JPH0471487A - ウロキナーゼ前駆体の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、大腸菌で製造したウロキナーゼ前駆体の精製
法に関するものである。

（発明の背景） ウロキナーゼ前駆体（以下、ｐｒｏＬ］Ｘと記載する）
は、血管内に生じた血栓を分解するプラスミンをその前
駆体であるプラスミノーゲンから誘導するウロキナーゼ
の前駆体である。従って、血栓症の治療薬として有用な
蛋白質である。

従来、人の尿から精製されたウロキナーゼが血栓症の治
療薬として使用されて来たが、これを取得するには大量
の尿が必要であり、充分に供給することが難しかった。

しかも、フィブリンに対する親和性が不十分であるため
、大量に使用すると出血等の副作用を示す恐れがある等
の課題もある。これに対してｐｒｏＵＫは、遺伝子操作
の手法により組み換え微生物を使用して大量に製造し得
、かつ、フィブリンに対して高い親和性を有するため出
血等の副作用を示し難いといった特徴を有することから
、近年注目されるようになっている。

ｐｒｏＵＫを微生物を使用して製造する方法は、例えば
特開昭５９−５１３００号公報等に記載されている。

このように微生物で製造されたｐｒｏＵＫは、医薬品と
して期待される以上、微生物に由来する蛋白質、核酸、
脂質、パイロジエンと呼ばれる発熱性物質、蛋白質等の
夾雑物の混在がないように高純度に純化する必要がある
。

一般に酵素（蛋白質）を精製する方法として、液体クロ
マトグラフィーによる方法、塩析法、有機溶媒分画法、
遠心分離法等が知られているが、これらの方法には長所
、短所があり、−の方法を採用することで充分に精製が
完了するものではない。例えば液体クロマトグラフィー
による方法では、分子量がｐｒｏＵＫと似通った夾雑物
（ｐｒｏＬＩＸの分子量は、約５１３０００である）の
分離は難しいであろうし、塩析法や有機溶媒分画法は大
量に存在する夾雑物の大部分を除去する、いわゆる粗精
製には適当であるものの、高純度のｐｒｏＵＫを取得す
るのには適当ではない。遠心分離法においても、沈降係
数が同様の夾雑物の除去は難しい。

本発明者らは、大腸菌で製造したｐｒｏＵＫを含有する
溶液から前述の夾雑物を除去することを目的として、そ
れ自体単独で実施した場合にも高い純度を有する　ｐｒ
ｏＵＫを取得でき、かつ、他の精製方法と組み合わせる
ことでより高純度のｐｒｏＵＫを取得出来るような精製
法について研究を進めた結果、アルキル基を担持した高
分子ゲルを使用することで良好な結果が得られることを
見出だし、本発明を完成するに至った。

（発明の構成） 大腸菌で製造したｐｒｏＵＫを含有する溶液について前
述の目的を達成するためになされた本発明は、即ち、活
性を発現し得るウロキナーゼ前駆体及び大腸菌に由来す
る夾雑物を含有する試料溶液をアルキル基を担持した高
分子ゲルと接触させ、次いで当該ゲルをアルコール系有
機溶媒と接触させて当該有機溶媒中にウロキナーゼ前駆
体を取得することを特徴とするウロキナーゼ前駆体の精
製方法である。以下、本発明の詳細な説明する。

大腸菌でｐｒｏＵＫを製造した場合、ｐｒｏＵＫは活性
を発現し得ない高次構造に折り畳まれた形態で製造され
る（特開昭５９−１８１３２１号公報等）。本発明にお
いて精製される　ｐｒｏＵＫは、このような不活性のｐ
ｒｏＵＫから特開昭５９−１６１３２１号、特開昭６０
−５００８９３号公報等に記載された方法に従って取得
されるものである。なお、ｐｒｏＵＫは、例えば特開昭
５５９−５１３００号公報等に記載された、天然型の一
次構造を有するものであっても良いし、例えば特開昭８
２−１４６８８号公報等に記載された様な、−次構造中
に人工的な変異を有するものであっても良い。

本発明における活性を発現し得るｐｒｏＵＫ及び大腸菌
に由来する夾雑物を含有する試料溶液は、前述した公報
等を参照することで取得することが可能である。−例を
記載すれば、特開昭５９−５１３００号公報等に記載さ
れたｐｒｏＵＫをコードする遺伝子を含むプラスミドを
構築し、大腸菌を形質転換して適当な培地で培養し活性
を発現し得ないｐｒｏＬＩＫを不溶性の凝集塊として内
部に蓄積した菌体を得、この菌体を適当な緩衝液等中で
破砕して不溶性画分にｐｒｏＵＫを回収し、特開昭５９
−１６１３２１号公報等に記載されたようにグアニジン
塩酸塩等の強力な変性剤を使用してｐｒｏＵＫを可溶化
し、更に変性剤濃度を低下させれば良い。以上の操作の
一例において、例えば破砕の後に可溶性画分を除去する
ような操作、可溶化の後に不溶性画分を除去するような
操作又は活性化後に塩析、有機溶媒分画等の操作を行い
、それぞれの両分又は溶液中の夾雑物を部分的に除去し
て粗精製を行っておいても良い。

粗精製を実施しておくことで、本発明で使用するゲルへ
の非特異的吸着等をより防止することが可能となり、同
時にゲルの劣化を防止出来るためである。

大腸菌に由来する夾雑物とは、主に、核酸、細胞壁多糖
類（リポサツカロイド等は発熱を引き起こすことから、
発熱性物質（パイロジエン）と呼ばれる）、脂質又は蛋
白質等である。

本発明で使用するゲルに担持されるアルキル基は、炭素
数が１から１０程度のものであれば良い。

ゲルの基材は、例えばセルロースやアガロース等の天然
の高分子であっても良いし、とニルポリマー等の合成高
分子であってもさしつかえない。また、その機械的強度
を高めるために、人工的に架橋を施したものであっても
良い。更に、基材はｐｒｏＵＫ及び／又は夾雑物の非特
異的吸着を防止するため、親水性の高分子であるか、又
はその表面に親水基を導入されたものであることが好ま
しい。

本発明では、好ましくはアルキル基を担持する高分子ゲ
ルをカラムに充填し、ゲルと試料溶液又はアルコール系
有機溶媒との接触等の操作を、このカラムへの溶液（溶
媒）の添加操作により実施すると良い。

前記したゲルと試料溶液の接触は、２０℃から５０℃の
温度範囲で実施すれば良い。５０℃以上の温度でこの操
作を実施すると、ｐｒｏＵＫの熱変性による失活が生じ
るため好ましくなく、２０℃以下では夾雑物がゲルへ吸
着し易くなるるためである。特に温度範囲を２５℃から
４０℃とすれば、ｐｒｏＵＫの失活や夾雑物の吸着等は
生じにくくなり、本発明をより効果的に実施することが
出来る。

試料溶液とゲルとを前記温度範囲で接触させることによ
り、ｐｒｏＵＫはゲル（アルキル基）に吸着する。次に
適当な緩衝液等をゲルに接触させれば、遊離した状態で
存在している夾雑物が除去されることになる。

以上の操作に続いて、ｐｒｏＵＫを吸着したゲルとアル
コール系有機溶媒を接触させる。本発明で使用するアル
コール系有機溶媒としては、例えばエチルアルコール、
プロピルアルコール、エチレングリコール等である。こ
れら有機溶媒は、例えば酢酸塩、燐酸塩、トリスヒドロ
キシアミノメタン、塩酸、グリシン、荷性ソーダ等の溶
液としてｐＨ４−１１に調節して使用する。これらアル
コール系有機溶媒を接触させることで、前記の操作でゲ
ルに吸着していた、除去されなかった夾雑物及びｐｒｏ
ＵＫが遊離する。従って、有機溶媒の接触は、溶液中の
有機溶媒濃度を徐々に高めていく、いわゆるグラデイエ
ンドによることが好ましい。濃度グラデイエンドの範囲
は、少なくとも０−１Ｏ％の範囲である。このように、
アルコール系有機溶媒をｐｒｏＵＫを吸着したゲルと接
触させることでｐｒｏＵＫをゲルから遊離させることが
出来るから、精製されたｐｒｏＵＫ画分を当該溶液中に
取得することが可能である。ここで、ゲルに吸着した夾
雑物であっても、有機溶媒グラデイエンドを付した適当
な溶液を添加していき、ゲルから遊離する遊離物を分別
回収すれば、ロー１０％程度の濃度範囲で夾雑物画分、
ｐｒｏＵＫ画分を得ることが出来る。

ところで、活性化操作がなされた直後の活性化後溶液を
試料溶液として本発明を実施する場合であって、試料溶
液中にグアニジン塩酸塩等の蛋白質変性剤が共存してい
る場合には、試料溶液とゲルを接触させるに先立って、
試料溶液に５０５ＭからＩＭ程度となるように塩類を添
加し、夾雑物等の疎水性を低下させておくと良い。塩類
としては、例えば硫酸、燐酸、カルボン酸、塩素、硝酸
、炭酸等の陰イオンを生じるものや、ナトリウム、アン
モニウム、カリウム、マグネシウム等の陽イオンを使用
すれば良い。中でも、硫安、硫酸ソーダ、硫酸マグネシ
ウム等の水に対する溶解性が高いものや、２価以上の多
価の塩が良い。

（発明の効果） 大腸菌により製造されたｐｒｏＵＫを血栓症の治療薬等
の医薬品として使用する場合には、大腸菌に由来する夾
雑物を除去する精製操作を実施することが必要である。

通常の液体クロマトグラフィ等の手法では、分子量の似
通った夾雑物が除去されないという事態が生じる恐れが
あるが、本発明の方法はゲルに担持されたアルキル基と
ｐｒｏＵ、にとの吸着を利用した精製法であることから
、このような事態が生じる恐れはない。

本発明は、活性を発現し得るｐｒｏＵＫ及び大腸菌に由
来する夾雑物を含有する試料溶液について、夾雑物のみ
を選択的に除去することが可能である。

このため、本発明は単独の精製法としてもｐｒｏＵＫの
精製に効果的であり、また、従来−・般に知られた例え
ば液体クロマトグラフィーによる精製法、塩析、有機溶
媒分画法、更にはｐｒｏＵＫに対する基質等を用いたア
フィニティークロマトグラフィー法等と組み合わせるこ
とで、より高純度のｐｒｏＵＫを取得することを可能と
するものである。

なお、本発明で使用するカラムは、使用後に水と荷性ソ
ーダで交互に洗浄する等の簡便な操作を行うのみで繰り
返し使用することが出来る。

（実施例） 以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載
するが、これら実施例は一例であって、本発明を限定す
るものではない。

なお、本実施例におけるｐｒｏＵＫの活性は、ｐｒｏＵ
Ｋをプラスミンで処理してウロキナーゼに変換した後、
ウロキナーゼの人工基質であるＰｙｒＧＩｙＡｒｇ　”
　ｐＮＡ　　（Ｓ−２４４，第一化学薬品（株）製、Ｐ
ｙｒはピログルタミル基を示す）の加水分解活性を測定
し、市販のウロキナーゼ（ミドリ十字（株）製）と比較
して決定した。また、蛋白質濃度は、２８０ｎ■の光吸
度を測定して決定した。

実施例　１゜ （試料溶液の調製） ｐｒｏＵＫをコードする遺伝子を含むプラスミド（特開
昭５９−５１３００号）で大腸菌（ＫＹ１４３Ｂ株）を
形質転換し、３０℃条件下、グリセリンとカゼイン分解
物を含むｍ９培地で培養してｐｒｏＵＫを発現させ、ｐ
ｒｏＵＫを菌体内部に有する菌体を取得した。

湿重ｆｆｉ　１５０ｇの菌体をＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液
（ａｌｌ　９．０）中でホモジナイズして破砕し、１．
５　Ｎの懸濁液を得た。この懸濁液に、１．５ｇの８Ｍ
グアニジン塩酸塩溶液を添加して不溶性画分中のｐｒｏ
ＵＫを可溶化し、続いて０．０２＋ｅＭ酸化型グルタチ
オン、０．２＋ｅＭの還元型グルタチオンを含むトリス
塩酸緩衝液（ｐｉｆ８．０）を添加してグアニジン塩酸
塩濃度を４倍希釈してｐｒｏＵＫの活性化を行った。な
お、以上の操作は特開昭５９−１１３１３２１号公報を
参照して行った。

取得された、活性を発現し得るｐｒｏＵＫを含む試料溶
液について、その蛋白質濃度及びウロキナーゼ活性を測
定したところ、それぞれ０．７５ａ＋ｇ／ｍｌ、３００
０１０／＋ｅｌであった。これらの値から溶液中の蛋白
質１■ｇ当たりのウロキナーゼ活性（比活性）を求めた
ところ、約４００１０７ｍｇであった。

この溶液に対し、硫安を２５％飽和となるように添加し
、生じた沈殿を分画分子ｆｆｉ　３００００の限外濾過
膜を使用して除去した後、更に硫安を６０％飽和となる
ように添加し、同様の濾過膜を使用して沈殿を回収した
。

回収された沈殿の１２　ｇを７％硫安（Ｗ／ｖ）と０゜
５Ｍグアニジン塩酸を含む３６０１のリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）に溶解し、試料溶液とした。なお、当該試料
溶成の蛋白質濃度、ウロキナーゼ活性、比活性はそれぞ
れ２．Ｉｌ＋＋ｇ／ｍｌ、９２０００１Ｕ／ｍｌ　、３
２８５７ＩＵ／＋ｔｇであった。

（ｐｒｏＵＸの精製） アルキル基を担持するゲルとして、ブチル基を担持した
市販のゲル（東ソー（株）製、ブチルトヨバール）を使
用した。ゲルを直径Ｑ、９ｅｌ長さｌＯｃ＊のカラムに
充填し、室温（２２℃）中で０．６Ｍ硫安を含む５０ｖ
Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）により平衡化し、
前記のようにして調製した試料溶液を添加した。更に２
００１の前記トリス塩酸緩衝液）を添加して遊離物を溶
出させた後、エタノール１５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８，５）をエタノール濃度が０−１０％のグラデ
イエンドとなる様添加した。

その結果、約２％のエタノールによる溶出画分にはウロ
キナーゼ活性をほとんど有しない成分が、約６％のエタ
ノールによる溶出画分にはｐｒｏＵＫ画分が溶出した。

ｐｒｏｌＪＫ画分についての蛋白質濃度、ウロキナーゼ
活性、比活性はそれぞれ０．２ｇｇ／ｍｌ、１７８００
０１Ｕ／１．８９０００１Ｕ／＋ｇであった。以上の結
果を表にまとめて示す。

なお、以上の操作は、流速２ｍｌ／ｍ１ｎで行った。

表 味するものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）活性を発現し得るウロキナーゼ前駆体及び大腸菌
   に由来する夾雑物を含有する試料溶液をアルキル基を担
   持した高分子ゲルと接触させ、次いで当該ゲルをアルコ
   ール系有機溶媒と接触させて当該有機溶媒中にウロキナ
   ーゼ前駆体を取得することを特徴とするウロキナーゼ前
   駆体の精製方法。