. 이것은 0.01M 인산나트륨 용액 (pH 10) 500ml에 첨가하였다. 이 혼합물을 20∼30분간 실온에서 방치한 다음, 세파로오즈 6B로부터 용액으로 분리된 우로키나제를 진공여과하여 분리시켰다. 이 용액 염산을 사용하여 pH 7.2로 조정한 다음에 동결 건조시켜 8,700 단위/mg이 비활성도를 갖는 우로키나제 약 5mg을 수득했다.

[실시예 6]

실시예 5에서 사용한 세파로오즈 6B의 전량을 컬럼에 충전시키고 0.05M 염화나트륨 용액으로 세척하여 재생한 다음 0.1M 인산염 완충용액으로 pH 6에서 평형을 유지하였다. 용액 (pH 6) 1,000ml중의 조제 우로키나제(비활성도 430 단위/mg) 약 4g을 컬럼에 상에 도포하면 우로키나제는 특히 세파로오즈 6B에 흡착되고, 대부분의 불순물들은 흡착됨이 없이 컬럼을 통과하였다. 이 컬럼을 0.05M 인산나트륨 용액(pH 6) 500ml로 세척한 다음에, 0.05M 리신 염산염 (pH 6)을 함유하는 0.05M 염화나트륨 용액 1,400ml로 세척함으로써 불순물들은 실질적으로 완전히 제거되었다.

우로키나제를 1N수산화나트륨을 사용하여 pH 9.5로 조정시킨 0.01M 염화나트륨 용액 약 1,500ml로 용출시켰다. 이와 같이 하여 얻은 우로키나제는 비활성도가 32,000 단위/mg이고 출발원료인 조제 우로키나제 보다 약 74배로 정제되었다. 그의 회수율은 96% 이었다.

[실시예 7]

인뇨 30ℓ를 사용하여 우로키나제의 제조 규모를 증대시키는 것을 제외하고는 실시예 2로 반복하여, 비활성도가 7,800 단위/mg인 우로키나제를 함유하는 투석용액 1,000ml를 얻었다.

이 용액을 실시예 6에 기술한 방법에 의해 다시 처리하였다. 우로키나제를 함유하는 이 용액 약 1,500ml를 생리 식염수로 투석시키고 이 용액을 동결 건조시켰다. 비활성도가 37,000 단위/mg인 우로키나제 3.5mg을 얻었다.

Claims (1)

1. 주성분으로서 아가로즈 또는 아가로펙틴을 함유하는 수불용성 폴리사카라이드인 한천 또는 세파로오스상에 pH 4.0∼7.0의 범위내에서 우로키나제 수용액을 함유하는 불순물로부터 우로키나제를 흡착시킨 다음, 이 흡착된 우로키나제를 공지의 방법에 따라 알칼리성 수용액 또는 고염농도 용액으로 용출시킴을 특징으로 하는 우로키나제의 정제 및 회수법.