PT87641B

PT87641B - Processo para isolar e purificar activador de plasminogenio tecidual

Info

Publication number: PT87641B
Application number: PT87641A
Authority: PT
Inventors: Peter Arletti Dephillips; Samuel Gregg Franklin; Kyung Oh Johanson; Patrick Joseph Mcdevitt; Robert David Sitrin; James Edward Strickler
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1987-06-03
Filing date: 1988-06-01
Publication date: 1992-09-30
Also published as: PT87641A; DK295988A; DK295988D0; ZA883905B; EP0294132A3; EP0294132A2; JPS63317082A; AU1668988A

Description

ÂMBITO DO INVENTO

Este invento refere-se ao processo para purificação do acti vador do plasminogêneo tecidual humano, a partir de meio condicionado.

ANTECEDENTES DO INVENTO activador do plasminogêneo tecidual (tPA) è uma glioopro teína, grande e complexa, de peso molecular de, aproximadamente, 70 000. As suas caracteristicas estruturais incluem 17 pontes dissulfureto que contribuem para a sua conformação complexa.

A dobragem correcta da proteína parece ser essencial para a sua actividade. Barece ser esta a razão porque o tPA produzido por E. coli recombinante é, em grande parte, inativo. Esforços para rearranjar o tPA produzido pela E. coli recombinante não tiveram grande êxito dado que o rearranjo espacial é difícil de dirigir e controlar, conduzindo a uma incorrecta ou incompleta dobragem.

Rijken e colab., Biochem. Biophys. Acta 580 : 140 (1979), descrevem a purificação do tPA a partir de cultura de células uterinas por : (a) extracção a pH 4,2 ; (b) precipitação por sulfato de amónio; (c) cromatografia em quelato de zinco agaro se (pH 7,5); (d) cromatografia em n-butil agarose (pH 7,5); (e) cromatografia em concanavalina A agarose (pH 7,5); (f) filtração por gel com Sephades® G-150.

Meyhack e colab., EP-A-143,081, nas páginas 19-20, sugerem a purificação do tPA a partir de cultura de células de leveduras, por meios convencionais como precipitação por sal, electroforese em gel, diálise, cromatografia por permuta iónica, cromatografia por exclusão de tamanhos, HP10 ou HPLO de fase inversa, calibragem molecular por coluna de Sephade^ adequada, ou métodos similares. Exemplificados específicamente nos Exem pios 20 e 21 estão a precipitação por sulfato de amónio e a cr£ matografia de afinidade usando anticorpos anti-tPA e o Inibidor da Tripsina Erythrina latíssima (DE-3).

Oollen e colab., EP-A-41 766, descrevem a purificação do

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tPA a partir de cultura de células de melanoma por: (a) cromatografia em quelato de zinco agarose (pH 7,5) eluição com imidazolo; (b) cromatografia em lectina agarose (concanavalina A

Se (pH 7,5), eluição com x-D-metilmanosido (0,5M) e tiocianato (114); e (c) filtração por gel em dextrano reticulado ( Sephade^ G-150 ).

Kruithof e colab., Biochem. J. 226:651-656 (1985), revelam um esquema para purificação do tPA produzido pelas células sero-independentes do melanoma de Bowes, que inclui os seguin. / \ _ - - - _ - . — , _ \ _ * Λ-*

com HC1 6 M; (c) passagem da solução através duma coluna de SP-Sephadex^; e (d) eluição do tPA com NaCl num tampão de acetato de sódio a pH 4,5.

Dodd e colab., FEBS 209(1):15 (1986), referem a purificação do tPA por cromatografia em coluna de lisina e quelato de zinco.

Wallen e colab., Eur. J. Biochem. 155: 681 (1983), referem a purificação do tPA a partir de cultura de células de melanoma por: (a) cromatografia de afinidade usando anti-tPA porcino associado a Sepharose® (pH 7,5), e eluição com tiocianato (5M); (b) cromatografia de afinidade em arginina-Sepharose® (pH 7,5) e eluição com cloreto de guanidinio (114); e (c) filtração por gel com Sephadex® G-150.

Murakami e colab., Patente dos EUA N² 4 552 760, sugerem a purificação do tPA por cromatografia de afinidade utilizando fibrina agarose (Sepharose® de fibrina), lectina agarose, quelato de zinco agarose ou anticorpos anti-tPA; permuta iónica numa carboximetil agarose (CM Sepharose® ): e filtração por gel Uma purificação típica ê determinada por: (a) precipitação de sulfato de amónio; (b) cromatografia de permuta iónica em CM celulose; (c) cromatografia de afinidade em lisina Sepharose®; e (d) filtração por gel (Sephacryl® S-200). Como exemplo, Murakami e colab., revelam purificação a partir de cultura de cê lulas de tecido pulmonar por cromatografia de afinidade usando

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-5anticorpos anti-uroquinase e depois em fibrina Sepharose®, seguida por concanavalina A Sepharos^ e filtração por gel (Sepha dezsí® 0-150).

Wilson, EP-A-113 319, relata diversos esquemas de purifica ção do tPA, nas págs 15-17, incluindo alguns dos procedimentos acima referidos, assim como cromatografia em Affi-Gel® Blue e arginobenzamidina Sepharose®. Exemplo particular é a cromatografia de afinidade utilizando Sepharose® DE-3. Ver, também, Exemplo 5.

Wei e colab., ΞΡ-Α-178 105, relatam a purificação do tPA por: (a) extracção por polietilenoglicol dextrano; (b) cromato grafia de afinidade usando um corante; (c) cromatografia de afi nidade usando anticorpos anti-tPA; e, (d) filtração por gel.

Malefyt e colab., Pedido de Patente Europeia n^ 86305794.9, depositada em 28 de Julho de 1986, revelam uma formulação farmacêutica de tPA que contém tPA numa solução tamponada a pH

3,5-5,5.

Hasegawa e colab., Patente dos EUA n2 4 568 544 revela a purificação do tPA a partir duma cultura de células por um pro cesso que compreende cromatografia de permuta iénica em CM Sepharos^®, usando um tampão de pH 8,9 para eluição.

Radcliffe e colab., Arch. Biochem. Biophys. 189:185 (1978), descrevem a purificação de tPA a partir de plasma por cromatografia de afinidade em lisina acoplada a Sepharose^ 4B a pH 7,5, eluindo com NaCl, seguido por filtração em gel em Sephadex® Q-150 (pH 7,5).

SUMÁRIO BO INVENTO de passos

Este invento baseia-se na invenção/de processo, e de um processo completo preferido, que pode sor utiluzado para purificar tPA a partir duma cultura de células. Especificamente, num aspecto, este invento ê um “passo de captura” para isolar inicialmente o tPA de meio condicionado. Neste aspecto, o invento envolve o contacto do meio com um suporte sélido que adsorve o tPA; lavagem do suporte com água tamponada a píí<5; e

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-6eluição do tPA com uma solução aquosa dum sal de metal alcalino ou alcalino-terroso ou de um caotropo tamponado a pH<5.

Num outro aspecto, o invento é um processo para purificar tPA a partir duma solução aquosa impura contendo o tPA, proces so que inclui o contacto da solução com um suporte sólido hidró fobo ficando assim o tPA adsorvido ao suporte e depois eluição do tPA adsorvido do suporte com um solvente orgânico polar.

Ainda noutro aspecto, este invento é um processo para purificar tPA a partir duma solução impura contendo o tPA, processo que inclui fazer circular a solução através de um gel calibrador, em que as partículas têm dimensões inferiores a 50 /un e que tem uma gama de separação para pesos moleculares entre 1000 e 500 000, e recolher o tPA.

Noutro aspecto, este invento é um processo para purificar tPA a partir dum meio condicionado duma cultura de células que produz tPA, processo que inclui:

(i) contacto do meio condicionado com um suporte sólido ao qual o tPA fica adsorvido, lavagem do suporte com água tamponada a pHz5, seguida de eluição do tPA com uma solução aquosa de um sal de metal alcalino ou alcalino-terroso e/ou um caotropo tamponado a pH<5;

(ii) precipitação selectiva do tPA do eluente do passo (i) e redissolução do precipitado numa solução aquosa contendo um caotropo a pH 2-5,5;

(iii) contacto do precipitado redissolvido do passo (ii) com um suporte de afinidade e eluição do tPA numa solução aquo sa contendo um caotropo a pH<5;

(iv) contacto do eluido do passo (iii) com um stiporte hidrófobo ficando o tPA adsorvido ao suporte, seguido de eluição do tPA adsorvido do suporte com um solvente orgânico polar a pH 2-5,5;

(v) contacto do eluido do passo (iv) com uma resina permutador a de iões e recolha do tPA numa solução aquosa contendo

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-7um caotropo a pH<5;

(vi) passagem da solução de tPA do passo (v) através dum gel calibrador em que a dimensão das partículas é inferior a 50 e a gama de separação do gel é de 1000 a 300 000 em peso molecular e recolha do tPA, purificado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Este invento compreende trés passos de processo que podem ser utilizados num processo para isolar e purificar tPA a partir de uma sua solução impura. Estes são: um ‘'passo inicial de captura, um procedimento de cromatografia de fase inversa e um procedimento de cromatografia por exclusão de tamanhos. Cada um destes passos pode ser combinado com outros passos do proces, so, incluindo os outros passos do processo do invento, a fim de alcançar um processo completo para isolar e purificar tPA de uma cultura de células, procariotas ou eucariotas, nativas ou recombinantes produtoras.

Estes, e outros passos de processo úteis, são descritos em seguida no contexto dum processo completo ilustrativo do invento, processo que inclui o passo inicial de captura, o procedimento de cromatografia de fase-inversa, um procedimento de cromatografia por permuta iónica e o procedimento de cromatogra fia por exclusão de tamanhos. Nesta descrição deste processo que se segue, entre o passo inicial de captura e a cromatogra „ fia de fase-inversa, estão incluídos um passo de precipitação selectiva e um segundo passo de cromatografia de adsorção. Este processo do invento destina-se a isolar e recuperar tPA bioactivo a partir de meio condicionado, isto é meio recolhido duma cultura de células produzindo tPA. Este processo é especialmente útil no caso de meios que contém soro ou componentes do soro, especialmente albuminas. Por conseguinte, tal proces so pode ser usado para purificar tPA expresso por culturas de células recombinantes ou outras, incluindo células recombinantes de ovário de criceto Chinês (CHO), células recombinantes de rim de criceto, células recombinantes de mieloma de ratinho ou ratazana, cultura de células de melanoma e cultura de célu67 724

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-8W .-y ^ϊ-Α«>_β las recombinantes de insecto.

meio condicionado é recolhido por decantação a partir dum sistema de cultura em lotes ou por recolha do meio a partir dum sistema contínuo flow-through. 0 meio é, opcionalmente, clarificado por exemplo, por filtração e/ou centrifugação, sen do o tPA inicialmente isolado por cromatografia de adsorção.

Este passo é denominado passo de captura inicial porque resulta no isolamento da maior parte do tPA ao mesmo tempo que reduz substancialmente o volume do meio para processamento pos terior. Esta cromatografia de adsorção emprega um suporte sólido capaz de tratar um grande volume de meio a um caudal elevado e com alta eficiência. Um exemplo desta cromatografia de adsorção é a cromatografia utilizando um ligando de afinidade, tal como, anticorpos monoclonais ou policlonais, agentes auelantes de metal, lisina, arginina, fibrina, DE-5, vários coran tes, ácido borónico, boronato de fenilo, concanavalina A, p-ami nobenzamidina e benzamidina. 0 passo de captura preferido é a cromatografia por quelato de metal, especialmente cromatografia por quelato de zinco. Esta técnica está descrita, na generalidade, por Porath e colab., Nature 258:598 (1975). 0 suporte pode ser, por exemplo, um gel mole tal como dextrano, agarose ou gel de poliacrilamida, um gel rígido como o gel de plímero de vinil·)Eractogel®, 52-65 Am de tamanho (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois), ou qualquer outro suporte capaz de adsorver tPA que seja estável a pH inferior a 5.

Poi agora verificado que o passo de captura pode ser melho rado e pode de facto contribuir significativamente para a purificação, por lavagem do suporte de adsorção com água tamponada a pH inferior a 5 antes da eluição do tPA e por eluição do tPA a pH inferior a 5 numa solução aquosa de um sal de metal alcalino ou alcalino-terroso, por exemplo, NaCl, KOI, MgClg ou CaCl2> ou de um caotropo, por exemplo, guanidina, cloreto de guanidinio, tiocianato, ureia ou etilenoglicol.

Poi verificado por exemplo, que apesar da lavagem duma co luna de quelato de zinco a pH proximo de pH neutro, de acordo

IP'

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_Z b

-9com o procedimento padrão, remover uma quantidade significativa de contaminantes dum meio condicionado, uma segunda lavagem a pH <5 remove inesperadamente, uma quantidade ainda mais signi ficativa de contaminantes. Por exemplo, numa experiencia repre sentativa, na qual uma coluna de quelato de zinco foi lavada completamente, primeiro com água tamponada a pH 6 com acetato de amónio e depois com água tamponada a pH 4,5 com acetato de amónio, antes da eluição com NaCl 0,25 M tamponado a pH 4,5 com acetato de amónio; a primeira lavagem removeu uma quantidade de contaminantes aproximadamente igual â quantidade de tPA recuperado, e a segunda lavagem removeu uma quantidade inesperadamente elevada de contaminantes, igual a cerca de 10% da quantidade de tPA determinada por comparação dos picos num cromatograma mos, trando a absorvância a 280 nm.

Ao levar a cabo o passo de captura, a lavagem é preferencialmente realizada, no início, a pH superior a 5, por exemplo, pH 6-8 e, preferivelmente, pH de aproximadamente 6, após o que o pH é reduzido a pH<5, por exemplo, pH 4,0-4,9, preferencialmente a pH de aproximadamente 4,5. 0 agente tampão pode ser qualquer ácido/sal solúvel em água, por exemplo, ácido acético, ácido adípico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido aspártico e ácido glutâmico, e os seus sais. 0 tampão preferido ê o acetato de amónio.

Para eluir o tPA, ê utilizada uma solução de um sal inorgânico de metal alcalino ou alcalino-terroso ou de um caotropo a pH<5, por exemplo, pH 4,0-4,9. A solução de eluição preferida é de cloreto de sódio 0,1 a 1,0 M, preferivelmente 0,25 K, em acetato de amónio 0,1 K (pH 4,5).

A solução impura obtida a partir do passo de captura é, de preferencia, ainda parcialmente purificada antes da cromatografia de fase inversa. À purificação parcial pode ser obtida por qualquer meio incluindo, por exemplo, precipitação selectiva, permuta iónica, cromatografia de afinidade, filtração, cromatografia de fase normal e por exclusão de tamanhos, ou qualquer combinação destes ou outros passos. Preferencialmente a solu-

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-10ção impura foi parcialmente purificada de modo que o tPA ê, pelo menos, cerca de 50% puro e, de preferência, cerca de 75% a 95% puro, baseado no conteúdo proteico total anterior ao procedimento de fase inversa.

São exemplos de passos de processo para a obtenção de um grau de pureza desejado antes do procedimento de fase inversa a precipitação selectiva, p.e. precipitação por sal ou outro procedimento de precipitação selectiva, e pelo menos um passo de adsorção, p.e. cromatografia de afinidade ou cromatografia de imunoafinidade.

A precipitação por sal é realizada pela adição, por exemplo, de sais de sulfato, fosfato ou citrato, com catioes monovalentes, tais como, amónio, potássio ou sódio, num gradiente passo a passo. As fracções contendo o tPA precipitado, após lavagem, são ressuspensas a pH baixo, por exemplo, pH 2-5,5. Outros agentes para precipitação selectiva são solventes orgânicos, um álcool C 1-3, acetona, acetonitrilo ou tetra-hidro, furano; polímeros orgânicos como polietileno-glicol; polielectrólitos como poliacrilatos; sais do ácido caprílico; e rivanol.

Para o segundo passo de cromatografia de adsorção, pode ser utilizada uma grande variedade de ligandos. Estes incluem os ligandos de afinidade mencionados acima. A eiuição pode ser específica, isto é, eiuição de afinidade, ou geral, como por alteração do pH ou da força iónica ou alteração da conformação do tPA.

Verificou-se ser útil utilizar, por exemplo, um suporte de benzamidina, p.e. benzamidina-agarose. Para este procedimen to, a pelota de sulfato de amónio é preferencialmente ressolubilizada numa solução tamponada a pH de cerca de 5, por exemplo, de acetato de amónio 0,1 M, na presença de um caotropo e de um detergente, por exemplo, Tween-80 a 0,01%. A solução ê preferencialmente diluída ató uma absorvâheia a 280 nm de cerca de 5 a 6 unidades e aplicada ao suporte numa quantidade de 8 a 15 unidades de preferencialmente a cerca de 12 unidades de

A₂so» P^or “1 de gel. Preferencialmente, a concentração do cao-

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-11tropo é baixa, por exemplo, até 4 M de guanidina ou de cloreto de guanidínio, até 50% (v/v) de etileno-glicol, até 6 K de ureia ou até 2 M de tiocianato de potássio. 0 caotropo mais preferido é o cloreto de guanidínio cerca de 0,1 a 0,4 Μ. A eluição é levada a efeito baixando o pH para pH<5, por exemplo, pH de cerca de 4.

No processo preferido do invento, a solução parcialmente purificada pelo passo inicial de captura, que foi tratada por precipitação selectiva e por um segundo passo de cromatografia de adsorção, é depois tratada por cromatografia de fase inversa.

A cromatografia de fase inversa utiliza um suporte hidrófobo para adsorver uma proteína a partir de um solvente aquoso, seguida por eluição selectiva com um solvente orgânico polar, tipicamente uma mistura de álcool-água. 0 solvente orgânico po. lar provoca eluição por deslocação dos domínios hidrófobos no polipéptido. Muitas proteínas não podem ser purificadas deste modo devido â utilização de condições rigorosas poderprovocar a perda de actividade de uma proteína, em especial no caso de uma proteína cuja actividade depende da conformação.

A cromatografia de fase inversa ê realizada, tipicamente, usando um suporte de alquilsílica, apesar de se poder utilizar qualquer suporte hidrófobo, por exemplo, geles de hidrato de carbono substituído por alquilo ou de alumina. 0 suporte preferido é uma sílica ligada ^a θ]_8’ preferencialmente C^. Outros silanos incluem octildimetil, octadecildimetil, fenildimetil, actil, octadecil e fenil silanos. 0 tamanho das partículas pode ser de 5 a 100 /tm, com preferencia para cerca de 15

O a 20 yttm. A dimensão típica dos poros é de 200 a 500 A.

A solução impura, antes do passo de fase inversa, é preferencialmente ajustada a um pH muito baixo, por exemplo, de 1,5 a 3,5, com, p.e., ácido heptafluorobutírico, ácido acético, ácido fosfórico ou ácido trifluoroacético. A inclusão de um caotropo ou de um solvente orgânico na solução impura, p.e., cloreto de guanidínio 0,1 a 0,4 M, melhora a separação, aparen temente por dissociação dos agregados de tPA. A eluição ê tí67 724

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-12picamente efectuada pela adição de quantidades crescentes de um solvente orgânico para diminuir as interacções hidrófobas, como, p.e., acetonitrilo, dioxano, tetra-hidrofurano, ou um álcool mis cível em a água, por exemplo, etanol, metanol, n-propanol ou iso propanol. 0 gradiente de eluição preferido é 0-30% de isopropanol contendo 0,1% de ácido trifluoroacético.

Após a cromatografia de fase inversa, são desejáveis um ou mais passos finais de limpeza para produzir um produto que seja tPA de qualidade farmacêutica. Preferencialmente estes passos são de cromatografia de permuta iônica usando resinas permutadoras de iões padrão ou suportes funcionais com eluição a pH baixo, isto é, pH 2 a 5,5, na presença de um caotropo, seguida de exclusão por tamanhos.

passo de permuta iónica serve para concentrar o tPA e remover o solvente orgânico. Preferencialmente este procedimento é realizado utilizando um suporte permutador de catiões, tal como um suporte de carboximetilo ou sulfopropilo. Alternativamente, pode ser utilizado um suporte permutador de aniões, como um suporte dietilaminoetilo ou aminoetilo quaternário.

As fracções recolhidas da coluna de permuta iónica e que contem tPA podem ser então tratadas por exclusão de dimensões.

passo de exclusão por dimensões ê realizado utilizando um enchimento de partículas pequenas, p.e., inferior a 50/im, com uma gama de separação para pesos moleculares de 1000 a 300 000. Foi verificado que, usando este gel, podem ser removidos vestígios residuais de contaminantes de alto peso molecu lar. Por exemplo, a agarose reticulada, Superose^ 12, (Pharma cia, Piscataway, Nev; Jersey) que tem uma dimensão média de par ticuias de 20-40 #m e uma gama de separação para pesos moleculares de 1000 a 300 000, separa facilmente o tPA, cujo peso mo lecular é de cerca de 70 000, dum contaminante de alto peso mo lecular (Ptí < cerca de 90 000), encontrado nas preparações de tPA obtidas a partir de meio condicionado contendo soro após a realização dos procedimentos já descritos, anteriores à exclusão por tamanhos. Esta separação de proteínas fisicamente se-

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SKB CASE 14304 melhantes, por cromatografia de exclusão de tamanhos, foi ines perada. Este procedimento também remove agregados residuais de tPA, incluindo dímeros e ácidos nucleicos, e, se presentes, partículas de vírus.

passo de exclusão por dimensões ê, de preferência, leva do a cabo na presença dum caotropo, preferencialmente cloreto de guanidínio 2 M, com pH ajustado a pH4 5. 0 caotropo rompe os agregados e permite a separação eficiente realizada neste passo. Convenientemente, o tPA pode ser eluido da resina permutadora de catiões com um tampão de eluição contendo esse cao tropo. Isto vai melhorar a dissociação e minimizar a formação de agregados de tPA.

As fracções contendo tPA obtidas do passo de exclusão por dimensões, são recolhidas para a formulação final, filtração estéril e embalagem. Antes da formulação final, o sal pode ser removido por, p.e., diálise, diafiltração, evaporação ou permu

Cada passo de processo do invento, como já foi referido anteriormente, pode ser combinado com outros passos que podem, ou não, ser passos de processo deste invento. Preferencialmen te, os passos de processo do invento sSo combinados da forma ilustrada no Esquema I, que se segue:

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-14ESQUERA I

REIO CONDICIONADO

Quelato de Zn Practogei®

ELUÍDQ

Sulfato de amónio

PRECIPITADO

J Lavagem/Dissolução/Filtração FILTRADO

Benzamidina agarose ELUIDO

HPLC (fase inversa)

FRACÇOES

J, CK-Sepharos^

ELUIDO

Superose® 12

FRACÇOES

Permuta de tamoão/Diafiltração/Concentraç&o CONCENTRADO filtro de 0,2 /un PRODUTO tPA ER RA3SA processo ilustrado no Esquema I utiliza colunas de cromatografia adequadas para processamento em larga escala. 0 uso de pH baixo ao longo de todo o procedimento ê vantajoso devido à estabilidade e solubilidade aumentadas do tPA e, inesperadamente, o pH baixo permite uma separação mais eficaz. Além disso, o plí baixo tende a suprimir as enzimas proteolíticas do meio condicionado. Igualmente, as condições do processo são tais que inactivam possíveis contaminantes virais, Rais importante ainda,

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-15por este processo é obtido, com grande rendimento, tPA puro, totalmente activo e não-desnaturado.

Após a purificação, a solução de tPA puro pode ser submetida a filtraçSo estéril e formulada para subsequente administração farmacêutica, tal como descrito por Malefyt e colab., no Pedido de Patente Europeia n^ 86305794.9.

EXEMPLO

Exemplo que se segue é ilustrativo da concretização pre. ferida do invento, mas não é limitativo. 0 processo está suma rizado no Esquema I anterior. 0 meio condicionado foi recolhi do de células de ovário de criceto Chinês (OHC) recombinantes desenvolvidas num meio de recolha de Meio Essencial Mínimo (MEM), alfa ( + ) com nucleósidos (Hazelton Research Products, Denver, Pennsylvania), suplementado com soro fetal de vitelo (5% v/v), gentamicina (0,05 g/1), metotrexato (200 nM), dexametasona (1 /iM) e NaHCO^ (2,2 g/L).

Coluna de quelato de zinco

Uma coluna de quelato de zinco Eractogel (1,5 a 7 L) é pre parada durante um dia de uso por equilíbrio de uma coluna de ácido iminodiacético imobilizado em Eractogel TSK HW-65P com cinco volumes de coluna de BETA 0,05 M, cinco volumes de coluna de bicarbonato de amónio 0,05 M, cinco volumes de coluna de água desionizada, cinco volumes de coluna de ZnC^ 7,3 mM e dez volumes de coluna de tampão de Equilibrio (MaCl 1 M, Tris-HCl 20 mM), até que nenhum ião zineo possa ser detectado no efluen te. 0 meio condicionado (100 a 500 L) é bombeado para a coluna a um caudal de 6 a 50 l/hora, dependendo do tamanho da colu na. A coluna é lavada com cinco volumes de coluna de tampão de Equilíbrio, 5 volumes de coluna de acetato de amónio 0,1 M (pH 6,0) e 2 volumes de coluna de acetato de amónio 0,1 M (pH 4,5).

produto é, em seguida, eluído com 5 volumes de coluna do tampão de Eluição (acetato de amónio 0,1 K, NaCl 0,25 M, pH 4,5).

As fracções contendo tPA, tal como é determinado pelo ensaio S-2251 (Weinberg e colab., J. Immunol. Meth. 75:289 (1984)) sã-o reunidas para processamento posterior.

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-162 Precipitação por Sulfato de Amónio

Sulfato de amónio granulado é adicionado gradualmente à solução das fracções reunidas a partir da coluna de quelato de zinco, até uma concentração final de 52% de saturação. A solução é agitada durante 30 minutos a 4°C e depois deixada em repouso durante, pelo menos, 12 horas a 4°C. A suspensão é centrifugada numa centrífuga Beckman J6B (Beckman Instruments, Pul lerton, Califórnia) a 4000 rpm durante 30 minutos a 4°C e a pelota é recolhida e armazenada a -70°C até ser utilizada no passo seguinte.

As pelotas de sulfato de amónio descongeladas (200-300 g), contendo, estimativamente, 12 a 16 g de tPA, tal como determinado no ensaio S-2251, são ressuspensas em 2-3 I> de sulfato de amónio saturado a 52% e a suspensão é centrifugada a cerca de 9 000 x g num rotor Beckman JA10 durante 30 minutos a 4°C a fim de obter uma pelota lavada para processamento posterior.

Coluna de Benzamidina Agarose

A pelota de sulfato de amónio lavada, produzida no passo anterior, é dissolvida em acetato de amónio 0,1 M contendo cio reto de guanidínio 0,2 K e 0,01% de Tween-80 (pH 5,0), e a solução é diluída até uma DO^qq de 5 a 6 (volume final de aproxi madamente 71). A solução ê filtrada através dum filtro de 0,22 micra e transferida para uma coluna carregada com 2 I de benzamidina agarose f(l> -aminobenzamidina imobilizada acoplada a agarose reticulada perlada (beaded) a 4%, via ácido 6-aminocapróico (Pierce Chemical Company, P.ockford, Illinoisa um caudal de 3 l/h. A coluna é lavada com 8 1 duma solução contendo acetato de amónio 0,1 M, cloreto de guanidínio 0,3 M, tiocianato de potássio 0,3 M, 0,01% de Tween-80 (pH 5,0) a um caudal de 8 l/h. 0 tPA ê eluido da coluna com acetato de amónio 0,1 H contendo cloreto de guanidínio 0,2 K e 0,01% de Tween-80 (pH 4,0) a um caudal de 8 l/h. As fracções contendo tPA, determinadas pela monitorização da absorvância em UV do efluente a 280 nm, são reunidas até um volume de, aproximadamente, 5 B.

Cromatografia de fase inversa

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-17A solução de fracções reunidas da coluna de benzamidina agarose é ajustada, a 4°0, a um pH de 2,1 í 0,1, com ácido tri fluoroacético (TPA) e submetida a cromatografia, em porções de aproximadamente 1 grama, em enchimento C-4 de 300 Angstrom Vydac 214 TP, (sílica de 15-20 >u,m) (Separations Group, Hesperia, Califórnia), numa coluna de 5,1 x 25 cm, previamente equilibra da com uma solução aquosa a 0,1% de ácido trifluoroacético, uti lizando um gradiente de 0 a 30% de isopropanol contendo ácido trifluoroacético a 0,01%, a um caudal de 80 ml/min. 0 produto desejado elui a, aproximadamente, 27% de isopropanol, tal como é detectado pela monitorização da absorvância em UV pelo efluente a 220 nm.

Cromatografia em OM Sepharose

A solução de fracções combinadas contendo tPA, da cromato grafia de fase inversa é diluída com um volume igual de acetato de amónio 1 M (pH 4,5) e bombeada para uma coluna de 400 ml de CM Sepharose (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) a um caudal de 100 ml/min. A coluna é lavada com, aproximadamente,

1,2 L de acetato de amónio 0,5 M (pH 4,5), 1,2 L de acetato de amónio 1 M (pH 4) e o produto desejado é eluido com acetato de amónio 0,1 M contendo cloreto de guanidínio 2 M (pH 4,0). 0 tPA no efluente é detectado pela monitorização da absorvância em UV a 280 nm. As fracções contendo tPA (aproximadamente 600 a 800 ml) são reunidas para processamento posterior.

Cromatografia em Superose-12 produto isolado da coluna de CM Sepharose é submetido a cromatografia, em tres a quatro porções de 200-300 ml, numa co. luna de 8 I de Superose 12 grau prep utilizando acetato de amó nio 0,1 M contendo cloreto de guanidínio 2 M (pH 4,0). As frac ções são reunidas eom base na pureza determinada por análise por HPLC.

Permuta de Tampão conjunto das fracções da coluna de Superose-12, contendo o produto desejado, é submetido a cromatografia, em duas a tres

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SKB CASS 14304

-18porções, numa coluna de 8 1 de Sephadex G-25 utilizando acetato de amónio 0,1 M (pH 4) a fim de efectuar a permuta de tampão. 0 efluente é monitorizado por UV a 280 nm e as fracções contendo o produto desejado são reunidas e concentradas numa célula de ultrafiltração sob agitação equipada com uma membrana PM-30 até uma DO₂₈₀ de 22 ± 1. A solução concentrada é fil trada através dum cartucho de 0,22 micra para obter uma solução de tPA global puro para formulação.

Alternativamente, o produto resultante da Superose-12 com binado ê concentrado numa célula de ultrafiltração sob agitação equipada com uma membrana PM-30, atê uma BOgsO ^de ί 1 e depois diafiltrado contra 10 volumes de acetato de amónio 0,1 K (pH 4). A solução concentrada é filtrada através dum cartucho de 0,22 micra para obter uma solução de tPA global puro para formulação.

A Tabela I descreve os resultados duma experiência de pro dução típica, partindo de 1667 L de meio condicionado contendo, estimativamente, 20 g de tPA tal como determinado pelo ensaio S-2251 utilizando o padrão de actividade da American Diagnostica (American Diagnostica, Greenwich., Connecticut) e presumindo 700 000 Ul/mg.

A primeira coluna da Tabela I regista a quantidade total de bioactividade, em biliões de unidades internacionais (BUI), presente em cada passo do processo e medida segundo o ensaio S-2251 utilizando o padrão de activadade da American Diagnostica. A segunda coluna da Tabela I regista a percentagem cumulativa de recuperação da bioactividade no decurso da purificação. A recuperação de bioactividade foi, na globalidade, de 37%. A terceira coluna regista a percentagem de recuperação para cada passo.

A recuperação da massa de tPA durante o processo foi deter minada por análise por HPLC. Os níveis de tPA, expressos em gramas, presentes em cada etapa para passos após a coluna de captura de quelato de zinco estão registados na coluna 4. A quantidade de tPA presente no meio condicionado não pode ser

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SKB CASE 14304

-19-4“ “Τ'* determinada neste ensaio.

A coluna 5 regista a percentagem de recuperação do tPA em cada passo, para os passos ensaiados pela análise de ΕΡΙΟ.

A coluna 6 regista o conteúdo proteico total em cada etepa do processo de purificaç-ão. 0 nível proteico total (tPA mais todos os outros constituintes) do meio condicionado contendo 5% de soro fetal de vitelo (SFV) pode ser calculado como sendo de 2 g/l, dado que o SPV contém 40 mg de proteínas por ml. A massa do conteúdo proteico do meio condicionado resulta do SPV adicionado. A quantidade total de todas as proteínas presentes (tPA mais contaminantes) em cada um dos passos da purificação foi estimada por UV a 280 nm assumindo que 1,8 uni dades de Α₂θθ correspondem a 1 mg de proteína por ml.

A actividade específica em cada passo do processo foi cal culada dividindo a actividade S-2251 em UI (coluna l) pelo con teúdo proteico total (coluna 6) e é expressa em Ul/mg.

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SKB OASE 14504

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SKB CASE 14304 *4 ,//

-21d (1) Padrão de Actividade da American. Diagnostica (2) BUI = 10⁹ UI (3) Assumindo que 1,8 DO = 1 mg de proteína total/ml, excepto no meio condicionado (Soro a 5%) no qual a proteína total está calculada como sendo de 2 g/l.

(4) A actividade específica foi calculada dividindo a actividade S-2251 total (coluna 1) pelo conteúdo proteico total (coluna 6), em cada passo.

Dadas as dificuldades técnicas na medição de quantidades vestigiais de ácidos nucleicos contaminantes, a remoção do ADN foi efectuada por factores de depuração utilizando ADN marcado com P32 de cerca de 500 pares de bases, para cada passo. O fac tor de depuração de agregados estimado para todo o processo é 6 x 10».

A inactivação dos vírus pelo processo é demonstrada pela incubação de retrovírus durante períodos de tempo e sob condições substancialmente idênticas às de cada passo do processo.

factor de inactivação agregado para os passos de fase inversa e permuta iónica ê estimado como sendo de mais de 3,7 x 10.

A descrição e os exemplos anteriores descrevem totalmente o invento e as suas concretizações preferidas. 0 invento, con tudo, não está limitado às construções precisas aqui descritas mas abrange todo o âmbito, incluindo modificações, das reivindicações que se seguem.

Claims

lã. - Processo para isolar activador de plasminogênio tecidual (tPA) a partir dum meio condicionado duma cultura de cé lulas que produz tPA, caracterizado por se fazer contactar o meio com um suporte sólido ao qual o tPA fica adsorvido, se la var o suporte com água tamponada a pH<5, e em seguida se eluir o tPA com uma solução aquosa de um sal de metal alcalino ou de metal alcalino-terroso ou um cao tropo tamponado a pH<5.

2ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por o passo de lavagem ser inicialmente realizado a um pH>5 após o que o pH ê diminuído para pH 4,0-4,9.

3^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por o suporte conter um ligando quelante de metal.

4^â. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteri zado por o suporte ser uma coluna de quelato de zinco e por o suporte ser lavado a pB 4,0-4,9.

5^â. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteri zado por o tPA ser eluido com 0,1 a 1,0 M de NaCl.

6ã. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteri zado por o passo de lavagem ser inicialmente realizado a um pH de cerca de 6 em acetato de amónio 0,1 M, após o que o pH é di minuído para aproximadamente 4,5 e por o tPA ser eluido com NaGl 0,25 M em acetato de amónio 0,1 K a pH 4,5.

7^â. - Processo para purificar tPA duma solução aquosa impura contendo o tPA, caracterizado por se fazer contactar a so lução com um suporte hidrofótico sendo o tPA adsorvido ao suporte e em seguida se efectuar a eluição do tPA adsorvido do suporte, com um solvente orgânico polar a pH 2-5,5.

8ã. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteri zado por a solução impura ser, pelo menos, cerca de 50% pura antes de se fazer contactar a solução com o suporte hidrofóbico e por o suporte hidrofóbico ser uma alquilsílica Oq.qg·

9^S. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracteri-

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SKB CASE 14504 ,Λ

-2>

zado por a solução impura ser ajustada a um pH de 1,5 a 5,5 e por se adicionar guanidina, cloreto de guanidinio, ureia, tiocianato ou etileno-glicol à solução impura antes do contacto da solução com o suporte hidrofóbico.

10-. - Processo de acordo com a reivindicação δ, caracterizado por a solução impura ser derivada dum meio condicionado duma cultura de células que produz tPA por, pelo menos, um pas so de cromatografia de adsorção.

llâ. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o meio condicionado ser parcialmente purificado por:

i) cromatografia de adsorção utilisando um suporte auela to de zinco e eluição com sal a pH < 5;

ii) precipitação com sulfato de amónio; e em seguida iii) cromatografia de adsorção, precedendo o contacto da solução com o suporte hidrofóbico.

12§. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracte. rizado por a segunda cromatografia de adsorção ser realizada usando um suporte de benzamidina e por eluição a um pH<5.

15^â. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracte rizado por após a eluição do tPA adsorvido do suporte hidrofóbico, a solução purificada ser posta em contacto com uma resina permutadora de iões e eluida a um pH entre 2 e 5,5, na presença de guanidina, cloreto de guanidinio, ureia, tiocianato ou etileno-glicol.

14^â. - Processo para purificar tPA a partir duma solução impura contendo o tPA, caracterizado por se fazer passar a solução por um gel calibrador, sendo a dimensão das partículas inferior a 50 A® θ estando o poder de separação do gel na gama de pesos moleculares de 1000 a 500 000, e por se recolher o tPA.

15^&. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a solução conter guanidina, cloreto de guanidinio, ureia, tiocianato ou etileno-glicol e ser ajustada a pH45 antes da calibragem.

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SKB CASB 14304 z

-2416ã. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracte rizado por o gel calibrador ser Superose® 12”.

17^â. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracte rizado por a solução conter acetato de amónio 0,1 K e cloreto de guanidínio 2 K e ter um pH de cerca de 4, antes da calibragem.

18ã. - Processo para purificar tPA a partir dum meio condicionado duma cultura de células que produz tPA, caracterizado por incluir os seguintes passos:

i) contacto do meio condicionado com um suporte sólido ao qual o tPA é adsorvido, lavagem do suporte com água tamponada a pH<5 e depois eluição do tPA com uma solução aquosa dum sal de metal alcalino ou alcalino-terroso e/ou um caotropo tampo mada a pH45.

ii) precipitação selectiva do tPA do eluido do passo i) e redissolução do precipitado numa solução aquosa contendo um caotropo, cloreto de guanidínio, ureia, tiocianato ou etileno-glicol a pH 2-5,5;

iii) contacto do precipitado redissolvido do passo ii) com um suporte de adsorção e eluição do tPA numa solução aquo sa contendo um caotropo a pH<5;

iv) contacto do eluido do passo iii) com um suporte hidrofóbico sendo o tPA adsorvido ao suporte e depois eluição do tPA adsorvido do suporte com um solvente orgânico polar a pH
2-5,5;

v) contacto do eluido do passo iv) com uma resina permutadora de iões e recolha do tPA numa solução aquosa contendo um caotropo a pH<5.

vi) passagem da solução de tPA do passo v) através dum gel calibrador, sendo a dimensão das partículas inferior a 50 >m e estando o poder de separação do gel na gama de pesos mole culares de 1000 a 300 000, e em seguida recolha do tPA purificado.