NO178882B - Fremgangsmåte for separasjon av vitamin K-avhengige blodkoagulerende faktorer - Google Patents
Fremgangsmåte for separasjon av vitamin K-avhengige blodkoagulerende faktorer Download PDFInfo
- Publication number
- NO178882B NO178882B NO902757A NO902757A NO178882B NO 178882 B NO178882 B NO 178882B NO 902757 A NO902757 A NO 902757A NO 902757 A NO902757 A NO 902757A NO 178882 B NO178882 B NO 178882B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- factor
- factors
- protein
- activity
- buffer
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims description 6
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 title description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 title 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 title 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 title 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 title 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 title 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims abstract description 36
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 32
- 229940024790 prothrombin complex concentrate Drugs 0.000 claims abstract description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims abstract description 18
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 claims abstract description 17
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 claims abstract description 17
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 16
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 16
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 126
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 83
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 79
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 79
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 63
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 claims description 59
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims description 58
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 47
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 38
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 33
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 33
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 claims description 32
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 claims description 32
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 claims description 31
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 claims description 31
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 claims description 30
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 30
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims description 29
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims description 29
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 28
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 22
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 20
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 claims description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 15
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 15
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 15
- 108010093564 inter-alpha-inhibitor Proteins 0.000 claims description 13
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 13
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 8
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 8
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical group OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 4
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 abstract description 49
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 50
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 50
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 44
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 30
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 28
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 20
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 19
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 8
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 8
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 8
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 8
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 7
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 4
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 4
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 3
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 3
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 2
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 108010012557 prothrombin complex concentrates Proteins 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 230000003253 viricidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000012873 virucide Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010029144 Factor IIa Proteins 0.000 description 1
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010001953 Protein C Inhibitor Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 1
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 201000005665 thrombophilia Diseases 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for i
det minste en delvis separasjon av vitamin K-avhengige blodkoagulerende faktorer fra en blanding som inneholder minst én slik faktor.
Plasma fra humant eller animalsk blod inneholder en
rekke verdifulle fysiologisk aktive forbindelser, da spesielt forskjellige blodkoagulerende faktorer, og enkelte av disse brukes i medisinen for behandling av pasienter som mangler én eller flere av disse forbindelsene. De blodkoagulerende faktorene, dvs. forbindelser som hører til den såkalte blodkoagulerende kaskade, innbefatter en gruppe inaktive og aktive proteolytiske enzymer og modifiserte proteiner som står i forhold til hverandre på følgende måte:
Vedhenget "a" betyr at enzymet er i den aktiverte
formen.
Andre viktige plasmaproteiner som også kan klassifiseres som blodkoagulerende faktorer, innbefatter protein C og protein S. Protein C er et inaktivt zymogen av det proteolytiske enzymet aktivert protein C (APC,PCa) . I motsetning til de overnevnte koagulerende faktorer, har APC en antikoagu-lerende effekt som virker gjennom proteolysen av faktor V og faktor VIII som således blir inaktivert. Aktiveringen av protein C synes a være en tilbakemeldingsprosess som innbefatter trombin og et endotelisk bundet protein, dvs. trombomodulin, som begge virker under koaguleringsprosessen. Aktiviteten av APC blir derved bedret i nærvær av protein C, som synes å virke som en kofaktor.
En rekke av de ovennevnte faktorene, nemlig II, VII, IX, X og dessuten protein C og protein S har vist seg å være vitamin K-avhengig. Disse faktorene, både i den aktive og inaktive formen (bortsatt fra den aktiverte faktor II), bærer terminale gamma-karboksyglutaminsyrerester som er blitt innført via en enzymatisk prosess som styres ved hjelp av vitamin K. Videre har det vist seg at protein C, protein S og faktorer X og IX, men ikke protrombin (faktor II) inneholder en modifisert aspartinsyrerest, nemlig JS-hydroksyaspartin-syrerest.
De vitamin K-avhengige blodkoagulerende faktorer representerer således en gruppe nærstående sure proteiner som har meget like fysiokjemiske egenskaper. Disse forbindelsers sure egenskaper har gjort at de tidligere har vært isolert som en gruppe på grunn av deres strukturelle og kjemiske likhet, og det har vært vanskelig å skille' de individuelle proteiner ved hjelp av vanlig kjent teknikk, såsom anionbytter-kromatografi.
Bortsett fra faktor VIII, som ikke er en del av protrombinkomplekset, har den mest vanlige tilførte blodkoagulerende faktoren vært faktor IX. Tradisjonelt har denne faktoren vært tilført som et konsentrat av alle faktorene i protrombinkomplekset, dvs. II, VII, IX og X, skjønt faktor VII har enkelte ganger vært tilført separat fra IX, II og X.
Etter infusjon av slike faktor IX-konsentrater har det vært et par rapporterte tilfeller av venetrombose og spredt intravaskulær koagulering (DIC). Disse uønskete reaksjonene kan antakelig tilskrives en hyperkoagulerbar tilstand som utvikles på grunn av det høye innhold av unødvendige koagulerende faktorer som tilføres sammen med faktor IX og/eller på grunn av uønskete trombogeniske komponenter i konsentratet. Intens og langvarig tilførsel av faktor IX kan føre til langt høyere nivå enn det som er normalt for faktor II, som infuseres i like store mengder og som har en lenger halv-forsvinningstid i plasma. Enkelte hypoteser basert på in vitro-undersøkelser eller dyremodeller har også antydet at en kombinasjon av faktorer kan være mer trombogeniske enn faktor IX alene. Ofte ville i virkeligheten de anvendte dosenivåer av faktor IX tildels være begrenset på grunn av at man må unngå for høy konsentrasjon av faktor II.
Videre har det vist seg at etter behandling med faktor VIII-konsentrater har enkelte hemofile A-pasienter vist tegn til ikke-viral immunoundertrykning. En liknende immunoundertrykning i hemofili B-pasienter etter behandling med faktor IX-konsentrat antyder at reaksjonen i begge tilfeller kan skyldes en uønsket forurensning i konsentratene.
Større plasmamengder som er gitt av blodgivere og fra hvilken de blodkoagulerende konsentrater blir fremstilt, kan inneholde årsaksfaktoren (antakelig virus) til ikke-A og ikke-B hepatit, og det vil dessuten være en viss risiko for forurensning av andre virus (f.eks. hepatit B og HIV). For å bedre produktsikkerheten på konsentratene underkastes de omfattende virucide behandlinger, noe som kan bli komplisert ved nærvær av forurensende proteiner. Denne viricid-behand-lingen vil være lettere å kunne utforme og derved få fremstilt et mer renset konsentrat, hvis man med minimale anstrengelser kan nedsette mengden av uønskete proteiner.
Generelt er det foretrukket å tilføre en blodkoagulerende faktor som skal erstatte eller supplere en spesifikk koagulerende faktor i en human pasient uten at man sam-tidig hever konsentrasjonen av andre faktorer, eller eventuelle forurensninger som ville kunne gi uønskete fysiologiske effekter.
Det er således behov for en forbedret fremgangsmåte som i det minste delvis skiller de vitamin K-avhengige koagulerende faktorer for derved å kunne redusere eller endog eliminere noen av de ovennevnte problemer. Man har da funnet at de vitamin K-avhengige blodkoagulerende faktorer i det minste delvis kan skilles fra hverandre ved hjelp av såkalt metallchelatkromatografi.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte for i det minste delvis å skille de vitamin K-avhengige blodkoagulerende faktorer fra en blanding som inneholder minst én slik faktor, karakterisert ved at nevnte blanding absorberes til et chelat av et divalent metall som er immobilisert på et inert underlag, idet nevnte blanding adsorberes på et chelat av et divalent metall immobilisert på et inert underlag, idet chelatiseringsgruppen eventuelt er bundet til underlaget gjennom en avstandsdannende gruppe, hvoretter det foretas en eluering som gir én eller flere fraksjoner anriket med hensyn til én av de nevnte faktorer.
Vanligvis vil nevnte blanding inneholde minst to vitamin K-avhengige blodkoagulerende faktorer. Skjønt foreliggende oppfinnelse således innbefatter rensning eller anrikning av helfunksjonaliserte koagulerende faktorer som stammer fra mikrobiologiske kulturer hvor man bruker rekombinant DNA-teknologi, vil kilden for fremstilling av de koagulerende faktorer vanligvis være et blodplasma, spesielt humant plasma.
Blandingen av faktorer som skal behandles ved hjelp av foreliggende oppfinnelse vil vanligvis være et plasma-fraksjonskonsentrat fra hvilket enkelte plasmafaktorer allerede er blitt fjernet.
Når man fremstiller de blandete faktorer fra plasma, så vil de typiske første fraksjonene som inneholder de forønskete komponenter innbefatte kryoutfelnings-supernatanten (supernatanten som blir igjen etter kryoutfeiningen av faktor VIII-konsentratet), fraksjon I supernatant og fraksjoner oppnådd etter adsorpsjon av plasmaet med forskjellige affinitets-reagenser, f.eks. heparin Sepharose. Vanligvis vil faktorene bli ytterligere konsentrert ved adsorpsjon til en anionbytter-harpiks såsom dietylaminoetyl (DEAE) cellulose, DEAE Sephadex eller DEAE Sepharose, hvorved man får fremstilt et protrombinkomplekskonsentrat.
Det skal bemerkes at under optimale betingelser med hensyn til faktor IX-fremstilling, så vil DEAE-cellulosen ikke binde faktor VII, skjønt høykapasitets ioneutbyttere (f.eks. DEAE Sephadex og DEAE Sepharose) vil binde faktor VII mer effektivt under aksepterte industrielle prosessbetingelser. Således vil protrombinkomplekskonsentratet fra DEAE-cellulose ikke inneholde faktor VII. Denne forskjellen med hensyn til adsorpsjon gjør det mulig å oppnå et konsentrat som hoved-sakelig inneholder faktor VII, skjønt dette kan også være resultatet av foreliggende rensnings- og anrikningsmetode. Skjønt anionbytterharpikskonsentrater med fordel kan behandles ifølge foreliggende oppfinnelse, kan andre kombinasjoner av faktorene også med fordel behandles for å anrike konsentrasjonen av en ønsket faktor. Mer spesielt kan det angis at en anriket fraksjon fremstilt ved hjelp av foreliggende oppfinnelse og som kan inneholde bare to av faktorene, kan videre underkastes en annen behandling for derved å få en ytterligere anrikning av én av de to faktorene.
Eksisterende rensningssystemer har flere ulemper. Heparin-Sepharose gir dårlig oppløsning og koagulerings-faktoraktivitet når den brukes i industriell skala. Sulfatert dekstran gir faktor IX med et meget kort NAPTT (se nedenfor) som kan føre til trombotiske episoder under klinisk bruk, og dekstransulfat er cytotoksisk og enhver lekkasje fra en slik affinitetsmatrise fører til en alvorlig forurensning av produktet. Foreliggende fremgangsmåte har fordeler fremfor alle slike rensningssystemer.
Skjønt man kan oppnå visse fordeler ved en porsjonsvis behandling av den første blandingen med det immobiliserte metallchelatet, fulgt av en enkel vasking for å fjerne de lettest eluerbare faktorer, så vil den mest foretrukne fremgangsmåten være en kolonnekromatografisk behandling. Blandingen av faktorer kan således påsettes toppen av kolonnen, og et elueringsmiddel føres gjennom kolonnen, hvorved man får tilveiebragt fraksjoner som inneholder de utskilte og delvis rensete faktorer. Alternativt kan den første blandingen påsettes porsjonsvis til det immobiliserte metallchelatet før dette påsettes kolonnen.
Cu<2+> er et spesielt foretrukket chelatert polyvalent metall.
Det immobiliserte chelateringsmiddelet kan innbefatte et vanlig kjent bærer (såsom en bærer basert på cellulose, poly-styren, akrylamid, silisiumdioksyd, fluorkarboner, tverrbundet dekstran eller tverrbundet agarose) som har grupper som er istand til å chelatere polyvalente metaller. Slike grupper er velkjente og kan finnes i tekstbøker såsom Martell og Calvin, Chemistry of the Metal Chelat Compounds, Prentice Hall, Inc. New York (1952) .
Iminodieddiksyregrupper, -N(CH2COOH) 2, er spesielt foretrukne chelateringsgrupper.
Chelateringsgruppene vil vanligvis befinne seg i en viss avstand fra hverandre langs kjedene eller skjelettet i underlaget, noe som oppnås ved hjelp av lineære avstandsdannende grupper som eventuelt kan være substituerte hydrokarbon- eller karbohydratkjeder, fortrinnsvis med 8-16 karbonatomer, f.eks. ca. 12 karbonatomer, mellom den chelaterende gruppen og underlaget. Slike avstandsdannende grupper kan innføres i passende substrater ved en reaksjon med en divalent reagens med forønsket kjedelengde. Den foretrukne metallbindende matrisen er Chelating Sepharose som er et 6% agaroseprodukt som selges i perleform av Pharmacia AB og som bærer iminodieddiksyregrupper, bundet til sepharosen via følgende kjede:
Binding av proteiner til det chelaterende underlaget er avhengig av minst fire faktorer: (i) ionestyrke, hvor en økende ionestyrke minimaliserer ikke-spesifikk binding; (ii) nærvær av bufferioner både i den prøve som påsettes kolonnen og i den ekvilibrerte metall-chelatgelen; (iii) matrisens absorbsjonskapasitet, dette er en begrenset faktor idet man kan fullmette matrisen ved tettere bundete proteiner på bekostning av svakere binding av samme proteiner. Matrisens kapasitet for et spesielt protein er således avhengig av sammensetning og konsentrasjon på protein-blandingen som den kommer i kontakt med under påsetningen og kontakttiden for selve absorbsjonstiden; (iv) pH som er en viktig faktor både ved binding og eluering.
Man har funnet at ved relativt høye ionestyrker så vil bindingen til chelatet av protrombin (faktor II) og trombin bli redusert, mens den øker for faktorene IX og X samt protein C. Ettersom det vanligvis er ønskelig å redusere protrombin-konsentrasjonen i konsentrater av andre blodkoagulerende faktorer, for derved å unngå en mulighet for trombindannelse, er denne oppdagelsen meget verdifull. Det er således foretrukket å påsette metallchelatet i en vandig oppløsning med relativt høy ionestyrke, f.eks. med fra 0,4 til 1,0 M, fortrinnsvis 0,4 til 0,6 M, mest foretrukket ca. 0,5 M natrium-klorid og/eller én eller flere andre elektrolytter som gir en oppløsning med tilsvarende ionestyrke.
De forskjellige vitamin K-avhengige koagulerings-faktorene har forskjellige pH-optima for binding til den chelaterende gelen, og ved følgelig å velge en passende pH for den innløpende bufferoppløsningen, gis ytterligere muligheter for å fremme en preferensiell binding til den chelaterende gelen av én eller flere av de vitamin K-avhengige koagulasjonsfaktorer i forhold til andre faktorer. Hvis man f .eks. har en Cu<2+->primet chelaterende sefarose, så vil den optimale binding for faktorene II, IX og X skje henholdsvis ved en pH mellom 6,0 og 7,0, over pH 7,0 og mellom pH 6,5-7,5. Hvis man følgelig vil bedre den differensielle bindingen av faktor IX til en slik gel i forhold til protrombin, så vil man følgelig anvende en pH som er 7,0 eller høyere.
Når det videre er ønskelig å fjerne protrombin fra én eller flere andre vitamin K-avhengige koagulerende faktorer, så vil nedsatt binding av protrombin i forhold til de andre blodkoagulerende faktorene, f.eks. faktor IX, kunne fremmes ved et passende valg av adsorpsjonskontakttid og konsentrasjon av proteiner. For således å få en optimal separasjon av faktor IX fra faktor II på Cu<2+->primet chelaterende sefarose, vil man, når man starter med en protrombinkomplekskonsentrat, ha en
adsorpsjonskontakttid som fortrinnsvis bør være over 20 minutter, særlig over 40 minutter eller lenger, og påsetnings-
konsentrasjonen bør fortrinnsvis være slik at konsentrasjonen av faktor IX er fra 250-450 -faktor IX:Ag-enheter pr. ml gel.
Kolonnekromatografi er foretrukket. Den første blandingen av faktorer blir fortrinnsvis påsatt toppen av kolonnen, men det er også mulig porsjonsvis å tilsette den første blandingen til det immobiliserte chelatet. Etter vasking, vanligvis ved relativt høy ionestyrke, kan de gjenværende faktorer skilles enten ved porsjonsvis eluering eller ved å overføre gelen til en kolonne for kromatografisk eluering.
Påsetningen på kolonnen følges fortrinnsvis direkte av en vasking med en vandig oppløsning av samme eller relativt lik ionestyrke og pH for å fjerne protrombin og eventuelt trombin som måtte være tilstede. Det er fordelaktig at et surt pH-vaskingstrinn ytterligere utføres for å fjerne en inter-a-trypsininhibitor fra den chelaterende gelen. Dette proteinet er vanligvis en meget uønsket forurensning i faktor IX-konsentrater fremstilt ved tidligere kjente fremgangsmåter, og utgjorde ofte opptil 30% av det totale proteininnholdet. Man har imidlertid funnet at inter-a-trypsininhibitoren kan elueres fra Cu<2+->primet chelaterende sefarose ved en pH mellom 4,5 og 5,5 uten særlig synlige tap av faktor IX fra gelen. For å redusere elektrolyttkonsentrasjonen i det endelige produktet, er det også hensiktsmessig å innbefatte minst et slutt-vasketrinn ved lav ionestyrke, f.eks. ekvivalent til 100-200 mM NaCl.
Denne vaskingen gjør det mulig å fjerne noen av de til-stedeværende virus ved ytterligere vasking mens proteinet er immobilisert. Videre kan de immobiliserte faktorer behandles med virucid, såsom et vaskemiddel eller lignende, og dette kan så igjen fjernes ved ytterligere vasking før selve elueringen. Det skal bemerkes at metallchelatmaterialet meget lett binder proteinfaktorene av interesse i nærvær av vaskemidler og/eller de oppløsningsmidler som brukes som virucider før den første adsorpsjonen ifølge foreliggende oppfinnelse, og kan beholde disse faktorer når virucidet fjernes ved vasking, eller når en virucid vaskemiddelløsning påføres før elueringen av faktorene. Dette står i motsetning til mange tidligere affinitetskolonner, hvor man brukte å adsorbere slike proteiner, og hvor nevnte vaskemidler hadde en tendens til å påvirke elueringen av proteinene.
De blodkoagulerende faktorer som blir igjen på kolonnen etter fjerning av faktor II, eller når slike faktorer påsettes kolonnen i et i alt vesentlig fravær av faktor II, kan elueres ved en forandring av pH og/eller ved å bruke et utskiftnings-middel valgt fra gruppen bestående av imidazol og aminosyrer, fortrinnsvis ved en betydelig lavere ionestyrke enn den påsatte bufferoppløsningen for derved å redusere eller å unngå behovet for å fjerne salter fra de resulterende anrikete fraksjoner. Egnete foretrukne ionestyrker for en slik eluering ligger i området fra 100-200 mM.
Når elueringen av de ønskete blodkoagulerende faktorer er avhengig av en pH-gradient, kan dette være en økende eller en avtagende pH-gradient, og i hvert tilfelle kan det være ønskelig å fjerne en inter-a-trypsininhibitor fra den chelaterende gelen før man oppsamler en faktor IX-anriket fraksjon. Hvis man således bruker en økende pH-gradient for eluering, så er det innlysende at start-pH kan være så lav som fra 4,5-5,5 for å oppnå en fjerning av nevnte inter-or-trypsin-inhibitor, hvoretter man vanligvis vil foreta en vesentlig pH-økning for å eluere de forønskete blodkoagulerende faktorer. Spesielt har man f.eks. funnet at faktor IX- og faktor X-anrikte fraksjoner kan med hell elueres fra en Cu<2+->primet chelaterende sefarose i nærvær av en ikke-aminosyre eller imidazolholdig buffersystem med en relativt lav ionestyrke, dvs. ca. 100 mM NaCl, ved å variere pH lineært fra ca. pH 7,0 til ca. pH 8,0. I de tilfeller hvor man bruker en avtakende pH-gradient for å eluere f.eks. fra den samme type gel forskjellige blodkoagulerende faktorer eller et protrombinkomplekskonsentrat, vil man etter å ha vasket gelen ved en pH på over 7,0 med høy ionestyrke, f.eks. 500 mM NaCl, for derved å fjerne faktor II, utføre en eluering av faktor X- og faktor IX-anrikete fraksjoner som i alt vesentlig er frie for inter-ct-trypsin ved at man foretar elueringen ved relativt lav ionestyre, f.eks. med 100 mM NaCl, og trinnvis å senke pH på elueringsbufferen i det sure området ned til ca. pH 4,0. I dette tilfelle vil man få følgende rekkefølge med hensyn til proteineluering: Faktor X/faktor V (pH ca. 5-5,6) inter-a-trypsininhibitor/protein C (pH ca. 4,6) og faktor IX (pH ca. 4,1) .
Hvis det er ønskelig å fremstille renset eller anriket faktor II, kan det også være foretrukket å foreta elueringen fra en metallchelatkolonne ved lav ionestyrke i et fravær av aminosyrer.
Når man bruker et fortrengningsmiddel, er det foretrukket at konsentrasjonen av imidazol eller aminosyre (da spesielt glycin, metionin eller glutaminsyre) i eluerings-middelet ligger i området fra 5-70 mM. Egnete aminosyrer som kan brukes ved en slik eluering innbefatter f.eks. alanin, fenylalanin, valin, lysin, glycin, metionin og glutaminsyre. De siste tre nevnte aminosyrer er spesielt foretrukket for dette formål.
Et elueringsmiddel inneholdende et fortrengningsmiddel blir fortrinnsvis buffret til en pH fra 4 til 9, mest foretrukket fra 6 til 8, f.eks. ca. 7. Egnete buffersystemer innbefatter aminoalkoholbuffere såsom Tris og citrat-fosfatbuffer. Man har funnet at Tris gjør det mulig å eluere alle faktorene ved lave konsentrasjoner av fortrengnings-midler, f.eks. imidazol eller en aminosyre.
Uansett hvilket elueringsmiddelsystem man bruker, så synes det som om elueringsrekkefølgen som igjen reflekterer bindingsaffiniteten er faktor II/IIa, faktor X, faktor IX/IXa/protein C.
Vanligvis vil elueringen utføres slik at de eluerte protein-spesifikke aktiviteter (renhet og/eller styrke) blir optimalisert. Vanligvis vil konsentrasjonen av den prinsipp-ielle faktor som er av interesse, f.eks. faktor IX, fortrinnsvis være minst 30 iu/ml.
Etter elueringen kan oppløsningen frysetørkes. For å inaktivere virusinfeksjoner kan det frysetørkete konsentratet oppvarmes til f.eks. 8 0°C. Man har funnet at rensete konsentrater ifølge foreliggende oppfinnelse i alt vesentlig overlever slik oppvarming, og man unngår aktivering av respektive faktorer i større grad enn i tidligere konsentrater.
Ved å bruke fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse har det vært mulig for første gang å fremstille: (a) Faktor IX i alt vesentlig fri for faktor II og inter-a-trypsininhibitor; (b) protein C i alt vesentlig fri for faktorene II, IX og X; (c) faktor X i alt vesentlig fri for faktor II og med en spesifikk faktor X-aktivitet på minst 13 iu/mg protein; og (d) faktor VII i alt vesentlig fri for faktor II og med en spesifikk faktor VII-aktivitet på mer enn én enhet pr. mg protein.
Prøvemetoder
De rapporterte tilfeller av tromboser etter infusjon av tidligere kjente protrombinkomplekskonsentrater har resultert i at det er utviklet in vitro og in vivo tester av produkter med hensyn til deres mulige trombogene effekt. In vivo-testene har vært utført i dyr (kaniner, griser og hunder) ved å bruke forskjellige kriterier for å bedømme eventuelt trombose etter infusjon. In vitro-testene er basert på konsentratenes evne til å redusere koaguleringstiden for substratplasma eller fibrinogen. Man har ikke kunnet vise betydningen av disse prøver, men ikke desto mindre har de en viss betydning med hensyn til produktkvalitetskontrollen.
Det anvendes i alt vesentlig tre hovedtester:
NAPTT: Her måler man nivået av aktiverte koagulerende faktorer i prøven med en vilkårlig lavt satt koaguleringstid på 150 sekunder. NAPTT-prøven står ikke i et entydig forhold til konsentrasjonen av en spesiell aktivert koagulerende faktor, men indikerer nærvær av faktor IXa og faktor Xa.
FCT: Her måler man tiden det tar for en fibrinogen oppløsning å bli koagulert i nærvær av prøvematerialet. Dette er et direkte mål på trombinkonsentrasjon (det nest siste proteinet i den såkalte blodkoagulerende "kaskaden"). Den nedre koaguleringstiden er 3 timer, noe som tilsvarer 5 x IO"<3 >iu/ml eller 2 ng/ml trombin.
Tat 50: Her måler man den tiden det tar å utvikle en kjent mengde trombin. Testen er et mål på aktiveringen av de koagulerende faktorer som opptrer tidlig i prosessen.
De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.
Tester som brukes i eksemplene for kvantifisering av proteiner
Både funksjonell biologisk aktivitet og antigenisk aktivitet ble brukt for å kvantifisere de proteiner som var av interesse.
Biologisk aktivitet for faktorene II, IX og X ble målt ved etablerte og kjente koaguleringsprøver. Enheten med hensyn til koagulerende aktivitet (:C) ble definert ved å bruke en arbeidsstandard 87/532 som er kalibrert mot den 1. internasjonale standard med hensyn til faktorene II-, IX- og X-konsentratene, med kode 84/681.
Biologisk aktivitet for faktor VII ble målt ved en etablert koaguleringstest, eller ved hjelp av en kromogen test hvor man brukte et syntetisk substrat. I begge tilfeller ble enhetsspesifiseringen bedømt ved å bruke et såkalt in-house faktor VII-konsentrat som arbeidsstandard, og som var blitt kalibrert mot en human plasmamengde som var gitt av mer enn 30 pasienter og definert med en faktor VII-aktivitet på 1,0 F.VII:C u/ml.
Alle antigene aktiviteter (:Ag) for faktorene II, V, IX og X, protein C og inter-a-trypsininhibitor ble målt ved immunelektroforese (Laurell's Rocket-metoden) ved å bruke normal plasma som standard. I hvert tilfelle ble standarden gitt en styrke på 1,0 enhet pr. ml, og prøveaktivitetene ble uttrykt i forhold til plasmaekvivalenter pr. ml.
I den foreliggende beskrivelse er koagulerings-aktiviteten eller "faktor -:C" angitt i internasjonale enheter pr. ml eller iu/ml. Antigenaktiviteten eller "faktor -:Ag" er gitt som enheter pr. ml (u/ml) eller plasmaekvivalenter pr. ml (p.e.u/ml).
Ettersom koagulerings- og antigenaktivitetene er mål for forskjellige aspekter av proteinkjemien, er den internasjonale enheten med hensyn til koaguleringsaktivitet ikke den samme som en plasmaekvivalent enhet. Typisk vil forholdet iu : p.e.u. for faktor II, faktor IX og faktor X i delvis rensete proteinkonsentrater være henholdsvis 0,86, 0,6 og 0,63.
Eksempel 1
Fremstilling av protrombin fra protrombinkomplekskonsentrat
(PCC)
Chelaterende sefarose ble behandlet eller primet med kobberioner ved å' føre en kobbersulfatoppløsning gjennom sefa-rosekolonnen. Gelen ble så vasket med citrat-fosfatbuffer inneholdende 500 mM NaCl ved pH 7,0. PCC-holdig 500 mM NaCl ble påsatt kolonnen i en mengde på 100-200 faktor IX iu pr. ml gel. Proteineluatet ble kontinuerlig analysert, og gjennombruddsproteinet ble oppsamlet. Dette inneholdt protrombin i en styrke på 5-25 iu/ml med en spesifikk aktivitet på 5 iu/mg protein. Dette produktet inneholdt minst 70% protrombin.
Eksempel 2
Effekt av ionestyrke på binding av faktorene II, IX, X og protein C til kobber- chelatgelen
PCC ble dialysert mot en citrat-fosfatbuffer pH 7,0 inneholdende 100, 250, 500 eller 1000 mM NaCl. Bufferen ble så påsatt en Cu<2+->primet chelaterende sefarosekolonne som var vasket med samme ionestyrkebuffer. Etter påsetning av 43 0 enheter pr. ml gel ble kolonnen ytterligere vasket med samme buffer, og eluert ubundet protein ble analysert m.h.t. faktorene II, IX, X og protein C. Tabell I nedenfor viser resultatene.
Maksimal differensiell binding av faktor IX i forhold til faktor II ble observert ved 500 mM NaCl.
Eksempel 3
Effekt av adsorpsions- pH på binding av faktorene II. IX og X til kobberchelatgel
Chelaterende sefarose ble først behandlet eller primet med kobberioner og så vasket med citrat-fosfatbuffer inne-holdende 500 mM NaCl med pH justert til angitt nivå. PCC, inneholdende 500 mM NaCl ble titrert til samme pH og påsatt gelen i en mengde på 3 00 faktor IX-enheter pr. ml gel. Gelen ble så vasket med samme buffer og gjennombrudds/ubundet protein ble oppsamlet og målt med hensyn til innhold av faktorene II, IX og X. Tabell II viser resultatene.
Optimal binding av faktor II ble oppnådd ved pH 6,0-7,0. Optimal binding av faktor IX ble oppnådd ved pH 7,0.
Optimal binding av faktor X ble oppnådd mellom pH 6,5 og pH 7,5.
pH ved adsorpsjonen kan derfor brukes for å optimalisere bindingen av foretrukken koagulerende faktor til gelen.
Eksempel 4
Fremstilling av et konsentrat av faktor X ocr faktor IX med redusert protrombin
En chelaterende sefarosekolonne ble fremstilt og fyllt som beskrevet i eksempel 1. Etter påsetning av PCC ble kolonnen vasket med citrat-fosfatbuffer inneholdende 500 mM NaCl ved pH 7,0. Ionestyrken ble så redusert ved vasking med en citrat-fosfatbuffer inneholdende 100 mM NaCl. Faktor X-fraksjonen ble så eluert med citrat-fosfatbuffer inneholdende 100 mM NaCl og 5 mM glycin. Denne fraksjonen inneholdt faktor X i en mengde på fra 15-40 faktor X iu/ml og mindre enn 0,01 enheter protrombin pr. enhet faktor X. Den spesifikke aktiviteten for faktor X var 13 iu/mg protein og var derfor 7% ren. Denne fraksjonen inneholdt også faktor IX i omtrent ekvimolare mengder (1 iu faktor IX pr. enhet faktor X).
Eksempel 5
Fremstilling av faktor X med redusert innhold av protrombin og faktor IX
En chelaterende sefarosekolonne ble behandlet og fyllt som beskrevet i eksempel 1. Etter påsetning av prøven ble kolonnen vasket med citrat-fosfatbuffer inneholdende 500 mM NaCl ved pH 7,0. Faktor X ble så eluert med citrat-fosfatbuffer ved pH 7,0 inneholdende 500 mM NaCl og 5 mM glycin. Produktet inneholdt 15-30 faktor X iu/ml med en spesifikk aktivitet på 14 iu/mg protein. Dette produktet skilte seg fra produktet i eksempel 4 ved å ha høyere protrombinaktivitet og lavere faktor IX-aktivitet. Her oppnådde man således 0,25 iu/enhet faktor X både for protrombin og faktor IX. Protrombin utgjør derfor stadig ca. 40-50 vektprosent av det totale proteinet.
Eksempel 6
Fremstilling av et konsentrat av faktor IX og faktor X med redusert innhold av protrombin
En chelaterende sefarosekolonne ble fremstilt og behandlet som beskrevet i eksempel I. Den ble så vasket først med citrat-fosfatbuffer inneholdende først 500 mM og så 100 mM NaCl ved pH 7,0. Både faktor IX og X ble så eluert med Tris-glycinbuffer inneholdende 100 mM NaCl med en styrke på 3 0 iu/ml. Protrombininnholdet ble redusert til 0,03 iu pr. enhet av faktor IX eller faktor X.
Eksempel 7
Fremstilling av et konsentrat av faktor IX og protein C med redusert innhold av protrombin og faktor X
En chelaterende sefarosekolonne ble fremstilt og vasket som beskrevet i eksempel 4. Etter eluering av protein i 5 mM glycin ble en Tris-glycinbuffer brukt for å eluere faktor IX. Man fant at Tris var godt egnet i området fra 10-3 0 mM, glycin i området fra 40-70 mM og NaCl ved 100 mM. Dette eluerte faktor X-produkt hadde en styrke på 30-50 iu/ml. Protrombin lot seg ikke påvise, og faktor X viste mindre enn 0,01 enheter pr. enhet av faktor IX (mindre enn 0,05 vektprosent). Protein C ble også eluert ved konsentrasjoner på 25-40 plasma-ekvivalentsenheter pr. ml.
Eksempel 8
Separasjon av protein C fra protrombin og faktor X
Rensning av protein C er komplisert ved at man får en sam-eluering av protrombin og faktor X i vanlig kjente kromatografiske systemer, slik som heparin-sefarose eller dekstran-sulfat-sefarose. I disse systemer er imidlertid forurensningen av faktor IX minimal på grunn av en sterkere binding av dette proteinet. Det metallchelatsystem som er beskrevet her, kan derfor brukes som et trinn under rensningen av protein C.
Fremstilling og vasking av en chelaterende sefarosekolonne er som beskrevet i eksempel 7. Ettersom protein-bindingen er konsentrasjonsavhengig, er påsatt mengde så høy som mulig, opptil 160 faktorer av X iu pr. ml gel eller 240 protrombin iu pr. ml gel. Kolonnen ble så vasket og eluert som beskrevet i eksempel 7, og protein C ble eluert i det endelige Tris-glycinbufferelueringsmiddelet, skilt fra protrombin og faktor X forurensninger.
Eksempel 9
Effekt av adsorpsionskontakttid på binding og innvinnin<g> av faktor II, faktor IX, faktor X og protein C fra Cu2*- primet chelaterende sefarose
Chelaterende sefarose ble pakket i kolonner og behandlet med kobberioner og så vasket med citrat-fosfatbuffer pH 7,0 inneholdende 500 mM NaCl. PCC inneholdende 500 mM NaCl ble påsatt hver kolonne i en kontrollert gjennomstrømnings-hastighet, slik at kontakttiden med gelen kunne varieres i de forskjellige kolonnene. Kolonnene ble så påsatt 43 0 faktor IX-enheter pr. ml gel, vasket med en 500 mM NaCl-buffer, så med 100 mM NaCl-buffer og så med 10 mM Tris, 70 mM glycin, 100 mM NaCl-buffer pH 7,0. Gjennombruddsproteinet og Tris-glycin-eluatene ble målt med hensyn til innehold av faktor II, faktor
Binding av protein til gelen er således avhengig av kontakttiden. Dette kan optimaliseres for faktorene IX, X og protein C ved kontakttider på 40 minutter eller mer. Øket kontakttid resulterer i mindre binding av faktor II til gelen.
Eksempel 10
Effekt av påsatt mengde med hensyn til binding og utvinning av faktor II, IX, X og protein C med Cu2*- primet chelaterende sefarose
Chelaterende sefarose ble pakket i flere kolonner, behandlet med kobberioner og vasket med citrat-fosfatbuffer pH 7,0 inneholdende 500 mM NaCl. PCC inneholdende 50 0 mM NaCl ble påsatt kolonnene i forskjellige mengder, og kontakttiden i hver kolonne ble holdt på 40 minutter ved å variere gjennom-strømningshastigheten i kolonnen. Kolonnene ble så vasket med de buffere som er beskrevet i eksempel 6. Resultatene er vist i tabell IV nedenfor.
Økende påsatte mengder fortrenger faktor II preferensielt. Påsatt mengde kan således brukes for å øke binding og utvinning av ett spesielt protein i forhold til andre. Forbedret separasjon av faktor IX fra faktor II ble oppnådd ved påsatte mengder på fra 258-430 F.IX:Ag enheter pr. ml gel (dette er ekvivalent til ca. 150-250 F.IX:C iu pr. ml gel) .
Eksempel 11
Effekt av faktor IX- konsentrasion på binding oa innvinning av faktor II, IX, X og protein C med Cu2*- primet chelaterende sefarose
Chelaterende sefarose ble primet med kobberioner og vasket som beskrevet i tidligere eksempler. PCC inne-holdende 500 mM NaCl ble fortynnet i citrat-fosfatbuffer pH 7,0 inneholdende 500 mM NaCl. Kolonnene ble påsatt konsen-trat i forskjellige fortynninger og vasket med buffere som beskrevet i eksempel 6. Total påsetning (ca. 250 enheter pr. ml gel) og. kontakttid ble holdt konstant. Resultatene er vist i tabell V.
Høyere konsentrasjoner av det påsatte materialet er foretrukket for at det skal skje en binding til chelatet.
Eksempel 12
Effekt av chelaterende gel på binding av faktor IX og innvinning av nevnte faktor
Like volumer av fem chelatinerende geltyper ble pakket i fem kolonner, behandlet med Cu<2+->ioner og vasket med citrat-fosfatbuffer pH 7,0 inneholdende 500 mM NaCl. PCC justert til et innhold på 500 mM NaCl ble tilsatt i like mengder på hver kolonne, fulgt av en vasking med samme buffer, buffer inneholdende 10 0 mM NaCl og så eluert med 10 mM Tris, 70 mM glycinbuffer pH 7,0. Faktor IX ble målt i gjennombrudds-oppløsningen, vaskeoppløsningen og eluatfraksjonene.
De anvendte geltyper var følgende:
1. Chelaterende sefarose som innbefatter iminodieddiksyre knyttet til sefarose ved hjelp av et 12 atoms (10
karbonatomer) avstandsmolekyl [Pharmacia].
2. Som 1, men med ytterligere tverrbinding for hurtigflytende sefarose. 3. Agarose med iminodieddiksyre knyttet ved hjelp av et
12 atoms (10 karbonatomer) avstandsmolekyl [Sigma].
4 . Iminodieddiksyre knyttet direkte til en styren-divinylbenzen-tverrbundet polymer [Chelex 100,
BioRad].
5. Som 4, men med et grovere nett av en ikke-tverrbundet matrise [Chelex 20, BioRad].
Tabell VI.viser resultatene.
Binding av faktor IX til Cu<2+->primet iminodieddiksyregrupper øker ved at man tilveiebringer et avstandsskapende molekyl mellom matrisen og den chelaterende gruppe og ved å bruke ikke-tverrbundet chelaterende sefarose.
Eksempel 13
Fremstilling av faktor IX ved å bruke Cu2^- primet chelaterende sefarose i porsjonsvis adsorpsjon
Chelaterende sefarose ble vasket med vann, så suspendert i en kobbersulfatoppløsning (5 mg/ml) og blandet i fra 20 til 30 minutter. Den Cu<2+->primete gelen ble utvunnet fra blandingen ved sentrifugering og vasket flere ganger med citrat-fosfatbuffer pH 7,0 inneholdende 500 mM NaCl. Gelen ble utvunnet som beskrevet ovenfor, resuspendert i en oppløsning av PCC inneholdende 50 0 mM NaCl og blandet i 20-3 0 minutter. Forholdet PCC til gel var ca. 150 faktor IX:C-enheter pr. ml gel. Gelen ble utvunnet ved sentrifugering eller ren sedimentasjon, hvoretter supernatanten ble fjernet.
Flere gangers vasking med citrat-fosfatbuffer pH 7,0 inneholdende 500 mM NaCl og deretter 100 mM NaCl fjernet svaktbundet protein og reduserte ionestyrken. Faktor X kunne så fjernes ved vasking med 10 mM Tris, 5 mM glycin og 100 mM NaCl pH 7,0. Faktor IX ble deretter eluert ved å vaske gelen
med 10 mM Tris, 70 mM glycin og 100 mM NaCl pH 7,0.
Eksempel 14
Utvinning av faktor IX fra Cu2*- primet chelaterende sefarose ved å bruke forskjellige aminosyreelueringsbuffere
Kolonner av chelaterende sefarose ble primet med Cu<2+->ioner og vasket som beskrevet tidligere. PCC (inneholdende 500 mM NaCl) ble påsatt hver kolonne, som deretter ble vasket med citrat-fosfatbuffer pH 7,0. Faktor IX ble utvunnet ved å eluere kolonnene med 10 mM Tris, pH 7,0, inneholdende 70 mM av en aminosyre valgt fra gruppen bestående av (a) ikke-polare aminosyrer (f.eks. alanin, valin, fenylalanin, metionin), (b) polare uladete aminosyrer (f.eks. glycin, serin, tyrosin, glutamin), (c) polare negativt ladete aminosyrer (f.eks. glutaminsyre) eller (d) polare positivt ladete aminosyrer (f.eks. lysin eller arginin). Man fant at metionin, glycin og glutaminsyre var spesielt fordelaktige, idet disse ga et utbytte av faktor IX som var mer enn 80% og en spesifikk aktivitet for samme faktor som var større enn 5 iu/mg.
Eksempel 15
Eluering av faktor X og IX fra chelaterende sefarose ved å bruke metionin
En kolonne av Cu<2+->primet chelaterende sefarose ble vasket med citrat-fosfatbuffer pH 7,0 inneholdende 500 mM NaCl. PCC ble påsatt kolonnen, som så ble vasket med samme buffer, før man reduserte ionestyrken ved vasking med en buffer inneholdende 100 mM NaCl. Faktor X ble så eluert med Tris-buffer ph 7,0 inneholdende fra 2-5 mM metionin. Styrken av faktor X var større enn 15 u/ml, og den spesifikke aktiviteten var ca. 3 0 enheter/mg. Innholdet av faktor IX ble redusert i faktor X-fraksjonen til ca. 0,5 enheter faktor IX pr. enheter faktor X, og protrombin var tilstede i mengder på mindre enn 0,1 enhet pr. enhet faktor X.
Man eluerte faktor IX ved å vaske med Tris-buffer inne-holdende 10-15 mM metionin. Styrken på faktor IX var større enn 15 u/ml og hadde en spesifikk aktivitet på ca. 20 enheter/mg. Protrombin lot seg ikke påvise i faktor IX-fraksjonen, og faktor X var tilstede i en mengde på mindre enn 0,1 enhet pr. enhet av faktor IX.
Eksempel 16
Eluering av faktor IX ocr X fra chelaterende sefarose ved hjelp av glutaminsyre
Man fremstilte en Cu<2+->primet chelaterende sefarosekolonne og påsatte PCC og vasket som beskrevet for metionin-oppløsningen (eksempel 15).
Faktor X ble eluert med 10 mM Trisbuffer inneholdende fra 5-10 mM glutaminsyre. Faktor X hadde en spesifikk aktivitet på 16-22 enheter/mg.
Faktor IX hadde en spesifikk aktivitet på ca. 15 u/mg og ble eluert ved å heve konsentrasjonen av glutaminsyre i bufferen til 40 mM.
Eksempel 17
Fremstilling av faktor IX og X ved å bruke økende pH- gradient i eluerin<g>soppløsningen fra chelaterende sefarose
En kolonne chelaterende sefarose ble primet med Cu<2>t-ioner og vasket med buffer ved pH 7,0 inneholdende 500 mM NaCl. PCC inneholdende 500 mM NaCl ble påsatt kolonnen som så ble vasket med buffer. Ionestyrken ble redusert til 100 mM NaCl ved å bruke en lavere saltbuffer ved pH 7,0. Noe faktor X ble eluert med denne bufferen med en spesifikk aktivitet på 10,5 u/mg.
Kolonnen ble så progressivt eluert med en pH-gradient fra pH 7,0 til 8,5. Faktor IX og faktor X ble eluert mellom pH 7,1 og pH 7,9 med spesifikke aktiviteter på henholdsvis 27 og 6 u/mg.
Eksempel 18
Fremstilling av faktorene IX, X og protein C ved å bruke pH og glycin i elueringsoppløsningen
En kolonne chelaterende sefarose primet med Cu<2*->ioner og vasket med citrat-fosfatbuffer, pH 7,5. PCC inneholdende 500 mM NaCl ble justert til pH 7,5 og påsatt kolonnen, som så ble vasket med buffer. Ionestyrken ble redusert ved vasking med citrat-fosfatbuffer pH 7,5 inneholdende 100 mM NaCl. Den eluerte faktor X med spesifikk aktivitet på 18 u/mg i en blanding med faktor X som hadde en spesifikk aktivitet på 9 u/mg. En samlet fraksjon inneholdende protein C (15 u/ml; 6,5 enheter pr. mg protein) og faktor IX (12 u/ml; 5 enheter pr. mg protein) ble så oppsamlet ved vasking med 10 mM Tris, 5 mM glycin, 100 mM NaCl-buffer, pH 8,0.
Eksempel 19
Eluering av proteinkomponenter fra chelaterende sefarose ved å bruke synkende pH- gradient
En kolonne chelaterende sefarose ble primet med Cu<2+->ioner og vasket med citrat-fosfatbuffer pH 7,5 inneholdende 500 mM NaCl. PCC ble så påsatt etter justering av pH til 7,5 og NaCl til 500 mM. Deretter brukte man samme buffer som nevnt ovenfor for å fjerne faktor II. 30% av faktor V i utgangsmaterialet ble også fjernet i denne vaske-oppløsningen. Ionestyrken ble så redusert ved vasking med buffer inneholdende 100 mM NaCl. Dette fjernet faktor X med en spesifikk aktivitet på ca. 15 enheter pr. mg protein. Ved å bruke citrat-fosfatbuffere og en pH-gradient som ble utviklet under vaskingen i kolonnen fra 7,5 til 4,0, fant man at man kunne oppsamle fraksjoner som var rike på utvalgte proteiner. Ved f.eks. pH 5,5 ble faktor X ytterligere fjernet, mens mellom pH 5 og 5,6 fjernet man ytterligere 40% av den bundete faktor V fra kolonnen i en mengde på fem plasmaekvivalentenheter pr. ml.
I dette pH-området begynte også inter-a-trypsin-inhibitor å elueres, og det samme var tilfelle for protein C. Da buffer-pH ble senket til pH 4,6, fikk man eluert inter-a-trypsin-inhibitor og protein C med spesifikke aktiviteter på henholdsvis 3,0 og 4,6 plasmaekvivalentenheter pr. mg protein. Bare små mengder faktor IX ble eluert under disse segmenter av fallende pH-gradient.
Når pH så ble redusert ytterligere, f.eks. til 4,1, ble faktor X eluert i en styrke på mer enn 4 0 enheter pr. ml og med en spesifikk aktivitet på mer enn 3 0 enheter pr. mg protein. Denne fraksjonen inneholdt ingen påvisbar mengde av faktor II eller X. Protein C var tilstede i en mengde på ca. 0,01 enheter pr. enhet av faktor IX, faktor V var tilstede som 0,06 enheter pr. enhet av faktor IX, mens inter-a-trypsin-inhibitor var tilstede i en mengde på 0,03 enheter pr. enhet av faktor IX. Med hensyn til deres forurensning av én enhet av faktor IX, representerer dette en reduksjon av protein C, faktor V og inter-a-trypsininhibitor på henholds-vis 95%, 63% og 90% i forhold til utgangsmaterialet (PCC).
Eksempel 2 0
Bruk av pH og aminosyrer for å skille proteinkomponentene fra chelaterende sefarose
En kolonne av chelaterende sefarose ble behandlet med Cu<2+->ioner og vasket med citrat-fosfatbuffer pH 7,5 inneholdende 500 mM NaCl. PCC justert til et innhold av 500 mM NaCl og en pH på 7,5 ble påsatt kolonnen, som så ble vasket med den buffer som er angitt ovenfor. Ytterligere vasking med citrat-fosfatbuffer pH 7,5 inneholdende 100 mM NaCl reduserte ionestyrken og fjernet faktor X som kunne oppsamles i en styrke på minst 6 enheter/ml og en spesifikk aktivitet på minst 15 enheter pr. mg protein. pH ble så redusert ved vasking med en tredje buffer, vanligvis en citrat-fosfatbuffer ved pH 4,5 inneholdende 100 mM NaCl. Dette fjernet minst 55% av den gjenværende bundete inter-a-trypsininhibitor og 24% av det gjenværende bundete protein C, men bare 5% av den bundete faktor IX. Kolonnen ble så re-ekvilibrert i en buffer med en pH og en saltkonsentrasjon som var egnet for eluering av faktor IX, dvs. pH 7,0 og 100 mM NaCl. Faktor IX ble så eluert med en aminosyreholdig buffer, f.eks. glycin i Tris-buffer inneholdende 100 mM NaCl som beskrevet i tidligere eksempler. Dette ga faktor IX i en mengde på 200 enheter/ml med en spesifikk aktivitet på mer enn 50 enheter pr. mg protein. Protein C var også tilstede med en spesifikk aktivitet på 20 plasmaekvivalentenheter pr. mg protein.
Sammenlignet med utgangsmaterialet av PCC inneholdt faktor IX-fraksjonen en betydelig mengde redusert forurensende protein. Faktor II, X, V og inter-a-trypsininhibitor var tilstede pr. enhet av faktor IX i mengder på henholdsvis 0,0005, 0,005, 0,002 og 0,04 enheter. Dette kan sammenlignes med verdier på henholdsvis 1,0, 1,0, 0,2 og 0,4 i utgangsmaterialet.
Eksempel 21
Fremstilling av faktor VII på en Cu2*- primet chelaterende sefarose
En kolonne chelaterende sefarose ble behandlet med Cu<2+->ioner, så vasket med citrat-fosfatbuffer pH 7,0 inneholdende 500 mM NaCl. Faktor VII-konsentrat fremstilt ved eluering av DEAE-sefarose adsorbert med en kryosupernatant eller en faktor IX-fattig supernatant ble justert til 500 mM NaCl og påsatt kolonnen i en mengde på 50-150 faktor VII-enheter pr. ml gel. Etter vasking med ovennevnte buffer ble ionestyrken redusert ved vasking med citrat-fosfatbuffer pH 7,0 inneholdende 100 mM NaCl.. Faktor VII ble så utvunnet med en spesifikk aktivitet på mer enn én enhet pr. mg ved vasking av kolonnen med 10 mM Tris, 6 0 mM glycin ved pH 7,0 inneholdende 10 0 mM NaCl.
Eksempel 22
Vaskemiddelbehandling av blodkoagulerende faktorer adsorbert på chelaterende sefarose
Chelaterende sefarose ble tilsatt Cu<2+->ioner, vasket og så fyllt som beskrevet i eksempel 1. Kolonnen ble så vasket med citrat-fosfatbuffer pH 7,0 inneholdende 500 mM NaCl. Kolonnen ble så vasket med minst fire kolonnevolumer med samme buffer inneholdende 1 vektprosent natriumdodekylsulfat for å oppløseliggjøre lipidkomponentene som var bundet til gelen. Deretter ble vaskemiddelet vasket ut fra gelen med citrat-fosfatbuffer inneholdende 100 mM NaCl. Dette trinn tjener også til å redusere ionestyrken ved avsaltning. Faktor IX ble så eluert fra gelen med glycin i Tris-buffer som beskrevet i eksempel 7. I samme fremgangsmåte kan nevnte natrium-dodekylsulf at erstattes med samme mengde cholinsyre eller polyoksyetylen (20) mono-oleat (Tween 80).
fosfatbuffere eller i vann, hvoretter det kan frysetørkes og oppvarmes ved 80°C i 72 timer. Den eluerende bufferen inneholdt Tris, men effekten av dette ble minimalisert ved valg av fraksjoner som hadde tilstrekkelig høy faktor IX-
styrke til at man fikk en effektiv fortynning av Tris-komponenten i den endelige bufferen. Alternativt kan fremstillingen av den eluerende bufferen modifiseres, slik at man kan utføre en direkte frysetørking av det ufortynnete eluatet.
Claims (11)
1. Fremgangsmåte for i det minste en delvis separasjon av vitamin K-avhengige blodkoagulerende faktorer fra en blanding som inneholder minst én slik faktor,
karakterisert ved at nevnte blanding adsorberes på et chelat av et divalent metall immobilisert på et
inert underlag, idet chelatiseringsgruppen eventuelt er bundet til underlaget gjennom en avstandsdannende gruppe, hvoretter det foretas en eluering som gir én eller flere fraksjoner anriket med hensyn til én av de nevnte faktorer.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at blandingen som anvendes er et protrombinkomplekskonsentrat.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at blandingen som anvendes er fremstilt via en mikrobiologisk kultur inneholdende en vitamin K-avhengig blodkoagulerende faktor produsert ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi.
4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at det inerte underlag som anvendes inneholder immobiliserte chelaterte Cu<2+->ioner.
Eksempel 23
Frysetørking og etterfølgende varmebehandling av sluttfraksionene fra eksemplene 1 og 4- 7
Eluater fra de ovennevnte angitte eksempler ble frysetørket uten tap av aktivitet, og ble så holdt på 80°C i 72 timer for å redusere en mulig virusinfeksjon. I motsetning til eksisterende PCC, kunne man ikke påvise noen trombinutvikling ved oppvarmingen. Faktorene II, IX og X viste forskjellige stabiliteter med hensyn til oppvarming i forskjellige media. Hvis eluatene ble fortynnet med citrat og vann, ga oppvarming fra 65-90% i aktivitet i forhold til aktivitet før oppvarming. Med fortynning i Tris resulterte i langt større tap av aktivitet, og dette var større for faktor X enn for protrombin, og større for faktor IX enn for faktor X. Denne generelle effekten kan brukes med fordel som beskrevet i eksemplene 24 og 25.
Eksempel 24
Redusert faktor IX- aktivitet i et konsentrat av faktor X
Eksempel 4 og 6 ovenfor beskriver fremstillingen av et faktor X-konsentrat, hvor også faktor IX er tilstede. Det er fordelaktig hvis faktor IX-aktiviteten kan reduseres ved fortynning av de relevante faktor X-fraksjonene i 50 mM Tris-buffer pH 7,0 før frysetørking. Hvis man derimot ønsker å unngå en fortynning av styrken på faktor X-eluatet, kan Tris-mengden i den eluerende bufferen økes til 50 mM, slik at faktor X elueres i selve opparbeidingsbufferen. Etter frysetørking kan materialet holdes på 80°C i 72 timer. Aktiviteten av faktor IX vil bli redusert sterkere enn for faktor X, slik at produktet kan brukes med større spesifisitet, som et faktor X-konsentrat.
Eksempel 25
Varmebehandlin<g> av et høyrent faktor X- konsentrat
For å oppnå maksimalt mulig utbytte av faktor IX-aktivitet etter oppvarming kan faktor IX-eluatet beskrevet i eksempel 7 fortynnes til den endelige styrke i citrat eller citrat-
5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at nevnte Cu<2+->ioner som anvendes er chelatert med iminodieddiksyregrupper festet til et agaroseunderlag via en avstandsdannende gruppe.
6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at nevnte blanding adsorberes fra en vandig oppløsning inneholdende 0,4-1,0 M natrium-klorid og/eller én eller flere andre elektrolytter som gir en oppløsning med tilsvarende ionestyrke, fulgt av vasking av underlaget for å fjerne bundet faktor II før en fraksjon anriket med hensyn til en forønsket vitamin K-avhengig blodkoagulerende faktor elueres.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,
karakterisert ved at adsorbsjonen av nevnte blanding etterfølges av et vasketrinn hvori i det minste sluttvasketrinnet utføres med en bufferløsning inneholdende 100-200 mM NaCl og/eller én eller flere andre elektrolytter som gir en løsning med ekvivalent ionestyrke.
8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-6, karakterisert ved at elueringen av én eller flere forønskete vitamin K-avhengige blodkoagulerende faktorer adsorbert på nevnte underlag oppnås ved hjelp av en pH-gradient.
9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-7, karakterisert ved at elueringen av én eller flere forønskete vitamin K-avhengige blodkoagulerende faktorer adsorbert på nevnte underlag oppnås ved hjelp av en bufferopp-løsning inneholdende en aminosyre.
10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-8, karakterisert ved at det foretas en eluering, hvor det anvendes en sur pH-bufferoppløsning for spesi-fikt å fjerne bundet inter-a-trypsininhibitor fra underlaget,
eventuelt fulgt av en oppsamling av en faktor IX-anriket fraksjon i alt vesentlig fri for nevnte inhibitor og faktor II.
11. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at det fremstilles en faktor X-anriket fraksjon og/eller en faktor VII-anriket fraksjon og/eller en protein C-anriket fraksjon i alt vesentlig frie for faktor II.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB878729822A GB8729822D0 (en) | 1987-12-22 | 1987-12-22 | Chemical process |
PCT/GB1988/001150 WO1989005650A2 (en) | 1987-12-22 | 1988-12-22 | Chemical process |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO902757L NO902757L (no) | 1990-06-21 |
NO902757D0 NO902757D0 (no) | 1990-06-21 |
NO178882B true NO178882B (no) | 1996-03-18 |
NO178882C NO178882C (no) | 1996-06-26 |
Family
ID=10628844
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO902757A NO178882C (no) | 1987-12-22 | 1990-06-21 | Fremgangsmåte for separasjon av vitamin K-avhengige blodkoagulerende faktorer |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0391974B1 (no) |
JP (1) | JPH0664B2 (no) |
AT (1) | ATE90567T1 (no) |
AU (1) | AU627446B2 (no) |
DE (1) | DE3881895T2 (no) |
DK (1) | DK175514B1 (no) |
GB (1) | GB8729822D0 (no) |
NO (1) | NO178882C (no) |
WO (1) | WO1989005650A2 (no) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AT402262B (de) * | 1991-06-20 | 1997-03-25 | Immuno Ag | Arzneimittel enthaltend aktiviertes protein c |
IT1262899B (it) * | 1992-03-27 | 1996-07-22 | Sclavo Spa | Processo per l'isolamento di fattore ix, fattore x e fattore ii altamente purificati dal complesso protrombinico o dal plasma umano |
DE4430204A1 (de) * | 1994-08-26 | 1996-02-29 | Behringwerke Ag | Arzneimittel, welches als Gegenmittel für Blut-Antikoagulanzien geeignet ist und seine Verwendung |
US5589571A (en) * | 1994-10-28 | 1996-12-31 | Cor Therapeutics, Inc. | Process for production of inhibited forms of activated blood factors |
US5714583A (en) * | 1995-06-07 | 1998-02-03 | Genetics Institute, Inc. | Factor IX purification methods |
AT409334B (de) * | 1997-09-19 | 2002-07-25 | Immuno Ag | Pharmazeutisches präparat enthaltend vitamin k-abhängige einzelfaktoren |
SE0203551D0 (sv) * | 2002-12-02 | 2002-12-02 | Biovitrum Ab | Prothrombin purification |
US20060068454A1 (en) * | 2004-09-27 | 2006-03-30 | Sysmex Corporation | Method of inactivating blood coagulation factor and blood coagulation factor-inactivated sample |
GB0710321D0 (en) * | 2007-05-30 | 2007-07-11 | Nhs Blood & Transplant | Method |
US9956272B2 (en) | 2007-05-30 | 2018-05-01 | Bio Products Laboratory Limited | Methods for preparing factor X, activated factor X, inactivated factor X and inactivated factor Xa, and pharmaceutical compositions comprising same |
US20140206844A1 (en) | 2013-01-18 | 2014-07-24 | Prothera Biologics | Methods for isolating blood products from an inter-alpha inhibitor protein-depleted blood product material |
CN104328036B (zh) * | 2014-10-28 | 2016-08-24 | 成都英德生物医药装备技术有限公司 | 一种人凝血酶原复合物吸附分离装置 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2303466C2 (de) * | 1973-01-25 | 1975-03-20 | Stanislaus Dipl.-Ing. 7340 Geislingen Malik | Verfahren zur Herstellung eines Wabenträgers |
JPS5263835A (en) * | 1975-11-21 | 1977-05-26 | Hokusan Kk | Method of fabricating light shaped steel material |
US4473553A (en) * | 1983-12-02 | 1984-09-25 | Miles Laboratories, Inc. | Process for producing a lipoprotein-poor concentrate of coagulation factors VII and VIIa |
FR2632309B1 (fr) * | 1988-06-07 | 1990-08-24 | Lille Transfusion Sanguine | Procede de purification par voie chromatographique de proteines, notamment de facteur viii, et les produits obtenus |
US4981952A (en) * | 1988-10-04 | 1991-01-01 | Eli Lilly And Company | Method for the purification of vitamin K-dependent proteins |
-
1987
- 1987-12-22 GB GB878729822A patent/GB8729822D0/en active Pending
-
1988
- 1988-12-22 DE DE89901619T patent/DE3881895T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-22 EP EP89901619A patent/EP0391974B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-22 JP JP1501523A patent/JPH0664B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-22 AT AT89901619T patent/ATE90567T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-12-22 AU AU30329/89A patent/AU627446B2/en not_active Expired
- 1988-12-22 WO PCT/GB1988/001150 patent/WO1989005650A2/en active IP Right Grant
-
1990
- 1990-06-21 NO NO902757A patent/NO178882C/no unknown
- 1990-06-22 DK DK199001534A patent/DK175514B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0391974A1 (en) | 1990-10-17 |
WO1989005650A3 (en) | 1989-07-27 |
NO902757L (no) | 1990-06-21 |
DE3881895T2 (de) | 1993-12-02 |
NO178882C (no) | 1996-06-26 |
WO1989005650A2 (en) | 1989-06-29 |
DK175514B1 (da) | 2004-11-15 |
JPH03501085A (ja) | 1991-03-14 |
DE3881895D1 (de) | 1993-07-22 |
ATE90567T1 (de) | 1993-07-15 |
DK153490A (da) | 1990-06-22 |
JPH0664B2 (ja) | 1994-01-05 |
NO902757D0 (no) | 1990-06-21 |
EP0391974B1 (en) | 1993-06-16 |
DK153490D0 (da) | 1990-06-22 |
AU627446B2 (en) | 1992-08-27 |
GB8729822D0 (en) | 1988-02-03 |
AU3032989A (en) | 1989-07-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0317376B1 (fr) | Préparation de concentré de facteur IX humain de haute pureté et d'autres protéines plasmatiques | |
US5679776A (en) | Process for preparing a concentrate of blood coagulation factor VIII-von willebrand factor complex from total plasma | |
NO178882B (no) | Fremgangsmåte for separasjon av vitamin K-avhengige blodkoagulerende faktorer | |
US4749783A (en) | Viral inactivation and purification of active proteins | |
FI116526B (fi) | Menetelmä K-vitamiinista riippuvaisten proteiinien eristämiseksi ja puhdistamiseksi | |
SK280989B6 (sk) | Spôsob výroby farmaceutického preparátu obsahujúceho zrážací faktor ix | |
Sakamoto et al. | Studies on the interaction between heparin and mouse bone collagenase | |
US5445958A (en) | Process for purifying blood clotting factors | |
JP3043558B2 (ja) | ヒト活性化プロテインc調製物及びその製法 | |
Vician et al. | Purification of human blood clotting factor X by blue dextran agarose affinity chromatography | |
EP0650364B1 (en) | Purification of factor ix | |
EP0813597B1 (en) | A process for the purification of vitamin k dependent coagulation factors by chromatography | |
JPH0739375A (ja) | プラスミノーゲンの精製方法 | |
AU627446C (en) | Chemical process | |
WO1994000483A1 (en) | PURIFICATION OF KRINGLE CONTAINING PROTEINS, AND ESPECIALLY t-PA |