JPH0236193A - マイコプラズマ・ニユーモニエからの１６８ｋＤタンパク質の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はマイコプラズマ・ニユーモニエ（Ｍｙｃｏｐｌ
ａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの１６８ｋＤタ
ンパク質の精製法に関する。

マイクプラズマ・ニユーモニエｌｔ下Ｍ、ニューモニエ
と略記する）は上部および下部気道の疾患を惹起するも
のである。全咽頭炎例の１０％まで、一般市民集団の全
肺炎例の１０〜３０％および閉鎖集団の全肺炎例の約６
０％までがこの病原体によるものとされうる。流行は４
〜７年間隔で出現し、そして文献では死亡例も記載され
ている（Ｒｏｌｌｉｎｓ　Ｓ、他、Ａｒｃｈ、Ｐａｔｈ
ｏｌ、Ｌａｂ、Ｍｅｄ。

１１０　ｉ　３４−４１（１９８６））。その上多数の
後感染性合併症、例えば病因の解明が必要とされる心筋
炎、心内膜炎、髄膜炎等が知られている。再感染も決し
て稀ではない。それらは主に成人集団に現われ、それら
の群では特に臨床的な合併症を予想しておかなければな
らない。

Ｍ、ニューモニエは細菌であり、従って上部および下部
気道疾患の主原因であるウィルスと対照的に抗生物質に
対して感受性であるので、迅速な診断によりかなり治療
効果をあげることができる。しかしながら臨床的にはＭ
、ニューモニエ感染を類似の、ウィルスまたは細菌によ
る感染から確実に区別することができない。利用できる
研究室診断法も同様に満足できるものではない。培養に
よる、病原体の検出は類１１ｆｚ培地上で１〜２週間と
いう非常にゆっくりした成長後にしか確実な評価が得ら
れない。現在では大抵の場合血清学的方法により診断が
行われている。最も広く用いられている試験である補体
結合試験（ＣＦＴ）では抗原としてＭ、ニューモニエか
ら得られる糖脂質抽出物を使用している。しかしながら
この糖脂質は他の細菌例えば、ストレプトコッカスＭＧ
・インターメジウス（５ｔｒｅｐ−ｔｏｃｏｃｃｕｓ　
Ｍ、Ｇ、ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）とのみならず植物の
脂質またはヒトの細胞成分とも交差反応する。

特に、細胞破壊に伴って現われる疾患例えばスイ臓炎、
髄膜炎または心炎に関しては、偽陽性ＣＦＴ反応が記載
されている。その他の試験法は、例えばＣＦＴと同様に
特異性が低い免疫蛍光法のように労働集約的すぎるが（
Ｍ、ニューモニエ全抽出物を用いるＥＬＩＳＡ　（Ｍｉ
ｔｚｕＬａｎｉ　Ｈ，Ｍｉｚ−ｕｔａｎｉ　Ｈ（Ａｎ、
Ｒｅｖ、Ｒｅ５ｐｉｒ、Ｄｉｓ、１２７　；　１７５−
１７９＋（１９８３））、あるいは例えば付着阻害試験
（ＪａｃｏｂｓＥ他、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、４；１１３−１１８．（１９８５））とし
て特別の試験室でのみしか使用できない。

Ｍ、ニューモニエはその生端構造部分中に分子量１６８
ｋＤを有するタンパク質を有しており、このものがその
病原体が宿主生物の細胞に付着する原因をなしている（
Ｆｅｌｄｎｅｒ　　Ｊ　　他、Ｎａｔｕｒｅ２９８　；
　７６５−７６９．（１９８２））。このタンパク質に
対する抗体はＭ、ニューモニエに感染した患者のこれま
でに検査されたすべての血清中に見出されたが、他のタ
ンパク質に対する免疫応答は通常現われなかった（Ｊａ
ｃｏｂｓ　Ｅ他、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、／　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉ
ｏｌ、２３　；　５１７−５２２．（１９８６ａ））。

従ってこの１６８ｋＤタンパク質は特異的な血清学的試
験に適する抗原である。

この１６８ｋＤタンパク質はすでにトリトン、デオキシ
コレート（ＤＯＣ）　、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）、Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、およびトリス緩衝液からなる界
面活性剤混合物（以下ＴＤＳＥＴと略記）を用いて単離
されておりそしてイムノアマイクテイクロマトグラフイ
ー（Ｌｅｉｔｈ　Ｄ　Ｋ、　Ｂａｓｅｍａｎ　Ｊ　Ｂ、
、ＪＢａｃｔｓｒｉｏｌ　　１５７　；　６７８−６８
０．（１９８４）、モノクローナル抗体アフイニイテイ
クロマトグラフイーにヨルマイコプラズマキニューモニ
エアトへシンの精製）により精製されている。しかしな
がらカラムに結合された抗体にイムノアマイクテイクロ
マトグラフイーで結合した１６８ｋＤタンパク質を溶離
するには、イムノ複合体を解離させるのに比較的激しい
条件を必要とし、それによりリガンドの変性およびカラ
ムの破壊が招来されうる。大量の変性１６８ｋＤタンパ
ク質を単離できる方法はＪａｃｏｂｓおよびＣ１ａｄ　
（Ｊａｃｏｂｓ　Ｅ、Ｃ１ａｄＡ。

Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１５４；５８３−５８９
．（１９８６）、分収用ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）−ポリアクリルアミドゲルからの固定され染色され
た膜タンパク質のメンプラントラップへのエレクトロエ
リューション）に記載されている。この研究においては
、完全なＭ、ニューモニエタンパク質がドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）により分離され、標識されそして次に１６
８ｋＤタンパク質を含有するバンドをゲルから切断しそ
してバイオトラップ系中にエレクトロエリューションさ
れた。

この方法においては１６８ｋＤタンパク質はドツト−Ｅ
ＬＩＳＡにおける抗原として使用できる量で単離されう
るが、（Ｊａｃｏｂｓ他、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉ
ｃｒｏｂ−４ｏ１．５　；　４３５−４４０．（１９８
６）、ドットエンザイムリンクトイムノソルベントアツ
セイにおける抗原として使用されるマイクプラズマ・ニ
ユーモニエノ１６８ｋＤタンパク質）、このタンパク質
の単離には非常に時間がかかりそしてこの方法で得られ
たタンパク質は天然の状態を有しない。

それゆえＭ、ニューモニエから１６８ｋＤタンパク質を
天然の形態で充分な量で得ることのできる方法を見出す
ことが本発明の目的であった。

この目的はＭ、ニューモニエの１６８ｋＤタンパク質の
精製法に基づき、マイコプラズマ・ニユーモニエの全細
胞を両性イオン系界面活性剤、好ましくは３−　［（３
−コラミドプロピル）ジメチルアンモニウム］　−１〜
プロパンスルホネート（以下ＣＩＡＰＳと略記する）で
処理し、次に得られたペレットから°非イオン系界面活
性剤、好ましくはオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド
（オクチルグルコシド）を用いて１６８ｋＤタンパク質
を抽出し、そして終わりにサイズ排除クロマトグラフィ
ーにより他の不純物を除去することにより達成された。

すでに述べたように、Ｌｅ　ｉ　ｔｈ（１９８４、前記
）はＭ、ニューモニエの膜タンパク質を溶解させるのに
トリトンＸ−１００、ＳＤＳおよびデオキシコレートを
含有する種々の界面活性剤の混合物（ＴＤＳＥＴ）を使
用した。しかしながらこの混合物はＭ、ニューモニエの
膜から１６８ｋＤタンパク質のみならず、不純物高分子
タンパク質をも溶解し、これらはゲル濾過によっては相
互に分離できない。今や本発明方法によって１６８ｋＤ
タンパク質を分別可溶化することにより２０倍量まで濃
縮することが可能である。残る不純物はかなり分子量が
低く、１回のゲル濾過工程によって除去できた。従って
本発明方法を用いる場合は１６８ｋｏタンパク質を変性
条件に露出させる必要はなく、それゆえこのタンパク質
が驚くほど大量にその天然の形で入手できる。

この緩和な溶解条件は用いられる界面活性剤の性質から
来ている。オクチルグルコシドは非イオン系界面活性剤
でありそしてＣＨＡＰＳは両性イオン系界面活性剤であ
る。どちらの界面活性剤も所定の構造およびＨＬＢ約１
５を有する。前記界面活性剤を用いることにより得られ
る結果を、ＳＤＳ緩衝液またはＴＤＳＥＴによりすべて
の細胞タンパク質を単離したのち得られた結果と比較し
ｔこ　。

比較するには細胞をＣＩＡＰＳまたはオクチルグルコシ
ドのいずれかを含有する溶解緩衝液を用いてまたはＴＤ
ＳＥＴ界面活性剤混合物を用いて処理した。得られた懸
濁液を遠心分離しそして得られた上清をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより分析した。その結果によれば、ＴＤＳＥＴは比
較的小さな分子量を有する分子を良好に溶解するのみな
らず、１６８ｋＤタンパク質ならびに細胞膜の分子量１
４５ｋＤを有するもう−の顕著なタンパク質も同様に溶
解することが示された。予想されｔ；ように、ＴＤＳＥ
Ｔ処理においては、わずかだけ小さな１４５ｋＤタンパ
ク質を続くサイズ排除クロマトグラフィーにより１６８
ｋＤタンパク質から分離することはできなかった。

オクチルグルコシドは１６８ｋＤタンパク質を良好に溶
解しそして１４５ｋＤタンパク質はあまり溶解しなかっ
た。この性質をＣＨＡＰＳは有していない。ＣＨＡＰＳ
は１４５ｋＤタンパク質を溶解させるには明らかに非常
に効率的な界面活性剤であるがしかしながら１６８ｋＤ
タンパク質はあまり効果的に溶解させない。この２種の
界面活性剤の組み脅せにより驚くほど良好な結果が得ら
れた。

この方法の第１工程では、Ｍ、ニューモニエの全細胞を
ＣＨＡＰＳで予備処理して、それにより１４５ｋＤタン
パク質および少量の１６８ｋＤタンパク質を含むタンパ
ク質の大部分を溶解させる。得られたホモジネートを遠
心分離したのちペレットの一部分ずつを種々の濃度のオ
クチルグルコシドで可溶化させる。

Ｍ、ニューモニエの全細胞を処理する第１番目の工程に
は、両性イオン系界面活性剤ＣＨＡＰＳを約０．１〜１
０％（ｗ／Ｖ）、好ましくは１％（ｗ／　ｖ）の濃度で
含有する緩衝剤混合物（緩衝液Ｉ）が使用されるのが好
ましい。

第１の溶解工程後に得られたペレットの非イオン系界面
活性剤オクチルグルコシドでの処理も同様にオクチルグ
ルコシドを約０．１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１
〜、（ｗ／　Ｖ）の濃度で含有する緩衝剤混合物（緩衝
液ＩＩ）が用いられるのが好ましい。

１６８ｋＤタンパク質を本発明により分別可溶化させる
と、Ｍ、ニューモニエ中に天然に存在する量である全細
胞タンパク質の約１．５％と比較して所望タンパク質が
２０倍に濃縮される。ここに記載される、本発明による
方法のもう一つのとても大きな利点は、何ら他の不純な
高分子タンパク質が存在しないという事実にある。次に
１回のサイズ排除クロマトグラフィーによる精製工程に
より溶解されている低分子量不純タンパク質が１６８ｋ
Ｄタンパク質から分離されうる。

好ましい緩衝剤Ｉは中性りん酸塩緩衝液中に約０．１〜
１ｏ％（ｗ　／　ｖ　）濃度のＣＨＡＰＳの他に１００
〜６００ｍＭのＮａＣ（＋、錯化剤、還元防止剤および
プロテアーゼインヒビター、好ましくは約１％（Ｖ／　
Ｖ）のＣＨＡＰＳ、　４００ｍＭのＮａＣｌ２．　　ｌ
　ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、５　
ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．６ｍＭのＰＭＳ
Ｆ（フェニルメタンスルホニルフルオライド）および５
０ｍＭのりん酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６，７５）を含
有する。これら緩衝剤成分は慣用に使用されるもので、
前記した量でＣＨＡＰＳの溶解作用を助けるものである
。

好ましい緩衝液■は中性りん酸塩緩衝液中に約０．１〜
１０％（ｗ／ｖ）濃度の非イオン系界面活性剤オクチル
グルコシドの他に１００〜６００ｍＭのＮａｃＱ。

錯化剤、還元防止剤およびプロテアーゼインヒビター、
好ましくは約、（ｗ／Ｖ）のオクチルグルコシド、４０
０ｍＭのＮａＣ（２，ｌ　ｍｌＪのＥＤＴＡ、　　５　
ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．６ｍＭのＰＭＳ
Ｆおよび５０ｍＭのりん酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６，
７５）を含有する。非イオン系界面活性剤オクチルグル
コシドに関しても本発明方法におけるこの緩衝剤混合物
は良好に適する。

第１の処理工程でのＭ、ニューモニエの全細胞の溶解作
用を助けるためには、ＣＨＡＰＳで予備処理した細胞を
超音波で好ましくは０℃、１．５分間処理することがで
きる。この超音波処理により細胞壁成分の崩解が促進さ
れ、それにより細胞壁に結合されていたタンパク質の放
出が高められうる。

ＣＨＡＰＳでの処理ならびに超音波処理後に生成するホ
モジネートから、そのうちの一つが所望の１６８ｋＤタ
ンパク買を含有するものである各７ラクシヨンに分ける
には、ホモジネートを好ましくは２５０００　Ｘ　９お
よび４℃で約４０分間遠心分離する。ペレット中に所望
の１６８ｋＤタンパク質が含有される。次にこのペレッ
トを洗浄しそして前記緩衝液■中にとる。これに続きも
う一回短時間超音波処理を行うことができる。

緩衝液■中にとったペレットを室温で５分間振盪し、続
いてもう一回遠心分離する。

緩衝液■中に含有されるオクチルグルコシドを用いて１
６８ｋＤタンパク質をかくの如く油田したのち、得られ
た懸濁液を室温で約５分間振盪してもよく、それに続い
て再び２５０００　Ｘ　９で４０分間遠心分離する。得
られた不透明の上清中に１６８ｋＤタンパク質が含有さ
れておりそしてこれは例えば０．４５ｇｍメンプランを
通して濾過して次にサイズ排除クロマトグラフィーにか
けることができる。

サイズ排除クロマトグラフィーは好ましくはスーパーロ
ース（Ｓｕｐｅｒｏｓａ）　６−分取等級カラムを用い
て行うことができる。１６８ｋＤタンパク質はこのカラ
ムからｐＨ約６．７５のＳＤＳ／りん酸ナトリウム緩衝
液を用い高純度、大量かつ天然の状態で溶離されうる。

本発明を下記実施例および図面により詳細に説明する。

第１図 種々の界面活性剤を用いて可溶化を行った場合のＭ、ニ
ューモニエのタンパクｆｆ　ヲＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離
した後に得られたセルバ（５ｅｒｖａ）ブルー染色ポリ
ペプチドパターンを示す写真である。

２００μζずつの細胞タンパク質をそれぞれの界面活性
剤の存在下に１．５分間超音波処理し、次に室温でさら
に５分間インキュベーションした。

この懸濁液を１００，０ＯＯＸ　ｇで遠心分離して得ら
れた上溝をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に調製する。各カラムの
界面活性剤は下記のとおりである。

ａ）　　、ＳＤＳ ｂ）　　１％　トリトンＸ−１００，０，、デオキシコ
ート、０．１％　ＳＤＳ（ＴＤＳＥＴ）ｃ）　　１％Ｃ
ＨＡＰＳ ｄ）　　１％　オクチルグルコシド 第２図 種々の濃度のオクチルグルコシドを用いる１６８ｋＤタ
ンパク質の可溶化を示す。

Ｍ、ニューモニエの細胞をＣＩＡＰＳ緩衝液で処理し、
遠心分離し、そして洗浄したペレット（タンパク質１０
０μｇずつ）を種々の濃度のオクチルグルコシドを含有
する緩衝液中に懸濁させる。

遠心分離したのち、上溝を５ＯＳ−ＰＡＧＥ用に調製し
そしてゲル（８，２５％Ｔ）に負荷する。固定され、セ
ルバーブルー染色されたゲルを５７５ｎｍでデンシトメ
ーターで測定しそして１６８ｋＤタンパク質の染色され
たバンドに相当するピークの範囲を界面活性剤の濃度に
対してプロットする。

第３図 Ｍ、ニューモニエの１６８ｋＤタンパク質のオクチルグ
ルコシド可溶化物のサイズ排除クロマトグラフィーを示
す。

１６８ｋＤタンパク質のオクチルグルコシド可溶化物１
ｍｆｆをスーパーロース６分取等級物を含有するカラム
（１，６Ｘ５０ｃｍ）に負荷する。ｐＨ６，７５を有す
る１００ｍＭりん酸ナトリウム中の０．１％ＳＤＳを用
いて０．２ｒｓ、Ｑ／分の速度で溶離して１．２＋１１
２ずつのフラクションを集めた。

第４図 粗製１６８ｋＤタンパク質のサイズ排除クロマトグラフ
ィーにより得られる７ラクシヨンをＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびセルバーブルー染色して得られるポリペプチドパタ
ーンを示す写真である。実験条件は第１図におけると同
じである。

レーン２；総細胞タンパク質（２００μｍ）レーン１５
　ｉ　１６８ｋＤタンパク質レーン３〜１４；サイズ排
除クロマトグラフィーの種々のフラクション 実施例　Ｉ Ｍ、ニューモニエの培養 Ｍ、ニューモニエのＦＨ株をルーピン中３７℃でヘイフ
リックス培地（Ｈａｙｆ　ｌｉｃｋｓｍｅｄｉｕｍＸＨ
ａｙｆ　１ｉｃｋＬ、Ｔｅｘ　Ｒｅｐ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅ
ｄ、　２３　；　５ｕｐｐ１．．２８５−３０３．細胞
培養物およびマイコプラズマ（１９６５））中で成育さ
せる。この細胞を４８時間後に収穫し、−７０００で貯
蔵する。

実施例　２ １６８ｋＤタンパク質の単離 実施例１に記載されるようにして調製されたＭ、ニュー
モニエの細胞を緩１１液Ｉ（１％ＣＨＡＰＳ。

４００ｍＭ　ＮａＣｆｆ、　　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　
　ｌ　ｍＭ　２−メルカプトエタノール、０．６ｍＭ　
ＰＭＳＦ、　５０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液　ｐＨ６
，７５）の５１１１２中に懸濁させそして０°Ｃで１．
５分間超音波処理する。このホモジネートを２５０００
Ｘ　９および４℃で４０分間遠心分離する。

以後のすべての工程は室温で行われる。

洗浄したベレットを緩衝液１１（、オクチルグルコシド
、４００ｍＭ　ＮａＣ４，ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　５
　ｍＭ　２−メルカブトエタノール、０．６＋ｎＭ　Ｐ
ＭＳＦ１５０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液　ｐＨ６，７
５）　ｌ　ｒｉｒｌ中に短時間超音波処理することによ
り再懸濁させる。

得られた懸濁液を室温で５分間振盪し、続いて２５００
０Ｘ　９で４０分間遠心分離する。不透明な上溝は粗製
１６８ｋＤタンパク質を含有する。この上清は０．４５
μ＋ｍメンプラン（Ｓｐａｒｔａｎ、５ｃｈｌｅｉｃｈ
ａｒ　ｕｒｌｄＳｃｈｕｌｌ、Ｋａｓｓｅｌ／　ＦＲＧ
）でのが過により統くクロマトグラフィー工程用に調製
する。

実施例　３ サイズ排除クロマトグラフィー 粗製１６８ｋＤタンパク質のオクチルグルコシド可溶化
物をスーパーロース６分取等級物（Ｄｅｕ−Ｌｓｃｈｅ
　Ｐｈａｒｍａｚｉｅ　ＡＧ　ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕ
ｒｇ／　ＦＲＧ）を含有するカラム（１，６×５０ｃｍ
）に負荷する。溶離緩衝液（０，１％ＳＤＳ、　ｌｏｏ
＋ｎＭりん酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，７５）を用い流
速０．２ｍＱ１分で溶離し、１．２ｍＱずつのフラクシ
ョンを集める。

第３図は分子量２０００００〜１００００を有するポリ
ペプチドに相当する溶離ダイヤグラムを示す。

フラクションの一部分ずつをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（第４図
）により分析する。いくつかの調製物において排除量に
相当する第１のピークがここに示されるクロマトグラム
におけるより約１０倍まで高いとしても、相当する７ラ
クシヨンは何らタンパク質を含有しない（第４図、レー
ン３）。こノ吸着は恐らくカラムに加えられる不透明上
溝中に混合ミセルが存在することに起因すると思われる
。第２のピークは第４図のレーン７〜９から明らかなよ
うに良く溶解された１６８ｋＤタンパク質を含有する本
方法により得られうる１６８ｋＤタンパク質の量はペレ
ットの湿潤細胞重量１９から１６８ｋＤタンパク質４０
％または３００μりである。

実施例　４ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 集められたタンパク質フラクションは不連続緩衝系（Ｌ
ａｅｍｍｌｉ　Ｕ、に、、Ｎａｔｕｒｅ　２２７　；　
６８０−６８５、バタテリオファーンＴ４のヘッドの組
み立て中における構造タンパク質の開裂（１９７０））
中８　、７５７のゲル濃度の１．５）厚さのスラブゲル
（１８Ｘ　１４ｃｉ＋）中でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分析する。

実施例　５ 希界面活性剤溶液中におけるタンパク質のアッセイ タンパク質を界面活性剤を同時に抽出することにより沈
澱させ（ｗｅｓｓｅｌ　Ｄ、Ｆｌムｇｇｅ　Ｕｌ　；　
ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ、１３８　；　１４１１４３、
界面活性剤および脂質の存在下に希溶液中のタンパク質
の全量的回収法（１９８４））そして集められたタンパ
ク質を改良ローリ−（Ｌｏｗｒｙ）法で測定する（　Ｐ
ｅｔｅｒｓｏｎ　ＧＬ＋Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、８
３　；　３４６−３５６、より一般的に適用しうるＬｏ
ｗｒｙ他のタンパクアッセイ法の簡単化（１９７７））
。

比較実験１ 実施例１に記載されるようにして調製されｔ；Ｍ、ニュ
ーモニエ細胞の一部分ずつをＬｅｉＬｈ　（前記）によ
り記載されているようにして、１％ＣＨＡＰＳまたは１
％オクチルグルコシドまたは界面活性剤混合物ＴＤＳＥ
Ｔ　［１％（ｗ／ｖ）　）リドンＸ１００．０．、（ｗ
／Ｖ）デオキシコレート、０．１％（ｗ／　ｖ）　　Ｓ
ＤＳ、　　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ１１０ｍＭト　リス−Ｈ
ＣＱｐＨ７，８］　をそれぞれ含有する緩衝液で処理す
る。

得られる懸濁液を遠心分離し、そして得られた上溝を第
１図において記載されるようにしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より分析する。

第１図ではＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびセルバブル−染色後
に得られるポリペプチドパターンをレーンａに示す。そ
こには実際上すべての細胞タンパク質が示されている。

分子量は第１図左側に示されておりそして１６８ｋＤタ
ンパク質の位置は矢印で示される。レーンｄ−ｂはそれ
ぞれＴＤＳＥＴ。

または１％（ＪＡＰＳ、または１％オクチルグルコシド
の存在下に可溶化後に得られるタンパク質フラクション
のポリペプチドパターンを示す。

Ｔ　Ｄ　Ｓ　Ｅ−Ｔは分子量の小さいタンパク質のみな
らず！６８ｋＤタンパク質ならびに分子量１４５ｋＤを
有す６Ｍ、ニューモニエのもう一つの重要なタンパク質
に対しても良好な溶解性質を有することが示される。分
子量１４５ｋＤおよび１６８ｋＤを有する二種のタンパ
ク質は後程のサイズ排除クロマトグラフィーで示される
ように相互に分離できなかった。

界面活性剤オクチルグルコシドは１６８ｋＤタンパク質
は良好に溶解するが、１４５ｋＤタンパク質はあまり溶
解しない。ＣＨＡＰＳ界面活性剤の場合には１４５ｋＤ
タンパク質の可溶化にとっては非常に効率的な界面活性
剤であるが、１６８ｋＤタンパク質にはわずかな溶解力
しか有しないことが判つ　ｌこ　。

比較実験２ オクチルグルコシドの有効濃度の測定 第２図はＣＨＡＰＳで予備処理されたＭ、ニューモニエ
細胞を０〜、の間の種々の濃度のオクチルグルコシドを
含有する。実施例２に記載されたと同様の緩衝液■で処
理することにより得られた結果を示す。第２図では１６
８ｋＤタンパク質の可溶化には１％以上のオクチルグル
コシド濃度で充分であることが示される。種々のタンパ
ク質濃度にとっての耐容限界を確保しそして界面活性剤
／タンパク質の割合を少くとも５に保持するためには、
オクチルグルコシド濃度、が特に適当である、何故なら
その場合に約４＋＊ｇ／ｍＱまでのタンパク質濃度が許
容されるからである。

ＣＨＡＰＳで予備処理したベレットから得られる、、オ
クチルグルコシド可溶化物のＳＤＳ−ＰＡＧＥポリペプ
チドパターンを第４図のレーン１５ｉこ示す。

１６８ｋＤタンパク質は本発明方法で分割可溶化を行う
ことにより、Ｍ、ニューモニエの全細胞タンパク質の約
１．５％に基づき計算して約２０倍に濃縮される。この
値はデンシトメトリーにより得られうる。本発明方法に
おけるようにして調製された１６８ｋＤタンパク質は何
ら不純な高分子タンパク質を含有しない。

双性イオン系界面活性剤ＣＨＡＰＳならびに非イオン系
界面活性剤オクチルグルコシドを用いて本発明方法によ
る操作により所望の１６８ｋＤタンパク質を分別溶解さ
せることにより、所望のタンパク質を２０倍まで濃縮す
ることができ、残留不純物は所望のタンパク質よりかな
り低い分子量を有しており従って１回のゲルが過工程に
より分離されうる。それゆえ本発明による方法では１６
８ｋＤタンパク質を変性性試薬に露出させる必要がなく
、従ってタンパク質はその天然の形で得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は種々の界面活性剤を用いて可溶化を行った場合
のＭ、ニューモニエのタンパク質を５ＯＳ−ＰＡＧＥで
分離した後に得られたセルバブル−染色ポリペプチドパ
ターンを示す写真である。 用いられた界面活性剤は次のとおりである。 ａ）　　、ＳＤＳ ｂ）　　　　１　　％　　ト　リ　ト　ン　Ｘ　　−ｔ
ｏｏ　、　０．、　　ＤＯＣ，０，１％ＳＤＳ（ＴＤＳ
ＥＴ） ｃ）　　１％ＣＨＡＰＳ ｄ）　　１％オクチルグルコシド 第２図は種々の濃度のオクチルグルコシドを用いる１６
８ｋＤタンパク質の可溶化を示す。 第３図はＭ、ニューモニエの１６８ｋＤタンパク質のオ
クチルグルコシド可溶化物のサイズ排除クロマトグラフ
ィーでの溶離ダイヤグラムを示す。 第４図は粗製１６８ｋＤタンパク質のサイズ排除クロマ
トグラフィーにより得られるフラクションをＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥおよびセルパブルー染色して得られるポリペプチ
ドパターンを示す写真である。 レーン２；細胞全タンパク質（２００μｍ）レーン１５
　；　１６８ｋＤタンパク質レーン３〜１４；サイズ排
除クロマトグラフィーの種々のフラクション 特許出願人　　ヴオルフガング・ブレット同　　タレメ
ンス　フフテ 同 二ノ・ヤーコプス 外２名 ＳＤＳ　　Ｔ口Ｓ ＣＨ Ｇ ｐｗｅｌ！　　−’ ２２０−〜− ＦＩＧ、２ オクチルグルコ７ド０１゜ 分子量−１０−３ ＦｉＧ、１ ＦＩｏ、３ 塔 離 ［ｍ１１ Ｈ３５３７３９闇ｕ　＆Ｓ　Ｌ７４９５１５３５５５７
　Ｆ＝ し・・・−ン ム ＦＩＧ、４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）マイコプラズマ・ニユーモニエの全細胞を両性イオ
   ン系界面活性剤、好ましくは３− ［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニウム］−
   １−プロパンスルホネートで処理し、得られるペレット
   から非イオン系界面活性剤、好ましくはオクチル−β−
   Ｄ−グルコピラノシド（オクチルグルコシド）を用いて
   １６８ｋＤタンパク質を抽出し、そして終わりにサイズ
   排除クロマトグラフィーにより他の不純物を除去するこ
   とからなるマイコプラズ マ・ニユーモニエの１６８ｋＤタンパク質の精製法。 ２）３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニ
   ウム］−１−プロパンスルホネー トが緩衝剤混合物（緩衝剤混合物 I ）中に約０．１〜
   １０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１％（ｗ／ｖ）の濃度で
   含有されることからなる請求項１記載の方法。 ３）オクチルグルコシドが緩衝剤混合物（緩衝剤混合物
   II）中に約０．１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜
   ２％（ｗ／ｖ）の濃度で含有されることからなる請求項
   １記載の方法。 ４）緩衝剤混合物 I が中性りん酸塩緩衝液中に０．１
   〜１０％（ｗ／ｖ）の３−［（３−コラミドプロピル）
   ジメチルアンモニウム］−１−プロパンスルホネート、
   １００〜６００ｍＭのＮａＣｌ、錯化剤、還元防止剤お
   よびプロテアーゼインヒビター、好ましくは１％（ｗ／
   ｖ）の３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモ
   ニウム］−１−プロパンスルホネート、４００ｍＭのＮ
   ａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカプトエ
   タノール、０．６ｍＭのＰＭＳＦおよび５０ｍＭのりん
   酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６．７５）を含有することか
   らなる請求項２記載の方法。 ５）緩衝剤混合物IIが中性りん酸塩緩衝液中に０．１〜
   １０％（ｗ／ｖ）のオクチルグルコシド、１００〜６０
   ０ｍＭのＮａＣｌ、錯化剤、還元防止剤およびプロテア
   ーゼインヒビター、好ましくは ２％（ｗ／ｖ）のオクチルグルコシド、４００ｍＭのＮ
   ａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカプトエ
   タノール、０．６ｍＭのＰＭＳＦおよび５０ｍＭのりん
   酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６．７５）を含有することか
   らなる請求項３記載の方法。 ６）３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニ
   ウム］−１−プロパンスルホネートで処理したのち細胞
   を超音波処理、好ましくは０℃で約１．５分処理するこ
   とからなる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 ７）超音波処理後に得られたホモジネートを好ましくは
   ２５０００×ｇおよび４℃で約４０分間遠心分離するこ
   とからなる請求項６記載の方法。 ８）オクチルグルコシドで抽出後に得られた懸濁液を室
   温で約５分間振盪しそして次に２５０００×ｇで４０分
   間遠心分離しそして１６８ｋＤタンパク質を含有する得
   られた上清をろ過することからなる請求項１〜７のいず
   れかに記載の方 法。 ９）サイズ排除クロマトグラフィーがスーパーロース６
   分取等級カラムを用いて行われ、そして１６８ｋＤタン
   パク質が中性ｐＨ値好ましくはｐＨ６．７５を有するＳ
   ＤＳ−りん酸ナトリウム緩衝液を用いて溶離されること
   からなる請求項１〜８のいずれかに記載の方法。