JPH082301B2 - 逆相液体クロマトグラフィーによるｔ−ＰＡ精製方法 - Google Patents
逆相液体クロマトグラフィーによるｔ−ＰＡ精製方法Info
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- JPH082301B2 JPH082301B2 JP62305940A JP30594087A JPH082301B2 JP H082301 B2 JPH082301 B2 JP H082301B2 JP 62305940 A JP62305940 A JP 62305940A JP 30594087 A JP30594087 A JP 30594087A JP H082301 B2 JPH082301 B2 JP H082301B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−p
A）を含む組織抽出画分、培養細胞抽出画分、培養細胞
培養上清、あるいはそれらの濃縮画分や粗精製画分を逆
相液体クロマトグラフィーで展開しt-PAを他の細胞成分
または培地成分から分離し、高純度t-PAを得る方法に関
する。
A）を含む組織抽出画分、培養細胞抽出画分、培養細胞
培養上清、あるいはそれらの濃縮画分や粗精製画分を逆
相液体クロマトグラフィーで展開しt-PAを他の細胞成分
または培地成分から分離し、高純度t-PAを得る方法に関
する。
（２）従来の技術 t-PAの精製に関連する技術としては、亜鉛キレートカ
ラムあるいはコンカナバリンＡカラムを用いたカラムク
ロマトグラフィー（Rijken,D.C.＆ Collen,D.,（198
1）,J.Biol.Chem.,256,7035）、エリスリナトリプシン
インヒビタ−アフィニティカラムクロマトラフィー（特
開昭59-110625）、イオン交換カラムを用いたカラムク
ロマトグラフィー（Sueishi,K.et al.,（1982）,Biodhi
m.Biophys.Acta,717,327）、抗t-PA抗体アフィニティー
カラムクロマトグラフィー、リジンまたはアルギニンセ
ファロースカラムクロマトグラフィー（Einarsson,M.et
al.,（1985）,Biochim.Biophys.Acta,83,1）等各種液
体カラムクロマトグラフィーが知られている。
ラムあるいはコンカナバリンＡカラムを用いたカラムク
ロマトグラフィー（Rijken,D.C.＆ Collen,D.,（198
1）,J.Biol.Chem.,256,7035）、エリスリナトリプシン
インヒビタ−アフィニティカラムクロマトラフィー（特
開昭59-110625）、イオン交換カラムを用いたカラムク
ロマトグラフィー（Sueishi,K.et al.,（1982）,Biodhi
m.Biophys.Acta,717,327）、抗t-PA抗体アフィニティー
カラムクロマトグラフィー、リジンまたはアルギニンセ
ファロースカラムクロマトグラフィー（Einarsson,M.et
al.,（1985）,Biochim.Biophys.Acta,83,1）等各種液
体カラムクロマトグラフィーが知られている。
各種液体カラムクロマトグラフィーでt-PAを分離、精
製する場合、t-PAの分離を助ける目的で溶離液中に各種
有機物または無機物を添加するので、次のステップでt-
PAとそれら添加物を分離する必要が生じる。その為に通
常はさらに他の液体カラムクロマトグラフィーを行なう
必要があり、精製物を得る為に煩雑かつ長時間の工程を
要した。
製する場合、t-PAの分離を助ける目的で溶離液中に各種
有機物または無機物を添加するので、次のステップでt-
PAとそれら添加物を分離する必要が生じる。その為に通
常はさらに他の液体カラムクロマトグラフィーを行なう
必要があり、精製物を得る為に煩雑かつ長時間の工程を
要した。
（３）発明が解決しようとする問題点 従来の技術を用いて各種液体クロマトグラフィーでt-
PAを精製を行うと、t-PAをカラムから溶出する際に使用
する溶離液中に含まれる各種有機物あるいは無機物をt-
PAと分離する為に多大な労力と時間を要した。
PAを精製を行うと、t-PAをカラムから溶出する際に使用
する溶離液中に含まれる各種有機物あるいは無機物をt-
PAと分離する為に多大な労力と時間を要した。
そこで逆相液体クロマトグラフィーを用い、易揮発性
有機溶媒を含む極性移動相を用いてt-PAを分離、精製す
ることができれば、そのステップでt-PAと極性移動相で
ある分離用溶液との分離は減圧下蒸発により簡単にでき
るので有用である。
有機溶媒を含む極性移動相を用いてt-PAを分離、精製す
ることができれば、そのステップでt-PAと極性移動相で
ある分離用溶液との分離は減圧下蒸発により簡単にでき
るので有用である。
しかしながら、糖鎖を有し分子量が比較的大きく（M.
W.約79 KDa）かつ複雑な立体構造をつくるといった特徴
を有するt-PAを逆相液体クロマトグラフを用い分離を試
みると、その性質に由来してt-PAと逆相カラムを構成す
る活性基、あるいはその活性基の担体との間で予想外の
相互作用を起こし、予想されるシャープな展開パターン
での分離をなし得なくなる。
W.約79 KDa）かつ複雑な立体構造をつくるといった特徴
を有するt-PAを逆相液体クロマトグラフを用い分離を試
みると、その性質に由来してt-PAと逆相カラムを構成す
る活性基、あるいはその活性基の担体との間で予想外の
相互作用を起こし、予想されるシャープな展開パターン
での分離をなし得なくなる。
本発明者らは、上述のt-PAの逆相カラム内での非特異
的吸着の問題を易揮発性有機溶媒を含み、かつ水素イオ
ン濃度が、下限がカラム担体が溶解せず、上限がt-PAを
溶離する条件を満たす範囲である極性移動相を使用する
ことで解決し、その結果得られた高純度t-PAに生理学的
活性の低下がないことを発見し、本発明を完成するに到
った。
的吸着の問題を易揮発性有機溶媒を含み、かつ水素イオ
ン濃度が、下限がカラム担体が溶解せず、上限がt-PAを
溶離する条件を満たす範囲である極性移動相を使用する
ことで解決し、その結果得られた高純度t-PAに生理学的
活性の低下がないことを発見し、本発明を完成するに到
った。
本発明を用いると従来分離が容易でなかった１本鎖t-
PAと２本鎖t-PAを容易に分離できることがわかり、フィ
ブリン親和性の高い１本鎖t-PA（Rijken,D.C.et al.,
（1982）,J.Biol.Chem.,257,2920）を簡単に得ることが
できるので有用である。
PAと２本鎖t-PAを容易に分離できることがわかり、フィ
ブリン親和性の高い１本鎖t-PA（Rijken,D.C.et al.,
（1982）,J.Biol.Chem.,257,2920）を簡単に得ることが
できるので有用である。
本発明は、また、いわゆる高性能液体クロマトグラフ
（HPLC）を使用することにより、従来のカラムクロマト
グラフィーに比べ非常に短い時間で分離を終了させるこ
とが容易に可能となるので有用である。
（HPLC）を使用することにより、従来のカラムクロマト
グラフィーに比べ非常に短い時間で分離を終了させるこ
とが容易に可能となるので有用である。
（４）問題を解決するための手段 本発明のいう逆相液体クロマトグラフィーは非極性固
定相と極性移動相で構成される。
定相と極性移動相で構成される。
非極性固定相の活性基（Ｒ）としてはｎが０から20で
あるアルキル基｛R:-(CH2)nCH3｝、シアノアルキル基
｛R:-(CH2)nCN｝、フェニルアルキル基、ジフェニルア
ルキル基等が有効であることが知られており、活性基の
担体としては通常シリカが用いられ、それら両者で構成
される非極性固定相はカラムに充填され使用される。
あるアルキル基｛R:-(CH2)nCH3｝、シアノアルキル基
｛R:-(CH2)nCN｝、フェニルアルキル基、ジフェニルア
ルキル基等が有効であることが知られており、活性基の
担体としては通常シリカが用いられ、それら両者で構成
される非極性固定相はカラムに充填され使用される。
活性基がアルキル基であるC4またはC18逆相カラムは
市販されており、入手も容易で本発明の目的を達成する
が、逆相液体クロマトグラフィーとして働くC1、C3、C8
あるいは上述の他の非極性活性基ならいかなるものも使
用できる。
市販されており、入手も容易で本発明の目的を達成する
が、逆相液体クロマトグラフィーとして働くC1、C3、C8
あるいは上述の他の非極性活性基ならいかなるものも使
用できる。
本発明で用いられる極性移動相は、水を主成分とする
溶液Ａと易揮発性有機溶媒を主成分とする溶液Ｂを任意
の割合で混合して供給される溶液である。
溶液Ａと易揮発性有機溶媒を主成分とする溶液Ｂを任意
の割合で混合して供給される溶液である。
本発明で用いられる極性移動相の水素イオン濃度は、
下限がカラム担体が溶解せず、上限がt-PAを溶離する条
件を満たす範囲に設定する。
下限がカラム担体が溶解せず、上限がt-PAを溶離する条
件を満たす範囲に設定する。
すなわち、極性移動相の水素イオン濃度はt-PAと非極
性固定相との予期せざる相互作用をさける目的で中性付
近より、より低く設定する。ある特定な条件で逆相カラ
ムでt-PAを分離する場合、極性移動相の水素イオン濃度
は4.5より低くする。より好ましくには3.5より低くす
る。
性固定相との予期せざる相互作用をさける目的で中性付
近より、より低く設定する。ある特定な条件で逆相カラ
ムでt-PAを分離する場合、極性移動相の水素イオン濃度
は4.5より低くする。より好ましくには3.5より低くす
る。
もちろん、極性移動相の水素イオン濃度が低すぎる
と、非極性固定相担体の溶解の問題が生じ、またt-PA自
身の変性の可能性も高まるのでそれらの問題が起きない
程度の水素イオン濃度でなければならない。
と、非極性固定相担体の溶解の問題が生じ、またt-PA自
身の変性の可能性も高まるのでそれらの問題が起きない
程度の水素イオン濃度でなければならない。
すなわち、ある特定な条件で逆相カラムでt-PAを分離
する場合、極性移動相の水素イオン濃度は1.0より高く
する。
する場合、極性移動相の水素イオン濃度は1.0より高く
する。
極性移動相に使用する溶液Ｂの主成分は親水性かつ易
揮発性有機溶媒ならいかなるものでも良いが、アセトニ
トリル、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノ
ール、ｎ−プロピルアルコール、あるいはこれらの混合
物を使用するとプラスミノーゲン活性化因子の活性をそ
こなうことなく効率的な分離、精製を行うことができ、
また分離後それら親水性かつ易揮発性有機溶媒を減圧下
蒸発により効率的に除くことができる。
揮発性有機溶媒ならいかなるものでも良いが、アセトニ
トリル、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノ
ール、ｎ−プロピルアルコール、あるいはこれらの混合
物を使用するとプラスミノーゲン活性化因子の活性をそ
こなうことなく効率的な分離、精製を行うことができ、
また分離後それら親水性かつ易揮発性有機溶媒を減圧下
蒸発により効率的に除くことができる。
極性移動相に使用する溶液Ａの主成分は水であるが、
pHを調整して用いる。pH調整は揮発性の酢酸等でも良い
が、イオン対形成剤として効果的な働きのあるトリフル
オロ酢酸（TFA）、過塩素酸を使用すると分離能が向上
するので望ましい。0.1％TFA溶液のpHは約1.7であるの
で、これを基準としてpH1.9以上にするときは0.1％TFA
溶液を、例えば、トリメチルアミンで滴定して作成する
と良い。TFAは溶液Ｂに添加してもしなくても良い。
pHを調整して用いる。pH調整は揮発性の酢酸等でも良い
が、イオン対形成剤として効果的な働きのあるトリフル
オロ酢酸（TFA）、過塩素酸を使用すると分離能が向上
するので望ましい。0.1％TFA溶液のpHは約1.7であるの
で、これを基準としてpH1.9以上にするときは0.1％TFA
溶液を、例えば、トリメチルアミンで滴定して作成する
と良い。TFAは溶液Ｂに添加してもしなくても良い。
本発明の逆相液体クロマトグラフィーは、カラム充填
剤の粒子が非常に小さく、堅く強固であり良くデザイン
された装置により高分解能、高圧、高速といった特徴を
有する、いわゆる高性能液体クロマトグラフ（HPLC;Hig
h Performance liquid chromatography）を適用すると
短時間で効率良い分離が行えるので必要に応じてHPLCを
利用すると良い。HPLCについては（Hancock,W.S.and Sp
ar row,J.T.,（1984）,HPLC Analysis of Biological C
ompounds,A Laboratory Guide,Marcel Dekker,INC.pp36
1）に詳細な説明ある。
剤の粒子が非常に小さく、堅く強固であり良くデザイン
された装置により高分解能、高圧、高速といった特徴を
有する、いわゆる高性能液体クロマトグラフ（HPLC;Hig
h Performance liquid chromatography）を適用すると
短時間で効率良い分離が行えるので必要に応じてHPLCを
利用すると良い。HPLCについては（Hancock,W.S.and Sp
ar row,J.T.,（1984）,HPLC Analysis of Biological C
ompounds,A Laboratory Guide,Marcel Dekker,INC.pp36
1）に詳細な説明ある。
本発明でいう組織プラスミノーゲン活性化因子（t-P
A）は、線維素溶解系（fiblinolysis）で働く酵素であ
り、それが働くことにより血栓の構成成分であるフィブ
リンクロット（fiblrin-clot）の溶解が始まることから
血栓症に於ける新規な治療薬として有用である。
A）は、線維素溶解系（fiblinolysis）で働く酵素であ
り、それが働くことにより血栓の構成成分であるフィブ
リンクロット（fiblrin-clot）の溶解が始まることから
血栓症に於ける新規な治療薬として有用である。
t-PAは分子量約65,000の糖たんぱく質でＳ−Ｓ結合に
よりクリングルが２個である立体構造をとるとされてい
る（Vehar,G.A.,et al,（1984）,Biotechnology,2,105
1）。
よりクリングルが２個である立体構造をとるとされてい
る（Vehar,G.A.,et al,（1984）,Biotechnology,2,105
1）。
t-PAは元来１本鎖であるがプラスミンにより所定分解
を受けると２本鎖となる（Wallen,P,et al.,（1983）,E
ur.J.Biochem.,132:681）。この２本鎖t-PAはメルカプ
トエタノール等で還元するとＳ−Ｓ結合が切断され、SD
S−ポリアクリルアミド電気泳動で２本のバンドとして
検出される。
を受けると２本鎖となる（Wallen,P,et al.,（1983）,E
ur.J.Biochem.,132:681）。この２本鎖t-PAはメルカプ
トエタノール等で還元するとＳ−Ｓ結合が切断され、SD
S−ポリアクリルアミド電気泳動で２本のバンドとして
検出される。
t-PAはフィンガー領域とクリングル領域とそれに続く
セリンプロテアーゼ領域から成り立っており、セリンプ
ロテアーゼ領域には酵素活性中心があり、前者の２領域
にはフィブリン結合部位、インヒビター結合部位があ
る。例えば、フィンガー領域を欠くt-PA（Kagirani,H.e
t al.（1985）,FEBS（Lertters,189,145）やクリングル
を除いたt-PA（特開昭62-48378）やポリクリングル（例
えば３〜４個のクリングル）ｔ−PA（特開昭62-10457
7）の例が報告されており、これら欠除、修飾、あるい
は変異にあるt-PAについても関連物質としてここではt-
PAに含める。
セリンプロテアーゼ領域から成り立っており、セリンプ
ロテアーゼ領域には酵素活性中心があり、前者の２領域
にはフィブリン結合部位、インヒビター結合部位があ
る。例えば、フィンガー領域を欠くt-PA（Kagirani,H.e
t al.（1985）,FEBS（Lertters,189,145）やクリングル
を除いたt-PA（特開昭62-48378）やポリクリングル（例
えば３〜４個のクリングル）ｔ−PA（特開昭62-10457
7）の例が報告されており、これら欠除、修飾、あるい
は変異にあるt-PAについても関連物質としてここではt-
PAに含める。
t-PA以外のプラスミノーゲン活性化因子である、いわ
ゆるウロキナーゼといわれていた分子量約54KDaの尿プ
ラスミノーゲン活性化因子（PA）あるいはその関連物
質、プラスミノーゲン活性化因子以外の酵素、γ−ある
いはβ−インターフェロン等リンフォカイン、コロニー
刺激因子あるいはエリスロポイエチン等の成長因子、ホ
ルモンあるいはHBsAg等ウィルス抗原あるいはガン関連
抗原といった糖鎖を有する蛋白質についてもプラスミノ
ーゲン活性化因子と糖鎖を含むことで共通点があり、本
発明の逆相液体カラムクロマトグラフィー法で分離、精
製できると容易に推察できる。
ゆるウロキナーゼといわれていた分子量約54KDaの尿プ
ラスミノーゲン活性化因子（PA）あるいはその関連物
質、プラスミノーゲン活性化因子以外の酵素、γ−ある
いはβ−インターフェロン等リンフォカイン、コロニー
刺激因子あるいはエリスロポイエチン等の成長因子、ホ
ルモンあるいはHBsAg等ウィルス抗原あるいはガン関連
抗原といった糖鎖を有する蛋白質についてもプラスミノ
ーゲン活性化因子と糖鎖を含むことで共通点があり、本
発明の逆相液体カラムクロマトグラフィー法で分離、精
製できると容易に推察できる。
以下に本発明の具体例をヒトt-PAの分離、精製を例に
とって詳細に説明する。
とって詳細に説明する。
本発明の方法ではヒトt-PAを含む混合物を逆相液体カ
ラムクトマトグラフで展開し、t-PAを他の混入物から分
離、精製する。また逆相液体クロマトグラフグラフの分
離条件の設定のしかたによってはt-PAのサブタイプであ
る１本鎖t-PAと２本鎖t-PAを分離することができる。
ラムクトマトグラフで展開し、t-PAを他の混入物から分
離、精製する。また逆相液体クロマトグラフグラフの分
離条件の設定のしかたによってはt-PAのサブタイプであ
る１本鎖t-PAと２本鎖t-PAを分離することができる。
ヒトt-PAの分離、精製の出発材料にはヒト腎臓抽出画
分（特開昭59-80614）、メラノーマボウズ（Bowes）株
培養上清（Rijken,D.C.and Collen,D.,（1981）,J.Bio
l.Chem.,256,7035）あるいはヒト正常細胞（2n＝46）、
ヒトt-PA遺伝子が導入された組換え体マウスC127細胞、
組換え体ミエローマ細胞、組換え体チャイニーズ−ハム
スター細胞あるいは組換え体ヒト細胞（特開昭62-12697
8）の培養上清等があるが、これらに限らずヒトt-PAを
含む組織抽出画分、培養細胞抽出画分、培養細胞培養上
清、組換え体抽出画分、組換え体培養上清あるいは他の
t-PAを含む混合物であればいかなるものでも良い。
分（特開昭59-80614）、メラノーマボウズ（Bowes）株
培養上清（Rijken,D.C.and Collen,D.,（1981）,J.Bio
l.Chem.,256,7035）あるいはヒト正常細胞（2n＝46）、
ヒトt-PA遺伝子が導入された組換え体マウスC127細胞、
組換え体ミエローマ細胞、組換え体チャイニーズ−ハム
スター細胞あるいは組換え体ヒト細胞（特開昭62-12697
8）の培養上清等があるが、これらに限らずヒトt-PAを
含む組織抽出画分、培養細胞抽出画分、培養細胞培養上
清、組換え体抽出画分、組換え体培養上清あるいは他の
t-PAを含む混合物であればいかなるものでも良い。
ヒトt-PAを含む上述の混合物は、通常ヒトt-PAの含有
量が低いのであらかじめ抗t-PA抗体カラム、リジンまた
はアルギニンセファロースカラム（Einarsson,M.et a
l.,（1985）,Biochim.Biophys.Acta,83,1〜10）、エリ
スリナトリプシンインヒビターカラム（特開昭59-11062
5）、亜鉛キレートカラムあるいはコンカナバリンＡカ
ラム（Rijken,D.C.＆ Collen,D.,（1981）,J.Biol.Che
m.,256,7035）、イオン交換カラムクロマトグラフィー
（Sueishi,K.et al.,（1982）,Biochim.Biophys.Acta,7
17,327〜336）等を用いヒトt-PAの濃縮を行い、また同
時にある程度精製しておいた方が本発明の効果をより良
く出せるので望ましい。
量が低いのであらかじめ抗t-PA抗体カラム、リジンまた
はアルギニンセファロースカラム（Einarsson,M.et a
l.,（1985）,Biochim.Biophys.Acta,83,1〜10）、エリ
スリナトリプシンインヒビターカラム（特開昭59-11062
5）、亜鉛キレートカラムあるいはコンカナバリンＡカ
ラム（Rijken,D.C.＆ Collen,D.,（1981）,J.Biol.Che
m.,256,7035）、イオン交換カラムクロマトグラフィー
（Sueishi,K.et al.,（1982）,Biochim.Biophys.Acta,7
17,327〜336）等を用いヒトt-PAの濃縮を行い、また同
時にある程度精製しておいた方が本発明の効果をより良
く出せるので望ましい。
部分精製して得た少量の不純物を含むヒトt-PA画分
を、逆相液体クロマトフラフィーを構成する極性移動相
の初期条件の溶液に溶解せしめ、逆相カラムに対しアプ
ライし、増大する濃度の易揮発性有機溶媒を含む極性移
動相を使用して展開しヒトt-PAを他の混合物、すなわち
細胞成分、培地成分あるいはその他の添加物より分離
し、高純度ヒトt-PAを得、あるいは必要があれば展開条
件を厳しく設定することで１本鎖t-PAと２本鎖t-PAを分
離する。
を、逆相液体クロマトフラフィーを構成する極性移動相
の初期条件の溶液に溶解せしめ、逆相カラムに対しアプ
ライし、増大する濃度の易揮発性有機溶媒を含む極性移
動相を使用して展開しヒトt-PAを他の混合物、すなわち
細胞成分、培地成分あるいはその他の添加物より分離
し、高純度ヒトt-PAを得、あるいは必要があれば展開条
件を厳しく設定することで１本鎖t-PAと２本鎖t-PAを分
離する。
極性移動相は水を主成分とする溶液Ａに対しグラジエ
ントあるいは段階を追って易揮発性有機溶媒を主成分と
する溶液Ｂが混合され供給される溶液である。
ントあるいは段階を追って易揮発性有機溶媒を主成分と
する溶液Ｂが混合され供給される溶液である。
ヒトt-PAと他の物質との分離、また１本鎖t-PAと２本
鎖t-PAとの分離は、有機溶媒濃度が増大する極性移動相
の使用によってなされる。
鎖t-PAとの分離は、有機溶媒濃度が増大する極性移動相
の使用によってなされる。
C4逆相カラムを使用してtPAを分離、精製する場合、
極性移動相の水素イオン濃度は１以上4.5以下、好まし
くは１以上3.5以下に調整し用いる。また、その場合極
性移動相の0.1％程度のトリフルオロ酢酸（TFA）を添加
すると分解能が高まるので好ましい。
極性移動相の水素イオン濃度は１以上4.5以下、好まし
くは１以上3.5以下に調整し用いる。また、その場合極
性移動相の0.1％程度のトリフルオロ酢酸（TFA）を添加
すると分解能が高まるので好ましい。
ヒトt-PAは、例えば0.1％TFAを含むpH1.9、pH2.5ある
いはその付近の溶液Ａおよびアセトニトリルあるいはイ
ソプロピルアルコールである溶液Ｂを使用したグラジエ
ント溶出法でC4逆相カラムで特異的ピークとして分離さ
れる。
いはその付近の溶液Ａおよびアセトニトリルあるいはイ
ソプロピルアルコールである溶液Ｂを使用したグラジエ
ント溶出法でC4逆相カラムで特異的ピークとして分離さ
れる。
分離されたヒトt-PAをC4逆相カラムを用い上述の方法
で再び展開し分析すると他の混入蛋白質由来のピークは
認められないかわずかであり、上述の方法で分離した場
合、純度が99％以上と計算される。
で再び展開し分析すると他の混入蛋白質由来のピークは
認められないかわずかであり、上述の方法で分離した場
合、純度が99％以上と計算される。
１本鎖t-PAと２本鎖t-PAの分離は、例えばC4逆相カラ
ムを使用し、0.1％程度の濃度のTFAを含むpH2.5付近の
極性移動相の溶液Ａとアセトニトリルである溶液Ｂを使
用した35％から37.5％までの、あるいはその付近のリニ
アグラジエント法を用いることによってなされる。
ムを使用し、0.1％程度の濃度のTFAを含むpH2.5付近の
極性移動相の溶液Ａとアセトニトリルである溶液Ｂを使
用した35％から37.5％までの、あるいはその付近のリニ
アグラジエント法を用いることによってなされる。
もちろん上述の分離例は１つの例であって逆相カラム
であるならいかなるものでも原理的に例用可能であり、
水素イオン濃度の条件を満たしていれば溶液Ａに他の少
量の添加物があっても良いし、TFA以外のイオン形成剤
を含めても良いし、また溶液Ｂについてはアセトニトリ
ルあるいはイソプロピルアルコール以外の易揮発性かつ
親水性有機溶媒を使用しても良い。
であるならいかなるものでも原理的に例用可能であり、
水素イオン濃度の条件を満たしていれば溶液Ａに他の少
量の添加物があっても良いし、TFA以外のイオン形成剤
を含めても良いし、また溶液Ｂについてはアセトニトリ
ルあるいはイソプロピルアルコール以外の易揮発性かつ
親水性有機溶媒を使用しても良い。
本発明の他の観点からの重要な点は分離され、溶媒の
蒸発によって回収されたヒトt-PAにその生理的活性があ
るということである。
蒸発によって回収されたヒトt-PAにその生理的活性があ
るということである。
上述の方法で分離、精製されたヒトt-PAは、TFAおよ
びアセトニトリル等を含む水溶液の形状であるが、この
水溶液を例えば凍結乾燥でt-PA以外の物質を蒸発により
除き適当な溶液に再溶解せしめる。
びアセトニトリル等を含む水溶液の形状であるが、この
水溶液を例えば凍結乾燥でt-PA以外の物質を蒸発により
除き適当な溶液に再溶解せしめる。
再溶解したt-PAをSDS−ポリアクリル電気泳動法（Lae
mmli,U.K.（1970）,Nature,227,680）で分画しシブリン
−寒天プレートを使用するザイモグラフ法（Granelli-P
iperno,A.and Reich,E.,（1978）,J.Exp.Med.148,223）
でその活性を調べたところオーセンティックなt-PAと同
様な分子量に位置にフィブリン−クロット溶解活性が認
められた。
mmli,U.K.（1970）,Nature,227,680）で分画しシブリン
−寒天プレートを使用するザイモグラフ法（Granelli-P
iperno,A.and Reich,E.,（1978）,J.Exp.Med.148,223）
でその活性を調べたところオーセンティックなt-PAと同
様な分子量に位置にフィブリン−クロット溶解活性が認
められた。
すなわち、本発明の方法によると生理学的活性を保持
したままヒトt-PAあるいは１本鎖t-PAを分離、精製する
ことができる。
したままヒトt-PAあるいは１本鎖t-PAを分離、精製する
ことができる。
次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する
が、これにより本発明は何等制限されるものではない。
が、これにより本発明は何等制限されるものではない。
本発明の方法を用いると短時間に高純度のtPAを生理
学的活性をそこなうことなく精製することができ、また
１本鎖t-PAと２本鎖t-PAについてもこれらを分離、精製
することができる。高純度のt-PAあるいは１本鎖t-PAは
医薬として利用されることが期待されているので、これ
ら医薬を分離、精製する分野にも係るので産業上有用で
ある。
学的活性をそこなうことなく精製することができ、また
１本鎖t-PAと２本鎖t-PAについてもこれらを分離、精製
することができる。高純度のt-PAあるいは１本鎖t-PAは
医薬として利用されることが期待されているので、これ
ら医薬を分離、精製する分野にも係るので産業上有用で
ある。
実施例 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例１ RijkenとCollenの方法（J.Biol,Chem.,（1981），25
6,7025）に基づいてメラノーマボウズ（Bowes）株を培
養し、ダウドルの方法（特開昭59-110625）でt-PAの部
分精製物を得た。
6,7025）に基づいてメラノーマボウズ（Bowes）株を培
養し、ダウドルの方法（特開昭59-110625）でt-PAの部
分精製物を得た。
すなわち、メラノーマボウズ株を培養し、アプロチニ
ン入り無血清培地を使用して得た培養上清のトウィーン
80を0.1％になるように加え、NaClを最終濃度が0.4Mに
なるように加え、酢酸でpH調整（pH5.5〜6.0）を行っ
た。この溶液をエリスリトリプシンインビーター（ET
I）セルロースカラムに流速45ml/hでアプライした。カ
ラムをその容量の６倍以上の0.4MNaClおよび0.1％トウ
ィーン80を含むリン酸緩衝液で洗浄した後、ETIカラム
の吸着蛋白質を1.6Mチオシアン酸カリウムおよび0.4MNa
Clを含む生理食塩水で溶離させた、得られた各画分の蛋
白濃度をA280の測定で調べ、またプラスミノーゲン依存
性フィブリン溶解活性プラスミノーゲン含有フィブリン
プレートで調べ、t-PA活性のある蛋白質のピークを分取
できた画分を集め、0.1M酢酸に対し透析を行いt-PAの部
分精製物を得た。
ン入り無血清培地を使用して得た培養上清のトウィーン
80を0.1％になるように加え、NaClを最終濃度が0.4Mに
なるように加え、酢酸でpH調整（pH5.5〜6.0）を行っ
た。この溶液をエリスリトリプシンインビーター（ET
I）セルロースカラムに流速45ml/hでアプライした。カ
ラムをその容量の６倍以上の0.4MNaClおよび0.1％トウ
ィーン80を含むリン酸緩衝液で洗浄した後、ETIカラム
の吸着蛋白質を1.6Mチオシアン酸カリウムおよび0.4MNa
Clを含む生理食塩水で溶離させた、得られた各画分の蛋
白濃度をA280の測定で調べ、またプラスミノーゲン依存
性フィブリン溶解活性プラスミノーゲン含有フィブリン
プレートで調べ、t-PA活性のある蛋白質のピークを分取
できた画分を集め、0.1M酢酸に対し透析を行いt-PAの部
分精製物を得た。
得られたETIカラムによるt-PA部分精製物（１本鎖t-P
A、２本鎖t-PA混合物）をSDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法（Laemmli,U.K.,（1970）,Nature,227,680）
で解析した結果いくらかの混入蛋白質が存在していた。
A、２本鎖t-PA混合物）をSDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法（Laemmli,U.K.,（1970）,Nature,227,680）
で解析した結果いくらかの混入蛋白質が存在していた。
ETIカラムで得たメラノーマt-PA部分精製物約200μｇ
を凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）、0.07％
トリメチルアミン（TMA）および15％アセトニトリルを
含む水溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相カラム（Synchro
pack RP-4;Syncrom社製）に対しアプライし、流速1ml/m
in、カラム温度34℃でギルソン社製HPLCシステムを用い
て極性移動相を構成する溶液Ａ（0.1％TFA、0.07％TMA
を含むpH2.5の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリ
ル）をアセトニトリルが15％から50％までのリニアグラ
ジエントとして35分間かけて分離を行った。
を凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）、0.07％
トリメチルアミン（TMA）および15％アセトニトリルを
含む水溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相カラム（Synchro
pack RP-4;Syncrom社製）に対しアプライし、流速1ml/m
in、カラム温度34℃でギルソン社製HPLCシステムを用い
て極性移動相を構成する溶液Ａ（0.1％TFA、0.07％TMA
を含むpH2.5の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリ
ル）をアセトニトリルが15％から50％までのリニアグラ
ジエントとして35分間かけて分離を行った。
上記の方法でリニアグラジエントで分離すると280nm
の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンション
時間約26分（RT≒26）に主にピークが出現した。主ピー
クを構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得られた乾燥
品を100μｌの0.1M酢酸に溶解せしめた。
の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンション
時間約26分（RT≒26）に主にピークが出現した。主ピー
クを構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得られた乾燥
品を100μｌの0.1M酢酸に溶解せしめた。
0.1M酢酸に溶解した試料を還元処理をせずにそのまま
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、
銀染色であるいはザイモグラフ法（Granelli-Piperno,
A.and Reich,E.,（1978）,J.Exp.Med.148,223）で分析
を行った。銀染色の結果、分子量約70KDaにダブレット
の主バンドを、また分子量約140KDaに二量体と考えられ
るマイナーをバンドが観察され、混入蛋白質由来の他の
バンドは観察されなかった。ザイモグラフで銀染色され
た蛋白のバンドと同一の分子量の位置にフィブリン溶解
活性が検出され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの
分離でメラノーマt-PAがその生理活性を維持したまま分
離されることが確かめられた。分離されたt-PAの比活性
は、クロット溶解時間を測定して（Gaffney,P.J.and A.
D.Curtis,（1985）,Thrombosis and Heamosstasis,53,1
34）求めると約４×105IU/mg proteinであった。
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、
銀染色であるいはザイモグラフ法（Granelli-Piperno,
A.and Reich,E.,（1978）,J.Exp.Med.148,223）で分析
を行った。銀染色の結果、分子量約70KDaにダブレット
の主バンドを、また分子量約140KDaに二量体と考えられ
るマイナーをバンドが観察され、混入蛋白質由来の他の
バンドは観察されなかった。ザイモグラフで銀染色され
た蛋白のバンドと同一の分子量の位置にフィブリン溶解
活性が検出され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの
分離でメラノーマt-PAがその生理活性を維持したまま分
離されることが確かめられた。分離されたt-PAの比活性
は、クロット溶解時間を測定して（Gaffney,P.J.and A.
D.Curtis,（1985）,Thrombosis and Heamosstasis,53,1
34）求めると約４×105IU/mg proteinであった。
上記のリニアグラジエント法で得られたt-PA乾燥品16
0μｇを0.1％TFA、0.07％TMAおよび15％アセトニトリル
を含む水溶液（pH2.5）に溶かし、再び上記のリニアグ
ラジエント法で逆相カラムで展開しA280のピークを調べ
たところRTが26分付近に単一のピークが出現し、混入蛋
白質由来の他のピークは認められないか、わずかであり
ピーク面積の計算からt-PAの純度は99％以上であった。
0μｇを0.1％TFA、0.07％TMAおよび15％アセトニトリル
を含む水溶液（pH2.5）に溶かし、再び上記のリニアグ
ラジエント法で逆相カラムで展開しA280のピークを調べ
たところRTが26分付近に単一のピークが出現し、混入蛋
白質由来の他のピークは認められないか、わずかであり
ピーク面積の計算からt-PAの純度は99％以上であった。
メラノーマ細胞の培養液に含まれるアプロチニン、わ
ずかに含まれる牛血清由来蛋白質またはETIカラムに含
まれるETIについてそれぞれ上記のリニアグラジエント
法で逆相カラムで展開するとRTはそれぞれETIで約24
分、牛血清由来の主要な蛋白質で約28分、またアプロチ
ニンで約８分となりヒトt-PAの約26分と重なることがな
いこと、およびETI、牛血清由来蛋白質、アプロチニ
ン、ヒトt-PAを等量混合した試料の分離を行うと、それ
ぞれの蛋白質はRTの差により分離できることを確認し
た。
ずかに含まれる牛血清由来蛋白質またはETIカラムに含
まれるETIについてそれぞれ上記のリニアグラジエント
法で逆相カラムで展開するとRTはそれぞれETIで約24
分、牛血清由来の主要な蛋白質で約28分、またアプロチ
ニンで約８分となりヒトt-PAの約26分と重なることがな
いこと、およびETI、牛血清由来蛋白質、アプロチニ
ン、ヒトt-PAを等量混合した試料の分離を行うと、それ
ぞれの蛋白質はRTの差により分離できることを確認し
た。
逆相カラムクロマトグラフィーに対する極性移動相の
水素イオン濃度の影響を調べる為、極性移動相の溶液Ａ
を0.1％TFA、15％アセトニトリルに対し異なる濃度のTM
Aを添加し作成し、種々の水素イオン濃度とし他の条件
は変えずt-PA部分精製物の分離を以下の様に行なった。
水素イオン濃度の影響を調べる為、極性移動相の溶液Ａ
を0.1％TFA、15％アセトニトリルに対し異なる濃度のTM
Aを添加し作成し、種々の水素イオン濃度とし他の条件
は変えずt-PA部分精製物の分離を以下の様に行なった。
TMA濃度を0.1％とすると溶液ＡのpHは1.9となり、こ
の水素イオン濃度で上述のリニアグラジエント法で分離
を行ったところ、上述のpH2.5の場合と同程度にシャー
プにヒトt-PAを分離することができた。
の水素イオン濃度で上述のリニアグラジエント法で分離
を行ったところ、上述のpH2.5の場合と同程度にシャー
プにヒトt-PAを分離することができた。
TMA濃度を0.42％とすると溶液ＡのpHは3.5となり、こ
の水素イオン濃度で上述のリニアグラジエント法で分離
を行ったところ、上述のph2.5の場合に比較してややシ
ャープさを欠くピークとしてt-PA画分が得られた。
の水素イオン濃度で上述のリニアグラジエント法で分離
を行ったところ、上述のph2.5の場合に比較してややシ
ャープさを欠くピークとしてt-PA画分が得られた。
TMA濃度をさらに減少させ溶液ＡのpHを4.5以上にして
上述のリニアグラジエント法で分離を行ったところ、t-
PAのピークはシャープさを欠きピーク面積も減少した。
分離終了後、逆相カラム内を100％アセトニトリルで洗
浄するとカラム内に非特異的吸着により残っていたt-PA
が溶出した。
上述のリニアグラジエント法で分離を行ったところ、t-
PAのピークはシャープさを欠きピーク面積も減少した。
分離終了後、逆相カラム内を100％アセトニトリルで洗
浄するとカラム内に非特異的吸着により残っていたt-PA
が溶出した。
上述のリニアグラジエント法で極性移動相を構成する
溶液Ｂをアセトニトリルに代えてイソプロピルアルコー
ルとすると、溶液ＡのpHを1.9あるいは2.5とするときt-
PAのRTは速くなった。そこでグラジエントの条件を25％
っから35％イソプロピルアルコールのリニアグラジエン
ト（35分間）に変更すると他の混入蛋白質と良い分離が
得られ、またt-PAのシャープなピークが得られることが
判明した。分離されたt-PAにフィブリン溶解活性がある
ことがザイモグラフ法で確かめられた。
溶液Ｂをアセトニトリルに代えてイソプロピルアルコー
ルとすると、溶液ＡのpHを1.9あるいは2.5とするときt-
PAのRTは速くなった。そこでグラジエントの条件を25％
っから35％イソプロピルアルコールのリニアグラジエン
ト（35分間）に変更すると他の混入蛋白質と良い分離が
得られ、またt-PAのシャープなピークが得られることが
判明した。分離されたt-PAにフィブリン溶解活性がある
ことがザイモグラフ法で確かめられた。
実施例２ RijkenとCollenの方法（J.Biol.Chem.,（1981），25
6,7035）に基づいてメラノーマボウズ（Bowes）株を培
養し、Einarssonらの方法（Biochim,Biophys.Acta,（19
85），83,1）でt-PAの部分精製物を得た。すなわち、メ
ラノーマボウズ株を培養し、アプロチニン入り無血清培
地を使用して得た培養上清とトウィーン80を0.1％にな
るように加え、pHを7.3に調整し、その培養上清を0.01
％トウィーン80を含む0.1Mチン酸ナトリウム緩衝液で平
衡化した抗t-PA抗体−セファロースカラムに対しアプラ
イした。
6,7035）に基づいてメラノーマボウズ（Bowes）株を培
養し、Einarssonらの方法（Biochim,Biophys.Acta,（19
85），83,1）でt-PAの部分精製物を得た。すなわち、メ
ラノーマボウズ株を培養し、アプロチニン入り無血清培
地を使用して得た培養上清とトウィーン80を0.1％にな
るように加え、pHを7.3に調整し、その培養上清を0.01
％トウィーン80を含む0.1Mチン酸ナトリウム緩衝液で平
衡化した抗t-PA抗体−セファロースカラムに対しアプラ
イした。
その後、カラムをカラム容量の６倍以上の0.25Mチオ
シアン酸カリウム、0.01％トウィーン80を含む0.1Mリン
酸緩衝液で洗浄した。次に吸着蛋白質を3.0Mチオシアン
酸カリウム及び0.01％トウィーン80を含む0.1Mリン酸ナ
トリウム緩衝液pH7.3で溶離した。280nmの吸収を測定し
て蛋白質濃度を調べ、又、プラスミノーゲン含有フィブ
リンプレートでプラスミノーゲン依存性フィブリン溶解
活性を調べた。これによって得られたフィブリン溶解活
性と対応する蛋白質のピークを分取したフラクションを
集めた。
シアン酸カリウム、0.01％トウィーン80を含む0.1Mリン
酸緩衝液で洗浄した。次に吸着蛋白質を3.0Mチオシアン
酸カリウム及び0.01％トウィーン80を含む0.1Mリン酸ナ
トリウム緩衝液pH7.3で溶離した。280nmの吸収を測定し
て蛋白質濃度を調べ、又、プラスミノーゲン含有フィブ
リンプレートでプラスミノーゲン依存性フィブリン溶解
活性を調べた。これによって得られたフィブリン溶解活
性と対応する蛋白質のピークを分取したフラクションを
集めた。
この画分を0.1M酢酸に対して透析しt-PA部分精製物を
得た。
得た。
得られた抗t-PA抗体カラムによるt-PA部分精製物をSD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Laemmli,U.K.,
（1970）,Nature,227,680）で解析した結果、いくらか
の混入蛋白質が認められた。
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Laemmli,U.K.,
（1970）,Nature,227,680）で解析した結果、いくらか
の混入蛋白質が認められた。
抗体カラムで得たメラノーマt-PA部分精製物約200μ
ｇを凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）、0.07
％トリメチルアミン（TMA）および15％アセトニトリル
を含む水溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相カラム（Synch
ropack RP-4;Synchrom社製）に対しアプライし、流速1m
l/min、カラム温度34℃でギルソン社製HPLCシステムを
用いて極性移動相を構成する溶液Ａ（0.1％TFA,0.07％T
MAを含むpH2.5の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリ
ル）をアセトニトリルが15％から50％までのリニアグラ
ジエントとして35分間かけて分離を行った。
ｇを凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）、0.07
％トリメチルアミン（TMA）および15％アセトニトリル
を含む水溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相カラム（Synch
ropack RP-4;Synchrom社製）に対しアプライし、流速1m
l/min、カラム温度34℃でギルソン社製HPLCシステムを
用いて極性移動相を構成する溶液Ａ（0.1％TFA,0.07％T
MAを含むpH2.5の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリ
ル）をアセトニトリルが15％から50％までのリニアグラ
ジエントとして35分間かけて分離を行った。
上記の方法でリニアグラジエントで分離すると280nm
の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンション
時間約26分（RT≒26）に主ピークが出現した。主ピーク
を構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得られた乾燥品
を100μｌの0.1M酢酸に溶解せしめた。
の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンション
時間約26分（RT≒26）に主ピークが出現した。主ピーク
を構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得られた乾燥品
を100μｌの0.1M酢酸に溶解せしめた。
0.1M酢酸に溶解した試料を還元処理せずそのままSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、銀染
色であるいはザイモグラフ法（Granelli-Pierno,A.and
Reich,E.,（1978）,J.Exp.Med148,223）で分析を行っ
た。銀染色の結果、分子量約70KDaにダブレットの主バ
ンドを、また分子量約140KDaに二量体と考えられるマイ
ナーバンドが観察され、混入蛋白質由来の他のバンドは
観察されなかった。ザイモグラフで銀染色された蛋白の
バンドと同一の分子量の位置にフィブリン溶解活性が検
出され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの分離でメ
ラノーマt-PAの生理活性を維持したまま分離されること
が確かめられた。分離されたt-PAの比活性は、クロット
溶解時間を測定して（Gaffney,P.J.and A.D.Curtis,（1
985）,Thrombosis and Haemostasis,53,134）求めると
約４×10-5IU/mg proteinであった。
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、銀染
色であるいはザイモグラフ法（Granelli-Pierno,A.and
Reich,E.,（1978）,J.Exp.Med148,223）で分析を行っ
た。銀染色の結果、分子量約70KDaにダブレットの主バ
ンドを、また分子量約140KDaに二量体と考えられるマイ
ナーバンドが観察され、混入蛋白質由来の他のバンドは
観察されなかった。ザイモグラフで銀染色された蛋白の
バンドと同一の分子量の位置にフィブリン溶解活性が検
出され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの分離でメ
ラノーマt-PAの生理活性を維持したまま分離されること
が確かめられた。分離されたt-PAの比活性は、クロット
溶解時間を測定して（Gaffney,P.J.and A.D.Curtis,（1
985）,Thrombosis and Haemostasis,53,134）求めると
約４×10-5IU/mg proteinであった。
上記のリニアグラジエント法で得られたt-PA乾燥品16
0μｇを0.1％TFA、0.07％TMAおよび15％アセトニトリル
を含む水溶液（pH2.5）に溶かし、再び上記のリニアグ
ラジエント法で逆相カラムで展開しA280のピークを調べ
たところRTが26分付近に単一のピークが出現し、混入蛋
白質由来の他のピークは認められないか、わずかであり
ピーク面積の計算からt-PAの純度は99％以上であった。
メラノーマ細胞の培養液に含まれるアプロチニン、わず
かに含まれる牛血清由来蛋白質または抗体カラムに含ま
れるIgGについてそれぞれ上記のリニアグラジエント法
で逆相カラムで展開するとRTはそれぞれIgGで約30分、
牛血清由来の主要な蛋白質で約28分、またアプロチニン
はで約８分となりヒトt-PAの約26分と重なることがない
こと、およびアプロチニン、牛血清由来蛋白質、IgG、
ヒトt-PAを等量混合した試料の分離を行うと、それぞれ
の蛋白質はRTの差により分離できることを確認した。
0μｇを0.1％TFA、0.07％TMAおよび15％アセトニトリル
を含む水溶液（pH2.5）に溶かし、再び上記のリニアグ
ラジエント法で逆相カラムで展開しA280のピークを調べ
たところRTが26分付近に単一のピークが出現し、混入蛋
白質由来の他のピークは認められないか、わずかであり
ピーク面積の計算からt-PAの純度は99％以上であった。
メラノーマ細胞の培養液に含まれるアプロチニン、わず
かに含まれる牛血清由来蛋白質または抗体カラムに含ま
れるIgGについてそれぞれ上記のリニアグラジエント法
で逆相カラムで展開するとRTはそれぞれIgGで約30分、
牛血清由来の主要な蛋白質で約28分、またアプロチニン
はで約８分となりヒトt-PAの約26分と重なることがない
こと、およびアプロチニン、牛血清由来蛋白質、IgG、
ヒトt-PAを等量混合した試料の分離を行うと、それぞれ
の蛋白質はRTの差により分離できることを確認した。
実施例３ RijkenとCollenらの方法（J.Biol.Chem.,（1981），2
56,7035）に基づいてメラノーマボウズ（Bowes）株を培
養し、彼等の方法でコンカナバリンＡカラムを用いてt-
PAの部分精製物を得た。
56,7035）に基づいてメラノーマボウズ（Bowes）株を培
養し、彼等の方法でコンカナバリンＡカラムを用いてt-
PAの部分精製物を得た。
すなわち、メラノーマボウズ株を培養し、アプロチニ
ン入り無血清培地を使用して得た培養上清にトウィーン
80を0.1％になるように加え、pH7.2に調整し、その培養
上清をあらかじめ1.0M NaClおよび0.01％トウィーン80
を含む0.01Mリン酸緩衝液pH7.5で平衡化したコンカナバ
リンＡ（ConA）セファロースカラムにアプライした。そ
の後、カラムをその容量の６倍以上の平衡化緩衝液で洗
浄した。次に0.4Mα−Ｄ−メチルマンノシドと2Mチオシ
アン酸カリ、0.01％トウィーン80を含有する0.01Mリン
酸緩衝液でα−Ｄ−メチルマンノシド０から0.4M、チオ
シアン酸カリ０から2Mの直線グラジエントをかけ吸着蛋
白質を溶出した。
ン入り無血清培地を使用して得た培養上清にトウィーン
80を0.1％になるように加え、pH7.2に調整し、その培養
上清をあらかじめ1.0M NaClおよび0.01％トウィーン80
を含む0.01Mリン酸緩衝液pH7.5で平衡化したコンカナバ
リンＡ（ConA）セファロースカラムにアプライした。そ
の後、カラムをその容量の６倍以上の平衡化緩衝液で洗
浄した。次に0.4Mα−Ｄ−メチルマンノシドと2Mチオシ
アン酸カリ、0.01％トウィーン80を含有する0.01Mリン
酸緩衝液でα−Ｄ−メチルマンノシド０から0.4M、チオ
シアン酸カリ０から2Mの直線グラジエントをかけ吸着蛋
白質を溶出した。
280nmの吸収を測定して蛋白質濃度を調べ、又、プラ
スミノーゲン含有フィブリンプレートでプラスミノーゲ
ン依存性フィブリン溶解活性を調べた。これによって得
られたフィブリン溶解活性と対応する蛋白質のピークを
分取したフラクションを集めた。この画分を0.1M酢酸に
対して透析しt-PA部分精製物を得た。
スミノーゲン含有フィブリンプレートでプラスミノーゲ
ン依存性フィブリン溶解活性を調べた。これによって得
られたフィブリン溶解活性と対応する蛋白質のピークを
分取したフラクションを集めた。この画分を0.1M酢酸に
対して透析しt-PA部分精製物を得た。
得られたConAカラムによるt-PA部分精製物（１本鎖t-
PA、２本鎖t-PA混合物）をSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法（Laemmli,U.K.,（1970）,Nature,227,68
0）で解析した結果、いくらかの混入蛋白質が認められ
た。
PA、２本鎖t-PA混合物）をSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法（Laemmli,U.K.,（1970）,Nature,227,68
0）で解析した結果、いくらかの混入蛋白質が認められ
た。
ConAカラムで得たメラノーマt-PA部分精製物約200μ
ｇを凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）、0.07
％トリメチルアミン（TAM）および15％アセトニリルを
含む水溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相カラム（Synchro
pack RP-4;Synchrom社製）に対しアプライし、流速1ml/
min、カラム温度34℃でギルソン社製HPLCシステムを用
いて極性移動相を構成する溶液Ａ（0.1％TFA、0.07％TM
Aを含むpH2.5の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリ
ル）をアセトニトリルが15％から50％までのリニアグラ
ジエントとして35分間かけて分離を行った。
ｇを凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）、0.07
％トリメチルアミン（TAM）および15％アセトニリルを
含む水溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相カラム（Synchro
pack RP-4;Synchrom社製）に対しアプライし、流速1ml/
min、カラム温度34℃でギルソン社製HPLCシステムを用
いて極性移動相を構成する溶液Ａ（0.1％TFA、0.07％TM
Aを含むpH2.5の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリ
ル）をアセトニトリルが15％から50％までのリニアグラ
ジエントとして35分間かけて分離を行った。
上記の方法でリニアグラジエントで分離すると280nm
の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンション
時間約26分（RT≒26）に主ピークが出現した。主ピーク
を構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得られた乾燥品
を100μｌの0.1M酢酸に溶解せしめた。
の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンション
時間約26分（RT≒26）に主ピークが出現した。主ピーク
を構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得られた乾燥品
を100μｌの0.1M酢酸に溶解せしめた。
0.1M酢酸に溶解した試料を還元処理せずそのままSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、銀染
色であるザイモグラフ法（Granelli-Piperno,A.and Rei
ch,E.,（1978）,J.Exp.Med.148,223）で分析を行った。
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、銀染
色であるザイモグラフ法（Granelli-Piperno,A.and Rei
ch,E.,（1978）,J.Exp.Med.148,223）で分析を行った。
銀染色の結果、分子量約70KDaのダブレットの主バン
ドを、また分子量約140KDaの二量体と考えられるマイナ
ーバンドが観察され、混入蛋白質由来の他のバンドは観
察されなかった。ザイモグラフで銀染色された蛋白のバ
ンドと同一の分子量の位置にフィブリン溶解活性が検出
され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの分離でメラ
ノーマt-PAがその生理活性を維持したまま分離されるこ
とが確かめられた。
ドを、また分子量約140KDaの二量体と考えられるマイナ
ーバンドが観察され、混入蛋白質由来の他のバンドは観
察されなかった。ザイモグラフで銀染色された蛋白のバ
ンドと同一の分子量の位置にフィブリン溶解活性が検出
され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの分離でメラ
ノーマt-PAがその生理活性を維持したまま分離されるこ
とが確かめられた。
分離されたt-PAの比活性は、クロット溶解時間を測定
して（Gaffney,P.J.and A.D.curtis,（1985）,Thrombos
is and Haemostasis,53,134）求めると約４×105IU/mg
proteinであった。
して（Gaffney,P.J.and A.D.curtis,（1985）,Thrombos
is and Haemostasis,53,134）求めると約４×105IU/mg
proteinであった。
上記のリニアグラジエント法で得られたt-PA乾燥品16
0μｇを0.1％TFA、0.07％TMAおよび15％アセトニトリル
を含む水溶液（pH2.5）に溶かし、再び上記のリニアグ
ラジエント法で逆相カラムで展開しA280のピークを調べ
たところRTが26分付近に単一のピークが出現し、混入蛋
白質由来の他のピークは認められないか、わずかであり
ピーク面積の計算からt-PAの純度は99％以上であった。
0μｇを0.1％TFA、0.07％TMAおよび15％アセトニトリル
を含む水溶液（pH2.5）に溶かし、再び上記のリニアグ
ラジエント法で逆相カラムで展開しA280のピークを調べ
たところRTが26分付近に単一のピークが出現し、混入蛋
白質由来の他のピークは認められないか、わずかであり
ピーク面積の計算からt-PAの純度は99％以上であった。
メラノーマ細胞の培養液に含まれるアプロチニン、わ
ずかに含まれる牛血清由来蛋白質についてそれぞれ上記
のリニアグラジエント法で逆相カラムで展開するとRTは
それぞれアプロチニンで約８分、牛血清由来の主要な蛋
白質で約28分となり、ヒトt-PAの約26分と重なることが
ないこと、およびアプロチニン、牛血清由来蛋白質、ヒ
トt-PAを等量混合した試料の分離を行うと、それぞれの
蛋白質はRTの差により分離できることを確認した。
ずかに含まれる牛血清由来蛋白質についてそれぞれ上記
のリニアグラジエント法で逆相カラムで展開するとRTは
それぞれアプロチニンで約８分、牛血清由来の主要な蛋
白質で約28分となり、ヒトt-PAの約26分と重なることが
ないこと、およびアプロチニン、牛血清由来蛋白質、ヒ
トt-PAを等量混合した試料の分離を行うと、それぞれの
蛋白質はRTの差により分離できることを確認した。
実施例４ RijkenとCollenの方法（J.Biol,Chem.,（1981），25
6,7025）に基づいてメラノーマボウズ（Bowes）株を培
養し、彼等の方法で亜鉛キレートカラムを用いてt-PAの
部分精製物を得た。
6,7025）に基づいてメラノーマボウズ（Bowes）株を培
養し、彼等の方法で亜鉛キレートカラムを用いてt-PAの
部分精製物を得た。
すなわち、メラノーマボウズ株を培養し、アプロチニ
ン入り無血清培地を使用して得た培養上清にトウィーン
80を0.01％になるように加え、pH7.5に調整し、その培
養上清を1M NaCl及び0.01％トウィーン80を含むpH7.5の
0.02Mトリス塩酸緩衝液で平衡化した亜鉛キレートアガ
ロースカラムにアプライした。
ン入り無血清培地を使用して得た培養上清にトウィーン
80を0.01％になるように加え、pH7.5に調整し、その培
養上清を1M NaCl及び0.01％トウィーン80を含むpH7.5の
0.02Mトリス塩酸緩衝液で平衡化した亜鉛キレートアガ
ロースカラムにアプライした。
この後、カラムを1M NaClおよび0.01％トウィーン80
を含むpH7.5の0.02Mトリス塩酸緩衝液を洗浄液としてカ
ラム容量の６倍以上洗浄した。次に上記の洗浄液にイミ
ダゾールを加えてカラムに０から0.05Mまでのイミダゾ
ールの直線グラジエントをかけ吸着蛋白を溶離した。
を含むpH7.5の0.02Mトリス塩酸緩衝液を洗浄液としてカ
ラム容量の６倍以上洗浄した。次に上記の洗浄液にイミ
ダゾールを加えてカラムに０から0.05Mまでのイミダゾ
ールの直線グラジエントをかけ吸着蛋白を溶離した。
280nmの吸収を測定して蛋白質濃度を調べ、又、プラ
スミノーゲン含有フィブリンプレートでプラスミノーゲ
ン依存性フィブリン溶解活性を調べた。これによって得
られたフィブリン溶解活性と対応する蛋白質のピークを
分取したフラクションを集めた。この画分を0.1M酢酸に
対して透析しt-PA部分精製物を得た。
スミノーゲン含有フィブリンプレートでプラスミノーゲ
ン依存性フィブリン溶解活性を調べた。これによって得
られたフィブリン溶解活性と対応する蛋白質のピークを
分取したフラクションを集めた。この画分を0.1M酢酸に
対して透析しt-PA部分精製物を得た。
得られた亜鉛キレートカラムによるt-PA部分精製物
（１本鎖t-PA、２本鎖t-PA混合物）をSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法（Laemmli,U.K.,（1970）,Natu
re,227,680）で解析した結果、いくらかの混入蛋白質が
存在していた。
（１本鎖t-PA、２本鎖t-PA混合物）をSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法（Laemmli,U.K.,（1970）,Natu
re,227,680）で解析した結果、いくらかの混入蛋白質が
存在していた。
亜鉛キレートカラムで得たメラノーマt-PA部分精製物
約200μｇを凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸（TM
A）、0.07％トリメチルアミン（TMA）および15％アセト
ニトリルを含む水溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相カラ
ム（Synchropack RP-4;Synchrom社製）に対しアプライ
し、流速1ml/min、カラム温度34℃でギルソン社製HPLC
システムを用いて極性移動相を構成する溶液Ａ（0.1％T
FA、0.07％TMAを含むpH2.5の水溶液）および溶液Ｂ（ア
セトニトリル）をアセトニトリルが15％から50％までの
リニアグラジエントとして35分かけて分離を行った。
約200μｇを凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸（TM
A）、0.07％トリメチルアミン（TMA）および15％アセト
ニトリルを含む水溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相カラ
ム（Synchropack RP-4;Synchrom社製）に対しアプライ
し、流速1ml/min、カラム温度34℃でギルソン社製HPLC
システムを用いて極性移動相を構成する溶液Ａ（0.1％T
FA、0.07％TMAを含むpH2.5の水溶液）および溶液Ｂ（ア
セトニトリル）をアセトニトリルが15％から50％までの
リニアグラジエントとして35分かけて分離を行った。
上記の方法でリニアグラジエントで分離すると280nm
の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンション
時間約26分（RT≒26）に主ピークが出現した。主ピーク
を構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得られた乾燥品
を100μｌの0.1M酢酸に溶解せしめた。
の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンション
時間約26分（RT≒26）に主ピークが出現した。主ピーク
を構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得られた乾燥品
を100μｌの0.1M酢酸に溶解せしめた。
0.1M酢酸に溶解した試料を還元処理をせずそのままSD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、銀
染色であるいはザイモグラフ法（Granelli-Piperno,A.a
nd Reich,E.,（1978）,J.Exp.Med.148,223）で分析を行
った。銀染色の結果、分子量約70KDaのダブレットの主
バンドを、また分子量約140KDaに二量体と考えられるマ
イナーバンドが観察され、混入蛋白質由来の他のバンド
は観察されなかった。ザイモグラフで銀染色された蛋白
のバンドと同一の分子量の位置にフィブリン溶解活性が
検出され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの分離で
メラノーマt-PAがその生理活性を維持したまま分離され
ることが確かめられた。分離されたt-PAの比活性は、ク
ロット溶解時間を測定して（Gaffney,P.J.and A.D.curt
is,（1985）,Thrombosis and Haemostasis,53,134）求
めると約４×105IU/mg proteinであった。
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、銀
染色であるいはザイモグラフ法（Granelli-Piperno,A.a
nd Reich,E.,（1978）,J.Exp.Med.148,223）で分析を行
った。銀染色の結果、分子量約70KDaのダブレットの主
バンドを、また分子量約140KDaに二量体と考えられるマ
イナーバンドが観察され、混入蛋白質由来の他のバンド
は観察されなかった。ザイモグラフで銀染色された蛋白
のバンドと同一の分子量の位置にフィブリン溶解活性が
検出され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの分離で
メラノーマt-PAがその生理活性を維持したまま分離され
ることが確かめられた。分離されたt-PAの比活性は、ク
ロット溶解時間を測定して（Gaffney,P.J.and A.D.curt
is,（1985）,Thrombosis and Haemostasis,53,134）求
めると約４×105IU/mg proteinであった。
上記のリニアグラジエント法で得られたt-PA乾燥品16
0μｇを0.1％TFA、0.07％TMAおよび15％アセトニトリル
を含む水溶液（ph2.5）に溶かし、再び上記のリニアグ
ラジエント法で逆相カラムで展開しA280のピークを調べ
たところRTが26分付近に単一のピークが出現し、混入蛋
白質由来の他のピークは認められないか、わずかであり
ピーク面積の計算からt-PAの純度は99％以上であった。
0μｇを0.1％TFA、0.07％TMAおよび15％アセトニトリル
を含む水溶液（ph2.5）に溶かし、再び上記のリニアグ
ラジエント法で逆相カラムで展開しA280のピークを調べ
たところRTが26分付近に単一のピークが出現し、混入蛋
白質由来の他のピークは認められないか、わずかであり
ピーク面積の計算からt-PAの純度は99％以上であった。
メラノーマ細胞の培養液に含まれるアプロチニン、わ
ずかに含まれる牛血清由来蛋白質について、それぞれ上
記のリニアグラジエント法で逆相カラムで展開すと、RT
はそれぞれアプロチニンで約８分、牛血清由来の主要な
蛋白質で約28分となりヒトt-PAの約26分と重なることが
ないこと、およびアプロチニン、牛血清由来蛋白質、ヒ
トt-PAを等量混合した試料の分離を行うと、それぞれの
蛋白質はRTの差により分離できることを確認した。
ずかに含まれる牛血清由来蛋白質について、それぞれ上
記のリニアグラジエント法で逆相カラムで展開すと、RT
はそれぞれアプロチニンで約８分、牛血清由来の主要な
蛋白質で約28分となりヒトt-PAの約26分と重なることが
ないこと、およびアプロチニン、牛血清由来蛋白質、ヒ
トt-PAを等量混合した試料の分離を行うと、それぞれの
蛋白質はRTの差により分離できることを確認した。
実施例５ ヒト正常細胞（2n＝46）培養上清を実施例３と同様な
方法でコンカナバリンＡ（ConA）セファロースカラムで
分離し、t-PAの部分精製物を得た。
方法でコンカナバリンＡ（ConA）セファロースカラムで
分離し、t-PAの部分精製物を得た。
すなわち、ヒト正常細胞MTC 017株（特開昭62-12697
8）を培養し、アプロチニンおよび少量の牛胎児血清を
含む培地を使用して得た培養上清よりconAカラムを用い
t-PA部分精製物を得た。
8）を培養し、アプロチニンおよび少量の牛胎児血清を
含む培地を使用して得た培養上清よりconAカラムを用い
t-PA部分精製物を得た。
得られたConAカラムによるt-PA部分精製物（１本鎖t-
PA、２本鎖t-PA混合物）をSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法（Laemmli,U.K.,（1970）,Nature,227,68
0）で解析した結果、いくらかの混入蛋白質が存在して
いた。
PA、２本鎖t-PA混合物）をSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法（Laemmli,U.K.,（1970）,Nature,227,68
0）で解析した結果、いくらかの混入蛋白質が存在して
いた。
ConAカラムで得た正常細胞t-PA部分精製物約200μｇ
を凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）、0.07％
トリメチルアミン（TAM）および15％アセトニリルを含
む水溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相カラム（Synchropa
ck RP-4;Synchrom社製）に対しアプライし、流速1ml/mi
n、カラム温度34℃でギルソン社製HPLCシステムを用い
て極性移動相を構成する溶液Ａ（0.1％TFA、0.07％TMA
を含むpH2.5の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリ
ル）をアセトニトリルが15％から50％までのリニアグラ
ジエントとして35分間かけて分離を行った。
を凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）、0.07％
トリメチルアミン（TAM）および15％アセトニリルを含
む水溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相カラム（Synchropa
ck RP-4;Synchrom社製）に対しアプライし、流速1ml/mi
n、カラム温度34℃でギルソン社製HPLCシステムを用い
て極性移動相を構成する溶液Ａ（0.1％TFA、0.07％TMA
を含むpH2.5の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリ
ル）をアセトニトリルが15％から50％までのリニアグラ
ジエントとして35分間かけて分離を行った。
上記の方法でリニアグラジエントで分離すると280nm
の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンション
時間約26分（RT≒26）に主ピークが出現した。主ピーク
を構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得られた乾燥品
を100μｌの0.1M酢酸に溶解せしめた。
の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンション
時間約26分（RT≒26）に主ピークが出現した。主ピーク
を構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得られた乾燥品
を100μｌの0.1M酢酸に溶解せしめた。
0.1M酢酸に溶解した試料を還元処理せずそのままSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、銀染
色であるいはザイモグラフ法（Granelli-Piperno,A.and
Reich,E.,（1978）,J.Exp.Med.148,223）で分析を行っ
た。銀染色の結果、分子量約70KDaにダブレットの主バ
ンドを、また分子量約140KDaの二量体と考えられるマイ
ナーバンドが観察され、混入蛋白質由来の他のバンドは
観察されなかった。ザイモグラフで銀染色された蛋白の
バンドと同一の分子量の位置にフィブリン溶解活性が検
出され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの分離で正
常細胞t-PAがその生理活性を維持したまま分離されるこ
とが確かめられた。分離されたt-PAの比活性は、クロッ
ト溶解時間を測定して（Gaffney,P.J.and A.D.curtis,
（1985）,Thrombosis and Haemostasis,53,134）求める
と約４×105IU/mg proteinであった。
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、銀染
色であるいはザイモグラフ法（Granelli-Piperno,A.and
Reich,E.,（1978）,J.Exp.Med.148,223）で分析を行っ
た。銀染色の結果、分子量約70KDaにダブレットの主バ
ンドを、また分子量約140KDaの二量体と考えられるマイ
ナーバンドが観察され、混入蛋白質由来の他のバンドは
観察されなかった。ザイモグラフで銀染色された蛋白の
バンドと同一の分子量の位置にフィブリン溶解活性が検
出され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの分離で正
常細胞t-PAがその生理活性を維持したまま分離されるこ
とが確かめられた。分離されたt-PAの比活性は、クロッ
ト溶解時間を測定して（Gaffney,P.J.and A.D.curtis,
（1985）,Thrombosis and Haemostasis,53,134）求める
と約４×105IU/mg proteinであった。
上記のリニアグラジエント法で得られたt-PA乾燥品16
0μｇを0.1％TFA、0.07％TMAおよび15％アセトニトリル
を含む水溶液（pH2.5）に溶かし、再び上記のリニアグ
ラジエント法で逆相カラムで展開しA280のピークを調べ
たところRTが26分付近に単一のピークが出現し、混入蛋
白質由来の他のピークは認められないか、わずか であり、ピーク面積の計算からt-PAの純度は99％以上で
あった。
0μｇを0.1％TFA、0.07％TMAおよび15％アセトニトリル
を含む水溶液（pH2.5）に溶かし、再び上記のリニアグ
ラジエント法で逆相カラムで展開しA280のピークを調べ
たところRTが26分付近に単一のピークが出現し、混入蛋
白質由来の他のピークは認められないか、わずか であり、ピーク面積の計算からt-PAの純度は99％以上で
あった。
正常細胞の培養液に含まれるアプロチニン、わずかに
含まれる牛血清由来蛋白質についてそれぞれ上記のリニ
アグラジエント法で逆相カラムで展開するとRTはそれぞ
れアプロチニンで約８分、牛血清由来の主要な蛋白質で
約28分となりヒトt-PAの約26分と重なることがないこ
と、およびアプロチニン、牛血清由来蛋白質、ヒトt-PA
を等量混合した試料の分離を行うと、それぞれの蛋白質
はRTの差により分離できることを確認した。
含まれる牛血清由来蛋白質についてそれぞれ上記のリニ
アグラジエント法で逆相カラムで展開するとRTはそれぞ
れアプロチニンで約８分、牛血清由来の主要な蛋白質で
約28分となりヒトt-PAの約26分と重なることがないこ
と、およびアプロチニン、牛血清由来蛋白質、ヒトt-PA
を等量混合した試料の分離を行うと、それぞれの蛋白質
はRTの差により分離できることを確認した。
実施例６ ヒトt-PA遺伝子を組み込んだチャイニーズ−ハムスタ
ー細胞の培養上清を実施例２と同様な方法で抗t-PA抗体
カラムで分離し、t-PAの部分精製物を得た。
ー細胞の培養上清を実施例２と同様な方法で抗t-PA抗体
カラムで分離し、t-PAの部分精製物を得た。
すなわち、組換え体チャイニーズ−ハムスター細胞
（特開昭62-126978）を培養し、アプロチニンおよび少
量の牛胎児血清を含む培地を使用して得た培養上清より
ConAカラムを用いt-PA部分精製物を得た。
（特開昭62-126978）を培養し、アプロチニンおよび少
量の牛胎児血清を含む培地を使用して得た培養上清より
ConAカラムを用いt-PA部分精製物を得た。
得られた抗体カラムによるt-PA部分精製物（１本鎖t-
PA、２本鎖t-PA混合物）をSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法（Laemmli,U.K.,（1970）,Nature,227,68
0）で解析した結果、いくらかの混入蛋白質が存在して
いた。
PA、２本鎖t-PA混合物）をSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法（Laemmli,U.K.,（1970）,Nature,227,68
0）で解析した結果、いくらかの混入蛋白質が存在して
いた。
抗体カラムで得た組換え体t-PA部分精製物約200μｇ
を凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）、0.07％
トリメチルアミン（TMA）および15％アセトニトリルを
含む水溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相カラム（Synchro
pack RP-4;Synchrom社製）に対しアプライし、流速1ml/
min、カラム温度34℃でギルソン社製HPLCシステムを用
いて極性移動相を構成する溶液Ａ（0.1％TFA,0.07％TMA
を含むpH2.5の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリ
ル）をアセトニトリルが15％から50％までのリニアグラ
ジエントとして35分間かけて分離を行った。
を凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）、0.07％
トリメチルアミン（TMA）および15％アセトニトリルを
含む水溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相カラム（Synchro
pack RP-4;Synchrom社製）に対しアプライし、流速1ml/
min、カラム温度34℃でギルソン社製HPLCシステムを用
いて極性移動相を構成する溶液Ａ（0.1％TFA,0.07％TMA
を含むpH2.5の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリ
ル）をアセトニトリルが15％から50％までのリニアグラ
ジエントとして35分間かけて分離を行った。
上記の方法でリニアグラジエントで分離すると280nm
の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンション
時間約26分（RT≒26）に主ピークが出現した。主ピーク
を構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得られた乾燥品
を100μｌの0.1M酢酸に溶解せしめた。
の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンション
時間約26分（RT≒26）に主ピークが出現した。主ピーク
を構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得られた乾燥品
を100μｌの0.1M酢酸に溶解せしめた。
0.1M酢酸に溶解した試料を還元処理せずそのままSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、銀染
色であるいはザイモグラフ法（Granelli-Piperno,A.and
Reich,E.,（1978）,J.Exp.Med148,223）で分析を行っ
た。銀染色の結果、分子量約70KDaにダブレットの主バ
ンドを、また分子量約140KDaに二量体と考えられるマイ
ナーをバンドが観察され、混入蛋白質由来の他のバンド
は観察されなかった。ザイモグラフで銀染色された蛋白
のバンドと同一の分子量の位置にフィブリン溶解活性が
検出され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの分離で
組換え体t-PAがその生理活性を維持したまま分離される
ことが確かめられた。分離されたt-PAの比活性は、クロ
ット溶解時間を測定して（Gaffney,P.J.and A.D.Curti
s,（1985）,Thrombosis and Haemostasis,53,134）求め
ると約４×105IU/mg proteinであった。
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、銀染
色であるいはザイモグラフ法（Granelli-Piperno,A.and
Reich,E.,（1978）,J.Exp.Med148,223）で分析を行っ
た。銀染色の結果、分子量約70KDaにダブレットの主バ
ンドを、また分子量約140KDaに二量体と考えられるマイ
ナーをバンドが観察され、混入蛋白質由来の他のバンド
は観察されなかった。ザイモグラフで銀染色された蛋白
のバンドと同一の分子量の位置にフィブリン溶解活性が
検出され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの分離で
組換え体t-PAがその生理活性を維持したまま分離される
ことが確かめられた。分離されたt-PAの比活性は、クロ
ット溶解時間を測定して（Gaffney,P.J.and A.D.Curti
s,（1985）,Thrombosis and Haemostasis,53,134）求め
ると約４×105IU/mg proteinであった。
上記のリニアグラジエント法で得られたt-PA乾燥品16
0μｇを0.1％TFA、0.07％TMAおよび15％アセトニトリル
を含む水溶液（pH2.5）に溶かし、再び上記のリニアグ
ラジエント法で逆相カラムで展開しA280のピークを調べ
たところRTが26分付近に単一のピークが出現し、混入蛋
白質由来の他のピークは認められないか、わずかであり
ピーク面積の計算からt-PAの純度は99％以上であった。
0μｇを0.1％TFA、0.07％TMAおよび15％アセトニトリル
を含む水溶液（pH2.5）に溶かし、再び上記のリニアグ
ラジエント法で逆相カラムで展開しA280のピークを調べ
たところRTが26分付近に単一のピークが出現し、混入蛋
白質由来の他のピークは認められないか、わずかであり
ピーク面積の計算からt-PAの純度は99％以上であった。
組換え体培養液に含まれるアプロチニン、わずかに含
まれる牛血清由来蛋白質または抗体カラムに含まれるIg
Gについてそれぞれ上記のリニアグラジエント法で逆相
カラムで展開するとRTはそれぞれIgGで約30分、牛血清
由来の主要な蛋白質で約28分、またアプロチニンはで約
８分となりヒトt-PAの約26分と重なることがないこと、
およびアプロチニン、牛血清由来蛋白質、IgG、ヒトt-P
Aを等量混合した試料の分離を行うと、それぞれの蛋白
質はRTの差により分離できることを確認した。
まれる牛血清由来蛋白質または抗体カラムに含まれるIg
Gについてそれぞれ上記のリニアグラジエント法で逆相
カラムで展開するとRTはそれぞれIgGで約30分、牛血清
由来の主要な蛋白質で約28分、またアプロチニンはで約
８分となりヒトt-PAの約26分と重なることがないこと、
およびアプロチニン、牛血清由来蛋白質、IgG、ヒトt-P
Aを等量混合した試料の分離を行うと、それぞれの蛋白
質はRTの差により分離できることを確認した。
実施例７ ヒトt-PA遺伝子を組み込んだマウスC127細胞の培養上
清を、実施例１と同様な方法でETIセファロースカラム
で分離し、t-PAの部分精製物を得た。
清を、実施例１と同様な方法でETIセファロースカラム
で分離し、t-PAの部分精製物を得た。
すなわち、組換え体マウスC127細胞（特開昭62-12697
8）を培養し、アプロチニンおよび少量の牛胎児血清を
含む培地を使用して得た培養上清よりETIカラムを用いt
-PA部分精製物を得た。
8）を培養し、アプロチニンおよび少量の牛胎児血清を
含む培地を使用して得た培養上清よりETIカラムを用いt
-PA部分精製物を得た。
得られたETIカラムによるt-PA部分精製物（１本鎖t-P
A、２本鎖t-PA混合物）をSDS−ポリアクリルアシドゲル
電気泳動法（Laemmle,U.K.（1970）,Nature,227,680）
で解析した結果、いくらかの混入蛋白質が存在してい
た。
A、２本鎖t-PA混合物）をSDS−ポリアクリルアシドゲル
電気泳動法（Laemmle,U.K.（1970）,Nature,227,680）
で解析した結果、いくらかの混入蛋白質が存在してい
た。
ETIカラムで得た組換え体t-PA部分精製物約200μｇを
凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）、0.07％ト
リメチルアミン（TMA）および15％アセトニトリルを含
む水溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相カラム（Synchropa
ck RP-4;Synchrom社製）に対しアプライし、流速1ml/mi
n、カラム温度34℃でギルソン社製HPLCシステムを用い
て極性移動相を構成する溶液Ａ（0.1％TFA,0.07％TMAを
含むpH2.5の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリル）
をアセトニトリルが15％から50％までのリニアグラジエ
ントとして35分間かけて分離を行った。
凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）、0.07％ト
リメチルアミン（TMA）および15％アセトニトリルを含
む水溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相カラム（Synchropa
ck RP-4;Synchrom社製）に対しアプライし、流速1ml/mi
n、カラム温度34℃でギルソン社製HPLCシステムを用い
て極性移動相を構成する溶液Ａ（0.1％TFA,0.07％TMAを
含むpH2.5の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリル）
をアセトニトリルが15％から50％までのリニアグラジエ
ントとして35分間かけて分離を行った。
上記の方法でリニアグラジエントで分離すると280nm
の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンション
時間約26分（RT≒26）に主ピークが出現した。主ピーク
を構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得られた乾燥品
を100μｌの0.1M酢酸に溶解せしめた。
の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンション
時間約26分（RT≒26）に主ピークが出現した。主ピーク
を構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得られた乾燥品
を100μｌの0.1M酢酸に溶解せしめた。
0.1M酢酸に溶解した試料を還元処理をせずそのままSD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、銀
染色であるいはザイモグラフ法（Granelli-Piperno,A.a
nd Reich,E.,（1978）,J.Exp.Med148,223）で分析を行
った。銀染色の結果、分子量約70KDaにダブレットの主
バンドを、また分子量約140KDaに二量体と考えられるマ
イナーバンドが観察され、混入蛋白質由来の他のバンド
は観察されなかった。ザイモグラフで銀染色された蛋白
のバンドと同一分子量の位置にフィブリン溶解活性が検
出され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの分離で組
換え体t-PAがその生理活性を維持したまま分離されるこ
とが確かめられた。分離されたt-PAの比活性はクロット
溶解時間を測定して（Gaffney,P.J.and A.D.Curtis,（1
985）,Thrombosis and Haemostasis,53,134）求めると
約４×105IU/mg proteinであった。
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、銀
染色であるいはザイモグラフ法（Granelli-Piperno,A.a
nd Reich,E.,（1978）,J.Exp.Med148,223）で分析を行
った。銀染色の結果、分子量約70KDaにダブレットの主
バンドを、また分子量約140KDaに二量体と考えられるマ
イナーバンドが観察され、混入蛋白質由来の他のバンド
は観察されなかった。ザイモグラフで銀染色された蛋白
のバンドと同一分子量の位置にフィブリン溶解活性が検
出され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの分離で組
換え体t-PAがその生理活性を維持したまま分離されるこ
とが確かめられた。分離されたt-PAの比活性はクロット
溶解時間を測定して（Gaffney,P.J.and A.D.Curtis,（1
985）,Thrombosis and Haemostasis,53,134）求めると
約４×105IU/mg proteinであった。
上記のリニアグラジエント法で得られたt-PA乾燥品16
0μｇを0.1％TFA、0.07％TMAおよび15％アセトニトリル
を含む水溶液（pH2.5）に溶かし、再び上記のリニアグ
ラジエント法で逆相カラムで展開しA280のピークを調べ
たところRTが26分付近に単一のピークが出現し、混入蛋
白質由来の他のピークは認められないか、わずかであり
ピーク面積の計算からt-PAの純度は99％以上であった。
0μｇを0.1％TFA、0.07％TMAおよび15％アセトニトリル
を含む水溶液（pH2.5）に溶かし、再び上記のリニアグ
ラジエント法で逆相カラムで展開しA280のピークを調べ
たところRTが26分付近に単一のピークが出現し、混入蛋
白質由来の他のピークは認められないか、わずかであり
ピーク面積の計算からt-PAの純度は99％以上であった。
組換え体細胞の培養液に含まれるアプロチニン、わず
かに含まれる牛血清由来蛋白質またはETIカラムに含ま
れるETIについてそれぞれ上記のリニアグラジエント法
で逆相カラムで展開するとRTはそれぞれアプロチニンで
約８分、牛血清由来の主要な蛋白質で約28分、またEETI
で約24分となりヒトt-PAの約26分と重なることがないこ
と、およびアプロチニン、ETI、牛血清由来蛋白質、ヒ
トt-PAを等量混合した試料の分離を行うと、それぞれの
蛋白質はRTの差により分離できることを確認した。
かに含まれる牛血清由来蛋白質またはETIカラムに含ま
れるETIについてそれぞれ上記のリニアグラジエント法
で逆相カラムで展開するとRTはそれぞれアプロチニンで
約８分、牛血清由来の主要な蛋白質で約28分、またEETI
で約24分となりヒトt-PAの約26分と重なることがないこ
と、およびアプロチニン、ETI、牛血清由来蛋白質、ヒ
トt-PAを等量混合した試料の分離を行うと、それぞれの
蛋白質はRTの差により分離できることを確認した。
実施例８ RijkenとCollenの方法（J.Biol,Chem.,（1981），25
6,7035）に基づいてメラノーマボウズ（Bowes）株を培
養し、ダウドルの方法（特開昭59-110625）でt-PA部分
精製物を得た。すなわち、メラノーマボウズ株を培養
し、アプロチニンを含む無血清培地を使用して得た培養
上清よりETIカラムを用いてt-PA部分精製物を得た。
6,7035）に基づいてメラノーマボウズ（Bowes）株を培
養し、ダウドルの方法（特開昭59-110625）でt-PA部分
精製物を得た。すなわち、メラノーマボウズ株を培養
し、アプロチニンを含む無血清培地を使用して得た培養
上清よりETIカラムを用いてt-PA部分精製物を得た。
得られたETIカラムによるt-PA部分精製物（１本鎖t-P
A、２本鎖t-PA混合物）をSDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法（Laemmli,U.K.,（1970）,Nature,227,680）
で解析した結果、いくらかの混入蛋白質が存在してい
た。
A、２本鎖t-PA混合物）をSDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法（Laemmli,U.K.,（1970）,Nature,227,680）
で解析した結果、いくらかの混入蛋白質が存在してい
た。
凍結乾燥したt-PA部分精製部を0.1％トリフルオロ酢
酸（TFA）、0.07％トリメチルアミン（TMA）およびアセ
トニトリル35％を含む溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相
カラム（Synchropack RP-4;Synchrom社製）に対しアプ
ライし、流速1ml/min、カラム温度34℃でギルソン社製H
PLCシステムを用いてアセトニトリル濃度を35％から37.
5％までのリニアグラジエント法で30分かけて溶出し
た。
酸（TFA）、0.07％トリメチルアミン（TMA）およびアセ
トニトリル35％を含む溶液（pH2.5）に溶かし、C4逆相
カラム（Synchropack RP-4;Synchrom社製）に対しアプ
ライし、流速1ml/min、カラム温度34℃でギルソン社製H
PLCシステムを用いてアセトニトリル濃度を35％から37.
5％までのリニアグラジエント法で30分かけて溶出し
た。
この方法によりリテンション時間が12分から15分の範
囲で一つの主ピークが得られ、15分から20分の範囲でも
う一つの主ピークが得られた。
囲で一つの主ピークが得られ、15分から20分の範囲でも
う一つの主ピークが得られた。
これらの二つの分画をマルカプトエタノールで還元し
て、あるいは非還元でSDS−ポリアクリルアミド電気泳
動後、銀染色で調べた結果、RTが12分から15分の範囲で
溶出されたt-PAは非還元で分子量約70KDa、還元すると
約30KDaと約40KDaにバンドが検出された。又、15分から
20分の範囲で溶出された分画は還元しても約70KDaであ
り、30KDaおよび40KDaのバンドは検出されなかった。
て、あるいは非還元でSDS−ポリアクリルアミド電気泳
動後、銀染色で調べた結果、RTが12分から15分の範囲で
溶出されたt-PAは非還元で分子量約70KDa、還元すると
約30KDaと約40KDaにバンドが検出された。又、15分から
20分の範囲で溶出された分画は還元しても約70KDaであ
り、30KDaおよび40KDaのバンドは検出されなかった。
この結果から12分から15分の範囲で溶出されるt-PAは
１本鎖t-PAであり、15分から20分の範囲で溶出されるt-
PAは２本鎖t-PAであることが確認された。
１本鎖t-PAであり、15分から20分の範囲で溶出されるt-
PAは２本鎖t-PAであることが確認された。
これら１本鎖t-PAおよび２本鎖t-PAはSDS−ポリアク
リルアミド電気泳動後ザイモグラフィー法で調べた結
果、フィブリン溶解活性が検出された。
リルアミド電気泳動後ザイモグラフィー法で調べた結
果、フィブリン溶解活性が検出された。
上記の１本鎖t-PAと２本鎖t-PAの逆相カラムクロマト
グラフィーに於ける分離条件についてカラム温度あるい
はpHを変動させその影響を調べた。
グラフィーに於ける分離条件についてカラム温度あるい
はpHを変動させその影響を調べた。
上記の分離条件でカラム温度を約16℃に設定した場
合、また40℃に設定した場合、いずれも34℃に設定した
場合に比較し１本鎖t-PAと２本鎖t-PAの分離は優れるも
のではなかった。
合、また40℃に設定した場合、いずれも34℃に設定した
場合に比較し１本鎖t-PAと２本鎖t-PAの分離は優れるも
のではなかった。
上記の分離条件で極性移動相に含まれるTMAの濃度を
増大させることでpHを3.5に高めた場合１本鎖t-PAと２
本鎖t-PAの分離はやや劣り、またTMAの濃度をさらに増
大しpHを4.5に高めた場合、１本鎖t-PAと２本鎖t-PAの
分離はさらにやや劣り、またカラム内にt-PAの非特異的
吸着が認められた。
増大させることでpHを3.5に高めた場合１本鎖t-PAと２
本鎖t-PAの分離はやや劣り、またTMAの濃度をさらに増
大しpHを4.5に高めた場合、１本鎖t-PAと２本鎖t-PAの
分離はさらにやや劣り、またカラム内にt-PAの非特異的
吸着が認められた。
上記の分離条件でアセトニトリルの代わりにイソプロ
ピルアルコールを使用すると１本鎖および２本鎖t-PAの
分離はやや劣った。
ピルアルコールを使用すると１本鎖および２本鎖t-PAの
分離はやや劣った。
Claims (1)
- 【請求項１】ｔ−PAを含む溶液を、易揮発性有機溶媒を
含みかつ水素イオン濃度が、下限がカラム担体を溶解せ
ず、上限がｔ−PAを溶解する条件を満たす範囲である極
性移動相を使用して、逆相液体クロマトグラフィーで展
開することにより、生理学的活性を保持した１本鎖ｔ−
PAと生理学的活性を保持した２本鎖t-PAとに分離するこ
とを特徴とするt-PAの精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62305940A JPH082301B2 (ja) | 1987-12-04 | 1987-12-04 | 逆相液体クロマトグラフィーによるｔ−ＰＡ精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62305940A JPH082301B2 (ja) | 1987-12-04 | 1987-12-04 | 逆相液体クロマトグラフィーによるｔ−ＰＡ精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01148185A JPH01148185A (ja) | 1989-06-09 |
| JPH082301B2 true JPH082301B2 (ja) | 1996-01-17 |
Family
ID=17951129
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62305940A Expired - Lifetime JPH082301B2 (ja) | 1987-12-04 | 1987-12-04 | 逆相液体クロマトグラフィーによるｔ−ＰＡ精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH082301B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT399241B (de) * | 1992-11-17 | 1995-04-25 | Cremisa Medizintechnik Ges M B | Verfahren zum gewinnen und dosieren zumindest eines radioaktiven tochternuklids aus einem mutternuklid |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63317082A (ja) * | 1987-06-03 | 1988-12-26 | スミスクライン・ベックマン・コーポレイション | ｔＰＡの精製 |
-
1987
- 1987-12-04 JP JP62305940A patent/JPH082301B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63317082A (ja) * | 1987-06-03 | 1988-12-26 | スミスクライン・ベックマン・コーポレイション | ｔＰＡの精製 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01148185A (ja) | 1989-06-09 |
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