NO322372B1

NO322372B1 - Fremgangsmate for separasjon av et vitamin K-avhengig protein fra ikke-vitamin K-avhengige, medfolgende proteiner fra en proteinholdig losning

Info

Publication number: NO322372B1
Application number: NO19950733A
Authority: NO
Inventors: Artur Mitterer; Friedrich Dorner; Bernhard Fischer
Original assignee: Baxter Ag
Priority date: 1994-02-28
Filing date: 1995-02-27
Publication date: 2006-09-25
Also published as: CZ53995A3; FI116526B; ES2161790T3; FI950888A0; CA2143510A1; NO950733D0; CA2143510C; FI950888A; NO950733L; HU9500594D0; HU219828B; HUT72844A; EP0669342B1; DK0669342T3; CZ290471B6; EP0669342A2; ATE205218T1; EP0669342A3; US5633350A; DE4406515C1

Description

Foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåte for separasjon av et vitamin K-avhengig protein fra ikke-vitamin K-avhengige, medfølgende proteiner fra en proteinholdig løsning.

Bortsett fra de naturlig forekommende proteinene er det i dag mulig ved hjelp av genteknologimetoder å fremstille pattedyrproteiner ved hjelp av rekombinantteknikker, spesielt menneskeproteiner. For dette formål dyrkes vertsceller som er omdannet eller transfektert med fremmed DNA, hvori det rekombinant fremstilte protein når det gjelder eukaryote vertsceller frigjøres i løselig form i cellekulturmediet (R.G. Werner og W. Berthold, Drug Res., 38, 422-428 (1988)). Siden vertscellene også frigjør andre proteiner i cellekulturmediet i tillegg til det ønskede rekombinant fremstilte protein, er det imidlertid nødvendig å anrike og/eller isolere det ønskede protein i ett eller flere rensetrinn. Når det gjelder dette, behøves fremgangsmåter som effektivt og selektivt tillater isolasjon av rekombinante proteiner fra cellekulturmediet.

Som regel anvendes proteinenes fysiske og kjemiske egenskaper for rensing av rekombinante proteiner. Slike egenskaper er proteinenes størrelse, overflatens naturlige ladning, proteinenes hydrofilisitet eller løselighet. Ytterligere rensemetoder angår bindingen med andre molekyler, som f.eks. antistoffer. Det samme gjelder for rensing av proteiner fra naturlige kilder. Basert på et proteins fysiske og kjemiske egenskaper forekommer også her en separasjon av proteinet fra de gjenværende, medfølgende proteiner.

Proteiner som er avhengige av vitamin K, er hittil renset ifølge slike metoder som proteinutfelling, ioneveksler-kromatografi og gelfiltrering (A.L. Bloom og D.P. Thomas, Haemostasis and Thrombosis, Churchill Livingstone, New York, 1987). B. Dahlbåck (Biochem. J., 209, 837-846 (1983)) beskriver en rensemetode for protein S (PS). Etter en bariumsitrat-utfelling isoleres PS på DEAE-Sephacel. J. Malm et al. (Eur. J. Biochem., 187, 737-743 (1990)) renset rekombinant PS (rPS) ved affinitetskromatografi på et monoklonalt antistoff. Faktor IX (FaIX) ble isolert av B. Osterude og R. -Flengsrud (Biochem. J. 145, 469-474 (1975)) ved bariumsulfatutfelling og ione-vekslerkromatografi på cellulose..Monoklonale antistoffer ble brukt av H. Kim et al. (Sem. Hematol., 28, Suppl. 6, 15-19 (19-91)) for rensing av FalX.

US patentskrift nr. 5 055 557 beskriver en fremgangsmåte for rensing og konsentrering av proteiner som er avhengige av vitamin K, fra plasma så vel som rekombinant fremstilte proteiner, ved hjelp av en immunadsorbent ved bruk av et monoklonalt antistoff.

I de ovenfor nevnte fremgangsmåtene må det tas hensyn til det faktum at mange proteiners egenskaper ikke skiller seg særlig fra hverandre, hvilket gjør deres fraksjonering vanske-ligere. Det er derfor nødvendig å anvende kombinasjoner av nøyaktige, samkoordinerte rensetrinn for optimalt å dra fordel av forskjeller i proteinenes egenskaper.

En rekke proteiner som forekommer naturlig i mennéske-og dyreblod, kan binde toverdige kationer. Slike proteiner syntetiseres i en fremgangsmåte som er avhengig av vitamin K, i cellen der kationbindingssteder oppstår ved omdannelse av glutaminsyre (Glu) til gamma-karboksyglutaminsyre (Gla). Disse kationbindingsstedene kan så mettes med kalsiumioner (Ca2+) . I tillegg til kalsiumioner er disse kation-bindingsstedene også som regel i stand til å binde toverdig strontium eller barium (B. Furie og B.C. Furie, Cell 53, 508-518 (1988)).

Mange av disse vitamin K-avhengige proteinene er komponenter i blodplasmaet og kan spille en betydelig rolle i homøostase. Gamma-karboksyglutaminsyregruppene i disse vitamin K-avhengige proteinene finnes i de strukturelt homologe N-terminale Gla-områdene (A. Tulinsky, Thromb. Haemost. 66, 16-31

(1991)). Blant disse kalsiumionbindende proteinene med homologe Gla-områder er blant andre protein S (PS), protein C, faktor IX (FalX), faktor II, faktor VII, faktor X og protein Z.

Som en følge av bindingen av kalsiumioner oppviser disse proteinene definitivt forandrede egenskaper sammenlignet med ikke-kalsiumbindende proteiner. Denne forskjell utnyttes i EP 363 126 for rensing av proteiner. EP 363 126 beskriver en fremgangsmåte for isolasjon av proteiner som er avhengige av vitamin K som oppnås rekombinant. Derved fjernes de toverdige kationene fullstendig ved addisjon av en chelatorkomponent til kulturmediet før den aktuelle proteinisolasjonen, og proteinet blir derved i stand til å bindes til en ionevekslerharpiks som f.eks. Mono Q. Videre elueres proteinet fra en anionveksler ved tilsetning av NaCl og Ca<2+->ioner. Derved ble det oppnådd et 58 % anriket produkt (protein C). Forurensningene (42 %) utgjør slike proteiner som også frigjøres fra ioneveksleren ved den anvendte saltkonsentrasjonen (0,15 M). I et ytterligere rensetrinn adsorberes det oppnådde protein-kationkomplekset på en kolonne på hvilken immobilisert EDTA er bundet, vaskes, og proteinet elueres. Proteinene i elueringsmidlet bindes til en in-line-ioneveksler og elueres med en saltgradient. Etter tilsetning av CaCl2 i elueringsmidlet adsorberes protein-kationkomplekset på en hydrofob kolonne, og det ønskede protein elueres med EDTA-buffer.

Ulempen med den fremgangsmåten som er beskrevet i EP 363 126, er at det inntrer en omfattende strukturforandring av det vitamin K-avhengige protein ved den gjentatte fjerning og tilsetning av kalsiumioner som fører til forandringer i proteinets egenskaper (Johanson et al., J. Biol. Chem., 258, 5554-5560 (1993); J. Stenflo, J. Biol. Chem., 251, 355-363

(1976)). I motsetning til dette .er det ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjort tilgjengelig en fremgangsmåte som ikke har disse ulemper fordi det ikke er nødvendig med noen prosesstrinn for fjerning av toverdige metallioner, f.eks. chelatorer, under hele renseprosessen.

Fordelen ved foreliggende oppfinnelse er at den opp-rinnelige strukturen og stabiliteten til det vitamin K-avhengige protein bevares under rensingen.

EP 354 454 beskriver en fremgangsmåte for anrikning av de blodkoagulerende faktorene II, VII, IX og X. De ovenfor nevnte protrombinkompleksfaktorene isoleres ved adsorpsjon på en matriks som har alfa-hydroksylaminogrupper, hvori spesielt faktor IX er sterkt bundet. Som en funksjon av ionestyrken elueres faktorene II, VII og X tidligere. Tilsetningen av kalsiumioner spiller ingen rolle i denne metoden.

EP 317 376 beskriver en fremgangsmåte for separasjon av en faktor IX-holdig human plasmafraksjon hvori kryoutfelling først forhåndsrenses kromatografisk, så utføres en separasjon ved anionvekslerkromatografi og selektiv eluering med en buffer med økende ionestyrke, og til slutt utføres affinitetskromatografi på Heparin-Sepharose med selektiv eluering. Denne fremgangsmåten tar heller ikke i betraktning de endrede proteinegenskapene til faktor IX i nærvær eller fravær av kalsiumioner.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å til-gjengeliggjøre en fremgangsmåte for separasjon av et vitamin K-avhengig protein fra ikke-vitamin K-avhengige, medfølgende proteiner fra en proteinholdig løsning, kjennetegnet ved at kalsiumioner tilsettes til denne løsning og den kalsiumholdige løsning bringes i kontakt med en anionveksler under betingelser i hvilke medfølgende proteiner, men ikke det vitamin K-avhengige protein, adsorberes.

Oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte for utvinning av et vitamin K-avhengig protein ifølge oppfinnelsen, samt fremgangsmåte for utvinning av et ikke-vitamin K-avhengig, medfølgende protein ifølge oppfinnelsen.

Det ovenstående formål løses ifølge oppfinnelsen ved hjelp av de fremgangsmåter som er vist i kravene.

Cellekultursupernatanter, så vel som cellekulturmedium behandlet på annen måte, supernatanter fra vevskulturer eller proteinløsninger fra naturlige kilder som omfatter vitamin K-avhengige proteiner, kromatograferes f.eks. først ved hjelp av en anionveksler i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. En spes-iell fjerning av toverdige kationer fra proteinløsningen før kromatografitrinnet er ikke nødvendig, i motsetning til den metode som er beskrevet i EP 363 126. Det ble overraskende fastslått at ved tilsetning av små mengder kalsiumioner ved lav saltkonsentrasjon forekommer ingen binding av det vitamin K-avhengige protein, men likevel binding av ikke-vitamin K-avhengige proteiner på anionveksleren. For første gang ble en ny type anionveksler med hyperdiffusjonsegenskaper, f.eks. Q-Hyper D (Sepractor) brukt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for separasjon av vitamin K-avhengige og ikke-vitamin K-avhengige proteiner. Anionvekslerkromatografi følges så av affinitetskromatografi - så lenge som en ytterligere proteinrensing er ønskelig.

Løsningen av vitamin K-avhengig protein kan anrikes ved et ytterligere proteinkonsentreringstrinn uten tidligere fjerning av toverdige kationer fra proteinløsningen, filtreres deretter gjennom en anionveksler og eventuelt også kromatograferes ved hjelp av en affinitetskolonne.

Ifølge et foretrukket alternativ filtreres det proteinkonsentrat som er anriket i et forhåndsrensetrinn (1. trinn) gjennom en anionveksler (2. trinn) og påføres så direkte på en affinitetskolonne. Den foretrukne kombinasjon er karakterisert som følger: (a) En løsning omfattende et vitamin K-avhengig protein bringes i kontakt med en anionveksler hvori det vitamin K-avhengige protein adsorberes på veksleren og elueres deretter med økende saltkonsentrasjon, hvoretter saltkonsentrasjonen i elueringsmidlet reduseres, (b) kalsiumionet tilsettes til elueringsmidlet fra (a), og dette bringes igjen i kontakt med en anionveksler under betingelser i hvilke de med-følgende proteinene, likevel ikke det vitamin K-avhengige protein, adsorberes, (c) det ikke-adsorberte vitamin K-avhengige protein fra (b) adsorberes på et affinitetssubstrat og elueres selektivt.

Den ovenfor nevnte foretrukne kombinasjon av fremgangsmåtetrinn illustreres nærmere som følger: I proteinkonsentreringstrinnet (1. trinn) bringes en løsning som omfatter et rekombinant eller naturlig vitamin K-avhengig protein i kontakt med en anionveksler. Dette kan foregå ganske enkelt ved blanding under føring over en kolonne. Det vitamin K-avhengige protein finnes dessuten sammen med de medfølgende proteinene i en saltløsning med lavere konsentrasjon (minimal saltkonsentrasjon). Under disse betingelser bindes det vitamin K-avhengige protein på anionveksleren sammen med en rekke andre proteiner. Ved å øke saltkonsentrasjonen (ionestyrken) frigjøres det vitamin K-avhengige protein således heretter selektivt fra veksleren.

Cellekultursupernatanter omfatter som regel et farge-stoff som indikerer pH-status. Dette fargestoffet, som f.eks. fenolrødt, gjør den klare proteinløsningen uklar, bindes sterkt til vanlige anionvekslere, som f.eks. Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia) eller MacroPrep (Bio-Rad), og adsorberer lyset ved proteinbestemmelsens bølgelengde, dvs. 280 nm. Dette fører til en hindring av rensingen av proteiner fra cellekulturmedium. For å oppnå en forbedring her ble for første gang cellekultursupernatanter ifølge oppfinnelsen filtrert over en anionveksler med hyperdiffusjonsegenskaper (Q-Hyper D, Sepracor). Det ble •derved vist at deri uspesifikke bindingen av fargestoffet fenolrødt reduseres til et minimum ved bruk av Q-Hyper D som en anionveksler. Fargestoffet er allerede eluert -fra anionveksleren ved saltkonsentrasjoner under den minimale konsentrasjonen. På denne måten kunne de eluerte proteinene bedre påvises under kromatografien. Dessuten unngås en forstyrrende, konkurrerende reaksjon mellom proteinene og fargestoffet på ioneveksleren i stor grad.

Den videre anionvekslerkromatografien (2. trinn) be-står i det faktum at ionestyrken til den løsning som omfatter det vitamin K-avhengige protein, reduseres til en verdi under den minimale saltkonsentrasjonen ved dialyse eller fortynning med saltfri buffer, og små mengder kalsiumioner tilsettes. Proteinløsningen bringes så igjen i kontakt med anionveksleren og/eller filtreres gjennom denne. Det ble derved overraskende fastslått at vitamin K-avhengige proteiner ikke bindes på anionveksleren, og de ikke-vitamin K-avhengige, medfølgende proteinene adsorberes på substratet. Dette er et resultat av den forskjellige ladningen på proteinene på grunn av bindingen av Ca-ioner. Det vitamin K-avhengige protein, som nå er ytterligere renset fra de forurensende proteinene i det foregående trinn, oppnås derved direkte (uten ytterligere saltavhengig eluering).

I mange tilfeller av proteinrensing er en kombinasjon av et forhåndsrensetrinn (1. trinn) og en rensing på en anionveksler (2. trinn) tilstrekkelig. Derved er det andre rensetrinnet så mye mer effektivt, med mindre det vitamin K-avhengige protein som skal separeres, er forurenset med med-følgende proteiner.

I det andre rensetrinnet på anionveksleren er det vitamin K-avhengige protein ikke bundet på anionveksleren ved valg av en viss saltkonsentrasjon under den minimale saltkonsentrasjonen for bandbredden og ved tilsetning av kalsiumioner.

Ved utnyttelsen av de kalsiumbindende egenskapene til de vitamin K-avhengige proteinene med Gla-området separeres disse fra de medfølgende proteinene ved at ved visse ione-styrker bindes bare de medfølgende proteinene til anionveksleren, mens de vitamin K-avhengige proteinene går gjennom anionveksleren uten binding til den. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er derfor, bortsett fra vitamin K-avhengige proteiner fra naturlige kilder, spesielt egnet for rensing av rekombinante vitamin K-avhengige proteiner med Gla-område, som f.eks. protein C, faktor IX, faktor II, faktor VII, protein S og protein Z.

For de ovenfor nevnte trinnene 1 og 2 foretrekkes det å anvende samme anionveksler, hvorved det oppnås spesielt gode resultater når anionvekslerkromatografien foregår på en kolonne.

I in-line-metoden (3. trinn), nemlig affinitets-kromatografien, forekommer det en binding av det vitamin K-avhengige protein på affinitetsmatriksen. I dette trinn adsorberes det vitamin K-avhengige protein på affinitetsmatriksen. I dette tilfellet viser forhåndsrensetrinnet forbundet i serier til anionveksleren seg å være spesielt fordelaktig fordi en rekke forurensende proteiner ble fjernet ved hjelp av dette. Dette fremmer elueringen av det vitamin K-avhengige protein fra affinitetsmatriksen og muliggjør isolasjon av det ønskede protein med høy renhet.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan omfatte et virusinaktiveringstrinn som er kjent for fagmannen fra teknik-kens stand, og som omfatter behandling av løsningene av det vitamin K-avhengige protein med fysisk-kjemiske eller kjemiske metoder. For dette formål kommer behandling i nærvær av anti-virussubstanser, eventuelt kombinert med en strålings- eller varmebehandling, på tale. Ifølge foreliggende oppfinnelse kan virusinaktiveringen foregå før separasjonen av vitamin K-avhengige proteiner fra ikke-vitamin K-avhengige, medfølgende

proteiner.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan bestå av en kombinasjon av rensetrinnene 1, 2 og 3, som kan utføres i en hvilken som helst rekkefølge. Fremgangsmåtetrinnet ifølge krav 1 er derved imidlertid alltid obligatorisk. Figurene 1-12 viser rensetrinn og/eller -resultater som følger: Figur 1.Rensing av rekombinant protein S fra cellekultursupernatant ved kromatografi på Q-Hyper (forhåndstrinn = 1. trinn). Figur 2.Rensing av rekombinant protein S ved kromatografi på Q-Hyper D med tilsetning av kalsiumioner (= 2. trinn). Figur 3.SDS-PAGE-gelelektroforese av renset rekombinant protein S (A: cellekultursupernatant; B: renset rPS). Figur 4:Rensing av rFaIX ved kromatografi på Q-Hyper D

(1. trinn).

Figur 5:Rensing av rFaIX ved kromatografi på Q-Hyper D

med tilsetning av kalsiumioner (2. trinn).

Figur 6:SDS-PAGE-gelelektroforese av rFaIX (A:

cellekultursupernatant; B: renset rFaIX). Figur 7:Rensing av rFaIX ved kromatografi på Heparin-Sepharose {3. trinn). Figur 8:Rensing av rFaIX ved koblet kromatografi på Q-Hyper D og Heparin-Sepharose (2. og

3. trinn).

Figur 9:SDS-PAGE-gelelektroforese av rFaIX (som opp nådd i figur 8). Figur 10.Rensing av rFall fra cellekultursupernatant ved kromatografi på Fraktogel EMD TMAE 650 (1. trinn). Figur 11:Rensing av rFall ved kromatografi på

Fraktogel EMD TMAE 650 (2. trinn).

Figur 12 .-Analyse av rFall ved SDS-PAGE-gelelektroforese (A: cellekultursupernatant; B: renset Fall) .

De følgende eksempler viser rensingen ifølge oppfin-

nelsen av protein S, faktor IX og faktor II.

Eksempel 1

a) Rensing av rPS ved hjelp av anionvekslerkromatografi

I det følgende eksempel ble det anvendt en anionveksler av den kvaternære aminotypen med hyperdiffusjonsegenskaper (Q-Hyper D, Sepracor).

Materialer:

Kolonne: Q-Hyper D> Sepracor; 2 cm x 4 cm. Buffer A:20 mM bis-tris/HCl, pH 7,0.

Buffer B: 20 mM bis-tris/HCl, pH 7,0, 0,18 M NaCl. Buffer C: 20 mM bis-tris/HCl, pH 7,0, 0,4 M NaCl. Buffer D: 20 mM bis-tris/HCl, pH 7,0, 1 M NaCl.

Rekombinant protein (rPS) ble isolert, basert på vanlige laboratoriemetoder, etter infeksjon av Vero-celler (apenyreceller) med kukoppevirus ved hjelp av cellekultur-teknologi. Vero-/kukoppeekspresjonssystemer og cellekultur-betingelser er uttømmende beskrevet av F.G. Falkner et al., Thrombosis and Haemostasis, 68, 119-124 (1992), og N. Barrett et al., AIDS Res., 5, 1598-171 (1989); F. Dorner et al., AIDS Research and Clinical Trials, Marcel Dekker, Inc., New York

(1990). Ekspresjonen av rPS foregår i kommersielt tilgjengelig, syntetisk DMEM-medium. Etter cellekultur ble kultursupernatan-ten isolert ved sentrifugering og inhibert med den syntetiske proteaseinhibitor Pefabloc SC, Pentapharm, til 0,1 mmol/1.

Kolonnen ble regenerert overensstemmende med produ-sentens instruksjoner og brakt i likevekt med buffer A. Deretter ble 485 ml cellekultursupernatant, som inneholdt rekombinant protein S, påført med en hastighet på 10 ml/minutt på kolonnen. Det materialet som ikke ble bundet til kolonnen, ble fjernet med samme strømningshastighet ved vasking med buffer A. Etter dette ble kolonnen først eluert med buffer B og deretter med buffer C. Etterfølgende eluering ble foretatt med buffer D. Proteinadsorpsjonen ble fulgt under kromatografien på normal måte ved 280 nm. Etter utførelsen av kromatografien ble proteinkonsentrasjonen bestemt ved hjelp av Bradford-metoden

(M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976)). Innholdet av protein S ble bestemt ved hjelp av et kommersielt ELISA-system (Asserachrome Protein S, Boehringer Mannheim) så vel som ved hjelp av en koaguleringstest (protein S-koaguleringstest, Boehringer Mannheim).

Det ble funnet at nesten alt rPS var bundet til matriksen. rPS ble eluert fra anionveksleren i 0,4 M NaCl (buffer C).

Ved bruk av den ovenfor nevnte anionveksler var fargestoffet bromfenolrødt, som vanligvis inneholdes i cellekulturmedium, allerede eluert fra kolonnen ved en saltkonsentrasjon på 0,18 M, som i det vesentlige fremmet den etter-følgende isolasjon av rPS ved 0,4 M NaCl. Dette utgjør en fordel sammenlignet med bruk av andre anionvekslere.

De essensielle resultatene av rensingen av rPS på anionveksleren (1. trinn) er oppsummert i figur 1 og tabell 1. Med den rensing som er beskrevet i eksempel 1, ble mengden på

3 % rPS antigen til det totale proteinet i cellekulturmediet økt til 8 % rPS antigen til protein i fraksjonen med 0,4 M NaCl. Den spesifikke aktiviteten økte 25 ganger.

b) Rensing av rPS ved adsorpsjon av medfølgende proteiner ved hjelp av anionvekslerkromatografi med tilsetning

av kalsiumioner ( 2. trinn)

Den samme anionvekslertype ble brukt som beskrevet under 1 a).

Materialer:

Kolonne: Q-Hyper D, Sepracor; 1 cm x 4 cm. Instrument: Pharmacia FPLC LCC-500.

Buffer A:20 mM bis-tris/HCl, pH 7,0.

Buffer B:20 mM bis-tris/HCl, pH 7,0,-0,15.M NaCl, 10

mM CaCl2.

Buffer C: 20 mM bis-tris/HCl, pH 7,0, IM NaCl.

Kolonnen ble regenerert overensstemmende med produ-sentens instruksjoner og brakt i likevekt med buffer B. Rekombinant protein S, som var isolert fra cellekultursupernatanten som beskrevet i eksempel 1 a) , ble fortynnet 2,5 ganger med buffer A, slik at konsentrasjonen av NaCl lå under 0,18 M. CaCl2 med en konsentrasjon på 10 mM ble tilsatt. Deretter ble proteinblandingen påført på kolonnen, og det ubundne proteinet ble vasket ut av kolonnen med buffer B. Bundet protein ble eluert ved hjelp av buffer C. Forløpet av kromatografien ble fulgt som beskrevet i eksempel la), og den respektive proteinkonsentrasjonen ble bestemt.

Resultatene viser at rPS passerte gjennom kolonnen uhindret, mens den overveiende majoritet av de andre proteinene forble på kolonnen. Disse forurensende proteinene ble så eluert med 1 M NaCl. De vesentlige resultatene fra dette forsøket er oppsummert i figur 2, figur 3 og tabell 2.

Ved den rensing som er beskrevet i eksempel 1 b), ble antigeninnholdet i rPS økt 12 ganger i forhold til de andre proteinene. Den spesifikke aktiviteten økte 14 ganger. Den denaturerende, elektroforetiske analysen (U.K. Laemmli, Nature, 227, 680-685 (1970)) viste (figur 3) at ved den rensing som er beskrevet i eksempel 1 b), ble rPS isolert med mer enn 95 % renhet.

Eksempel 2

a) Rensing av rFaIX ved anionvekslerkromatografi

Materialer:

Kolonne: Q-Hyper D, Sepracor; 2 cm x 4 cm. Instrument: Pharmacia FPLC LCC-500.

Buffer A:20 mM bis-tris/HCl, pH 5,5.

Buffer B:20 mM bis-tris/HCl, pH 5,5, 0,18 M NaCl. Buffer C: 20 mM bis-tris/HCl, pH 5,5, 0,3 M NaCl. Buffer D: 20 mM bis-tris/HCl, pH 5,5, 1,0 M NaCl.

Rekombinant faktor IX (rFIX) ble oppnådd på analog måte som for rPS (eksempel 1 a)).

Kolonnen ble regenerert overensstemmende med produ-sentens instruksjoner og brakt i likevekt med buffer A. Deretter ble 1997 ml cellekultursupernatant, som inneholdt rekombinant faktor IX, påført med en hastighet på 10 ml/minutt på kolonnen. Det materialet som ikke var bundet til kolonnen, ble fjernet med samme strømningshastighet ved vasking med buffer A. Etter dette ble kolonnen først vasket med buffer B og deretter med buffer C. Etterfølgende eluering ble foretatt med buffer D.

Proteinadsorpsjonen ble fulgt under kromatografien på vanlig måte ved 280 nm. Etter avsluttet kromatografi ble proteinkonsentrasjonen bestemt ved hjelp av Bradford-metoden (M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976)). Innholdet av faktor IX ble bestemt ved hjelp av en kommersiell koaguleringstest (faktor IX-koagulering, Immuno).

Resultatene viser at nesten all rFaIX ble bundet til anionveksleren. rFaIX ble eluert fra anionveksleren i 0,3 M NaCl. Analoge resultater ble også oppnådd ved bruk av andre kvaternære aminoanionvekslere. Ved bruk av Q-Hyper D var fargestoffet fenolrødt, som normalt inneholdes i cellekulturmedium, på den annen side allerede eluert fra kolonnen ved en saltkonsentrasjon under 0,3 M, som i det vesentlige fremmet den etterfølgende isolasjon av rFaIX ved 0,3 M NaCl. Andre anionvekslere har ikke denne fordelaktige egenskap.

De avgjørende resultatene fra rensingen av rFaIX på anionveksleren er oppsummert i figur 4 og tabell 3. Ved den rensing som er beskrevet i eksempel 2 a), ble rFaIX anriket 20 ganger. Den spesifikke aktiviteten økte 12 ganger.

b) Rensing av rFaIX ved adsorpsjon av medfølgende proteiner ved hjelp av anionvekslerkromatografi med

tilsetning av kalsiumioner

Q-Hyper D tjente som anionveksler slik den også ble brukt i eksempel 2 a).

Materialer:

Kolonne: Q-Hyper D, Sepracor; 2 cm x 4 cm. Instrument: Pharmacia FPLC LCC-500.

Buffer A:20 mM bis-tris/HCl, pH 7,4.

Buffer B:20 mM bis-tris/HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 10

mM CaCl2.

Buffer C: 20 mM bis-tris/HCl, pH 7,4, 1,0 M NaCl.

Kolonnen ble regenerert overensstemmende med produ-sentens instruksjoner og brakt i likevekt med buffer A. 85 ml rekombinant faktor IX, slik den ble oppnådd i eksempel 2 a) , ble fortynnet 2 ganger med buffer A, slik at konsentrasjonen av NaCl ble redusert til 0,15 M. CaCl2 ble tilsatt til 10 mM. Deretter ble proteinblandingen påført, og det ubundne proteinet ble vasket ut av kolonnen med buffer B. Protein som var bundet til kolonnen, ble eluert ved hjelp av buffer C. Forløpet av kromatografien ble fulgt som beskrevet i eksempel 2 a). Proteinkonsentrasjonene og enzymaktivitetene ble bestemt.

Resultatene viser at rFaIX passerte gjennom kolonnen uhindret, mens den overveiende majoritet av de forurensende proteinene forble på kolonnen. Disse forurensende proteinene ble så eluert med 1 M NaCl.

De vesentlige resultatene er oppsummert i figur 5, figur 6 og tabell 4. Ved den rensing som er beskrevet i eksempel 2 b), økte den spesifikke aktivitet til rFaIX 4 ganger. Den denaturerende, elektroforetiske analysen ifølge Laemmli viste (figur 6) at ved den rensing som er beskrevet i eksempel 2 b), ble rFaIX isolert med mer enn 80 % renhet.

c) Rensing av rFAIX ved affinitetskromatografi

I det følgende ble rFaIX, som oppnådd i eksempel 2 a),

renset ved affinitetskromatografi. Heparin-Sepharose ble brukt som affinitetsmatriks.

Materialer:

Kolonne: HiTrap Heparin, Pharmacia; 5 ml. Instrument: Pharmacia FPLC LCC-500.

Buffer A:50 mM tris, 20 mM natriumsitrat, pH 7,4. Buffer B:50 mM tris, 20 mM natriumsitrat, pH 7,4, 0,15

M NaCl.

Buffer C:50 mM tris, 20 mM natriumsitrat, pH 7,4, 0,3

M NaCl.

Buffer D:50 mM tris, 20 mM natriumsitrat, pH 7,4, 1 M

NaCl.

Kolonnen ble regenerert overensstemmende med produ-sentens instruksjoner og brakt i likevekt med buffer A. 78 ml rFaIX, slik den ble oppnådd i eksempel 2 a), ble påført på kolonnen, og det ubundne proteinet ble vasket ut av kolonnen med buffer A. Deretter ble kolonnen eluert buffer B og deretter med buffer C. Den etterfølgende eluering foregikk med buffer D. Forløpet av kromatografien ble fulgt som beskrevet i eksempel 2 a). Proteinkonsentrasjonene og enzymaktivitetene ble bestemt. Resultatene viser at rFaIX ble fullstendig bundet på kolonnen og først eluert fra denne med 0,3 M NaCl. I denne fremgangsmåten ble imidlertid ytterligere proteiner også eluert samtidig med rFaIX og derved ikke separert fra rFaIX. Den spesifikke aktiviteten til rFaIX ble bare økt 4,5 ganger ved hjelp av den metoden som er vist i eksempel 2 c).

De vesentlige resultatene er oppsummert i figur 7 og tabell 5.

Eksempel 3

Rensing av rFAIX ved direkte kobling av anionvekslerkromatografi og affinitetskromatografi

I det følgende eksempel ble rFaIX, slik det er oppnådd i eksempel 2 a), renset på en slik måte at det først ble påført på en anionveksler og deretter på en affinitetskromato-grafikolonne. Q-Hyper D tjente som anionveksler. Dette er en anionveksler av aminotypen med hyperdiffusjonsegenskaper. Heparin-Sepharose (HiTrap Heparin, Pharmacia) ble brukt som affinitetsmatriks. Q-Hyper D-kolonnen ble festet i direkte serie foran Heparin-Sepharose-kolonnen. Bare en fleksibel rør-forbindelse begrenset til et minimum, eventuelt med en ventil, ble montert mellom kolonnene.

Materialer:

Kolonne: Q-Hyper D, Sepracor; 2 cm x 4 cm. Kolonne: HiTrap Heparin, Pharmacia; 5 ml. Instrument: Pharmacia FPLC LCC-500.

Buffer A:20 mM tris/HCl, pH 7,4.

Buffer B:20 mM tris/HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM

CaCl2-

Buffer C:20 mM tris/HCl, pH 7,4, 1,0 M NaCl.

Buffer D:50 mM tris, 20 mM natriumsitrat, pH 7,4, 0,15

M NaCl.

Buffer E:50 mM tris, 20 mM natriumsitrat, pH 7,4, 0,3

M NaCl.

Buffer F:50 mM tris, 20 mM natriumsitrat, pH 7,4, IM

NaCl.

Utløpet av kolonnen med anionveksleren var direkte forbundet med innløpet til affinitetskromatografikolonnen med en fleksibel rørforbindelse, slik at strømmen av væske først gikk gjennom kolonne 1 og deretter direkte gjennom kolonne 2.

Kolonnene ble regenerert overensstemmende med produ-sentens instruksjoner og brakt i likevekt med buffer B. 70 ml rFaIX, som var isolert fra cellekultursupernatanten som beskrevet i eksempel 2 a), ble fortynnet to ganger med buffer A, slik at konsentrasjonen av NaCl ble redusert til 0,15 M. CaCl2 ble tilsatt inntil en konsentrasjon på 10 mM. Deretter ble proteinblandingen påført på kolonne 1 (Q-Hyper D) ved 2,5 ml/ minutt og direkte overført til kolonne 2 (Heparin-Sepharose), hvori ubundet protein ble vasket fra kolonnene med buffer B. Deretter ble kolonne 1 koblet fra affinitetskolonnen, og strømmen av væske ble direkte påført på kolonne 2. Analogt med den metode som er vist i eksempel 2 c) ble ubundet protein fra Heparin-kolonnen fjernet ved vasking med buffer D. Elueringen av Heparin-kolonnen foregikk med buffer E. Den etterfølgende eluering ble utført med buffer F. Etter påføring av prøven ble det oppnådd analoge resultater når Q-Hyper-kolonnen ikke ble fjernet fra Heparin-kolonnen, men i stedet ble væskestrømmen for eluering av Heparin-kolonnen ført direkte på Heparin-kolonnen gjennom en sammenbindende ventil.

De proteiner som var bundet på kolonne 1 (Q-Hyper D) ble eluert med buffer C.

Forløpet av kromatografien ble fulgt som beskrevet i eksempel 2a). Proteinkonsentrasjonene og enzymaktivitetene ble bestemt.

Resultatene viser at ved påføring av prøven gjennom den innførte Q-Hyper D-kolonnen går rFalX gjennom denne uhindret og blir fullstendig absorbert på den Heparin-kolonne som er plassert deretter. rFaIX ble eluert fra den sistnevnte med 0,3 M NaCl.

De vesentlige resultatene er oppsummert i figur 8, figur 9 og tabell 6.

rFaIX anrikes 8,4 ganger ved den rensing som er beskrevet i eksempel 3. Den spesifikke aktiviteten økes 8,8 ganger. Den denaturerende, elektroforetiske analysen (ifølge Laemmli) viste {figur 9) at rFaIX isoleres med mer enn 95 % renhet ved den rensing som er beskrevet i eksempel 3.

I eksempel 3 ble rensingen av rFaIX utført ved hjelp av en direkte kombinasjon av metodene fra eksempler 2a), b) og

c), hvori de samme startmaterialer ble anvendt. Sammenlignet med rensingen fra eksempel 2 c) ble det imidlertid oppnådd en

høyere anrikning og en høyere spesifikk aktivitet ved en kombinasjon av anionvekslerkromatografi og affinitetskromatografi. Ved kombinasjonen av begge kromatografimetodene separeres tydeligvis slike forurensende proteiner som ufordel-aktig påvirker separasjonsprosessen på affinitetssubstratet på forhånd, hvorved det oppnås en høyere spesifisitet og selek-tivitet av affinitetssubstratet.

Eksempel 4

Rensing av rFall ved hjelp av anionvekslerkromatografi

I det følgende eksempel ble det anvendt en anionveksler med tentakelstruktur av den kvaternære aminotypen (Fraktogel EMD TMAE 650 M, Merck).

Materialer:

Kolonne:Fraktogel EMD TMAE 650 M, Merck, 1,6 cm x 5

cm.

Instrument: Pharmacia FPLC LCC-500-system.

Buffer A:50 mM tris/HCl, pH 7,4.

Buffer B: 50 mM tris/HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl. Buffer C: 50 mM tris/HCl, pH 7,4, 300 mM NaCl. Buffer D: 50 mM tris/HCl, pH 7,4, 1,4 M NaCl.

Rekombinant faktor II ble isolert, basert på vanlige laboratoriemetoder i cellekulturteknologien (Falkner et al., Thrombosis and Haemostasis, 68, 119-124 (1992)).

Ekspresjonen av rFall foregikk i kommersielt tilgjengelig, syntetisk DMEM-medium. Cellefri kultursupernatant ble oppnådd ved sentrifugering.

Kolonnen ble regenerert overensstemmende med produ-sentens instruksjoner og brakt i likevekt med buffer A. Deretter ble 200 ml cellekultursupernatant, som inneholdt rekombinant faktor II, påført på kolonnen med en hastighet på 4 ml/minutt. Materialet som ikke ble bundet til kolonnen, ble fjernet ved vasking med buffer A med samme strømningshastighet.

Deretter ble kolonnen først vasket med buffer B og deretter med buffer C. Etterfølgende eluering ble så utført med buffer D. Proteinadsorpsjonen ble fulgt på vanlig måte ved 280 nm

under kromatografien. Etter kromatografien ble proteinkon-

) sentrasjonen bestemt ved hjelp av Bradford-metoden. Innholdet av faktor II ble bestemt ved hjelp av en koaguleringstest (Thrombinzeit, Immuno AG).

Det ble funnet at nesten alt rFall var bundet på anionvekslergelen. rFall ble eluert fra anionveksleren med

i 0,3 M NaCl. I motsetning til andre anionvekslere av aminotypen,

som f.eks. MacroPrep (BioRad) eller Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), var fargestoffet bromfenolrødt, som vanligvis inneholdes i cellekultursupernatanten, allerede eluert fra

kolonnen ved en saltkonsentrasjon på 0,2 M NaCl, hvilket

) fremmet den etterfølgende isolasjon av rFall ved 0,3 M NaCl vesentlig.

De vesentlige resultater av rensingen av rFall på anionveksleren er oppsummert i figur 10 og tabell 71. Med den

rensing som er beskrevet i eksempel 4, økte den spesifikke

i aktiviteten til rFall 3,5 ganger.

b) Rensing av rFall ved adsorpsjon av medfølgende proteiner ved hjelp av anionvekslerkromatografi med

tilsetning av kalsiumioner

Fraktogel EMD TMAE 650 M (Merck) tjente som anion-vekslerharpiks.

Materialer:

Kolonne:Fraktogel EMD TMAE 650 M, 1,6 cm x 5 cm. Instrument: Pharmacia FPLC LCC-500.

Buffer A:50 mM tris/HCl, pH 7,4.

Buffer B:50 mM tris/HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM

CaCl2.

Buffer C: 50 mM tris/HCl, pH 7,4, 1,0 M NaCl.

Kolonnen ble regenerert overensstemmende med produ-sentens instruksjoner og brakt i likevekt med buffer B. Rekombinant faktor II, slik den ble isolert fra cellekultursupernatanten som beskrevet i eksempel 4 a), ble fortynnet 2 ganger med buffer A, slik at konsentrasjonen av NaCl totalt var mindre enn 0,2 M. CaCl2 ble tilsatt inntil en konsentrasjon på 10 mM. Deretter ble proteinblandingen påført på kolonnen, og det ubundne proteinet ble vasket ut av kolonnen med buffer B. Bundet protein ble eluert ved hjelp av buffer C.

Forløpet av kromatografien ble fulgt som i det foregående eksempel, og proteinkonsentrasjonene ble bestemt. Resultatene viser at rFall gikk gjennom kolonnen uhindret, mens den overveiende majoritet av forurensende proteiner forble på kolonnen. Disse proteinene ble så eluert med 1 M NaCl.

De vesentlige resultatene er oppsummert i figur 11, figur 12 og tabell 8. Ved den rensing som er beskrevet i eksemplene 4 a) og b), ble den spesifikke aktiviteten til rFall økte 11 ganger.

Den denaturerende, elektroforetiske analysen ifølge Laemmli viste (figur 9) at ved den rensing som er beskrevet i eksemplene 4 a) og b), ble rFall isolert med mer enn 95 % renhet .

Claims

1. Fremgangsmåte for separasjon av et vitamin K-avhengig protein fra ikke-vitamin K-avhengige, medfølgende proteiner fra en proteinholdig løsning, karakterisert ved at kalsiumioner tilsettes til denne løsning og den kalsiumholdige løsning bringes i kontakt med en anionveksler under betingelser i hvilke med-følgende proteiner, men ikke det vitamin K-avhengige protein, adsorberes.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at løsningen som inneholder vitamin K-avhengig protein, i tillegg bringes i kontakt med en anionveksler under betingelser i hvilke det vitamin K-avhengige protein adsorberes på veksleren, vaskes, elueres, og eventuelt reduseres elueringsmidlets ionestyrke.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det ikke-adsorberte vitamin K-avhengige protein adsorberes på et affinitetssubstrat og elueres selektivt.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den utføres med et fremgangsmåtetrinn ifølge kravene 2 og/eller 3 i en hvilken som helst kombinasjon eller rekkefølge.

5. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 og 2, karakterisert ved at separasjonstrinnet ut-føres med samme anionveksler, fortrinnsvis ved hjelp av kromatografi.

6. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-5, karakterisert ved at anionveksleren har hyperdiffusjonsegenskaper.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at bæreren, en anionveksler med hyperdiffusjonsegenskaper anvendes som anionveksler.

8. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-5, karakterisert ved at anionveksleren har tentakelstruktur.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at proteinløsningens ionestyrke reduseres til 0,15-0,2 M etter eluering.

10. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-9, karakterisert ved at det vitamin K-avhengige protein velges fra Fil, FVII, FIX, FX, protein S, protein C og protein Z.

11. Fremgangsmåte for utvinning av et vitamin K-avhengig protein ifølge kravene 1-10.

12. Fremgangsmåte for utvinning av et ikke-vitamin K-avhengig, medfølgende protein ifølge kravene 1-10.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1-10, karakterisert ved at CaCl2 tilsettes inntil en konsentrasjon på 10 mM, men minimum 1,0 mM.

14. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-10, karakterisert ved at proteinløsningen har en pH-verdi mellom 4 og 9.