JPH0471488A - ウロキナーゼ前駆体の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、大腸菌で製造したウロキナーゼ前駆体の精製
法に関するものである。

（発明の背景） ウロキナーゼ前駆体（以下、ｐｒｏＵＫと記載する）は
、血管内に生じた血栓を分解するプラスミンをその前駆
体であるプラスミノーゲンから誘導するウロキナーゼの
前駆体である。従って、血栓症の治療薬として有用な蛋
白質である。

従来、人の尿から精製されたウロキナーゼが血栓症の治
療薬として使用されて来たが、これを取得するには大量
の尿が必要であり、充分に供給することが難しかった。

しかも、フィブリンに対する親和性が不十分であるため
、大量に使用すると出血等の副作用を示す恐れがある等
の課題もある。これに対してｐｒｏＵＫは、−遺伝子操
作の手法により組み換え微生物を使用して大量に製造し
得、しかもフィブリンに対して高い親和性を有すること
から出血等の副作用を示し難いといった特徴を有するた
め、近年注目されている。

ｐｒｏＵＫを微生物を使用して製造する方法は、例えば
特開昭５９−５１３００号公報等に記載されている。

このように微生物で製造されたｐｒｏＵＫは、医薬品と
して期待される以上、微生物に由来する蛋白質、核酸、
脂質、パイロジエンと呼ばれるＪｌ性物質、蛋白質等の
夾雑物の混在がないように高純度に純化する必要がある
。

一般に酵素（蛋白質）を精製する方法として、液体クロ
マトグラフィーによる方法、塩析法、有機溶媒分画法、
遠心分離法等が知られているが、これらの方法には長所
、短所があり、−の方法を採用することで充分に精製が
完了するものではない。例えば液体クロマトグラフィー
による方法では、分子量がｐｒｏＵＫと似通った夾雑物
（ｐｒｏＵＫの分子量は、約５６０００である）の分離
は難しいであろうし、塩析法や有機溶媒分画法は大量に
存在する夾雑物の大部分を除去する、いわゆる粗精製に
は適当であるものの、高純度のｐｒｏＵＫを取得するの
には適当ではない。遠心分離法においても、沈降係数が
同様の夾雑物の除去は難しい。

本発明者らは、大腸菌で製造したｐｒｏＵＫを含有する
溶液から前述の夾雑物を除去することを目的として、そ
れ自体単独で実施した場合にも高い純度を有するｐｒｏ
ＬＩＫを取得でき、かつ、他の精製方法と組み合わせる
ことでより高純度のｐｒｏＵＫを取得出来るような精製
法について研究を進めた結果、アルギル基を担持した高
分子ゲルを使用することで良好な結果が得られることを
見出だし、本発明を完成するに至った。

（発明の構成） 大腸菌で製造したｐｒｏＵＫを含有する溶液について前
述の目的を達成するためになされた本発明は、即ち、活
性を発現し得るウロキナーゼ前駆体及び大腸菌に由来す
る夾雑物を含有する試料溶液を２０℃から５０℃の温度
範囲でアルキル基を担持した高分子ゲルと接触させ、次
いで当該ゲルに１０℃以下に調整された溶液を接触させ
て当該溶液中にウロキナーゼ前駆体を取得することを特
徴とするウロキナーゼ前駆体の精製法である。以下、本
発明の詳細な説明する。

大腸菌でｐｒｏＬＩＫを製造した場合、ｐｒｏＵＫは活
性を発現し得ない高次構造に折り畳まれた形態で製造さ
れる（特開昭５９−１６１３２１号公報等）。本発明に
おいて精製されるｐｒｏＵＫは、このような不活性のｐ
　ｒ　０１１　Ｋから特開昭５９−１１３１３２１号、
特開昭６０−５００８９３号公報等に記載された方法に
従って取得されるものである。なお、ｐｒｏＵＫは、例
えば特開昭５５９−５１３００号公報に記載された、天
然型の一次構造を有するものであっても良いし、例えば
特開昭０２−ｔ４６８６号公報に記載された様な、−次
構造中に人工的な変異を有するものであっても良い。

本発明における活性を発現し得るｐｒｏＵＫ及び大腸菌
に由来する夾雑物を含有する試料溶液は、前述した公報
等を参照することで取得することが可能である。−例を
記載すれば、特開昭５９−５１３００号公報等に記載さ
れたｐｒｏＵＫをコードする遺伝子を含むプラスミドを
構築し、大腸菌を形質転換して適当な培地で培養し活性
を発現し得ないｐｒｏＵＫを不溶性の凝集塊として内部
に蓄積した菌体を得、この菌体を適当な緩衝液等中で破
砕して不溶性画分にｐｒｏＵＫを回収し、特開昭５９−
１６１３２１号公報等に記載されたようにグアニジン塩
酸塩等の強力な変性剤を使用してｐｒｏＵＫを可溶化し
、更に変性剤濃度を低下させれば良い。以上の操作の一
例において、例えば破砕の後に可溶性画分を除去するよ
うな操作、可溶化の後に不溶性画分を除去するような操
作又は活性化後に塩析、有機溶媒分画等の操作を行い、
それぞれの両分又は溶液中の夾雑物を部分的に除去して
粗精製を行っておいても良い。

粗精製を実施しておくことで、本発明で使用するゲルへ
の非特異的吸着等をより防止することが可能となり、同
時にゲルの劣化を防止出来るためである。

大腸菌に由来する夾雑物とは、主に、核酸、細胞壁多糖
類（リポサツカロイド等は発熱を引き起こすことから、
発熱性物質（パイロジエン）と呼ばれる）、脂質又は蛋
白質等である。

本発明で使用するゲルに担持されるアルキル基は、炭素
数が１からＩＯ程度のものであれば良い。

ゲルの基材は、例えばセルロースやアガロース等の天然
の高分子であっても良いし、ビニルポリマー等の合成高
分子であってもさしつかえない。また、その機械的強度
を高めるために、人工的に架橋を施したものであっても
良い。更に、基材はｐｒｏＵＫ及び／又は夾雑物の非特
異的吸着を防止するため、親水性の高分子であるか、又
はその表面に親水基を導入されたものであることが好ま
しい。

本発明では、好ましくはアルキル基を担持する高分子ゲ
ルをカラムに充填し、試料溶液とゲルとの接触や温度を
調整された溶液とゲルとの接触、更にはゲルからの遊離
物の取得はこのカラムへの溶液の添加操作やカラムから
の溶出液の取得操作により実施すると良い。

前記したゲルと試料溶液の接触は、２０℃から５０℃の
温度範囲で実施すれば良い。５０℃以上の温度でこの操
作を実施すると、ｐｒｏＵＫの熱変性による失活が生じ
るため好ましくなく、２０℃以下では夾雑物のゲルへの
吸着が生じるためである。特に温度範囲を２５℃から４
０℃とすれば、ｐｒｏＵＫの失活や夾雑物の吸着等は生
じにくくなり、本発明をより効果的に実施することが出
来る。

試料溶液とゲルとを前記温度範囲で接触させることによ
り、ｐｒｏＵＫはゲル（アルキル基）に吸着し、夾雑物
は遊離した状態となる。この状態で試料を添加したとき
の温度と同様の温度に調整された適当な溶液を添加する
か、又は試料溶液をそのまま溶出させれば夾雑物を除去
出来る。後に、１０℃程度に調整された適当な溶液を添
加れば、ｐｒｏＵＫをゲルから遊離させることが出来る
から、精製されたｐｒｏＵＫ画分を取得することが可能
である。

ここで、夾雑物を除去した後、温度グラデイエンドを付
した適当な溶液を添加し、最終的に温度を１０℃以下に
低下させ、ゲルから遊離する遊離物を分別回収すれば、
２０℃から５０℃の温度範囲でゲルに吸着し、１０℃で
遊離する性質を有する夾雑物であっても除去することが
出来る。

ところで、活性化操作がなされた直後の活性化後溶液を
試料溶液として本発明を実施する場合であって、試料溶
液中にグアニジン塩酸塩等の蛋白質変性剤が共存してい
る場合には、試料溶液とゲルを接触させるに先立って、
試料溶液に５０ｆｆ１ＭからＩＭ程度となるように塩類
を添加し、夾雑物等の疎水性を低下させておくと良い。

塩類としては、例えば硫酸、燐酸、カルボン酸、塩素、
硝酸、炭酸等の陰イオンを生じるものや、ナトリウム、
アンモニウム、カリウム、マグネシウム等の陽イオンを
使用すれば良い。中でも、硫安、硫酸ソーダ、硫酸マグ
ネシウム等の水に対する溶解性が高いものや、２価以上
の多価の塩が良い。

ｐｒｏＵＫを吸着したゲルと接触させる溶液は、ｐｒｏ
ＵＫの変質を防止するため、そのｐＨがｐｌ＋４−１１
に調製された溶液を使用すると良い。例えば、酢酸塩、
燐酸塩、トリスヒドロキシアミノメタン、塩酸、グリシ
ン、荷性ソーダ等によりそのｐｌ＋を調製した緩衝液が
例示出来る。

（発明の効果） 大腸菌により製造されたｐｒｏＵＫを血栓症の治療薬等
の医薬品として使用する場合には、大腸菌に由来する夾
雑物を除去する精製操作を実施することが必要である。

通常の液体クロマトグラフィー等の手法では、分子量の
似通った夾雑物が除去されないという事態が生じる恐れ
があるが、本発明の方法はゲルに担持されたアルキル基
とｐｒｏＵＫとの吸着を利用した精製法であることから
、このような事態が生じる恐れはない。

本発明は、活性を発現し得る　ｐｒｏＵＫ及び大腸菌に
由来する夾雑物を含有する試料溶液について、夾雑物の
みを選択的に除去することが可能である。

このため、本発明は単独の精製法としてもｐｒｏＵＫの
精製に効果的であり、また、従来一般に知られた例えば
液体クロマトグラフィーによる精製法、塩析、有機溶媒
分画法、更にはｐｒｏＵＫに対する基質等を用いたアフ
ィニティークロマトグラフィー法等と組み合わせること
で、より高純度のｐｒｏＵＫを取得することを可能とす
るものである。

なお、本発明で使用するカラムは、使用後に水と荷性ソ
ーダで交互に洗浄する等の簡便な操作を行うのみで繰り
返し使用することが出来る。

（実施例） 以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載
するが、これら実施例は一例であって、本発明を限定す
るものではない。

なお、本実施例におけるｐｒｏＵＫの活性は、ｐｒｏＵ
Ｋをプラスミンで処理してウロキナーゼに変換した後、
ウロキナーゼの人工基質であるＰｙｒＧＩｙＡｒｇ−ｐ
ＮＡ　　（Ｓ−２４４，第一化学薬品（株）製、Ｐｙｒ
はピログルタミル基を示す）の加水分解活性をａｌｌ定
し、市販のウロキナーゼ（ミドリ十字（株）製）と比較
して決定した。また、蛋白質濃度は、市販の測定キット
（ＢｉｏＲａｄ社製、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋ
ｉｔ　）及び２８０　ｎｍの光吸度を測定して決定した
。

実施例　１ （試料溶液の調製） ｐｒｏｔｌＫをコードする遺伝子を含むプラスミド（特
開昭５９−５１３００号）で大腸菌（ＫＹ１４３Ｂ株）
を形質転換し、３０℃条件下、グリセリンとカゼイン分
解物を含む卸９培地（ｐＨ７，０）で培養してｐｒｏＵ
Ｋを発現させ、ｐｒｏＵＫを菌体内部に有する菌体を取
得した。

湿重量１５０ｇの菌体を、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐ
ｔｌ９．０）中でホモジナイズして破砕し、■。５ｇの
懸濁液を得た。この懸濁液に、１．５　Ｎの８Ｍグアニ
ジン塩酸塩溶液を添加して不溶性画分中のｐｒｏＵＫを
可溶化し、続いて０．０２ｍＭ酸化型グルタチオン、０
．２１Ｘの還元型グルタチオンを含むトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８，０）を添加してグアニジン塩酸塩濃度が４倍
希釈してｐｒｏＵＫの活性化を行った。なお、以上の操
作は特開昭５９−１６１３２１号公報を参照して行った
。

取得された、活性を発現し得るｐｒｏＬＩＫを含む試料
溶液について、その蛋白質濃度及びウロキナーゼ活性を
測定したところ、それぞれ０．７５　ｍｇ／ｍｌ、３０
００１υ／１であった。これらの値から溶液中の蛋白質
１ｍｇ当たりのウロキナーゼ活性（比活性）を求めたと
ころ、約４０００１０／ａ＋ｇであった。

この溶液に対し、硫安を２５％飽和となるように添加し
、生じた沈殿を分画分子ｆｆｉ　３００００の限外濾過
膜を使用して除去した後、更に硫安を６０％飽和となる
ように添加し、同様の濾過膜を使用して沈殿を回収した
。

回収された沈殿の１２　ｇを、７％硫安と０．５おグア
ニジン塩酸を含む３６０１のリン緩衝液（ｐｔｌ　７．
０）に溶解し、試料溶液とした。なお、当該試料溶液の
蛋白質濃度、ウロキナーゼ活性、比活性はそれぞれ２．
８０　ｍｇ／ｅｌ、９２０００　ＩＵ／ｍｌ　、３２８
６０　　Ｉｌｌ／ｍｇであった。

溶出した遊離物について蛋白質濃度、ウロキナーゼ活性
、比活性を測定した結果を表１に示す。

なお、室温条件下で溶出した両分ではウロキナーゼ活性
は測定されなかった。

表　　１ （ｐｒｏｌＪＫの精製） アルキル基を担持するゲルとして、ブチル基を担持した
市販のゲル（東ソー（株）製、ブチルトヨバール）を使
用した。ゲルを直径０．９ｃｍ５長さ１０ｃｍのカラム
に充填し、室温（２２℃）中で５０１１Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８，５）により平衝化し、前記のようにして
調製した試料溶液を添加した。更に２００ｍ１の５０５
Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐｔｌ　８．５）を添加して遊
離物を溶出させた後、表１中の温度に設定された実験室
内で同一の緩衝液を添加させ、遊離物を溶出させた。以
上の操作は流速２ｍｌ／ａ＋Ｉｎで実施した。

実施例　２゜ 実施例１で調製した試料溶液について、試料溶液とゲル
との接触を２６℃で、その溶出を表２中に示した温度で
実施した以外は実施例１と同様の操作を実施した。結果
を表２に示す。

実施例　３ 実施例１で調製した試料溶液について、試料溶液とゲル
との接触を３８℃で、その溶出を表３に示した温度で実
施した以外は実施例１と同様の操作を実施した。結果を
表３に示す。

表　　２ 表　　３ 実施例　４ 実施例１て調製した試料溶液について、試料溶液とゲル
との接触を５０℃で、その溶出を表４に示した温度で実
施した以外は実施例１と同様の操作を実施した。結果を
表４に示す。

表　　４

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）活性を発現し得るウロキナーゼ前駆体及び大腸菌
   に由来する夾雑物を含有する試料溶液を２０℃から５０
   ℃の温度範囲でアルキル基を担持した高分子ゲルと接触
   させ、次いで当該ゲルに１０℃以下に調整された溶液を
   接触させて当該溶液中にウロキナーゼ前駆体を取得する
   ことを特徴とするウロキナーゼ前駆体の精製法。