FI116526B - Menetelmä K-vitamiinista riippuvaisten proteiinien eristämiseksi ja puhdistamiseksi - Google Patents

Description

116526

Menetelmä K-vitamiinista riippuvaisten proteiinien eristämiseksi ja puhdistamiseksi

Luonnossa esiintyvien proteiinien lisäksi on nykyi-5 sin mahdollista valmistaa geenitekniikan menetelmien avulla nisäkkäiden proteiineja rekombinanttitekniikoilla, erityisesti ihmisten proteiineja. Tätä tarkoitusta varten viljellään vieraalla DNA:11a transformoituja tai transfek-toituja isäntäsoluja, jolloin eukaryootti-isäntäsolujen 10 ollessa kyseessä rekombinanttisesti tuotettu proteiini vapautetaan liukoisessa muodossa solujen kasvatusalustaan (R. G. Werner ja W. Berthold, Drug. Res. 38, 422 - 428 (1988)). Koska isäntäsolut kuitenkin vapauttavat solujen kasvatusalustaan muitakin proteiineja halutun rekombinant-j 15 tisesti tuotetun proteiinin lisäksi, on välttämätöntä ri kastaa ja/tai eristää haluttu proteiini yhdellä tai useammalla puhdistusvaiheella. Tämän huomioon ottaen tarvitaan menetelmiä, jotka mahdollistavat rekombinanttiproteiinien eristämisen tehokkaasti ja selektiivisesti solujen kasva-20 tusalustasta.

Yleensä käytetään proteiinien fysikaalisia ja ke- , . miallisia ominaisuuksia rekombinanttiproteiinien puhdista- • > · ; ; miseksi. Tällaisia ominaisuuksia ovat proteiinien koko, pinnan luonnollinen varaus, niiden hydrofiilisyys tai liu- 25 koisuus. Toisissa puhdistusmenetelmissä käytetään sitoutu- • · mistä toisiin molekyyleihin, kuten esimerkiksi vasta-ai-

• I

: neisiin. Sama koskee proteiinien puhdistusta luonnollisis- .* ta lähteistä. Yhtä hyvin tässä proteiinin erottelu jäljel le jäävistä mukana olevista proteiineista tapahtuu sen | 30 fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien perusteella.

K-vitamiinista riippuvaiset proteiinit on puhdistettu tähän mennessä sellaisilla menetelmillä, kuten pro- > · teiinisaostus, ioninvaihtokromatografia ja geelisuodatus ’*”· (A. L. Bloom ja D. P. Thomas, Haemostasis and Thrombosis, ; .'· 35 Churchill Livingstone, New York, 1987). B. Dahlbäck (Bio- ί I * ! 2 116526 chem. J. 209, 837 - 846 (1983)) kuvaa proteiini S:n (PS) puhdistusmenetelmän. Bariumsitraattisaostuksen jälkeen PS eristetään DEAE-Sephacelissä. J. Malm et ai. (Eur. J. Bio-chem. 187, 737 - 743 (1990)) puhdistivat rekombinantti- 5 PS:n (rPS) affiniteettikromatografialla monoklonaalisella vasta-aineella. Tekijä IX:n (FalX) eristivät B. Osterude ja R. Flengsrud (Biochem. J. 145, 469 - 474 (1975)) ba-riumsulfaattisaostuksella ja ioninvaihtokromatografiällä selluloosalla. H. Kim et ai. (Sem. Hematol. 28 liite. 6, 10 15 - 19 (1991) käyttivät monoklonaalisia vasta-aineita

FaIX:n puhdistamiseen.

US-patentissa 5 055 557 kuvataan menetelmä K-vita-miinista riippuvaisten proteiinien puhdistamiseksi ja kon-sentroimiseksi plasmasta, samoin kuin rekombinanttisesti 15 tuotettujen proteiinien, immunoadsorbentin avulla käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta.

Edellä mainituissa menetelmissä täytyy kiinnittää huomiota siihen tosiseikkaan, että monet proteiinit eivät eroa ominaisuuksiltaan olennaisesti toisistaan, mikä tekee 20 niiden fraktioinnista vaikeamman. Sen vuoksi on välttämätöntä käyttää täsmällisten, toistensa kanssa koordinoitu-. . jen puhdistusvaiheiden yhdistelmiä, jotta käytetään opti- ; ! maalisesti hyödyksi erot proteiinien ominaisuuksissa.

; Joukko ihmisten ja eläinten veressä luonnostaan 25 esiintyviä proteiineja voi sitoa divalenttisia kationeja.

* i Tällaisia proteiineja syntetoidaan solussa K-vitamiinista « » ; riippuvaisessa prosessissa, jossa kationeja sitovat kohdat V '· muodostuvat glutamiinihapon (Glu) konversiossa gammakar- boksiglutamiinihapoksi (Gla). Nämä kationinvaihtokohdat • 30 voidaan sitten saturoida kalsiumioneilla (Ca2+). Kalsium- ionien lisäksi nämä kationeja sitovat kohdat kykenevät myöskin pääsääntöisesti sitomaan divalenttista strontiumia < t tai bariumia (B. Furie ja B. C. Furie, Cell 53, 508 - 518 (1988)).

» I i 3 116526

Monet näistä K-vitamiinista riippuvaisista proteii-; neista ovat veriplasman aineosia ja niillä on tärkeä teh tävä homeostaasin ylläpitämisessä. Gammakarboksiglutaraii-nihapporyhmät näissä K-vitamiinista riippuvaisissa pro-5 teiineissa ovat rakenteellisesti homologisilla N-terminaa-lisilla Gla-alueilla (A. Tulinsky, Thromb. Haemost. 66, 16 - 31 (1991). Näihin kalsiumioneja sitoviin proteiineihin, joissa on homologiset Gla-alueet, kuuluvat muiden muassa proteiini S (PS), proteiini C, tekijä IX (FalX), 10 tekijä II, tekijä VII, tekijä X ja proteiini Z.

Kalsiumionien sitomisen seurauksena näillä proteiineilla on epäilyksettä muuttuneita ominaisuuksia verrattuna kalsiumin sitomiseen kykenemättömiin proteiineihin. Tätä eroa on käytetty hyväksi EP-patenttihakemuksessa 15 363 126 proteiinien puhdistuksessa. EP-patenttihakemukses- sa 363 126 kuvataan menetelmä K-vitamiinista riippuvaisten, rekombinanttirekniikalla saatujen proteiinien eristämiseksi. Menetelmän mukaisesti divalenttiset kationit poistetaan täysin lisäämällä kelaattorikomponenttia kasva-20 tusalustaan ennen proteiinin todellista eristämistä, ja proteiini kykenee sen vuoksi sitoutumaan ioninvaihtohart-siin, kuten Mono Q:hun. Lisäksi proteiini eluoidaan anio- ; ninvaihtajasta lisäämällä NaCl:ia ja ja Ca2+-ioneja. Näin saatiin 58 % rikastettua tuotetta (proteiini C:tä). Epä- :.v 25 puhtaudet (42 %) käsittävät sellaisia proteiineja, jotka * * « myöskin vapautuvat ioninvaihtajasta käytetyllä suolakon- ::: sentraatiolla (0,15 M). Myöhemmässä puhdistusvaiheessa saatu proteiini-kationikompleksi adsorboidaan pylvääseen, johon immobilisoitu EDTA on sitoutunut, pestään ja eluoi- : 30 daan proteiini. Eluointiliuoksessa olevat proteiinit sido- • · · .··, taan in-line ioninvaihta jaan ja eluoidaan suolagradientil- la. Sen jälkeen kun eluointiliuokseen on lisätty CaCl2:a » ♦ « proteiini-kationi-kompleksi adsorboidaan hydrofobiseen pylvääseen ja haluttu proteiini eluoidaan EDTA-puskurilla.

• » t « · > * t 4 116526 EP-patenttihakemuksessa 363 126 kuvatun menetelmän haittana on se, että K-vitamiinista riippuvaisen proteiinin konformaatiossa tapahtuu laajamittainen muutos monien kalsiumionien poistamisen ja lisäämisen vuoksi, mikä joh-5 taa proteiinin ominaisuuksien muutoksiin. (Johanson et ai., J. Biol. Chem. 258, 5554 - 5560 (1993); J. Stenflo, ! J. Biol. Chem. 251, 355 - 363 (1976)). Tähän verrattuna keksinnön mukaisella menetelmällä tarjotaan käyttöön prosessi, jolla ei ole näitä haittoja, koska prosessissa ei 10 koko puhdistuksen aikana tarvita mitään vaihetta divalent-tisten metalli-ionien, esimerkiksi kelaatinmuodostajien, poistamiseksi.

Tämän keksinnön etuna on, että K-vitamiinista riippuvaisen proteiinin alkuperäinen konformaatio ja stabili-15 teetti säilytetään puhdistuksen aikana.

Patenttihakemuksessa 354 354 kuvataan menetelmä veren hyytymistekijöiden II, VII, IX ja X rikastamiseksi. Edellä nimetyt protrombiinikompleksin tekijät eristetään adsorptiolla matriisissa, joka sisältää alfahydroksyyli-20 aminoryhmiä, joihin erityisesti tekijä IX sitoutuu voimakkaasti. Tekijät II, VII ja X eluoituvat aikaisemmin ioni- . , vahvuuden funktiona. Kalsiumionien lisäämisellä ei ole * « « merkitystä tässä menetelmässä.

• · ψ ’·*·* Patenttihakemuksessa 317 376 kuvataan menetelmä ·.·.· 25 tekijää IX sisältävän ihmisen plasmafraktion eristämisek- I I | si, jolloin menetelmässä kryopresipitaatti esipuhdistetaan j : : ensin kromatografiällä, sen jälkeen suoritetaan erottelu anioninvaihtokromatografian avulla ja valikoiva eluointi puskurilla, jossa on nouseva ionivahvuus, ja lopuksi teh- ; 30 dään af f initeettikromatograf ia Heparin-Sepharosella selek- • · » ,·>·, tiivisella eluoinnilla. Tässä menetelmässä ei myöskään oteta huomioon tekijä IX:n muuttuneita proteiiniominai-

» I I

*...· suuksia kalsiumionien läsnä ollessa tai puuttuessa.

': Tämän keksinnön tavoitteena on tarjota käyttöön . 35 menetelmä K-vitamiinista riippuvaisten ja kalsiumioneja * * 5 116526 ! ί j sitovien proteiinien erottelemiseksi liuoksista niiden yhteydessä olevista K-vitamiinista riippumattomista proteiineista ilman, että on välttämätöntä poistaa kalsium-ioneja, mihin liittyy mahdollisesti proteiinien denaturoi-5 tuminen. Tämän menetelmän, joka voidaan toteuttaa rikastetuilla proteiiniliuoksilla luonnollisista lähteistä, samoin kuin soluviljelmien supernatanteilla rekombinantti-proteiinien tuotannosta, tulisi olla yksinkertainen, ja johtaa erittäin puhtaisiin K-vitamiinista riippuvaisiin 10 proteiineihin.

Edellä mainittu tavoite toteutetaan keksinnön mukaisesti menetelmillä, jotka esitetään patenttivaatimuksissa 1 - 16. Keksintö käsittää myös erittäin puhtaat K-vitamiinista riippuvaiset proteiinit, jotka on eristetty 15 näiden menetelmien avulla.

Esimerkiksi soluviljelmien supernatantit, samoin kuin toisella tavalla prosessoitu solujen kasvatusalusta, supernatantit kudosviljelmistä tai proteiiniliuokset luonnollisista lähteistä, jotka käsittävät K-vitamiinista 20 riippuvaisia proteiineja, ajetaan ensin kromatografiällä anioninvaihtajassa keksinnön mukaisella menetelmällä. Spe-., sifistä divalenttisten kationien poistamista proteiinili- uoksesta ennen kromatografiavaihetta ei vaadita, päinvas- • · * taoin kuin menetelmässä, joka on kuvattu EP-patenttihake-25 muksessa 363 126. Päinvastoin määritettiin hämmästyttäväs- « · · ·...· ti, että lisäämällä pieniä määriä kalsiumioneja matalana • · : suolakonsentraationa K-vitamiinista riippuvaisten proteiini’: nien sitoutumista ei tapahtunut anioninvaihtajassa, vaik kakin K-vitamiinista riippumattomien proteiinien sitoutu-: .·. 30 mistä tapahtui. Ensimmäistä kertaa käytettiin uuden tyyp- pistä anioninvaihtajaa, jolla on hyperdiffuusio-ominai- • « ’·’ suuksia, esimerkiksi Q-Hyper DR (Sepracor), keksinnön mu- kaisessa menetelmässä K-vitamiinista riippuvaisten ja ’·” K-vitamiinista riippumattomien proteiinien erottelemisek- . 35 si. Anioninvaihtokromatografiaa seuraa sitten affiniteet- * » * » 6 116526 tikromatografia niin kauan kuin halutaan proteiinin puhdistumista lisää.

Keksinnön mukaisesti K-vitamiinista riippuvaista proteiinia sisältävää liuosta voidaan rikastaa ylimääräi-5 sellä proteiinin konsentrointivaiheella ilman aikaisempaa i divalenttisten kationien poistamista proteiiniliuoksesta, ! suodattaa sen jälkeen anioninvaihtajan läpi ja haluttaessa myös ajaa kromatografiällä affiniteettipylväässä.

Edullisen vaihtoehdon mukaisesti esipuhdistusvai-10 heessa (1. vaihe) rikastettu proteiinikonsentraatti suodatetaan anioninvaihtajan läpi (2. vaihe) ja laitetaan sitten suoraan affiniteettipylvääseen. Edullista yhdistelmää luonnehditaan seuraavalla tavalla: (a) K-vitamiinista riippuvaista proteiinia sisältä-15 vä liuos saatetaan yhteyteen anioninvaihtajan kanssa, jolloin K-vitamiinista riippuvainen proteiinin adsorboituu vaihtajaan ja se eluoidaan sen jälkeen nousevalla suola-konsentraatiolla; sen jälkeen eluointiliuoksen suolakon-sentraatiota pienennetään, 20 (b) eluointiliuokseen vaiheesta (a) lisätään kal- siumioneja ja se saatetaan taas yhteyteen anioninvaihtajan . . kanssa olosuhteissa, joissa mukana olevat proteiinit, mut- ' ; ta ei K-vitamiinista riipuvainen proteiini, adsorboituvat, (c) Ei-adsorboitunut K-vitamiinista riippuvainen *·'·' 25 proteiini vaiheesta (b) adsorboidaan af f initeettisub- * · » ·...· straattiin ja eluoidaan selektiivisesti.

·,: · Edellä esitettyä edullista yhdistelmää menetelmän : : : vaiheista valaistaan lähemmin seuraavasti:

Proteiinin konsentraatiovaiheessa (1. vaihe) liuos, • 30 joka sisältää rekombinanttisen tai luonnollisen K-vitamii- • < * · nista riippuvaisen proteiinin, saatetaan kontaktiin an-ioninvaihtajan kanssa. Tämä voi tapahtua yksinkertaisesti '··’ sekoittamalla tai ohjaamalla pylvään yllä.

1 ‘ Sitä paitsi K-vitamiinista riippuvainen proteiini ; 35 on yhdessä muiden proteiinien kanssa suolaliuoksessa, jon- 7 116526 ka konsentraatio on alhainen (minimaalisuolakonsentraa-tio). Näissä olosuhteissa K-vitamiinista riippuvainen proteiini on sitoutunut anioninvaihtajaan yhdessä joukon muita proteiineja kanssa. Lisäämällä suolakonsentraatiota 5 (ionivahvuutta) K-vitamiinista riippuvainen proteiini va pautetaan siten alempana selektiivisesti ioninvaihtajasta.

Soluviljelmien supernatantit käsittävät säännönmukaisesti väriainetta, joka osoittaa pH-tilaa. Tämä väri, kuten fenolipuna, sameuttaa kirkkaan proteiiniliuoksen, 10 sitoutuu voimakkaasti tavallisiin anioninvaihtajiin, kuten Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia) tai MacroPrepR (Bio-Rad), ja absorboi valoa proteiinimäärityksen aallonpituudella, se on 280 nm:ssä. Tämän johdosta soluviljelmistä peräisin olevien proteiinien puhdistuminen estyy. Jotta 15 saataisiin aikaan parannusta tässä suhteessa, keksinnön mukaisesti soluviljelmien supernatantit suodatettiin ensimmäistä kertaa anioninvaihtajassa, jolla oli hyperdif-fuusio-ominaisuudet (Q-Hyper DR, Sepracor). Tällä tavalla osoitettiin, että fenolipunavärin epäspesifinen sitoutumi-20 nen vähenee minimiin käyttämällä Q-Hyper D:tä anionion-vaihtajana. Väri eluoituu anioninvaihtajasta jo alle mini-. . mikonsentraation olevissa suolakonsentraatioissa. Tällä tavalla eluoituneet proteiinit voitiin detektoida paremmin I · « kromatografian aikana. Lisäksi häiritsevä kilpaileva reak-25 tio proteiinien ja värin välillä ioninvaihtajassa väite- « * » ·...· tään suurelta osin.

j.j · Seuraava anioninvaihtokromatografia (2. vaihe) pe- : Γ: rustuu siihen, että K-vitamiinista riippuvaisen proteiinin sisältävän liuoksen ionivahvuus vähennetään arvoon, joka : .*. 30 on alle minimaalisuolakonsentraation, dialyysillä tai lai- ,···. mentamalla suolattomalla puskurilla ja lisätään pieniä määriä kalsiumioneja. Sen jälkeen proteiiniliuos saatetaan I I < uudelleen yhteyteen anioninvaihta jän kanssa ja/tai suoda-tetaan sen läpi. Siten määritettiin hämmästyttävästi, et-. 35 teivät K-vitamiinista riippuvaiset proteiinit sitoudu an- • > 8 116526 ioninvaihtajaan, ja että mukana olevat K-vitamiinista riippumattomat proteiinit adsorboituvat substraattiin. Tämä on seurausta proteiinien erilaisesta varauksesta, mikä johtuu sitoutumisesta Ca-ioneihin. K-vitamiinista 5 riippuvainen proteiini, joka nyt on puhdistettu lisää preliminääri vaiheen kontaminoivista proteiineista, saadaan tällä tavalla suoraan (ilman, että täytyy tehdä vielä suolasta riippuva eluointi).

Monissa tapauksissa proteiineja puhdistettaessa 10 esipuhdistusvaiheen (1. vaihe) ja puhdistuksen anionin-vaihtajalla (2. vaihe) yhdistelmä on riittävä. Siten toinen puhdistusvaihe on sitä tehokkaampi, mitä vähemmän eroteltava K-vitamiinista riippuvainen proteiini on mukana olevien proteiinien kontaminoima.

15 Toisessa puhdistusvaiheessa anioninvaihtajalla K-vitamiinista riippuvainen proteiini ei ole sitoutunut anioninvaihtajaan johtuen kaistaleveyden minimisuolakon-sentraation alle olevan tietyn suolakonsentraation selektiosta, ja johtuen kalsiumionien lisäyksestä.

20 Hyväksikäyttämällä Gla-alueen omaavien K-vitamii- nista riippuvaisten proteiinien kalsiumia sitovia ominai-. , suuksia, ne erotellaan mukana olevista proteiineista si- ten, että tietyissä ionivahvuuksissa vain mukana olevat proteiinit sitoutuvat anioninvaihtajaan, K-vitamiinista 25 riippuvaisten proteiinien kuitenkin kulkiessa anioninvah-:,,,· tajan läpi sitoutumatta siihen. Sen vuoksi, paitsi K-vita- *,· j miinista riippuvaisten proteiinien, jotka ovat peräisin : luonnollisista lähteistä, tämän keksinnön mukainen mene telmä on erityisen sopiva puhdistettaessa rekombinanttisia : 30 K-vitamiinista riippuvaisia proteiineja, joilla on Gla- ,*·*, alue, näitä ovat esimerkiksi proteiini C, tekijä IX, teki jä II, tekijä VII, proteiini S ja proteiini Z.

Edellä nimetyissä vaiheissa 1 ja 2 on edullista käyttää samaa anioninvaihtajaa, jolloin erityisen hyviä • i 9 116526 tuloksia saadaan, kun anioninvaihtokromatografia tehdään pylväässä.

In-line-menetelmässä (3. vaihe), nimittäin affini-teettikromatografiässä, tapahtuu K-vitamiinista riippuvai-5 sen proteiinin sitoutuminen affiniteettimatriisiin. Tässä vaiheessa K-vitamiinista riippuvainen proteiini adsorboituu affiniteettimatriisiin. Tässä tapauksessa esipuhdis-tusvaihe, joka on yhdistetty sarjaan anioninvaihtajia, osoittautuu erityisen edulliseksi, koska sen avulla pois-10 tettiin joukko kontaminoivia proteiineja. Tämä edistää K-vitamiinista riippuvaisen proteiinin eluoitumista affi-niteettimatriisista, ja tekee mahdolliseksi halutun proteiinin eristämisen erittäin puhtaana.

Tämän keksinnön mukaiseen menetelmään voi kuulua 15 viruksen inaktivointivaihe, jonka alan ammattilainen tuntee tunnetusta tekniikasta, ja joka käsittää K-vitamiinista riippuvaista proteiinia sisältävien liuosten käsittelyn fysikaalis-kemiallisilla tai kemiallisilla menetelmillä. Tätä tarkoitusta varten harkitaan käsittelyä virustenvas-20 täisten aineiden läsnä ollessa, mikä yhdistetään haluttaessa säteilytykseen tai kuumakäsittelyyn. Tämän keksin- ,, nön mukaisesti viruksen inaktivointi voi tapahtua ennen * · ; ' K-vitamiinista riippuvaisten proteiinien erottelua K-vita- miinista riippumattomista, mukana olevista proteiineista. 25 Keksinnön mukainen menetelmä voi koostua puhdistus- vaiheiden 1, 2 ja 3 yhdistelmästä, ja ne voidaan toteuttaa ·,· · missä tahansa järjestyksessä. Siten kuitenkin patenttivaa- : timuksen 1 mukainen menetelmän vaihe on aina pakollinen.

Kuvioissa 1-12 esitetään puhdistusvaiheet ja/tai ί 30 tulokset seuraavasti:

> t I

,***. Kuvio 1. Rekombinantti-proteiini S:n puhdistus so- * luviljelmän supernatantista kromatografialla Q-Hyperillä * .. (esivaihe = 1. vaihe).

‘ 1 . n 116526 ίο

Kuvio 2. Rekombinantti-proteiini S:n puhdistus kro-matografiällä Q-Hyper D:llä lisäämällä kalsiumioneja (= 2. vaihe).

Kuvio 3. Puhdistetun rekombinantti-proteiini S:n 5 SDS-PAGE-geelielektroforeesi (A: soluviljelmän superna- tantti, B: puhdistettu rPS),

Kuvio 4. fFaIX:n puhdistus kromatografiällä Q-Hyper D:llä (1. vaihe).

Kuvio 5. rFaIX:n puhdistus kromatografiällä Q-Hyper 10 D:llä lisäämällä kalsiumioneja (2. vaihe).

Kuvio 6. fFaIX:n SDS-PAGE-geelielektroforeesi (A: soluviljelmän supernatantti, B: puhdistettu rFalX).

Kuvio 7. rFaIX:n puhdistus kromatografiällä hepa-riini-Sepharosella (3. vaihe).

15 Kuvio 8. rFalXtn puhdistus kytketyllä kromatogra- fiällä Q-Hyperillä ja hepariini-Sepharosella (2. ja 3. vaihe).

Kuvio 9. Kuviossa 8 esitetyllä tavalla saadun rFalX:n SDS-PAGE-geelielektroforeesi.

20 Kuvio 10. rFallrn puhdistus soluviljelmän superna- tantista kromatografiällä FraktogelR EMD TMAE 650:llä (1. vaihe), %

Kuvio 11. rFaII:n puhdistus kromatografiällä Frak- I · togelR EMD TMAE 650:llä (2. vaihe).

» * > 25 Kuvio 12. rFalltn analyysi SDS-PAGE-geelielektrofo- reesilla (A: soluviljelmän supernatantti, B: puhdistettu

Li*: Fan).

: i : Seuraavissa esimerkeissä esitetään proteiini S:n, tekijä IX:n ja tekijä II:n keksinnön mukainen puhdistus.

• .*. 30 Esimerkki 1 * * t a) rPS:n puhdistus anioninvaihtokromatografiällä

1 I

Seuraavassa esimerkissä käytettiin kvaternaarista *··* aminotyypin anioninvaihtajaa, jolla oli hyperdif fuusio- ominaisuudet (Q-Hyper D, Sepracor).

11 116526

Materiaalit:

Pylväs: Q-Hyper D, Sepracor; 2 cm x 4 cm Puskuri A: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,0 Puskuri B: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,0, 018 M NaCl 5 Puskuri C: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,0, 0,4 M NaCl

Puskuri D: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,0, 1 mM NaCl Rekombinanttiproteiini (rPS) eristettiin tavanomaisilla laboratoriomenetelmillä, sen jälkeen kun Vero-solut (apinan munuaissolut) oli infektoitu vaccinia-viruksella 10 soluviljelytekniikalla. Vero/vaccinia -ekspressiojärjestelmät ja solujen viljelyolosuhteet on selitetty perusteellisesti julkaisuissa F. G. Falkner et ai., Thrombosis and Haemostasis, 68, 119 - 124 (1992) ja N. Barrett et ai., AIDS Res., 5, 1598 - 171 (1989); F. Dorner et ai., 15 AIDS Research and Clinical Trials, Marcel Dekker, Inc., New York (1990). rPS:n ekspressio tapahtuu kaupallisesti saatavissa olevalla, synteettisellä DMEM-ravintoalustalla. Soluviljelyn jälkeen viljelmän supernatantti eristettiin sentrifugoimalla ja siihen lisättiin synteettistä proteaa-20 si-inhibiittoria PefablocR SC, Pentapharm, 0,1 mMol/1.

Pylväs regeneroitiin valmistajan ohjeiden mukaisesti ja tasapainotettiin puskurilla A. Sen jälkeen pylvää-, ’ seen lisättiin nopeudella 10 ml/min 485 ml viljelmän su- i ; · ; ; pernatanttia, joka sisälsi rekombinantti-proteiini S:ää.

25 Pylvääseen sitoutumaton materiaali poistettiin samalla # » · virtausnopeudella pesemällä puskurilla A. Sen jälkeen pyl-:.· j västä eluoitiin ensin puskurilla B ja sen jälkeen pusku- i i * ·* rilla C. Seuraava eluointi tehtiin puskurilla D. Proteii nin adsorptiota seurattiin kromatografiän aikana normaa- 30 lilla tavalla 280 nm:ssä. Kromatograf iän päättämisen jäi- ♦ « * · keen proteiinikonsentraatio määritettiin Bradfordin mene-telmän avulla (M. Bradford, Anal. Biochem. 72, 248 - 254 '··’ (1976). Proteiini S:n määrä määritettiin kaupallisella ELISA-järjestelmällä (Asserachrome Protein S, Boehringer 12 116526

Mannheim) samoin kuin hyytymistestillä (proteiini S:n hyy-tymistesti, Boehringer Mannheim).

Havaittiin, että melkein kaikki rPS oli sitoutuneena matriisiin. rPS eluoitiin anioninvaihtajasta 0,4 M 5 NaCl:illa (puskuri C).

Käyttäen edellä nimettyä anioninvaihtajaa, bromife-nolipunaväri, jota soluviljelmät sisältävät yleisesti, eluoitui pylväästä jo suolakonsentraatiossa 0,18 M, mikä edisti olennaisesti sen jälkeistä rPS:n eristämistä 0,4 M 10 NaCllilla. Tämä on etu verrattuna muiden anioninvaihtajien käyttöön.

Olennaisista tuloksista rPS:n puhdistuksesta anio-ninvaihtajalla (1. vaihe) on esitetty yhteenveto kuviossa 1 ja taulukossa 1. Esimerkissä 1 kuvatulla puhdistuksella 15 rPS-antigeenin määrä 3 % solujen kasvatusalustan kokonais-proteiinista nousi 8 %:iin antigeeniä proteiinista 0,4 M NaCl-fraktiossa. Spesifinen aktiivisuus lisääntyi 25-ker-taisesti.

Taulukko 1 20 Näyte Tilavuus Proteiinia Proteiini-S Spesifinen- antigeeni- aktiivisuus aktiivisuus (ml) (mg/ml) (mU/ml) (roU/ml) (U/mg) f · • Solujen 25 supernatantti 485 0,108 137 11 0,1 «1,*, Sitoutumaton fraktio 560 0,05 4 0 0 *< · 0.18 M NaCl 60 0.014 4 0 0 j 0.4 M Mad 14 0.537 1700 1358 2.5 30 1 M MaCl 20 0,54 4 0 0 • * · ‘ b) rPS:n puhdistus adsorboimalla mukana olevat pro teiinit anioninvaihtokromatografiällä lisäämällä kalsium-|,| | ioneja (2. vaihe).

:Käytettiin samaa anioninvaihtotyyppiä kuin kohdassa *'· 35 l.a) on kuvattu.

‘4 ' I t

Materiaalit: • - 1 » t » , Pylväs: Q-Hyper D, Sepracor; 1 cm x 4 cm <

Laite: Pharmacia FPLC LCC-500 t 13 116526

Puskuri A: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,0 Puskuri B: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,0, 015 M NaCl, 10 mM CaCl2

Puskuri C: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,0, IM NaCl 5 Pylväs regeneroitiin valmistajan ohjeiden mukaises ti ja tasapainotettiin puskurilla B. Rekombinantti-pro-teiini S, joka oli eristetty soluviljelmän supernatantista esimerkissä l.a) kuvatulla tavalla, laimennettiin 2,5-ker-taisesti puskurilla A niin, että NaCl:n konsentraatio oli 10 alle 0,18 M. Lisättiin CaCl2:ta konsentraationa 10 mM. Sen jälkeen proteiiniseos lisättiin pylvääseen ja sitoutumaton proteiini pestiin ulos pylväästä puskurilla B. Sitoutunut proteiini eluoitiin puskurilla C. Kromatografiän kulkua seurattiin, kuten esimerkissä l.a) on kuvattu ja kukin 15 proteiinikonsentraatio määritettiin.

Tulokset osoittavat, että rPS kulki pylvään läpi esteittä, kun taas pääosa muista proteiineista pysyi kiinnittyneenä pylvääseen. Kontaminoivat proteiinit eluoitiin sitten 1 M NaCl:11a. Olennaisista tuloksista tästä kokees-20 ta on esitetty yhteenveto kuviossa 2, kuviossa 3 ja taulukossa 2.

Esimerkissä l.b) esitetyllä puhdistuksella rPS:n » · antigeenimäärä nousi 12-kertaiseksi suhteessa muihin pro- ! » · teiineihin. Spesifinen aktiivisuus lisääntyi 14-kertaisek-25 si. Denaturoiva elektroforeesianalyysi (U. K. Laemmli, * « »

Nature 227, 680 - 685 (1970)) osoitti (kuvio 3), että esi-;,· I merkissä l.b) kuvatulla puhdistuksella rPS eristettiin «'/ enemmän kuin 95-prosenttisesti puhtaana.

Taulukko 2 : 30 Näyte Tilavuus Proteiinia Proteiini-S Spesifinen- ^ * antigeeni- aktiivisuus ‘aktiivisuus ,|, (ml) (mg/ml) (mU/ml) (mU/ml) (U/mg) ‘ f,,* Valmiste 35 esimerkistä la 34 0,215 680 543 2,5 . Sitoutumaton ; : fraktio 34 0.014 600 520 37 '<_ 1,0 M NaCl 10 0,332 83 0 0 14 116526

Esimerkki 2 a) rFaIX:n puhdistus anioninvaihtokromatografiällä.

Seuraavassa esimerkissä käytettiin kvaternaarista aminotyypin anioninvaihtajaa, jolla oli hyperdiffuusio-5 ominaisuudet (Q-Hyper D, Sepracor).

Materiaalit:

Pylväs: Q-Hyper D, Sepracor; 2 cm x 4 cm

Laite: Pharmacia FPLC LCC-500

Puskuri A: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 5,5 10 Puskuri B: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 5,5, 018 M NaCl

Puskuri C: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 5,5, 0,3 M NaCl

Puskuri D: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 5,5, 1,0 M NaCl

Rekombinantti tekijä IX (rFIX) saatiin analogisella tavalla kuin rPS (esimerkki l.a).

15 Pylväs regeneroitiin valmistajan ohjeiden mukaises ti ja tasapainotettiin puskurilla A. Sen jälkeen 1997 ml soluviljelmän supernatanttia, joka sisälsi rekombinantti-sen tekijä IX:n lisättiin nopeudella 10 ml/min pylvääseen. Pylvääseen sitoutumaton materiaali poistettiin samalla 20 virtausnopeudella pesemällä puskurilla A. Sen jälkeen pylväs pestiin ensin puskurilla B ja sen jälkeen puskurilla C. Seuraava eluointi tehtiin puskurilla D.

t »

Proteiinin adsorptiota seurattiin kromatografian 1 « t ; aikana normaalilla tavalla 280 nm:ssä. Kromatografian ’’·* 25 päättämisen jälkeen proteiinikonsentraatio määritettiin

Bradfordin menetelmän avulla (M. Bradford, Anal. Biochem.

: 72, 248 - 254 (1976). Tekijä IX:n määrä määritettiin kau- : > pallisella hyytymistestillä (tekijä IX:n hyytymistesti,

Immuno).

• 30 Tulokset osoittavat, että melkein kaikki rFalX oli /·. sitoutunut anionivaihtajaan. rFalX eluoitui anioninvaihta- jasta 0,3 M NaCl:ssa. Analogiset tulokset saatiin myös käyttämällä muita kvaternaarisia aminoanioninvaihtajia. Toisaalta käyttämällä Q-Hyper D:tä, väri bromifenolipuna, 35 jota soluviljelmän alusta normaalisti sisältää, eluoitui 15 116526 pylväästä jo suolakonsentraatiossa alle 0,3 M, mikä edisti olennaisesti seuraavaa rFaIX:n eristämistä 0,3 M NaCl:lla. Muilla anioninvaihtajilla ei ole tätä edullista ominaisuutta .

5 Olennaisista tuloksista rFalXrn puhdistamisesta an- ioninvaihtajalla on esitetty yhteenveto kuviossa 4 ja taulukossa 3. Esimerkissä 2.a kuvatulla puhdistuksella rFalX rikastettiin 20-kertaisesti; spesifinen aktiivisuus lisääntyi 12-kertaisesti.

10 Taulukko 3 Näyte Tilavuus Proteiinia Tekijä IX:n Spesifinen aktiivisuus aktiivisuus (ml) (mg/ml) (mU/ml) (U/mg)

Solujen 15 supernatantti 1997 0,178 100 0,56

Sitoutumaton fraktio 2100 0,091 0 0 0,18 M NaCl 94 0,382 162 0,41 0,3 M NaCl 94 0,300 2099 6.86 20 1 M NaCl 93 0.09 32 0,35 b) rFalXrn puhdistus adsorboimalla mukana olevat proteiinit anioninvaihtokromatografiällä lisäämällä kal-siumioneja Q-Hyper D palveli anioninvaihtajana, kuten myös 25 esimerkissä 2.a).

: : : Materiaalit: * » :Y: Pylväs: Q-Hyper D, Sepracor; 2 cm x 4 cm » t

Laite: Pharmacia FPLC LCC-500 : Puskuri A: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,4 * * # 30 Puskuri B: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,4, 015 M NaCl, 1 * t 10 mM CaCl2 . , Puskuri C: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,4, 1,0 M NaCl > * · · Pylväs regeneroitiin valmistajan ohjeiden mukaises- » '·*·" ti ja tasapainotettiin puskurilla A. 85 ml rekombinantti- 35 tekijä IX:ää, joka oli saatu esimerkissä 2.a) kuvatulla tavalla, laimennettiin 2-kertaisesti puskurilla A niin, että NaCl:n konsentraatio pieneni 0,15 M:ksi. Lisättiin

CaCl2:ta konsentraatioon 10 mM. Sen jälkeen proteiiniseos

! I

16 116526 lisättiin pylvääseen ja sitoutumaton proteiini pestiin ulos pylväästä puskurilla B. Pylvääseen sitoutunut proteiini eluoitiin puskurilla C. Kromatografiän kulkua seurattiin, kuten esimerkissä 2.a) on kuvattu. Proteiinikon-5 sentraatiot ja entsyymiaktiivisuudet määritettiin.

Tulokset osoittavat, että rFalX kulki pylvään läpi esteittä, kun taas pääosa muista proteiineista pysyi kiinnittyneenä pylvääseen. Nämä kontaminoivat proteiinit eluoitiin sitten 1 M NaCl:11a.

10 Olennaisista tuloksista on esitetty yhteenveto ku viossa 5, kuviossa 6 ja taulukossa 4. Esimerkissä 2.b) esitetyllä puhdistuksella rFalXzn spesifinen aktiivisuus lisääntyi 4-kertaiseksi. Denaturoiva elektroforeesianalyy-si Laemmlin menetelmän mukaisesti osoitti (kuvio 6), että 15 esimerkissä 2.b) kuvatulla puhdistuksella rFalX eristettiin enemmän kuin 80-prosenttisesti puhtaana.

Taulukko 4 Näyte Tilavuus Proteiinia Tekijä IX:n Spesifinen aktiivisuus aktiivisuus 20 (ml) (mg/ml) (mU/ml) (U/mg)

Valmiste esimerkistä 2a 170 0.153 1040 6.7

Sitoutumaton i , : fraktio 200 0.04 1076 27.5 25 1 NaCl 20 0,45 0 0

» f I

; c) rFalXzn puhdistus affiniteettikromatografialla • t ·

Seuraavassa rFalX, joka oli saatu, kuten esimerkis- » * sä 2.a) on kuvattu, puhdistettiin affiniteettikromatogra- ί fialla. Affiniteettimatriisina käytettiin Heparin-Sepha- I | * V * 30 rosea.

Materiaalit: * ;’j Pylväs: HiTraP hepariini, Pharmacia, 5 ml

Laite: Pharmacia FPLC LCC-500

• 1 I

Puskuri A: 50 mM Tr is, 20 mM natriumsitraatti, pH

35 7,4 t

Puskuri B: 50 mM Tris, 20 mM natriumsitraatti, pH

7,4, 0,15 M NaCl ! » » 17 116526

Puskuri C: 50 mM Tris, 20 mM natriumsitraatti, pH

7.4, 0,3 M NaCl

Puskuri D: 50 mM Tris, 20 mM natriumsitraatti, pH

7.4, IM NaCl 5 Pylväs regeneroitiin valmistajan ohjeiden mukaises ti ja tasapainotettiin puskurilla A. 78 ml rFalXrää, joka oli saatu esimerkissä 2.a) kuvatulla tavalla, lisättiin pylvääseen ja sitoutumaton proteiini pestiin pylväästä puskurilla A. Sen jälkeen pylvästä eluoitiin puskurilla B, 10 sen jälkeen puskurilla C. Seuraava eluointi tehtiin puskurilla D. Kromatografiän kulkua seurattiin, kuten esimerkissä 2.a) on kuvattu; proteiinikonsentraatiot ja entsyymiaktiivisuudet määritettiin.

Tulokset osoittavat, että rFalX oli täysin sitoutu-15 nut pylvääseen ja eluoitui siitä ensimmäisenä 0,3 M NaCl:11a. Tällä menetelmällä kuitenkin muut proteiinit eluoituivat samanaikaisesti rFaIX:n kanssa, eivätkä siten erottuneet rFaIX:sta. rFaIX:n spesifinen aktiivisuus lisääntyi ainoastaan 4,5-kertaisesti esimerkissä 2.c) esite-20 tyllä menetelmällä.

Olennaisista tuloksista on esitetty yhteenveto ku- , . viossa 7 ja taulukossa 5.

• · · ";*** Taulukko 5 « · · *,*,* Näyte Tilavuus Proteiinia Tekijä IX:n Spesifinen 25 aktiivisuus aktiivisuus • · · ·.» (ml) (mg/ral) (mU/ml) (U/mg) ».»* Valmiste \ esimerkistä 2a 78 0,121 788 6.5 • * · · •·· Sitoutumaton • · » *·' ‘ 30 fraktio 90 0.038 0 0 0,15 M NaCl 10 0.10 0 0 ; 0.3 M NaCl 22 0.053 1572 29,6 ·;; * Esimerkki 3 ’···’ rFaIX:n puhdistus kytkemällä suoraan anioninvaihto- 35 kromatografia ja affiniteettikromatografia.

·;· * Seuraavassa esimerkissä rFalX, joka saatiin, kuten esimerkissä 2.a) on kuvattu, puhdistettiin siten, että se 18 116526 laitettiin ensin anioninvaihtajaan ja sen jälkeen affini-teettikromatografiapylvääseen. Q-Hyper D toimi anionin-vaihtajana; tämä on aminotyyppinen anioninvaihtaja, jolla on hyperdiffuusio-ominaisuudet. Affiniteettimatriisina 5 käytettiin hepariini-Sepharosea (HiTrapR Heparin, Pharmacia). Q-Hyper D -pylväs kiinnitettiin suoraan sarjassa ennen hepariini-Sepharose-pylvästä. Vain minimiin rajoitettu taipuisa putkiyhteys, jossa oli haluttaessa venttiili, kiinnitettiin pylväiden välille.

10 Materiaalit:

Pylväs 1: Q-Hyper D , Sepracor: 2 cm x 4 cm Pylväs 2: HiTrap Heparin, Pharmacia: 5 ml Laite: Pharmacia FPLC LCC-500

Puskuri A: 20 mM Tris/HCl, pH 7,4 15 Puskuri B: 20 mM Tris/HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2

Puskuri C: 20 mM Tris/HCl, pH 7,4, 1,0 M NaCl

Puskuri D: 50 mM Tris, 20 mM natriumsitraatti, pH

7.4, 0,15 M NaCl

20 Puskuri E: 50 mM Tris, 20 mM natriumsitraatti, pH

7.4, 0,3 M NaCl

. , Puskuri F: 50 mM Tris, 20 mM natriumsitraatti, pH

7.4, IM NaCl '·*’* Anioninvaihtajalla varustetun pylvään ulostulotie *.·.· 25 oli yhdistetty suoraan af finiteettikromatografiapylvään ·...· sisäänmenoaukkoon taipuisalla putkella niin, että neste- • <;· j virta kulki ensin pylvään 1 läpi ja sen jälkeen suoraan : : : pylvään 2 läpi.

Pylväät regeneroitiin valmistajan ohjeiden mukai-: 30 sesti ja tasapainotettiin puskurilla B. 70 ml rFaIX:ää, t i i · ,···, joka oli eristetty soluviljelmän supernatantista esimer- kissä 2.a) kuvatulla tavalla, laimennettiin 2-kertaisesti puskurilla A niin, että NaCl: n konsentraatio pieneni 0,15 M:ksi. Lisättiin CaCl2:ta, kunnes sen konsentraatio . 35 oli 10 mM. Sen jälkeen proteiiniseos ajettiin pylvään 1 19 116526 läpi (Q-Hyper DR) 2,5 ral/min ja siirrettiin suoraan pylvääseen 2 (hepariini-Sepharose), ja sitoutumaton proteiini pestiin pylväistä puskurilla B. Sen jälkeen pylväs 1 erotettiin affiniteettipylväästä ja nestevirta laitettiin 5 suoraan pylvääseen 2. Samoin kuin esimerkissä 2.c) kuvatussa menetelmässä, sitoutumaton proteiini hepariinipyl-väästä poistettiin pesemällä puskurilla D. Hepariinipyl-vään eluointi suoritettiin puskurilla E. Seuraava eluointi tehtiin puskurilla F. Samanlaiset tulokset saatiin, kun 10 näytteen lisäämisen jälkeen Q-Hyper DR -pylvästä ei irrotettu hepariinipylväästä, vaan sen sijaan nestevirta hepa-riinipylvään eluoimista varten johdettiin suoraan heparii-nipylvääseen liitosventtiilin kautta.

Pylvääseen 1 (Q-Hyper DR) sitoutuneet proteiinit 15 eluoitiin puskurilla C.

Kromatografian kulkua seurattiin, kuten esimerkissä 2.a) on kuvattu; proteiinikonsentraatiot ja entsyymiaktiivisuudet määritettiin.

Tulokset osoittavat, että ajamalla näyte lisätyn 20 Q-Hyper DR -pylvään läpi, rFalX kulkee pylvään läpi esteettä, ja adsorboituu täysin sen jälkeen asetettuun heparii-, . nipylvääseen. rFalX eluoitiin jälkimmäisestä 0,3 M

NaCl: 11a.

'**·' Olennaisista tuloksista on esitetty yhteenveto ku- *.·.· 25 viossa 8, kuviossa 9 ja taulukossa 6.

rFalX rikastetaan 8,4-kertaisesti esimerkissä 3 jt· j kuvatulla puhdistuksella; spesifinen aktiivisuus lisääntyy :T: 8,8-kertaisesti. Denaturoiva elektroforeettinen analyysi (Laemmlin mukaisesti) osoitti (kuvio 9), että rFalX eris-:30 tetään enemmän kuin 95-prosenttisesti puhtaana esimerkissä 3 kuvatulla puhdistuksella.

» · ’’·* Esimerkissä 3 rFaIX:n puhdistus toteutettiin yhdis- ‘...· tämällä suoraan menetelmät esimerkeistä 2.a), b) ja c), jolloin käytettiin samaa aloitusmateriaalia. Verrattuna . 35 puhdistukseen esimerkistä 2.c) saavutettiin kuitenkin 20 116526 suurempi rikastuminen ja suurempi spesifinen aktiivisuus yhdistämällä anioninvaihtokromatografia ja affiniteetti-kromatografia. Yhdistämällä kumpikin kromatografiamenetel-mä, sellaiset kontaminoivat proteiinit, jotka vaikuttavat 5 epäsuotuisasti erotteluprosessiin aff initeettisubstraatis-sa, erottuvat ilmeisesti etukäteen, jolloin seuraa affini-teettisubstraatin suurempi spesifisyys ja selektiivisyys. Taulukko 6 Näyte Tilavuus Proteiinia Tekijä IX:n Spesifinen 10 aktiivisuus aktiivisuus (nti) (mg/ml) (mU/ml) (U/mg)

Valmiste esimerkistä 2a 148 0,0196 123 6,3

Sitoutumaton 15 fraktio 160 0,01 0 0 0,15 M NaCl 32 0,01 0 0 0.3 M NaCl 10 0,019 1041 54.8 1 M NaCl 30 0.015 0 0

Esimerkki 4 20 rFallzn puhdistus anioninvaihtokromatografiällä.

Seuraavassa esimerkissä käytettiin kvaternaarista aminotyypin anioninvaihtajaa, jolla oli tentakkelirakenne (Fraktogel EMD TMAE 650 M, Merck).

Materiaalit: : 25 Pylväs: Fraktogel EMD TMAE 650 M, Merck, 1,6 cm x :Y: 5 cm

Laite: Pharmacia FPLC LCC-500 järjestelmä < « .*·. Puskuri A: 50 mM Tris/HCl, pH 7,4 • · : Puskuri B: 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl

I I I

Y.‘ 30 Puskuri C: 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, 300 mM NaCl * Puskuri D: 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, IM NaCl

Rekombinantti tekijä II eristettiin soluviljelytek- :·: ‘ niikan tavallisten laboratoriomenetelmien mukaisesti ·...’ (Falkner et ai., Thrombosis and Haemostasis, 68, 119 - 124 ;·*·. 35 (1992)).

rFaII:n ekspressio tapahtui kaupallisesti saataval- • la synteettisellä DMEM-alustalla. Soluista puhdas viljel-män supernatantti saatiin sentrifugoimalla.

21 116526

Pylväs regeneroitiin valmistajan ohjeiden mukaisesti ja tasapainotettiin puskurilla A. Sen jälkeen pylvääseen lisättiin nopeudella 4 ml/min 200 ml soluviljelmän supernatanttia, joka sisälsi rekombinantin tekijä II:n.

5 Pylvääseen sitoutumaton materiaali poistettiin pesemällä puskurilla A samalla virtausnopeudella. Sen jälkeen pylväs pestiin ensin puskurilla B ja sen jälkeen puskurilla C. Sitten seuraava eluointi tehtiin puskurilla D. Proteiinin adrorptiota seurattiin tavanomaisella tavalla 280 nm:ssa 10 kromatografiän aikana. Kromatografiän jälkeen proteiini- konsentraatio määritettiin Bradfordin menetelmällä. Tekijä II:n määrä määritettiin hyytymistestillä (Thrombinzeit, Immuno AG).

Havaittiin, että melkein koko rFall oli sitoutunut 15 anioninvaihtogeeliin. rFall eluoitiin anioninvaihtajasta 0,3 M NaCl:11a. Lisäksi - päinvastoin kuin muissa amino-tyypin anioninvaihtajissa, kuten esimerkiksi MacroPrepK (Bio-Rad) tai Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) - väri bromifenolipuna, jota soluviljelmien supernatantti ylei-20 sesti sisältää, oli eluoitunut pylväästä jo suolakonsent-raatiossa 0,2 M NaCl, mikä edisti olennaisesti seuraavaa .. rFaII:n eristämistä 0,3 M NaCl:lla.

* * · • · · ; ; Olennaisista tuloksista rFall:n puhdistuksesta ani- **'·' oninvaihtajalla on esitetty yhteenveto kuviossa 10 ja tau- 25 lukossa 7. Esimerkissä 4 kuvatulla puhdistuksella rFall:n spesifinen aktiivisuus lisääntyi 3,5-kertaisesti.

·,· j Taulukko 7 ; ; l Näyte Tilavuus Proteiinia Tekijä ll:n Spesifinen aktiivisuus aktiivisuus 30 (ml) (mg/ml) (rnU/ml) (U/mg) Ϊ l l Solujen kasvualusta 200 0,45 50 0,1 • · **· Sitoutumaton ,***, fraktio 200 0,177 2 0,01 35 0.2 M NaCl 40 0.4 6 0.015 0,3 M NaCl 45 0.36 150 0,42 ’ , 0,5 M NaCl 32 0,25 0 0 22 116526 b) rFalltn puhdistus mukana olevien proteiinien adsorptiolla anioninvaihtokromatografian avulla lisäämällä kalsiumioneja

Fraktogel EMD TMAE 650 M (Merck) palveli anionin-5 vaihtohartsina.

Materiaalit:

Pylväs: Fraktogel EMD TMAE 650 M, Merck, 1,6 cm x 5 cm

Laite: Pharmacia FPLC LCC-500 10 Puskuri A: 50 mM Tris/HCl, pH 7,4

Puskuri B: 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2

Puskuri C: 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, 1,0 mM NaCl Pylväs regeneroitiin valmistajan ohjeiden mukaises-15 ti ja tasapainotettiin puskurilla B. Rekombinantti tekijä II, joka oli eristetty soluviljelmän supernatantista esimerkissä 4a) kuvatulla tavalla, laimennettiin 2-kertaises-ti puskurilla A niin, että NaCl:n konsentraatio oli kokonaisuudessaan vähemmän kuin 0,2 M. Lisättiin CaCl2:ta, kun-20 nes konsentraatio oli 10 mM. Sen jälkeen proteiiniseos lisättiin pylvääseen ja sitoutumaton proteiini pestiin . . ulos pylväästä puskurilla B. Sitoutunut proteiini eluoi- ; tiin puskurilla C.

Kromatografian kulkua seurattiin, kuten edeltävässä \V 25 esimerkissä, ja proteiinikonsentraatiot määritettiin. Tu- ·...* lokset osoittavat, että rFall kulki pylvään läpi esteittä, >,· | kun taas suurin osa kontaminoivista proteiineista pysyi

: : : kiinni pylväässä. Nämä proteiinit eluoitiin sitten 1 M

NaCl:11a.

j 30 Olennaisista tuloksista on esitetty yhteenveto ku- » » * · viossa 11, kuviossa 12 ja taulukossa 8. Esimerkissä 4.a) • · '·* ja b) kuvatulla puhdistuksella rFaII:n spesifinen aktiivi- suus lisääntyi 11-kertaisesti.

'·”· Laemmlin menetelmän mukainen denaturoiva elektrofo- . 35 reettinen analyysi osoitti (kuvio 9), että esimerkissä 23 116526 4.a) ja b) kuvatulla puhdistuksella rFall eristettiin enemmän kuin 95-prosenttisesti puhtaana.

Taulukko 8 Näyte Tilavuus Proteiinia Tekijä ll:n Spesifinen 5 aktiivisuus aktiivisuus (ml) (mg/ml) (mU/ml) (U/mg)

Valmiste esimerkistä 4a 80 0,18 75 0,41 S i toutumaton 10 fraktio 80 0,015 75 4.6 1,0 M NaCl 15 0,62 0 0 > *

Claims (12)

1 1 6526

1. Menetelmä K-vitamiinista riippuvaisen proteiinin erottamiseksi sen mukana olevista K-vitamiinista riip- 5 pumattomista proteiineista liuoksesta, joka sisältää proteiineja, tunnettu siitä, että menetelmässä lisätään kalsiumioneja tähän liuokseen, ja tämä kalsiumia sisältävä liuos saatetaan yhteyteen anioninvaihtajan kanssa olosuhteissa, joissa mukana olevat proteiinit adsorboituvat, 10 mutta ei K-vitamiinista riippuvainen proteiini.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että K-vitamiinista riippuvaista proteiinia sisältävä liuos saatetaan lisäksi yhteyteen anionin-vaihtajan kanssa olosuhteissa, joissa K-vitamiinista riip- 15 puvainen proteiini adsorboituu vaihtajaan, pestään, eluoi-daan ja haluttaessa eluentin ionivahvuutta pienennetään.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ei-adsorboitunut, K-vitamiinista riippuvainen proteiini adsorboituu affiniteettikantajaan 20 ja eluoituu selektiivisesti.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se toteutetaan menetelmän vaiheel- Y: la patenttivaatimusten 2 ja/tai 3 mukaisesti missä tahansa yhdistelmässä tai järjestyksessä.

5. Patenttivaatimusten 1 ja 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erotteluvaiheet toteutetaan samal- • · · la anioninvaihtaj alla, edullisesti kromatograf iän avulla. » · * · * 6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että anioninvaihtaj alla on hy- * · *. 30 perdif fuusio-ominaisuudet.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, » tunnettu siitä, että käytetään kantajaa Q-Hyper DR anioninvaihtaj ana.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen mene- » * » *·' 35 telmä, tunnettu siitä, että anioninvaihtaj alla on ten- » » » takkelirakenne. 116526

9. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiiniliuoksen ionivahvuus pienennetään eluoinnin jälkeen 0,15 - 0,2 M:ksi.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen me- 5 netelmä, tunnettu siitä, että K-vitamiinista riippuvainen proteiini valitaan seuraavista: FII, FVII, FIX, FX, proteiini S, proteiini C ja proteiini Z.

11. Menetelmä K-vitamiinista riippuvaisen proteiinin talteenottamiseksi jonkin patenttivaatimuksen 1-10 10 mukaisesti.

12. Menetelmä K-vitamiinista riippumattoman, mukana olevan proteiinin talteenottamiseksi jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukaisesti. < » f <. # * I · * · • t » • * * » ‘ I * » · • » * · < > t » 1 · 116526 Patentkr&v