JPH0739375A - プラスミノーゲンの精製方法 - Google Patents
プラスミノーゲンの精製方法Info
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- JPH0739375A JPH0739375A JP18789693A JP18789693A JPH0739375A JP H0739375 A JPH0739375 A JP H0739375A JP 18789693 A JP18789693 A JP 18789693A JP 18789693 A JP18789693 A JP 18789693A JP H0739375 A JPH0739375 A JP H0739375A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
(57)【要約】
【構成】 プラスミノーゲン含有組成物を陰イオン交換
体に接触させ、その未吸着画分を回収することを特徴と
するプラスミノーゲンの精製方法。塩濃度０．１〜２
％，好ましくは０．４〜０．８％および／またはｐＨ５
〜９，好ましくはｐＨ６〜８の条件下でプラスミノーゲ
ン含有組成物を陰イオン交換体に接触させることを特徴
する上記プラスミノーゲンの精製方法。 【効果】 プラスミノーゲン含有組成物からプラスミノ
ーゲン抗原性を有する高分子物質の除去するのに有用で
ある。また、プラスミノーゲンを短時間に効率よく、収
率よく、かつ経済的に精製することができる。従って、
大量のプラスミノーゲン含有組成物からの精製において
特に有利であり、工業的規模におけるプラスミノーゲン
の製法として極めて有用である。
体に接触させ、その未吸着画分を回収することを特徴と
するプラスミノーゲンの精製方法。塩濃度０．１〜２
％，好ましくは０．４〜０．８％および／またはｐＨ５
〜９，好ましくはｐＨ６〜８の条件下でプラスミノーゲ
ン含有組成物を陰イオン交換体に接触させることを特徴
する上記プラスミノーゲンの精製方法。 【効果】 プラスミノーゲン含有組成物からプラスミノ
ーゲン抗原性を有する高分子物質の除去するのに有用で
ある。また、プラスミノーゲンを短時間に効率よく、収
率よく、かつ経済的に精製することができる。従って、
大量のプラスミノーゲン含有組成物からの精製において
特に有利であり、工業的規模におけるプラスミノーゲン
の製法として極めて有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、プラスミノーゲンの精
製方法に係り、詳細にはプラスミノーゲン含有組成物中
の夾雑物が除去された高純度のプラスミノーゲンを製造
する方法に関する。
製方法に係り、詳細にはプラスミノーゲン含有組成物中
の夾雑物が除去された高純度のプラスミノーゲンを製造
する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】プラスミノーゲンは、ウロキナーゼ、スト
レプトキナーゼ等によって活性化されてプラスミンとな
り、これがフィブリンを分解して線溶現象を生起するの
で、ウロキナーゼやストレプトキナーゼとともに血栓症
の治療の他、広く臨床応用が可能な医薬品として注目さ
れている。特にそのＮ末端がリジル残基であるリジル型
プラスミノーゲンの有用性が期待されている。
レプトキナーゼ等によって活性化されてプラスミンとな
り、これがフィブリンを分解して線溶現象を生起するの
で、ウロキナーゼやストレプトキナーゼとともに血栓症
の治療の他、広く臨床応用が可能な医薬品として注目さ
れている。特にそのＮ末端がリジル残基であるリジル型
プラスミノーゲンの有用性が期待されている。
【０００３】従来、プラスミノーゲンの精製法として
は、等電点−酸抽出法、硫安分画法、ポリエチレングリ
コール分画法等により比活性０．０１〜０．１ＣＵ／ｍ
ｇ程度の粗プラスミノーゲンを得る方法が知られてい
る。この粗プラスミノーゲンの比活性を更に向上せしめ
る精製方法として、リジン−アガロースを用いたアフィ
ニティクロマト法が知られている。このリジン−アガロ
ース処理によると、プラスミノーゲンはかなり高純度ま
で精製されるが、なおまだ不純物が混在する。このよう
な不純物の中にはプラスミノーゲンの抗原性を有するも
のが含まれ、アフィニティクロマト法では除去できな
い。
は、等電点−酸抽出法、硫安分画法、ポリエチレングリ
コール分画法等により比活性０．０１〜０．１ＣＵ／ｍ
ｇ程度の粗プラスミノーゲンを得る方法が知られてい
る。この粗プラスミノーゲンの比活性を更に向上せしめ
る精製方法として、リジン−アガロースを用いたアフィ
ニティクロマト法が知られている。このリジン−アガロ
ース処理によると、プラスミノーゲンはかなり高純度ま
で精製されるが、なおまだ不純物が混在する。このよう
な不純物の中にはプラスミノーゲンの抗原性を有するも
のが含まれ、アフィニティクロマト法では除去できな
い。
【０００４】そこで、このような夾雑物を除去するため
に更なる精製処理として、分子量の差で分画するゲル濾
過法、イオン交換体に吸着させて分離・分画する方法な
どが行われている。
に更なる精製処理として、分子量の差で分画するゲル濾
過法、イオン交換体に吸着させて分離・分画する方法な
どが行われている。
【０００５】しかしながら、ゲル濾過法においては、高
い分離、精製能を得るために、一般に試料の添加容量
を少なくする（通常、添加試料容量はカラム体積の１〜
５％程度）、カラムの長さを長くする（ベット高を高
くする）、流速を遅くするなどの技法が要求される。
このため、かかるゲル濾過法によると、前もってカラム
に添加する試料の濃縮操作が必要となり、また試料の添
加容量に応じてゲルが必要である、さらには分離、精製
処理に長い時間がかかるなどの点で工業的使用において
は問題があった。
い分離、精製能を得るために、一般に試料の添加容量
を少なくする（通常、添加試料容量はカラム体積の１〜
５％程度）、カラムの長さを長くする（ベット高を高
くする）、流速を遅くするなどの技法が要求される。
このため、かかるゲル濾過法によると、前もってカラム
に添加する試料の濃縮操作が必要となり、また試料の添
加容量に応じてゲルが必要である、さらには分離、精製
処理に長い時間がかかるなどの点で工業的使用において
は問題があった。
【０００６】また、従来のイオン交換体処理は、一旦イ
オン交換体に吸着させて分離する方法であり、この方法
によると、イオン交換体への吸着および分離のための
条件の詳細な至適化が必要であること、さらに至適化
後も適時調整が必要であること、分離溶出のために大
量の緩衝液が必要であること、目的物を吸着させるた
めに大量のイオン交換体が必要である等の問題がある。
オン交換体に吸着させて分離する方法であり、この方法
によると、イオン交換体への吸着および分離のための
条件の詳細な至適化が必要であること、さらに至適化
後も適時調整が必要であること、分離溶出のために大
量の緩衝液が必要であること、目的物を吸着させるた
めに大量のイオン交換体が必要である等の問題がある。
【０００７】このように従来法は、時間や手間がかか
り、さらには経済性の点で解決されるべき問題を含んで
おり、大量のプラスミノーゲン含有組成物の処理には不
適当であった。
り、さらには経済性の点で解決されるべき問題を含んで
おり、大量のプラスミノーゲン含有組成物の処理には不
適当であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、プラ
スミノーゲン含有組成物中の夾雑物、就中プラスミノー
ゲン抗原性をもつ高分子物質を除去する方法を提供する
ことである。さらに、本発明の他の目的は、短時間で、
効率、かつ高い収率をもって、かつ経済的にプラスミノ
ーゲンを精製する方法を提供することである。
スミノーゲン含有組成物中の夾雑物、就中プラスミノー
ゲン抗原性をもつ高分子物質を除去する方法を提供する
ことである。さらに、本発明の他の目的は、短時間で、
効率、かつ高い収率をもって、かつ経済的にプラスミノ
ーゲンを精製する方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来法に
おける問題を解決すべく、効率のよいプラスミノーゲン
の精製方法について種々研究を重ねた結果、プラスミノ
ーゲン含有組成物から短時間で夾雑物を除去し、高純度
のプラスミノーゲンを高収率にかつ経済的に取得できる
方法を確立するに至った。
おける問題を解決すべく、効率のよいプラスミノーゲン
の精製方法について種々研究を重ねた結果、プラスミノ
ーゲン含有組成物から短時間で夾雑物を除去し、高純度
のプラスミノーゲンを高収率にかつ経済的に取得できる
方法を確立するに至った。
【００１０】すなわち、本発明はプラスミノーゲン含有
組成物を陰イオン交換体に接触させ、その未吸着画分を
回収することを特徴とするプラスミノーゲンの精製方法
である。本発明方法において、好ましくは上記精製を塩
濃度０．１〜２％、より好ましくは塩濃度０．４〜０．
８％の条件下で、さらに好ましくはｐＨ５〜９、より好
ましくはｐＨ６〜８の条件下で行うことである。すなわ
ち、本発明はこの特定条件下においてプラスミノーゲン
含有組成物を陰イオン交換体に接触させ、その未吸着画
分を回収することを特徴とするプラスミノーゲンの精製
方法である。
組成物を陰イオン交換体に接触させ、その未吸着画分を
回収することを特徴とするプラスミノーゲンの精製方法
である。本発明方法において、好ましくは上記精製を塩
濃度０．１〜２％、より好ましくは塩濃度０．４〜０．
８％の条件下で、さらに好ましくはｐＨ５〜９、より好
ましくはｐＨ６〜８の条件下で行うことである。すなわ
ち、本発明はこの特定条件下においてプラスミノーゲン
含有組成物を陰イオン交換体に接触させ、その未吸着画
分を回収することを特徴とするプラスミノーゲンの精製
方法である。
【００１１】本発明の精製方法における目的物であるプ
ラスミノーゲンは、メチオニル型（Ｎ末端アミノ酸がメ
チオニンである）、グルタミル型（Ｎ末端アミノ酸がグ
ルタミン酸である）またはリジル型（Ｎ末端アミノ酸が
リジンである）等が例示される。また、これらの混合物
であってもよい。好ましくは、リジル−プラスミノーゲ
ンである。
ラスミノーゲンは、メチオニル型（Ｎ末端アミノ酸がメ
チオニンである）、グルタミル型（Ｎ末端アミノ酸がグ
ルタミン酸である）またはリジル型（Ｎ末端アミノ酸が
リジンである）等が例示される。また、これらの混合物
であってもよい。好ましくは、リジル−プラスミノーゲ
ンである。
【００１２】本発明における出発原料であるプラスミノ
ーゲン含有組成物は、水溶液状態として本発明の方法に
付される。プラスミノーゲンは、血液，体液，胎盤など
の中に存在し、プラスミノーゲン含有組成物は、これら
から一般既知の方法にて製造することができる。
ーゲン含有組成物は、水溶液状態として本発明の方法に
付される。プラスミノーゲンは、血液，体液，胎盤など
の中に存在し、プラスミノーゲン含有組成物は、これら
から一般既知の方法にて製造することができる。
【００１３】陰イオン交換体との接触時におけるプラス
ミノーゲン含有組成物の精製度は、特に限定されるもの
ではなく、任意の精製度のものに適用可能である。従っ
て、陰イオン交換体との接触はプラスミノーゲンの精製
のいずれの段階にも適用される。
ミノーゲン含有組成物の精製度は、特に限定されるもの
ではなく、任意の精製度のものに適用可能である。従っ
て、陰イオン交換体との接触はプラスミノーゲンの精製
のいずれの段階にも適用される。
【００１４】従って、出発原料であるプラスミノーゲン
含有組成物は、プラスミノーゲンを含有していれば特に
限定されるものではなく、例えば、血清，血漿，腹水，
胎盤抽出液，胎盤組織抽出液，血漿から得たコーンの低
温アルコール分画法の第II＋III 画分あるいは第III 画
分, その他の血漿または組織抽出液を各種分画法により
処理して得られる画分からなる組成物，遺伝子組換え宿
主また組織培養により得られる培養液、市販のプラスミ
ノーゲン製剤が例示される。
含有組成物は、プラスミノーゲンを含有していれば特に
限定されるものではなく、例えば、血清，血漿，腹水，
胎盤抽出液，胎盤組織抽出液，血漿から得たコーンの低
温アルコール分画法の第II＋III 画分あるいは第III 画
分, その他の血漿または組織抽出液を各種分画法により
処理して得られる画分からなる組成物，遺伝子組換え宿
主また組織培養により得られる培養液、市販のプラスミ
ノーゲン製剤が例示される。
【００１５】また、本発明方法を適用するプラスミノー
ゲン含有組成物は、上記プラスミノーゲン含有組成物を
更に硫安分画，ポリエチレングリコール分画またはデキ
ストラン分画などの分画操作、リジン−アフィニティク
ロマトグラフィー、ゲル濾過法もしくはそれらの組合せ
による種々の分離操作を施したものであってもよい。好
ましくは、リジン−アフィニティクロマトグラフィーを
行ったものである。
ゲン含有組成物は、上記プラスミノーゲン含有組成物を
更に硫安分画，ポリエチレングリコール分画またはデキ
ストラン分画などの分画操作、リジン−アフィニティク
ロマトグラフィー、ゲル濾過法もしくはそれらの組合せ
による種々の分離操作を施したものであってもよい。好
ましくは、リジン−アフィニティクロマトグラフィーを
行ったものである。
【００１６】このようにして得られるプラスミノーゲン
含有組成物は、本発明の陰イオン交換体処理に付され
る。陰イオン交換体は、セルロース，デキストラン，親
水性ポリマー，シリカゲル合成樹脂もしくはアガロース
などの適当な支持体に強塩基性もしくは弱塩基性の官能
基を結合させたものである。強塩基性官能基とは、広範
囲のｐＨ範囲で完全に解離しているイオン交換能を有す
る塩基性の残基なるものをいい、具体的には、ジエチル
−（２−ハイドロキシプロピル）アミノエチル，ジエチ
ルメチルアミノエチル等の第４級アミノエチル（ＱＡＥ
−）、トリメチルアミノメチル等の第４級アミノメチル
（Ｑ−）などが例示される。また、弱塩基性官能基と
は、解離度すなわち交換容量がｐＨによって著しく変化
するイオン交換能を有する塩基性の残基なるものをい
い、具体的には、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ），
アミノエチル（ＡＥ）などが例示される。
含有組成物は、本発明の陰イオン交換体処理に付され
る。陰イオン交換体は、セルロース，デキストラン，親
水性ポリマー，シリカゲル合成樹脂もしくはアガロース
などの適当な支持体に強塩基性もしくは弱塩基性の官能
基を結合させたものである。強塩基性官能基とは、広範
囲のｐＨ範囲で完全に解離しているイオン交換能を有す
る塩基性の残基なるものをいい、具体的には、ジエチル
−（２−ハイドロキシプロピル）アミノエチル，ジエチ
ルメチルアミノエチル等の第４級アミノエチル（ＱＡＥ
−）、トリメチルアミノメチル等の第４級アミノメチル
（Ｑ−）などが例示される。また、弱塩基性官能基と
は、解離度すなわち交換容量がｐＨによって著しく変化
するイオン交換能を有する塩基性の残基なるものをい
い、具体的には、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ），
アミノエチル（ＡＥ）などが例示される。
【００１７】本発明で使用する陰イオン交換体は、特に
限定されないが、好ましくは強塩基性官能基を結合して
なる陰イオン交換体であり、具体的にはトリメチルアミ
ノメチル，トリメチルアミノエチル，ジエチル−（２−
ハイドロキシプロピル）アミノエチル基を官能基とする
ものである。とりわけ、ＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ５
５０Ｃ（トーソー社製）、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ
ａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア製）が好ましい。
限定されないが、好ましくは強塩基性官能基を結合して
なる陰イオン交換体であり、具体的にはトリメチルアミ
ノメチル，トリメチルアミノエチル，ジエチル−（２−
ハイドロキシプロピル）アミノエチル基を官能基とする
ものである。とりわけ、ＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ５
５０Ｃ（トーソー社製）、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ
ａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア製）が好ましい。
【００１８】プラスミノーゲン含有組成物を、本発明の
陰イオン交換体処理に接触させる条件として、接触させ
る環境の塩濃度は０．１〜２％、好ましくは０．４〜
０．８％であり、またｐＨは５〜９、好ましくはｐＨ６
〜８である。また使用する緩衝液は、上記のｐＨ範囲に
緩衝能を有するものであれば特に限定されない。好まし
くは、トリス塩酸緩衝液，リン酸塩緩衝液である。使用
される緩衝液の濃度は、０．００５〜０．２Ｍ、好まし
くは０．０１〜０．０５Ｍである。さらに、０．２％程
度のリジンなどを配合していてもよい。
陰イオン交換体処理に接触させる条件として、接触させ
る環境の塩濃度は０．１〜２％、好ましくは０．４〜
０．８％であり、またｐＨは５〜９、好ましくはｐＨ６
〜８である。また使用する緩衝液は、上記のｐＨ範囲に
緩衝能を有するものであれば特に限定されない。好まし
くは、トリス塩酸緩衝液，リン酸塩緩衝液である。使用
される緩衝液の濃度は、０．００５〜０．２Ｍ、好まし
くは０．０１〜０．０５Ｍである。さらに、０．２％程
度のリジンなどを配合していてもよい。
【００１９】使用される塩としては、塩化ナトリウム，
塩化カリウム，クエン酸ナトリウムなどが挙げられる
が、好ましくは、塩化ナトリウムである。
塩化カリウム，クエン酸ナトリウムなどが挙げられる
が、好ましくは、塩化ナトリウムである。
【００２０】陰イオン交換体は、使用される前あらかじ
め、上記の条件で十分平衡化しておくことが好ましい。
め、上記の条件で十分平衡化しておくことが好ましい。
【００２１】また、上記条件下の陰イオン交換体に接触
させるプラスミノーゲン含有組成物は、陰イオン交換体
と同一の緩衝液条件に調製されていることが好ましい。
調製方法として、陰イオン交換体の平衡化と同一の緩衝
液を外液とする透析法などが挙げられる。このように調
製されたプラスミノーゲン含有溶液を、平衡化された陰
イオン交換体に接触させるが、かかる処理は０〜６０
℃、好ましくは４〜２５℃の温度で行われる。
させるプラスミノーゲン含有組成物は、陰イオン交換体
と同一の緩衝液条件に調製されていることが好ましい。
調製方法として、陰イオン交換体の平衡化と同一の緩衝
液を外液とする透析法などが挙げられる。このように調
製されたプラスミノーゲン含有溶液を、平衡化された陰
イオン交換体に接触させるが、かかる処理は０〜６０
℃、好ましくは４〜２５℃の温度で行われる。
【００２２】使用される陰イオン交換体のゲル容量は、
接触させるプラスミノーゲン含有溶液に含まれる総蛋白
量１０ｍｇあたり１ｍｌ以上が好ましい。
接触させるプラスミノーゲン含有溶液に含まれる総蛋白
量１０ｍｇあたり１ｍｌ以上が好ましい。
【００２３】この条件において、プラスミノーゲン含有
組成物に混入する夾雑物は陰イオン交換体に吸着される
が、目的のプラスミノーゲンは吸着されない。従って、
本発明の陰イオン交換体処理によると、一回の操作でプ
ラスミノーゲンと夾雑物とを分離することができ、プラ
スミノーゲン含有組成物から高純度のプラスミノーゲン
が取得される。夾雑物とは、本発明陰イオン交換体処理
に付す前のプラスミノーゲン含有組成物に含有されるモ
ノマーのプラスミノーゲン以外のものを示す包括的な概
念である。具体的には、プラスミノーゲン抗原性を有す
る高分子物質（プラスミノーゲンのダイマーおよびポリ
マー，リポプロテインＡなど）およびリポ蛋白質などが
例示され、本発明方法はこれらの除去に特に効果的であ
る。
組成物に混入する夾雑物は陰イオン交換体に吸着される
が、目的のプラスミノーゲンは吸着されない。従って、
本発明の陰イオン交換体処理によると、一回の操作でプ
ラスミノーゲンと夾雑物とを分離することができ、プラ
スミノーゲン含有組成物から高純度のプラスミノーゲン
が取得される。夾雑物とは、本発明陰イオン交換体処理
に付す前のプラスミノーゲン含有組成物に含有されるモ
ノマーのプラスミノーゲン以外のものを示す包括的な概
念である。具体的には、プラスミノーゲン抗原性を有す
る高分子物質（プラスミノーゲンのダイマーおよびポリ
マー，リポプロテインＡなど）およびリポ蛋白質などが
例示され、本発明方法はこれらの除去に特に効果的であ
る。
【００２４】かくして得られるプラスミノーゲンは、比
活性２４ＣＵ／ｍｇの値を示し、また回収率も高く、通
常９０〜１００％の収率を示す。
活性２４ＣＵ／ｍｇの値を示し、また回収率も高く、通
常９０〜１００％の収率を示す。
【００２５】なお、本発明の陰イオン交換体処理に付さ
れるプラスミノーゲン含有組成物は、その前にＳＤ処理
がなされているものであってもよい。ＳＤ処理は、公知
の方法（特開昭６０−５１１１６号公報、特開平３−２
１８３２２号公報）に準じて行うことができる。また、
界面活性剤の共存下で行なわれることが好ましく、さら
に好ましくはＳＤ処理時に安定化剤として、ベンズアミ
ジン類（ベンズアミジン、ｐ−アミノベンズアミジン
等）、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン等）、アプ
ロチニンあるいはε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）を
添加して行うことである。界面活性剤としては、Ｔｗｅ
ｅｎ８０，Ｔｗｅｅｎ２０，ＴｒｉｔｏｎＸ１００など
が用いられる。また、安定化剤の添加量は、ベンズアミ
ジン類で０．０００１〜０．１Ｍ程度、塩基性アミノ酸
で０．１〜１Ｍ程度、アプロチニンで１０〜１００ＫＩ
Ｕ／ｍｌ、ＥＡＣＡで１〜１０％（ｗ／ｖ）程度が例示
される。
れるプラスミノーゲン含有組成物は、その前にＳＤ処理
がなされているものであってもよい。ＳＤ処理は、公知
の方法（特開昭６０−５１１１６号公報、特開平３−２
１８３２２号公報）に準じて行うことができる。また、
界面活性剤の共存下で行なわれることが好ましく、さら
に好ましくはＳＤ処理時に安定化剤として、ベンズアミ
ジン類（ベンズアミジン、ｐ−アミノベンズアミジン
等）、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン等）、アプ
ロチニンあるいはε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）を
添加して行うことである。界面活性剤としては、Ｔｗｅ
ｅｎ８０，Ｔｗｅｅｎ２０，ＴｒｉｔｏｎＸ１００など
が用いられる。また、安定化剤の添加量は、ベンズアミ
ジン類で０．０００１〜０．１Ｍ程度、塩基性アミノ酸
で０．１〜１Ｍ程度、アプロチニンで１０〜１００ＫＩ
Ｕ／ｍｌ、ＥＡＣＡで１〜１０％（ｗ／ｖ）程度が例示
される。
【００２６】本発明の陰イオン交換体処理は、バッチ
法，カラム法，メンブレン法などのいずれの方法による
ものであってもよい。好ましくは、カラム法である。か
かる方法によれば、カラムに充填した状態で効率よくか
つ経済的に、イオン交換体（ゲル）の平衡化、プラスミ
ノーゲンの精製、ゲルの再生などの一連の操作を繰り返
し実施することができる。イオン交換体（ゲル）は、極
めて温和な条件で、好ましくは塩濃度の上昇により、再
生されて繰り返しプラスミノーゲンの精製に用いること
ができる。
法，カラム法，メンブレン法などのいずれの方法による
ものであってもよい。好ましくは、カラム法である。か
かる方法によれば、カラムに充填した状態で効率よくか
つ経済的に、イオン交換体（ゲル）の平衡化、プラスミ
ノーゲンの精製、ゲルの再生などの一連の操作を繰り返
し実施することができる。イオン交換体（ゲル）は、極
めて温和な条件で、好ましくは塩濃度の上昇により、再
生されて繰り返しプラスミノーゲンの精製に用いること
ができる。
【００２７】本発明の陰イオン交換体処理により得られ
るプラスミノーゲンは、必要に応じてさらなる精製処理
に付すこともできる。例えば、再度リジンまたはアプロ
チニンをリガンドとするアフィニティクロマトグラフィ
ーに付したり、透析などによって、一層高度に精製され
たプラスミノーゲンを得ることができる。
るプラスミノーゲンは、必要に応じてさらなる精製処理
に付すこともできる。例えば、再度リジンまたはアプロ
チニンをリガンドとするアフィニティクロマトグラフィ
ーに付したり、透析などによって、一層高度に精製され
たプラスミノーゲンを得ることができる。
【００２８】かくして精製されたプラスミノーゲンは、
医薬品として用いられる。従って当該プラスミノーゲン
はウイルス不活化のための処理が行われることが好まし
い。ウイルス不活化処理としては通常の処理が用いられ
る。具体的には、例えばプラスミノーゲンの液状組成物
を５０〜１００℃で５〜３０時間加熱する方法、乾燥組
成物を５０〜１００℃で１０〜１５０時間加熱する方
法、界面活性剤と接触させる方法およびこれら処理の組
合せが挙げられる。
医薬品として用いられる。従って当該プラスミノーゲン
はウイルス不活化のための処理が行われることが好まし
い。ウイルス不活化処理としては通常の処理が用いられ
る。具体的には、例えばプラスミノーゲンの液状組成物
を５０〜１００℃で５〜３０時間加熱する方法、乾燥組
成物を５０〜１００℃で１０〜１５０時間加熱する方
法、界面活性剤と接触させる方法およびこれら処理の組
合せが挙げられる。
【００２９】
【発明の効果】本発明の精製方法によれば、プラスミノ
ーゲン含有組成物中に夾雑する物質、就中プラスミノー
ゲン抗原性を有する高分子物質を簡便に除去することが
できる。更に本発明方法によれば、プラスミノーゲン含
有組成物から高純度のプラスミノーゲンを短時間に効率
よく、収率よく、かつ経済的に取得することができる。
従って、大量のプラスミノーゲン含有組成物からの精製
において特に有利であり、工業的規模におけるプラスミ
ノーゲンの製法として極めて有用である。
ーゲン含有組成物中に夾雑する物質、就中プラスミノー
ゲン抗原性を有する高分子物質を簡便に除去することが
できる。更に本発明方法によれば、プラスミノーゲン含
有組成物から高純度のプラスミノーゲンを短時間に効率
よく、収率よく、かつ経済的に取得することができる。
従って、大量のプラスミノーゲン含有組成物からの精製
において特に有利であり、工業的規模におけるプラスミ
ノーゲンの製法として極めて有用である。
【００３０】以下、実施例及び比較例により、更に詳し
く説明するが、これら実施例により本発明が限定される
ものではない。
く説明するが、これら実施例により本発明が限定される
ものではない。
【００３１】
参考例１ 血漿のコーン第II＋III 画分における抽出残渣１００ｇ
に０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム加５０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ８．３）５００ｍｌを添加し、１６時間攪拌し
た。硫酸デキストランナトリウム塩２．５ｇおよび塩化
マグネシウム１．５ｇを添加し、３時間攪拌した。４０
００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、上清画分５００ｍｌ
を回収した。硫安１２１ｇを添加し、２時間攪拌した。
４０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、沈澱画分１５０
ｇを回収した。０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム加０．９
％ｗ／ｖグリシン溶液（ｐＨ７．４）３００ｍｌを添
加、溶解した。０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム加０．９
％ｗ／ｖグリシン溶液（ｐＨ７．２）で平衡化したリジ
ンアガロース（商品名：リジンセファロース４Ｂ）カラ
ムにアプライした。１Ｍ塩化ナトリウム加０．９％ｗ／
ｖグリシン溶液（ｐＨ７．２）で洗浄後に０．９％ｗ／
ｖ塩化ナトリウム加０．２５Ｍリジン溶液（ｐＨ７．
２）で溶出し、溶出液３５０ｍｌを得た。限外濾過膜
（ミニタン：分画分子量３万；ミリポア社製）を用いて
濃縮し、０．４５％ｗ／ｖ塩化ナトリウム加０．９％グ
リシン溶液（ｐＨ７．２）にてｐＨ７．２に調製した。
これに、最終濃度が各々０．３％（ｗ／ｖ）および１％
（ｗ／ｖ）となるようにトリ−Ｎ−ブチルホスフェート
（ＴＮＢＰ）およびＴｗｅｅｎ８０を添加し、３０℃で
６時間加温し、これをプラスミノーゲン含有溶液とし
た。
に０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム加５０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ８．３）５００ｍｌを添加し、１６時間攪拌し
た。硫酸デキストランナトリウム塩２．５ｇおよび塩化
マグネシウム１．５ｇを添加し、３時間攪拌した。４０
００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、上清画分５００ｍｌ
を回収した。硫安１２１ｇを添加し、２時間攪拌した。
４０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、沈澱画分１５０
ｇを回収した。０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム加０．９
％ｗ／ｖグリシン溶液（ｐＨ７．４）３００ｍｌを添
加、溶解した。０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム加０．９
％ｗ／ｖグリシン溶液（ｐＨ７．２）で平衡化したリジ
ンアガロース（商品名：リジンセファロース４Ｂ）カラ
ムにアプライした。１Ｍ塩化ナトリウム加０．９％ｗ／
ｖグリシン溶液（ｐＨ７．２）で洗浄後に０．９％ｗ／
ｖ塩化ナトリウム加０．２５Ｍリジン溶液（ｐＨ７．
２）で溶出し、溶出液３５０ｍｌを得た。限外濾過膜
（ミニタン：分画分子量３万；ミリポア社製）を用いて
濃縮し、０．４５％ｗ／ｖ塩化ナトリウム加０．９％グ
リシン溶液（ｐＨ７．２）にてｐＨ７．２に調製した。
これに、最終濃度が各々０．３％（ｗ／ｖ）および１％
（ｗ／ｖ）となるようにトリ−Ｎ−ブチルホスフェート
（ＴＮＢＰ）およびＴｗｅｅｎ８０を添加し、３０℃で
６時間加温し、これをプラスミノーゲン含有溶液とし
た。
【００３２】実施例１ 参考例１で得られたプラスミノーゲン含有溶液を表１に
記載する陰イオン交換体（φ５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ）
にそれぞれに添加して、イオン交換クロマトグラフィー
（流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ；緩衝液：０．９％グリシ
ン，０．４５％ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）を行った。カラ
ムをそのまま通過した未吸着画分をゲル濾過法（以下、
ＧＰＣという。）により分析した。なお、各イオン交換
体は、あらかじめ上記の緩衝液で平衡化しておいた。結
果を表１に示す。
記載する陰イオン交換体（φ５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ）
にそれぞれに添加して、イオン交換クロマトグラフィー
（流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ；緩衝液：０．９％グリシ
ン，０．４５％ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）を行った。カラ
ムをそのまま通過した未吸着画分をゲル濾過法（以下、
ＧＰＣという。）により分析した。なお、各イオン交換
体は、あらかじめ上記の緩衝液で平衡化しておいた。結
果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】実施例２ Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（φ５ｍ
ｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）およびＱＡＥ
−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０Ｃ（φ５ｍｍ×５ｃｍ；
１ｍｌ、トーソー社製）、Ｓｕｐｅｒ Ｑ−Ｔｏｙｏｐ
ｅａｒｌ ６５０Ｍ（φ５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、トー
ソー社製）を用いて参考例１で得られたプラスミノーゲ
ンについてイオン交換クロマトグラフィーを行った（流
速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ；平衡化および洗浄用緩衝液：
２０ｍＭ トリス緩衝液，０．２％リジン，０．４５％
ＮａＣｌ，ｐＨ７．２；溶出用緩衝液：２０ｍＭ トリ
ス緩衝液，０．２％リジン，１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．
２）。カラムをそのまま通過した未吸着画分および溶出
用緩衝液により溶出された吸着画分をそれぞれＧＰＣに
より分析し、プラスミノーゲン活性を測定した。結果を
表２に示す。
ｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）およびＱＡＥ
−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０Ｃ（φ５ｍｍ×５ｃｍ；
１ｍｌ、トーソー社製）、Ｓｕｐｅｒ Ｑ−Ｔｏｙｏｐ
ｅａｒｌ ６５０Ｍ（φ５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、トー
ソー社製）を用いて参考例１で得られたプラスミノーゲ
ンについてイオン交換クロマトグラフィーを行った（流
速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ；平衡化および洗浄用緩衝液：
２０ｍＭ トリス緩衝液，０．２％リジン，０．４５％
ＮａＣｌ，ｐＨ７．２；溶出用緩衝液：２０ｍＭ トリ
ス緩衝液，０．２％リジン，１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．
２）。カラムをそのまま通過した未吸着画分および溶出
用緩衝液により溶出された吸着画分をそれぞれＧＰＣに
より分析し、プラスミノーゲン活性を測定した。結果を
表２に示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】実施例３ 塩濃度の影響 参考例１で得られたプラスミノーゲン含有溶液につい
て、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（φ
５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）を用いて
イオン交換クロマトグラフィー（流速：０．５ｍｌ／ｍ
ｉｎ）を行う際に、使用する平衡化および洗浄用緩衝液
（２０ｍＭトリス緩衝液，０．２％リジン，ｐＨ７．
２）の塩濃度を０、０．１５、０．３、０．４５、０．
６、０．７５、０．９％と変化させてプラスミノーゲン
の回収率、精製度に対する塩濃度の影響を調べた。得ら
れた未吸着画分、および溶出用液（２０ｍＭトリス緩衝
液，０．２％リジン，１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で
溶出された吸着画分をＧＰＣで測定した結果を表３に示
す。
て、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（φ
５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）を用いて
イオン交換クロマトグラフィー（流速：０．５ｍｌ／ｍ
ｉｎ）を行う際に、使用する平衡化および洗浄用緩衝液
（２０ｍＭトリス緩衝液，０．２％リジン，ｐＨ７．
２）の塩濃度を０、０．１５、０．３、０．４５、０．
６、０．７５、０．９％と変化させてプラスミノーゲン
の回収率、精製度に対する塩濃度の影響を調べた。得ら
れた未吸着画分、および溶出用液（２０ｍＭトリス緩衝
液，０．２％リジン，１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で
溶出された吸着画分をＧＰＣで測定した結果を表３に示
す。
【００３７】
【表３】
【００３８】ｐＨの影響 参考例１で得られたプラスミノーゲン含有溶液につい
て、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（φ
５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）を用いて
イオン交換クロマトグラフィー（流速：０．５ｍｌ／ｍ
ｉｎ）を行う際に、使用する平衡化緩衝液（２０ｍＭト
リス緩衝液，０．２％リジン，０．４５％ＮａＣｌ）の
ｐＨを６．２、６．７、７．２、７．７、８．３と変化
させてプラスミノーゲンの回収率、精製度に対するｐＨ
の影響を調べた。得られた未吸着画分、および溶出用液
（２０ｍＭトリス緩衝液，０．２％リジン，０．１Ｍ
ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で溶出された吸着画分をＧＰＣ
で測定した結果を表４に示す。
て、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（φ
５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）を用いて
イオン交換クロマトグラフィー（流速：０．５ｍｌ／ｍ
ｉｎ）を行う際に、使用する平衡化緩衝液（２０ｍＭト
リス緩衝液，０．２％リジン，０．４５％ＮａＣｌ）の
ｐＨを６．２、６．７、７．２、７．７、８．３と変化
させてプラスミノーゲンの回収率、精製度に対するｐＨ
の影響を調べた。得られた未吸着画分、および溶出用液
（２０ｍＭトリス緩衝液，０．２％リジン，０．１Ｍ
ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で溶出された吸着画分をＧＰＣ
で測定した結果を表４に示す。
【００３９】
【表４】
【００４０】リジン濃度および緩衝液濃度の影響 参考例１で得られたプラスミノーゲン含有溶液につい
て、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（φ
５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）を用いて
イオン交換クロマトグラフィー（流速：０．５ｍｌ／ｍ
ｉｎ、ｐＨ７．２）を行う際に、使用する平衡化および
洗浄用緩衝液（０．９％ グリシン，０．４５％ Ｎａ
Ｃｌ）のリジン濃度およびトリス緩衝液の濃度を変化さ
せてプラスミノーゲンの回収率、精製度に対する影響を
調べた。得られた未吸着画分をＧＰＣで測定した結果を
表５、および表６に示す。
て、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（φ
５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）を用いて
イオン交換クロマトグラフィー（流速：０．５ｍｌ／ｍ
ｉｎ、ｐＨ７．２）を行う際に、使用する平衡化および
洗浄用緩衝液（０．９％ グリシン，０．４５％ Ｎａ
Ｃｌ）のリジン濃度およびトリス緩衝液の濃度を変化さ
せてプラスミノーゲンの回収率、精製度に対する影響を
調べた。得られた未吸着画分をＧＰＣで測定した結果を
表５、および表６に示す。
【００４１】
【表５】
【００４２】
【表６】
【００４３】実施例４ 高分子物質の除去効果 Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（φ５ｍ
ｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）に、参考例１
で得られたプラスミノーゲン含有溶液を、各々量を変え
てアプライして（１．０、０．５、０．２ｍｌ）、イオ
ン交換クロマトグラフィーを行い（流速：０．５ｍｌ／
ｍｉｎ、平衡化緩衝液：０．９％グリシン，０．４５％
塩化ナトリウム，ｐＨ７．２；溶出用緩衝液：０．９％
グリシン，１Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）、得られ
た未吸着画分をＧＰＣで分析した。結果を表７に示す。
ｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）に、参考例１
で得られたプラスミノーゲン含有溶液を、各々量を変え
てアプライして（１．０、０．５、０．２ｍｌ）、イオ
ン交換クロマトグラフィーを行い（流速：０．５ｍｌ／
ｍｉｎ、平衡化緩衝液：０．９％グリシン，０．４５％
塩化ナトリウム，ｐＨ７．２；溶出用緩衝液：０．９％
グリシン，１Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）、得られ
た未吸着画分をＧＰＣで分析した。結果を表７に示す。
【００４４】
【表７】
【００４５】数％の高分子を含む出発試料では、ゲルの
１／５〜１／１０量の添加で高分子物質は完全に除去さ
れた（図１）。
１／５〜１／１０量の添加で高分子物質は完全に除去さ
れた（図１）。
【図１】実施例４において、イオン交換クロマト処理し
たプラスミノーゲンのゲル濾過クロマトグラフィーにお
ける分析結果を示す図である。図中、未処理とは、イオ
ン交換クロマト未処理のプラスミノーゲン含有溶液のゲ
ル濾過クロマトグラムを示す。また各クロマトグラム左
上に示した量（１．０ｍｌ、０．５ｍｌ、０．２ｍｌ）
は、イオン交換体に添加したプラスミノーゲン含有溶液
の量を示す。
たプラスミノーゲンのゲル濾過クロマトグラフィーにお
ける分析結果を示す図である。図中、未処理とは、イオ
ン交換クロマト未処理のプラスミノーゲン含有溶液のゲ
ル濾過クロマトグラムを示す。また各クロマトグラム左
上に示した量（１．０ｍｌ、０．５ｍｌ、０．２ｍｌ）
は、イオン交換体に添加したプラスミノーゲン含有溶液
の量を示す。
１ 高分子物質のピーク
【手続補正書】
【提出日】平成６年７月２５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】しかしながら、ゲル濾過法においては、高
い分離、精製能を得るために、一般に試料の添加容量
を少なくする（通常、添加試料容量はカラム体積の１〜
５％（ｖ／ｖ）程度）、カラムの長さを長くする（ベ
ット高を高くする）、流速を遅くするなどの技法が要
求される。このため、かかるゲル濾過法によると、前も
ってカラムに添加する試料の濃縮操作が必要となり、ま
た試料の添加容量に応じてゲルが必要である、さらには
分離、精製処理に長い時間がかかるなどの点で工業的使
用においては問題があった。
い分離、精製能を得るために、一般に試料の添加容量
を少なくする（通常、添加試料容量はカラム体積の１〜
５％（ｖ／ｖ）程度）、カラムの長さを長くする（ベ
ット高を高くする）、流速を遅くするなどの技法が要
求される。このため、かかるゲル濾過法によると、前も
ってカラムに添加する試料の濃縮操作が必要となり、ま
た試料の添加容量に応じてゲルが必要である、さらには
分離、精製処理に長い時間がかかるなどの点で工業的使
用においては問題があった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】すなわち、本発明はプラスミノーゲン含有
組成物を陰イオン交換体に接触させ、その未吸着画分を
回収することを特徴とするプラスミノーゲンの精製方法
である。本発明方法において、好ましくは上記精製を塩
濃度０．１〜２％（ｗ／ｖ、以下の濃度表示について単
に「％」と表示することもある。）、より好ましくは塩
濃度０．４〜０．８％の条件下で、さらに好ましくはｐ
Ｈ５〜９、より好ましくはｐＨ６〜８の条件下で行うこ
とである。すなわち、本発明はこの特定条件下において
プラスミノーゲン含有組成物を陰イオン交換体に接触さ
せ、その未吸着画分を回収することを特徴とするプラス
ミノーゲンの精製方法である。
組成物を陰イオン交換体に接触させ、その未吸着画分を
回収することを特徴とするプラスミノーゲンの精製方法
である。本発明方法において、好ましくは上記精製を塩
濃度０．１〜２％（ｗ／ｖ、以下の濃度表示について単
に「％」と表示することもある。）、より好ましくは塩
濃度０．４〜０．８％の条件下で、さらに好ましくはｐ
Ｈ５〜９、より好ましくはｐＨ６〜８の条件下で行うこ
とである。すなわち、本発明はこの特定条件下において
プラスミノーゲン含有組成物を陰イオン交換体に接触さ
せ、その未吸着画分を回収することを特徴とするプラス
ミノーゲンの精製方法である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】なお、本発明の陰イオン交換体処理に付さ
れるプラスミノーゲン含有組成物は、その前にＳＤ（Ｓ
ｏｌｖｅｎｔ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）処理がなされてい
るものであってもよい。ＳＤ処理は、公知の方法（特開
昭６０−５１１１６号公報、特開平３−２１８３２２号
公報）に準じて行うことができる。また、界面活性剤の
共存下で行なわれることが好ましく、さらに好ましくは
ＳＤ処理時に安定化剤として、ベンズアミジン類（ベン
ズアミジン、ｐ−アミノベンズアミジン等）、塩基性ア
ミノ酸（アルギニン、リジン等）、アプロチニンあるい
はε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）を添加して行うこ
とである。界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ８０，Ｔｗ
ｅｅｎ２０，ＴｒｉｔｏｎＸ１００などが用いられる。
また、安定化剤の添加量は、ベンズアミジン類で０．０
００１〜０．１Ｍ程度、塩基性アミノ酸で０．１〜１Ｍ
程度、アプロチニンで１０〜１００ＫＩＵ／ｍｌ、ＥＡ
ＣＡで１〜１０％（ｗ／ｖ）程度が例示される。
れるプラスミノーゲン含有組成物は、その前にＳＤ（Ｓ
ｏｌｖｅｎｔ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）処理がなされてい
るものであってもよい。ＳＤ処理は、公知の方法（特開
昭６０−５１１１６号公報、特開平３−２１８３２２号
公報）に準じて行うことができる。また、界面活性剤の
共存下で行なわれることが好ましく、さらに好ましくは
ＳＤ処理時に安定化剤として、ベンズアミジン類（ベン
ズアミジン、ｐ−アミノベンズアミジン等）、塩基性ア
ミノ酸（アルギニン、リジン等）、アプロチニンあるい
はε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）を添加して行うこ
とである。界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ８０，Ｔｗ
ｅｅｎ２０，ＴｒｉｔｏｎＸ１００などが用いられる。
また、安定化剤の添加量は、ベンズアミジン類で０．０
００１〜０．１Ｍ程度、塩基性アミノ酸で０．１〜１Ｍ
程度、アプロチニンで１０〜１００ＫＩＵ／ｍｌ、ＥＡ
ＣＡで１〜１０％（ｗ／ｖ）程度が例示される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】実施例１ 参考例１で得られたプラスミノーゲン含有溶液を表１に
記載する陰イオン交換体（φ５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ）
にそれぞれに添加して、イオン交換クロマトグラフィー
（流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ；緩衝液：０．９％グリシ
ン，０．４５％ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）を行った。カラ
ムをそのまま通過した未吸着画分をゲル濾過法（以下、
ＧＰＣという。）により分析した。なお、各イオン交換
体は、あらかじめ上記の緩衝液で平衡化しておいた。各
カラム処理によるプラスミノーゲンの回収率〔処理前の
蛋白量を１００とした時の回収蛋白質量（活性）の回収
率、以下同じ。〕および不純物量（試料をＧＰＣ分析し
た際、試料のＡ２８０ｎｍに対する不純物のＡ
２８０ｎｍの比、以下同じ。）を表１に示す。
記載する陰イオン交換体（φ５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ）
にそれぞれに添加して、イオン交換クロマトグラフィー
（流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ；緩衝液：０．９％グリシ
ン，０．４５％ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）を行った。カラ
ムをそのまま通過した未吸着画分をゲル濾過法（以下、
ＧＰＣという。）により分析した。なお、各イオン交換
体は、あらかじめ上記の緩衝液で平衡化しておいた。各
カラム処理によるプラスミノーゲンの回収率〔処理前の
蛋白量を１００とした時の回収蛋白質量（活性）の回収
率、以下同じ。〕および不純物量（試料をＧＰＣ分析し
た際、試料のＡ２８０ｎｍに対する不純物のＡ
２８０ｎｍの比、以下同じ。）を表１に示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３６】実施例３ 塩濃度の影響 参考例１で得られたプラスミノーゲン含有溶液につい
て、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（φ
５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）を用いて
イオン交換クロマトグラフィー（流速：０．５ｍｌ／ｍ
ｉｎ）を行う際に、使用する平衡化および洗浄用緩衝液
（２０ｍＭトリス緩衝液，０．２％リジン，ｐＨ７．
２）の塩濃度を０、０．１、０．１５、０．３、０．
４、０．４５、０．６、０．７５、０．８、０．９％と
変化させてプラスミノーゲンの回収率、精製度に対する
塩濃度の影響を調べた。得られた未吸着画分、および溶
出用液（２０ｍＭトリス緩衝液，０．２％リジン，１Ｍ
ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で溶出された吸着画分をＧＰ
Ｃで測定した結果を表３に示す。
て、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（φ
５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）を用いて
イオン交換クロマトグラフィー（流速：０．５ｍｌ／ｍ
ｉｎ）を行う際に、使用する平衡化および洗浄用緩衝液
（２０ｍＭトリス緩衝液，０．２％リジン，ｐＨ７．
２）の塩濃度を０、０．１、０．１５、０．３、０．
４、０．４５、０．６、０．７５、０．８、０．９％と
変化させてプラスミノーゲンの回収率、精製度に対する
塩濃度の影響を調べた。得られた未吸着画分、および溶
出用液（２０ｍＭトリス緩衝液，０．２％リジン，１Ｍ
ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で溶出された吸着画分をＧＰ
Ｃで測定した結果を表３に示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】
【表３】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３８】ｐＨの影響 参考例１で得られたプラスミノーゲン含有溶液につい
て、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（φ
５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）を用いて
イオン交換クロマトグラフィー（流速：０．５ｍｌ／ｍ
ｉｎ）を行う際に、使用する平衡化緩衝液（２０ｍＭト
リス緩衝液，０．２％リジン，０．４５％ＮａＣ１）の
ｐＨを５、６、６．２、６．７、７．２、７．７、８、
８．３と変化させてプラスミノーゲンの回収率、精製度
に対するｐＨの影響を調べた。得られた未吸着画分、お
よび溶出用液（２０ｍＭトリス緩衝液，０．２％リジ
ン，０．１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で溶出された吸
着画分をＧＰＣで測定した結果を表４に示す。
て、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（φ
５ｍｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）を用いて
イオン交換クロマトグラフィー（流速：０．５ｍｌ／ｍ
ｉｎ）を行う際に、使用する平衡化緩衝液（２０ｍＭト
リス緩衝液，０．２％リジン，０．４５％ＮａＣ１）の
ｐＨを５、６、６．２、６．７、７．２、７．７、８、
８．３と変化させてプラスミノーゲンの回収率、精製度
に対するｐＨの影響を調べた。得られた未吸着画分、お
よび溶出用液（２０ｍＭトリス緩衝液，０．２％リジ
ン，０．１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で溶出された吸
着画分をＧＰＣで測定した結果を表４に示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３９】
【表４】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４３】実施例４ 高分子物質の除去効果 Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（φ５ｍ
ｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）に、参考例１
で得られたプラスミノーゲン含有溶液を、各々量を変え
てアプライして（１．０、０．５、０．２、０．１ｍ
ｌ）、イオン交換クロマトグラフィーを行い（流速：
０．５ｍｌ／ｍｉｎ、平衡化緩衝液：０．９％グリシ
ン，０．４５％塩化ナトリウム，ｐＨ７．２；溶出用緩
衝液：０．９％グリシン，１Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ
７．２）、得られた未吸着画分をＧＰＣで分析した。結
果を表７に示す。
ｍ×５ｃｍ；１ｍｌ、ファルマシア社製）に、参考例１
で得られたプラスミノーゲン含有溶液を、各々量を変え
てアプライして（１．０、０．５、０．２、０．１ｍ
ｌ）、イオン交換クロマトグラフィーを行い（流速：
０．５ｍｌ／ｍｉｎ、平衡化緩衝液：０．９％グリシ
ン，０．４５％塩化ナトリウム，ｐＨ７．２；溶出用緩
衝液：０．９％グリシン，１Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ
７．２）、得られた未吸着画分をＧＰＣで分析した。結
果を表７に示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】
【表７】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４５】図１は、イオン交換クロマト処理したプラ
スミノーゲンのゲル濾過クロマトグラフィーにおける分
析結果を示す図であり、図中１は高分子物質のピークを
示す。図１から明らかなように、数％の高分子物質を含
む出発試料では、ゲル（１ｍｌ）の１／５量（０．２ｍ
ｌ）〜１／１０量（０．１ｍｌ）の添加で高分子物質は
完全に除去された。
スミノーゲンのゲル濾過クロマトグラフィーにおける分
析結果を示す図であり、図中１は高分子物質のピークを
示す。図１から明らかなように、数％の高分子物質を含
む出発試料では、ゲル（１ｍｌ）の１／５量（０．２ｍ
ｌ）〜１／１０量（０．１ｍｌ）の添加で高分子物質は
完全に除去された。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】実施例４において、イオン交換クロマト処理し
たプラスミノーゲンのゲル濾過クロマトグラフィーにお
ける分析結果を示す図である。図中、未処理とは、イオ
ン交換クロマト未処理のプラスミノーゲン含有溶液のゲ
ル濾過クロマトグラムを示す。また各クロマトグラム左
上に示した量（１．０ｍｌ、０．５ｍｌ、０．２、０．
１ｍｌ）は、イオン交換体に添加したプラスミノーゲン
含有溶液の量を示す。
たプラスミノーゲンのゲル濾過クロマトグラフィーにお
ける分析結果を示す図である。図中、未処理とは、イオ
ン交換クロマト未処理のプラスミノーゲン含有溶液のゲ
ル濾過クロマトグラムを示す。また各クロマトグラム左
上に示した量（１．０ｍｌ、０．５ｍｌ、０．２、０．
１ｍｌ）は、イオン交換体に添加したプラスミノーゲン
含有溶液の量を示す。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
Claims (5)
- 【請求項１】 プラスミノーゲン含有組成物を陰イオン
交換体に接触させ、その未吸着画分を回収することを特
徴とするプラスミノーゲンの精製方法。 - 【請求項２】 塩濃度０．１〜２％の条件下でプラスミ
ノーゲン含有組成物を陰イオン交換体に接触させること
を特徴する請求項１記載のプラスミノーゲンの精製方
法。 - 【請求項３】 塩濃度０．４〜０．８％の条件下でプラ
スミノーゲン含有組成物を陰イオン交換体に接触させる
ことを特徴する請求項１記載のプラスミノーゲンの精製
方法。 - 【請求項４】 ｐＨ５〜９の条件下でプラスミノーゲン
含有組成物を陰イオン交換体に接触させることを特徴す
る請求項１〜３のいずれかに記載のプラスミノーゲンの
精製方法。 - 【請求項５】 ｐＨ６〜８の条件下でプラスミノーゲン
含有組成物を陰イオン交換体に接触させることを特徴す
る請求項１〜３のいずれかに記載のプラスミノーゲンの
精製方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18789693A JPH0739375A (ja) | 1993-07-29 | 1993-07-29 | プラスミノーゲンの精製方法 |
| PCT/JP1994/001124 WO1995004077A1 (fr) | 1993-07-29 | 1994-07-08 | Procede de purification du plasminogene |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18789693A JPH0739375A (ja) | 1993-07-29 | 1993-07-29 | プラスミノーゲンの精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0739375A true JPH0739375A (ja) | 1995-02-10 |
Family
ID=16214096
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18789693A Pending JPH0739375A (ja) | 1993-07-29 | 1993-07-29 | プラスミノーゲンの精製方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0739375A (ja) |
| WO (1) | WO1995004077A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6964764B2 (en) | 1999-11-13 | 2005-11-15 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Method of thrombolysis by local delivery of reversibly inactivated acidified plasmin |
| US6355243B1 (en) | 1999-11-13 | 2002-03-12 | Bayer Corporation | Method of thrombolysis by local delivery of active plasmin |
| US7544500B2 (en) | 1999-11-13 | 2009-06-09 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Process for the production of a reversibly inactive acidified plasmin composition |
| US6969515B2 (en) | 1999-11-13 | 2005-11-29 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Method of thrombolysis by local delivery of reversibly inactivated acidified plasmin |
| JP2011522538A (ja) | 2008-06-04 | 2011-08-04 | タレクリス・バイオセラピユーテイクス・インコーポレーテツド | プラスミン製造のための組成物、方法およびキット |
| PT2403865E (pt) | 2009-03-03 | 2015-11-18 | Grifols Therapeutics Inc | Métodos de preparação de plasminogénio |
| WO2017040501A1 (en) * | 2015-08-31 | 2017-03-09 | Diversey, Inc. | Method and composition for stable liquid tetraacetylethylenediamine composition |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT390801B (de) * | 1988-07-28 | 1990-07-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von lys-plasminogen |
-
1993
- 1993-07-29 JP JP18789693A patent/JPH0739375A/ja active Pending
-
1994
- 1994-07-08 WO PCT/JP1994/001124 patent/WO1995004077A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1995004077A1 (fr) | 1995-02-09 |
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