WO2023204377A1 - 면역글로불린 정제방법 - Google Patents
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Definitions
- Cone pools can be formed by isolation from plasma samples.
- the heparin chromatography in step (d) above can be performed by obtaining a non-column adsorption solution using the solution obtained in step (c) under conditions of pH 5.0 to 6.5 and conductivity of 8 mS/cm or less.
- the solvent/detergent treatment may be performed at pH 4.0 to 6.0 for 5 hours or more, more preferably at pH 4.0 to 5.5 for 6 hours or more.
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Abstract
본 발명은 면역글로불린 정제방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 면역글로불린을 함유하는 혈장 유래 Cohn fraction I+II+III paste와 II+III paste로부터 카프릴산 침전 및 크로마토그래피 공정을 통해 다양한 혈장유래 불순물, 특히 항보체 활성에 영향을 주는 면역글로불린 중합물 (polymer), 선천적인 IgA 결핍환자에게 과민증 반응을 유도하는 IgA 및 혈전색전을 유발할 수 있는 세린 프로테아제인 응고 FXIa (Factor Xia)를 효율적으로 제거하는 정제 방법에 관한 것이다. 특히, 시작물질에 함유된 과량의 FXIa를 카프릴산 침전 및 헤파린 크로마토그래피를 통한 이중 제거공정을 도입하여 면역글로불린 제품의 안정성을 높였다.
Description
본 출원은 2022년 4월 19일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2022-0047983호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 면역글로불린 정제방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 혈장 유래 Cohn 분획 I+II+III paste 또는 II+III paste로부터 면역글로불린을 고수율 및 고순도로 정제함과 동시에, 혈장 유래 불순물인 IgA, 세린 프로테아제인 활성화된 응고 FXIa (Factor XIa)와 면역글로불린 중합물 수준을 현저히 낮출 수 있는 면역글로불린 정제방법에 관한 것이다.
혈장 유래 혈액 제품은 다양한 혈액 질환뿐만 아니라, 다른 기원의 질환을 치료하기 위해 사용된다. 예를 들면, 인간 혈장 유래의 면역글로불린(IgG) 제품은 면역 결핍증을 치료하기 위해 1952년에 처음 사용되었다. 이후, IgG 제제는 (1) 면역 결핍증, 예컨대 X염색체 연관 무감마글로불린혈증, 저감마글로부민혈증(1차 면역 결핍증) 및 낮은 항체 수준을 특징으로 하는 후천성 손상 면역 병증(이차 면역 결핍증); (2) 염증성 및 자가면역 질환; 및 (3) 급성 감염의 의학 병증의 적어도 3가지 주요 카테고리에서 널리 사용되고 있다.
혈장 유래 생물학적 치료제를 제조하고 제제화할 때 다양한 안전성 예방을 취해야 한다. 이러한 예방은 수혈된 혈장 사용으로부터 생기는 혈액성 병원균(예를 들면, 바이러스 및 박테리아 병원균), 항보체 활성에 영향을 주는 면역글로불린 중합물 (polymer), 선천적인 IgA 결핍환자에게 과민증 반응을 유도하는 IgA 및 다른 원치 않는 오염질을 제거하고/하거나 불활성화하는 방법을 포함한다.
특히, 연구에 의하면 높은 수준의 아미도분해 활성(amidolytic activity)의 투여가 원치않는 혈전색전성 사건을 발생시킨다는 것이 제시되었다(Wolberg AS et al., Coagulation factor XI is a contaminant in intravenous immunoglobulin preparations. Am J Hematol 2000;65:30-34; 및 Alving BM et al., Contact-activated factors: contaminants of immunoglobulin preparations with coagulant and vasoactive properties. J Lab Clin Med 1980; 96:334-346; 이의 개시내용이 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함됨). 이러한 관심의 흥미로운 부분은 증가된 혈전색전성 사건 보고에 따라 미국이 옥타감(Octagam)(등록상표)(옥타파마(Octapharma))을 자발적으로 철수시키고 유럽 연합이 옥타감(등록상표) 및 옥타감 10%에 대한 시판 허가를 중지한 것이다. 세린 프로테아제 및 세린 프로테아제 지모겐 불순물, 예컨대 XI 인자, XIa 인자, XII 인자 및 XIIa 인자에 의해 야기되는 생물제제에서 높은 수준의 아미도분해 활성에 의해 증가된 혈전성 사건이 야기된다는 것이 제시되어 있다.
혈장 유래 단백질 조성물 중에서 면역글로불린을 주성분으로 하는 제제에서는 세린 프로테아제 및 세린 프로테아제 지모겐의 존재에 대한 관심 증가로, 면역글로불린 제제에서 이 오염물질, 특히 FXI 및 FXIa의 수준을 감소시키는 방법과 더불어 공정 수율 향상과 순도를 높이는 정제방법에 대한 수요가 당해 분야에 존재한다.
혈장유래 조성물 중, Cohn fraction I+II+III paste는 면역글로불린 뿐 아니라 상기의 FXIa를 포함한 다양한 혈장유래 불순물이 농축된 상태이며, 이후 적절한 공정의 조합을 통한 제거가 필요하다. 어느 하나의 공정단계로 모든 불순물을 제거할 수 없으며, 적절한 제거 공정의 조합을 통해 원하는 수준의 면역글로불린 순도 확보가 요구된다. 특히 FXIa의 경우, Cohn fraction I+II+III paste 단계에서 과량으로 농축 및 활성화되어 있으며 (Dong Hwarn Park et al. Biologicals. 2017 Jan;45:1-8. A new manufacturing process to remove thrombogenic factors (II, VII, IX, X, and XI) from intravenous immunoglobulin gamma preparations), 이를 원활하게 제거하기 위해 카프릴산 등의 물질을 활용한 침전 공정 또는 크로마토그래피 공정의 적절한 조합이 요구된다.
이러한 과량의 불순물들을 완벽히 제거하며 면역글로불린의 수율을 확보하는 것은 기술적으로 매우 어렵다. 우선적으로 카프릴산 침전을 포함한 fractionation 기법에서 면역글로불린 수율 손실을 최소화하며 FXIa를 포함한 과량의 불순물을 제거해야 한다. FXIa의 경우, 침전 공정만으로 완벽하게 제거될 수 없으며 크로마토그래피 공정 등 추가적인 제거 공정이 요구된다. 이 때 침전 공정에서 FXIa가 충분히 제거되지 않을 경우, 이후 크로마토그래피 공정에서 FXIa 제거에 많은 부담이 발생하며 적합 수준의 면역글로불린 수율을 확보할 수 없으므로 두 공정간 면역글로불린 수율 및 불순물 제거의 균형 유지가 필요하다.
크로마토그래피 공정의 경우, 목적에 따라 이온교환, 헤파린 등의 affinity 및 역상수지 등의 다양한 방식을 조합으로 사용할 수 있다. 크로마토그래피에서 면역글로불린을 흡착시키는 방법은 적절한 세척, 용출 조건의 최적화가 요구되므로 수율을 극대화하기에 제한이 있다. 반면, 불순물을 흡착시키고 면역글로불린을 비흡착으로 회수하는 공정은 상대적으로 높은 수율을 기대할 수 있으나, 전체 공정에 적용되는 모든 크로마토그래피 공정을 비흡착 방식으로 설계하는 방법은 (1) 선행 공정과 후행 공정간 버퍼를 같은 조건으로 통일해야하는 점; (2) 각 크로마토그래피 별 영향성을 최소화하기 위해 낮은 농도의 버퍼 및 염 농도를 적용해야 하는 점; (3)해당 조건에서 적절한 불순물 제거효과를 확보해야 하는 점으로 인해 개발 난이도가 높다 할 수 있다.
따라서, Cohn fraction I+II+III paste 또는 II+III paste를 시작물질로 하는 면역글로불린의 정제방법에 있어, 카프릴산 침전 및 크로마토그래피 공정의 적절한 조합과 각 단위 공정의 최적화된 조건의 정제방법에 대한 수요가 당해 분야에 존재한다.
이에, 본 발명자는 혈장 유래 Cohn fraction I+II+III paste 또는 Cohn fraction II+III paste를 시작물질로 하는 면역글로불린의 정제방법에 있어 불순물인 면역글로불린 중합물, IgA와 특히, 세린 프로테아제, 구체적으로는 FXIa를 효과적으로 제거하고 면역글로불린의 순도 및 수율을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하고자 연구를 거듭한 결과 카프릴산 침전을 통해 과량의 FXIa를 제거한 후, 8 mS/cm 이하의 낮은 전도도를 유지하면서 음이온 교환 크로마토그래피, 헤파린 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피를 모두 면역글로불린 비흡착 (flow-through) 방식으로 진행하고, 바이러스 불활화 및 나노필터를 통해 혈장 유래 면역글로불린 조성물을 정제함으로써 이와 같은 목적을 달성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 혈장 유래 면역글로불린의 정제방법을 제공한다:
(a) Chon 분획 I+II+III 또는 II+III를 용해한 용액에 침전제를 첨가하여 침전반응을 수행하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 침전 상층액으로 농축/투석을 진행하여 전도도를 8 mS/cm 이하로 조정하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 용액으로 음이온교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획으로 헤파린 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계의 비흡착 분획을 2차 농축/투석하여 염성분을 제거하는 단계;
(f) 상기 (e) 단계의 용액에 S/D를 첨가하여 바이러스를 불활화하는 단계;
(g) 상기 (f) 단계의 용액에 포함된 S/D를 역상 크로마토그래피를 사용하여 제거하는 단계; 및
(h) 상기 (g) 단계의 용액을 나노필터로 여과하여 바이러스를 제거하는 단계.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 일실시예에서는 인간 혈장으로부터 얻어진 Chon 분획 I+II+III 또는 분획 II+III를 사용하여 면역글로불린을 정제하였으며, 상기 Chon 분획 I+II+III 또는 분획 II+III은 통상적인 콘 혈장 분획법에 따라서 제조되었다. 분획 I+II+III 또는 분획 II+III에 포함된 다양한 리포프로테인류, 피브리노겐, α-글로불린, β-글로불린, 면역글로불린 중합물, IgA 및 다양한 응고인자들(예를 들어, 세린프로테아제)을 제거하기 위한 후속 정제공정을 수행하였다.
본 발명에서 상기 콘 혈장 분획법에 따라 제조된 "콘 풀(Cohn pool)"은 혈장 샘플 또는 혈장 샘플의 풀의 분별화에 사용되는 출발 물질을 의미한다. 콘 풀은 예비 처리 단계로 처리되거나 처리되지 않을 수 있는 전체 혈장, 냉동 결핍성 혈장 샘플 및 냉동 결핍성 혈장 샘플의 풀을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 콘 풀은 예비 처리 단계, 예를 들면 고상(예를 들면, 수산화알루미늄, 미분 이산화규소 등)에의 흡착 또는 크로마토그래프 단계(예를 들면, 이온 교환 또는 헤파린 친화도 크로마토그래피)에서 1 이상의 혈액 인자가 제거되는 냉동 결핍성 혈장 샘플이다. 8 억제제 바이패스 활성(Factor Eight Inhibitor Bypass Activity: FEIBA) 인자, IX-복합체 인자, VII-농축물 인자 또는 안티트롬빈 III-복합체 인자(이들로 제한되지는 않음)를 비롯한 다양한 혈액 인자를 냉동 결핍성 혈장 샘플로부터 단리하여 콘 풀을 형성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 Chon 분획 I+II+III 또는 분획 II+III의 용해는 분획 I+II+III 또는 분획 II+III : 증류수가 1 : 3 내지 1 : 10이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하며, 상기 증류수는 주사용 증류수를 사용할 수 있다.
상기 Chon 분획 I+II+III 또는 분획 II+III은 실질적으로 비-변성 온도 및 pH에서 물 및/또는 완충액에 현탁액화(용해)되는 것이 바람직하다. '실질적으로 비변성'은 상기 언급된 조건이 면역글로불린 분자들의 기능성 활성의 실질적으로 비가역적인 손실, 예컨대, 항원결합 활성 및/또는 생물학적 Fc-작용의 손실을 야기시키지 않는 것을 의미한다.
바람직하게는, 상기 Chon 분획 I+II+III 또는 분획 II+III은 플라즈마 단백질 분획 부피의 3 내지 10, 바람직하게는 3 내지 8배의 부피로 하나 이상의 비변성 완충제로 산성화된 물에 용해시키며, 면역글로불린-함유 현탁액의 pH는 면역글로불린의 최적의 용해도를 보장할 수 있도록, 바람직하게는 pH 6.0 이하로, 더 바람직하게는 4.0 내지 6.0으로, 가장 바람직하게는 4.0 내지 4.3이 되도록 유지할 수 있다. 산성 완충액으로 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용될 수 있으나, 바람직하게는 인산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 아세트산, 염산, 물(증류수) 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 카프릴산 침전 반응을 통해 면역글로불린이 포함된 상층액 및 기타 물질이 포함된 침전물을 분리하는 단계이다.
상기 침전제는 다양한 분자량을 가지는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 카프릴산 및 황산암모늄에서 선택된 하나 이상의 물질을 사용할 수 있으며, 당업계에 공지된 비변성 수용성 단백질 침전제를 침전법의 수단으로 사용할 수도 있다. 바람직하게는 카프릴산을 사용할 수 있다.
상기 (a) 단계에 따른 카프릴산 침전반응은 불순물을 제거하여 순도를 높이는 단계이며, 특히 혈전형성에 관여하는 혈액응고 XI, XIa 인자를 제거하는 침전반응으로 카프릴산이 10 내지 50mM, 바람직하게는 20 내지 40mM, 가장 바람직하게는 25 내지 35mM이 되도록 첨가한 다음 pH가 4 내지 6, 바람직하게는 4.5 내지 5.5가 되도록 조절한다. pH 조절은 아세트산 또는 수산화나트륨을 첨가할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니며, 통상적으로 pH 조절을 위해 사용될 수 있는 다른 물질이 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
침전제는 침전 반응은 고체상과 액상 사이에서 평형이 이루어질 때까지, 0.5 내지 5시간 동안, 바람직하게는 0.5 내지 2시간 동안 수행된다.
침전 반응으로 침전된 침전물에는 다량의 응집된 단백질 물질이 포함되며, 상층액에는 면역글로불린이 포함되어 있으므로, 상층액만 취해 면역글로불린을 정제할 수 있으며, 면역글로불린-함유 상층액은 큰 응집체, 필터보조제, 잔류 비-용해된 페이스트 등을 제거하기 위해 여과 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 여과는 바람직하게 심층필터(depth filter)를 사용하며, C150 AF, AF 2000 또는 AF 1000(SChenk), 30 LA(Cuno) 또는 유사한 필터류를 이용하여 수행될 수 있다. 경우에 따라, 응집체, 필터 보조제, 잔류 비-용해된 단백질 물질의 제거는 또한 원심분리법에 의해 수행될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 (a) 단계 이후에 침전 상층액을 농축/투석, 보다 구체적으로는 한외여과/투석여과(ultrafiltration/diafiltration: UF/DF) 시스템을 이용하여 침전제를 제거하고, 용액의 이온강도를 8 mS/cm 이하로 조정하는 단계이다. 상기 한외여과/투석여과의 과정을 통해 침전제가 제거됨과 동시에 상기 침전 상층액을 농축하고 투석하는 효과가 달성이 될 수 있다. 특히, 용액의 이온강도를 8 mS/cm 이하로 조정함으로써 이후 진행되는 크로마토그래피 공정을 진행하는데 적합한 버퍼 조성을 유지한다.
본 발명에서 상기 "한외여과(ultrafiltration: UF)"는 정수압이 액체를 반투과성 막에 미는 다양한 막 정제 방법을 포함한다. 현탁된 고체 및 높은 분자량의 용질이 보유되고, 물 및 낮은 분자량의 용질이 막을 통과한다. 이 분리 과정은 대개 거대분자(103 내지 106Da) 용액, 특히 단백질 용액을 정제하고 농축하기 위해 사용된다. 이들이 보유하는 분자의 크기에 따라 여러 한외여과 막이 이용 가능하다. 한외여과는 통상적으로 1kDa 내지 1000kDa의 막 기공 크기를 특징으로 하고, 0.01bar 내지 10bar의 압력에서 작동하고, 특히 당 및 염과 같은 소분자로부터 단백질을 분리하기에 유용하다.
본 발명에서 상기 "투석여과(diafiltration)"는 정용여과로도 불리며 한외여과와 동일한 막으로 수행되고, 접선 유동 정제 또는 데드 엔드 정제 방식으로 실행될 수 있다. 투석여과 동안, 완충제를 순환 탱크로 도입하고, 여액을 유닛 조작으로부터 제거한다. 생성물이 잔류물(예를 들면, IgG 면역글로빈)인 공정에서, 투석여과는 생성물 풀로부터 성분을 여액으로 세척하여, 완충제를 교환시키고 바람직하지 않은 종의 농도를 감소시켜 전도도를 8 mS/cm 이하로 낮출 수 있다. 이 단계를 통해 면역글로불린의 농도를 10 내지 50, 바람직하게는 20 내지 40㎎/㎖으로 조정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 (b) 단계의 용액을 사용하여 음이온교환 크로마토그래피를 pH 5.0 내지 6.5, 전도도 8 mS/cm 이하, 유속 90 내지 140cm/hr의 조건에서 수행하고, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.0 내지 3.0 로딩볼륨(Loading Volume; LV)으로 수득하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게 상기 pH는 5.4 내지 6.0, 가장 바람직하게 5.7 내지 6.0이 되도록 조절한다.
농축된 면역글로불린 함유 용액은 침전제 및 면역글로불린 A(IgA), 알부민, 응집체를 포함하는 다른 혈장 단백질을 제거하기 위해 하나 이상의 단계에 음이온 및 양이온교환 크로마토그래피를 적용시킬 수 있다. 음이온교환 크로마토그래피 단계에서의 음이온교환 수지는 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 사차 암모니움(Quaternary ammonium)기들로 치환된 것들을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 강염기성의 사차 암모니움기를 가지는 그룹이나 또는 약염기성의 디에틸아미노에틸(DEAE) 그룹을 가지는 음이온 교환수지 중에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다.
예를 들면, 강염기성의 음이온교환 수지로는 Q Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, Resource Q, Source 15Q, Source 30Q, Mono Q, Mini Q, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q HyperCel, Q Cermic HyperD F, Nuvia Q, UNOsphere Q, Macro-Prep High Q, Macro-Prep 25 Q, Fractogel EMD TMAE(S), Fractogel EMD TMAE Hicap (M), Fractogel EMD TMAE (M), Eshmono Q, Toyopearl QAE-550C, Toyopearl SuperQ-650C, Toyopearl GigaCap Q-650M, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl SuperQ-650M, Toyopearl SuperQ-650S, TSKgel SuperQ-5PW (30), TSKgel SuperQ-5PW (20), TSKgel SuperQ-5PW 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업계에 공지된 음이온교환 수지를 사용할 수 있다.
음이온교환 크로마토그래피에 사용되는 수지의 적절한 부피는 컬럼 치수, 즉, 컬럼의 직경과 수지의 높이에 의해 반영되고, 예컨대, 적용되는 용액의 면역글로불린 용액양과 사용되는 수지의 결합 성능에 따라 달라진다. 음이온교환 크로마토그래피를 수행하기 전에, 음이온교환 수지는 바람직하게는 완충액으로 평형화시켜, 수지가 그의 짝 이온과 결합할 수 있도록 한다.
컬럼 완충액으로는 인산나트륨 완충액, 구연산 완충액, 아세트산 완충액 등 당업계에 공지된 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer), 세척버퍼(wash buffer) 및 용출버퍼(elution buffer)를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계의 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획으로 헤파린 크로마토그래피를 수행하는 단계이다. 대부분의 혈액 유래 불순물은 상기의 카프릴산 침전 및 음이온교환 크로마토그래피를 통해 대부분 제거되지만 미량으로 남아있는 혈액응고 XIa 인자를 제거하기 위해 헤파린 크로마토그래피의 수행이 필요하다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 (d) 단계에서 헤파린 크로마토그래피를 수행하여 얻어진 분획에는 혈전색전을 야기할 수 있는 세린 프로테아제, 구체적으로는 FXIa의 함량이 현저히 낮아지는 것으로 확인되었다.
상기 (d) 단계에서 수행되는 헤파린 크로마토그래피는 바람직하게는 헤파린 친화성 크로마토그래피로서, 이에 적용되는 레진은 당업계에 공지된 헤파린 레진이라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 헤파린 세파로즈 레진(heparin sepharose resin)이 사용될 수 있으며 flow-through mode로 공정액이 회수될 수 있다.
상기의 (d) 단계의 헤파린 크로마토그래피는 (c)단계에서 수득한 용액을 pH 5.0 내지 6.5, 전도도가 8 mS/cm 이하의 조건에서 컬럼 비흡착 용액을 수득하는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계 이후에, (e) 상기 (d) 단계에서 헤파린 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획에 한외여과/투석여과(ultrafiltration/diafiltration: UF/DF) 시스템을 이용하여 용액에 함유된 염을 제거하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
상기 (e) 단계는 상기 (d) 단계의 헤파린 크로마토그래피 비흡착 용액을 한외여과/투석여과(ultrafiltration/diafiltration: UF/DF) 시스템을 이용하여 용액의 이온강도를 1 mS/cm 미만으로 조정하는 단계이다. 해당 시스템을 사용하여 용액을 2차로 농축/투석함으로써, 용액에 포함된 염성분을 1 mS/cm 미만으로 제거하며 이후 진행되는 용매/세제 첨가, 역상크로마토그래피, 나노필터여과에 적합한 상태로 유지한다. 세부내용은 상기 (b) 단계와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계 이후에, (f) 상기 (e) 단계에서 수득한 용액에 용매/세제를 처리하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 (f) 단계는 면역글로불린이 포함된 용액의 잠재적 지질 외피 바이러스(lipid enveloped virus) 등의 바이러스를 불활성시키고, 불활성화 이후, 불활성화를 위해 사용된 물질을 제거하기 위한 단계로서, 바이러스-비활성화제, 바람직하게는 용매 및/또는 세제, 가장 바람직하게는 용매/세제 혼합물을 이용한 용매 및 세제 처리(Solvent ＆ Detergent Treatment)가 이용될 수 있다.
상기 (f) 단계를 통해 HIV1 및 HIV2, 간염 타입 C 및 non A-B-C, HTLV1 및 2, 헤르페스 바이러스군, CMV 및 엡스타인 바이러스 등의 잠재적 지질외피바이러스들이 불활성화되어, 최종 제품의 안전성이 제고될 수 있다.
본 발명에서 상기 "용매(solvent)"는 하나 이상 다른 물질을 용해 또는 분산시킬 수 있는 임의의 액체 물질을 포함한다. 용매는 물과 같이 자연상태에서 무기물일 수 있거나, 또는 에탄올, 아세톤, 메틸 아세트산염, 에틸 아세트산염, 헥산, 가솔린 에테르, 등과 같은 유기 액체일 수도 있다. "용매세제 처리"에 이용되었을 때, 용매는 유기 용매(가령, 트리-N-부틸 인산염)를 나타내며, 이는 용액 안에 지질에 에워싸인 바이러스를 비활성화시키는데 이용되는 용매 세제 혼합물의 일부다.
본 발명에서 상기 "세제(detergent)"는 "계면활성제" 또는 "표면 활성화제"로 불리기도 한다. 계면활성제는 전형적으로 소수성 기("꼬리")와 친수성 기("머리")를 가지고 있어, 유기 용매와 물 모두에서 계면활성제를 가용성으로 만드는 양쪽성인 유기 화합물이다. 계면활성제는 머리에 하전된 기의 존재에 근거하여 분류할 수 있다. 비-이온성 계면활성제는 이의 머리 부분에 하전된 기들이 없으며, 반면 이온성 계면활성제는 이의 머리기에 순전하(net charge)를 가진다. 쌍성이온(zwitterionic) 계면활성제는 두 개의 상반되는 하전된 기를 가진 머리를 포함한다. 통상적인 계면활성제의 일부 예들은 다음을 포함한다: 음이온성(설페이트, 설포네이트 또는 카르복실레이트 음이온 근거): 퍼플로오르옥타노에이트 (PFOA 또는 PFO), 퍼플로오로옥탄설포네이트 (PFOS), 도데실 설페이트 나트륨(SDS), 라우릴 설페이트 암모늄, 그리고 기타 알킬 설페이트 염, 라우레(laureth) 설페이트 나트륨(라우릴 에테르 설페이트 나트륨, 또는 SLES로 알려짐), 알킬 벤젠 설포네이트; 양이온 (4가 암모늄 양이온 근거): 세틸 트리메틸암모니움 브롬화물 (CTAB) a.k.a. 헥사데실 트리메틸 암모니움 브롬화물, 그리고 기타 알킬트리메틸암모니움 염, 세틸피리디니움 염화물 (CPC), 폴리에톡실화된 우지(tallow) 아민(POEA), 벤잘코니움 염화물 (BAC), 벤조토니움 염화물 (BZT); 장쇄 지방산 및 이의 염: 카프릴레이트(카프릴산), 카프릴산(카프릴산), 헵타노에이트(heptanoat), 헥사논산(hexanoic acid), 헵타논산(heptanoic acid), 나논산(nanoic acid), 데카논산(decanoic acid) 및 이와 유사한 것들을 포함; 쌍성이온(양쪽성): 도데실 베타인; 코카미도프로필 베타인(cocamidopropyl betaine); 코코 암포 글리시네이트(coco ampho glycinate); 비이온성: 알킬 폴리(에틸렌 옥시드), 알킬페놀 폴리(에틸렌 옥시드), 폴리(에틸렌 옥시드)와 포릴(프로필렌 옥시드)의 코폴리머(Poloxamers 또는 Poloxamines로 상업적으로 알려짐), 옥틸 글루코시드를 포함한 알킬 폴리글루코시드, 데실 말토시드, 지방 알코올 (가령, 세틸 알코올 및올레일 알코올), 코카미드 MEA, 코카미드 DEA, 폴리소르베이트(Tween 20, Tween 80, 등), 트리톤 세제, 및 도데실 디메틸아민 옥시드.
본 발명의 일 양태에서, 상기 (f) 단계에서 사용될 수 있는 용매 및 세제는 바이러스, 특히 지질 외피 바이러스를 불활성화시킬 수 있는 특성을 가진 것이라면 어느 것이나 제한없이 사용 가능하다. 세제는 비이온성 및 이온성 세제로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 실질적으로 비변성인 것이 바람직하다. 특히, 제거의 용이성 측면에서, 비이온성 세제가 바람직하며, 용매는 미국등록특허 제4,764,369 호에 개시된 바와 같이 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP : Tri-n-butyl phosphate)이 가장 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명을 수행하는 데 특히 바람직한 바이러스-비활성화제는 TNBP 및 폴리소르베이트 80(트윈(Tween) 80), 트리톤 X-100 및 트리톤 X-45 중에서 선택되는 하나 이상인 것의 혼합물이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직한 용매/세제 혼합물은 면역글로불린 함유 용액 중 용매 농도가 1 내지 6 중량%, 바람직하게는 1 내지 5 중량%가 되도록 첨가되며, 세제의 농도는 0.1 내지 3 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 2 중량%의 농도가 되도록 첨가될 수 있다.
또한, 상기 (f) 단계에서 용매/세제의 처리는 pH 4.0 ~ 6.0의 조건으로 5 시간 이상, 더 바람직하게는 pH 4.0 ~ 5.5의 조건으로 6시간 이상 처리될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (f) 단계 이후에, (g) 상기 (f) 단계의 용액에 포함된 용매 및 세제를 역상 크로마토그래피를 사용하여 제거하는 단계가 추가로 수행될 수 있다. 상기 (f) 단계의 용액을 역상 크로마토그래피 컬럼 볼륨 대비 5 내지 10 배의 양으로 50 ~ 200 cm/hr 조건으로 로딩하여 용매 및 세제를 제거할 수 있다.
본 발명에 사용된 역상 크로마토그래피는 담체에 탄화수소(C18)를 결합시켜 비극성 충진물로 만든 C18 resin을 사용하나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업계에 공지된 역상 수지를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (g) 단계 이후에, (h) 나노필터를 사용하여 잠재적인 바이러스 오염 리스크를 제거하는 여과 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 나노필터여과는 용액의 pH를 4.0 내지 4.5로 조절하며 2.0 내지 3.0 bar 압력 조건에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 각 단계를 마친 후 안정화제를 첨가하여 정맥주사용 면역글로불린을 제조하는 단계가 추가로 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 추가 첨가되는 안정화제는 슈가 알콜, 말토스, 소르비톨, 만노스, 글루코스, 트레할로스, 알부민, 리신, 글리신 PEG 및 Tween 80으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 말토즈 또는 글리신이 사용될 수 있다.
상기 안정화제는 9 내지 11%(w/w) 또는 200 내지 300mM이 되도록 첨가될 수 있으며, 안정화제를 첨가한 후, pH를 4.5 내지 5.5로 조절하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 pH가 4.7 내지 4.9가 되도록 산, 바람직하게는 황산 또는 염산을 첨가함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 상기 방법은 감마 글로불린을 혈장 1L 당 5 g 이상의 수율로 정제하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법에 따라 정제된 혈장 유래 면역글로불린은 순도 99%(w/w) 이상, 면역글로불린 중합물 1%(w/w) 이하, FXIa 함량 0.5mIU/mL 이하, IgA 60 μg/mL 이하인 것을 특징으로 할 수 있다.
이상의 본 발명은 FXIa를 제거함에 있어 카프릴산 침전과 헤파린 크로마토그래피 공정을 통한 이중 제거 공정을 통해, FXIa를 최종 0.5mIU/mL 이하 수준으로 제거하여 면역글로불린의 안전성을 극대화하였다.
또한 본 발명에 있어서, 상기의 고순도 면역글로불린 정제의 핵심인 크로마토그래피 공정 (음이온교환 크로마토그래피, 헤파린 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피)의 배열을 모두 불순물을 흡착시키고 면역글로불린을 비흡착시키는 방식으로 개발하였다. 면역글로불린을 비흡착시키는 크로마토그래피 공정은 면역글로불린을 흡착 및 용출시키는 크로마토그래피 공정과 비교하여 높은 수율을 나타내며, 상기의 크로마토그래피를 모두 면역글로불린 비흡착 공정으로 설계함으로써 전체 공정 수율을 극대화하였다.
본 발명에 따른 면역글로불린 정제방법은 혈장 유래 면역글로불린 조성물로부터 항보체 활성에 영향을 주는 면역글로불린 중합물 (polymer), 선천적인 IgA 결핍환자에게 과민증 반응을 유도하는 IgA 및 혈전색전을 유발할 수 있는 세린 프로테아제, 특히 FXIa등 불순물을 제거하는데 효율적이며, 고순도의 면역글로불린을 제공할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 면역글로불린 정제 과정의 흐름을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따른 면역글로불린 정제 과정별 혈장 유래 면역글로불린 조성물 내 감마 글로불린의 순도를 전기영동으로 평가한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 고수율 및 고순도 immunoglobulin 정제
전체 정제 공정흐름도는 도 1 과 같다.
Cohn fractionation 기법을 통해 수득된 fraction I+II+III paste 또는 fraction II+III paste를 주사용수에 1 : 5 (paste : 주사용수)의 비율로 용해하였다. 이 때, 1M acetic acid를 사용하여 pH를 4.1로 조정하였다. 용해 완료 후, 용해액에 최종 농도가 30mM이 되도록 카프릴산을 첨가하고, pH 5.0으로 조정하여 침전하였다. 발생한 침전물은 depth filter를 사용하여 여과하였으며 투입된 Cohn fraction I+II+III paste 또는 fraction II+III paste의 5 배 volume으로 post-wash 하였다.
확보된 공정액은 UF/DF 공정을 통해 sodium acetate buffer로 치환하였다. 이 때 공정액의 9 배 volume 이상으로 semi-continuous diafiltration 하여 잔존하는 카프릴산을 제거하고 투석을 통해 전도도를 8 mS/cm이하로 조정하였다. 회수한 공정액의 pH를 pH 5.7 ~ 6.0로 조정한 후, Fractogel EMD TMAE resin이 packing된 chromatography에 110 cm/hr의 선속도로 loading 하였으며, flow-through mode로 공정액을 회수하였다(음이온교환 크로마토그래피, anion exchange chromatography).
이 후, heparin sepharose resin이 packing된 chromatography에 150 cm/hr의 선속도로 loading하였으며, flow-through mode로 공정액을 회수하였다(헤파린 친화성 크로마토그래피, heparin affinity chromatography). 회수한 공정액은 pH 4.0 ~ 4.5로 조정하였다.
공정액에 잔류한 염을 제거하기 위해 UF/DF을 수행하였으며, 주사용수를 사용하여 permeate의 전도도가 1 mS/cm 미만이 될 때까지 diafiltration을 진행하였다. 회수한 공정액에 TNBP 3%, triton X-100 1%가 되도록 solvent/detergent(S/D)를 첨가하여 바이러스 불활화하였다. 이 후, 공정액을 C18 resin이 packing된 chromatography (역상 크로마토그래피, reverse phase chromatography)에 70 cm/hr의 유속으로 loading하였으며, flow-through mode로 공정액을 회수하였다.
상기의 공정액을 0.1 μm pore size의 필터를 사용하여 pre-filtration 한 후, 20nm pore size의 nano-filter를 사용하여 nano-filtration하였다(바이러스 등 제거). 필터 완료액은 각기 10 % maltose 또는 250 mM glycine을 첨가하여 formulation 하였다.
실시예 2. 실험 결과
각 공정별로 sampling하여 SDS-PAGE 분석을 진행한 결과는 도 2와 같다. 그 결과 immunoglobulin (heavy chain 50 kDa, light chain 25 kDa)을 제외한 대부분의 불순물이 카프릴산 침전 공정과 음이온교환 크로마토그래피 공정을 통해 제거됨을 확인할 수 있다.
각 공정별로 sampling 하여 gamma-globulin, 즉 면역글로불린의 순도와 FXIa 함량, IgA 함량, 중합물 함량 및 수율에 대해 분석한 결과는 표 1과 같다.
그 결과, 면역글로불린의 순도는 카프릴산 침전 공정과 음이온교환 크로마토그래피 공정을 통해 99 % 이상으로 증가함을 확인할 수 있었으며 대부분의 IgA와 면역글로불린 중합물 (polymer)이 제거됨을 확인할 수 있다. 해당 결과는 도 2의 SDS-PAGE 분석결과와 일치하였다. FXIa의 경우, 카프릴산 침전 공정 및 헤파린 크로마토그래피를 통해 0.5 mIU/mL 이하까지 제거됨을 확인하였다.
면역글로불린 수율의 경우, 전도도 8 mS/cm 이하를 유지하며 음이온 교환 크로마토그래피, 헤파린 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피를 진행하였다. 모든 크로마토그래피 공정을 불순물을 흡착시키고 면역글로불린을 비흡착시키는 방식으로 진행함으로써 각 공정 단계별 95 % 이상의 높은 수율을 확인하였으며, 면역글로불린을 혈장 1 L당 5 g 이상의 높은 수율로 정제할 수 있었다.
본 발명에 따른 면역글로불린 정제방법은 혈장 유래 면역글로불린 조성물로부터 혈전색전을 유발할 수 있는 세린 프로테아제, 특히 FXIa을 비롯하여 면역글로불린 중합물 (polymer), IgA 등 불순물을 제거하는데 효율적이며, 고수율 및 고순도의 면역글로불린을 제공할 수 있는 효과가 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
Claims (18)
- 다음 단계를 포함하는 혈장 유래 면역글로불린의 정제방법:(a) Chon 분획 I+II+III 또는 II+III 를 용해한 용액에 침전제를 첨가하여 침전반응을 수행하는 단계;(b) 상기 (a) 단계의 침전 상층액으로 농축/투석을 진행하여 전도도를 8 mS/cm 이하로 조정하는 단계;(c) 상기 (b) 단계의 용액으로 음이온교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및(d) 상기 (c) 단계에서 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획으로 헤파린 크로마토그래피를 수행하는 단계.
- 제1항에 있어서, 상기 침전제가 카프릴산(caprylic acid)인 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상게 (a) 단계에서 침전반응은 침전제가 10 내지 50mM이 되도록 첨가한 후, pH가 4.0 내지 6.0이 되도록 조절하여 수행되는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계 이후에 침전 상층액을 필터로 여과하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 침전 상층액을 한외여과/투석여과(ultrafiltration/diafiltration: UF/DF) 시스템을 이용하여 침전제를 제거하고, 전도도를 8 mS/cm 이하로 유지하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c)의 음이온교환 크로마토그래피는 용액의 pH 5.0 내지 6.5, 전도도 8 mS/cm 이하의 조건에서 컬럼의 비흡착 용액을 수득하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기의 (d) 단계의 헤파린 크로마토그래피는 (c)단계에서 수득한 용액을 pH 5.0 내지 6.5, 전도도가 8 mS/cm 이하의 조건에서 컬럼 비흡착 용액을 수득하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제1항에 있어서, (e) 상기 (d) 단계에서 헤파린 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획에 한외여과/투석여과(ultrafiltration/diafiltration: UF/DF) 시스템을 이용하여 용액에 함유된 염을 제거하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제8항에 있어서, (f) 상기 (e) 단계에서 수득한 용액에 용매/세제를 처리하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제9항에 있어서, 상기 용매는 트리(엔-부틸)-포스페이트 (TNBP, Tri-n-butyl phosphate)인 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제9항에 있어서, 상기 세제는 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-100 및 트리톤 X-45로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제9항에 있어서, (g) 상기 (f) 단계 이후에 용액에 첨가된 용매/세제를 역상크로마토그래피를 사용하여 제거하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제12항에 있어서, (h) 상기 (g) 단계 이후, 나노필터를 사용하여 잠재적인 바이러스 오염 리스크를 제거하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제13항에 있어서, (i) 상기 (h) 단계 이후, 안정화제를 첨가하여 제제화하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
- 제14항에 있어서, 상기 안정화제는 슈가 알콜, 말토스, 소르비톨, 만노스, 글루코스, 트레할로스, 알부민, 리신, 글리신, PEG 및 Tween 80으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제14항에 있어서, 상기 안정화제는 9 내지 11%(w/w) 말토즈 또는 200 내지 300mM 글리신이 되도록 첨가되는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 감마 글로불린을 혈장 1L 당 5 g 이상의 수율로 정제하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법에 따라 정제된 혈장 유래 면역글로불린은 순도 99%(w/w) 이상, 면역글로불린 중합물 1%(w/w) 이하, FXIa 함량 0.5mIU/mL 이하, IgA 60 μg/mL 이하인 것을 특징으로 하는 정제방법.
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